双RNA-SEQ分析在挪威云杉和病重养殖病原体之间的相互作用中提供了新的见解异常annosum s.l.

背景

针叶树的根和根茎腐烂，由属于Heterobasidion annosum物种复合体是整个北半球针叶林中最重要的经济真菌病害之一。我们研究了两者之间的相互作用Heterobasidion真菌及其宿主通过进行双重RNA-SEQ和对挪威云杉树的化学分析，自然感染Heterobasidion我们分析了云杉的寄主和病原菌的转录组以及酚类和萜类成分的含量。

结果

研究结果强调了苯丙素和类黄酮通路在挪威云杉化学防御中的作用。木脂素在表现木材腐烂症状的树木中积累。我们鉴定了一些在云杉防御反应的高水平调控中具有预测作用的候选基因。我们的研究结果表明，ABA信号可能在云杉防御中起重要作用Heterobasidion感染。在寄主定殖过程中，真菌表达了碳水化合物和木质素降解酶基因、次生代谢基因和效应器类基因。

结论

我们的结果提供了挪威云杉树雇用的防御策略的额外洞察力Heterobasidion感染。这些候选基因作为抗根腐病标志物的应用价值值得进一步研究。

树木健康是森林生态系统稳定运行的重要前提。尽管为防止和控制森林树木病虫害的蔓延作出了相当大的努力，但它们继续对全世界的天然林和商业种植园构成严重威胁。的成员Heterobasidion annosum物种复合物是北方和温带区的针叶树林中最具破坏性的真菌病原体之一。在生存树的茎和根中生长成年人，它们大大降低了木材质量，使树木更容易受到意外收获，造成严重的经济损失[1]．没有治疗可供感染的树木，目前的控制策略专注于收获后的树桩处理，这可以防止新鲜树桩的定植Heterobasidion菌类。真菌菌丝体可以持续到几十年的根碎片和树桩，并且完全根除几乎是不可能的[1]．

由于其经济重要性，不同方面的相互作用Heterobasidion真菌和它们的宿主树已经成为许多研究的对象。物种复合体中的三个物种的基因组被测序[2那3.那4.，为比较基因组学研究提供了宝贵的资源。同时，利用人工接种实验的数据了解针叶树对真菌入侵的响应[5.那6.那7.那8.那9.那10那11那12]．这些实验结果表明茉莉酸和乙烯信号通路在树木对真菌感染的响应中起关键作用。在分子水平上，主要的反应是诱导苯丙素和萜类途径的组分，参与木质素形成和细胞壁强化的基因和致病相关(PR)蛋白的基因。的适应Heterobasidion真菌对木材和木质纤维素基质的生长也得到了相当大的关注[2那13那14那15]．同时，关于所使用的机制，已知的要少得多Heterobasidion真菌寄生于它们的宿主。限制因素之一是人工接种实验中病原菌生物量低，导致检测到的真菌转录本数量相对较低[2那12]．然而，在感染的高级阶段对天然感染的树木的研究可以为接种方法提供可行的替代方法[16]．

尽管对针叶树的主要防御反应有很好的理解Heterobasidion感染，较少越来越少了解其抵抗力的因素。传统上，树组织中的坏死病变的长度和病原体涂抹程度用于量化树木接种的反应[17]．坏死病变本身可能不足以作为持久耐药的指标，因此需要寻找额外的标志物来补充病变的测量。在Lind等人的分析中引入了病原体排除和感染预防的概念[18]．然而，尚不完全清楚所有这些参数如何与自然林分中的树木抗性有关。通过SNP标记分离分析，鉴定出几个与抗性不同方面相关的候选基因₁后代人口[18]．Mukrimin等人使用基于基于基因组关联分析的替代方法进行抗性特征。[19]．进一步的研究表明，类黄酮通路组分可能在挪威云杉抗性中起作用Heterobasidion感染(20.那21]．

对宿主的互动研究极大地受益于最近的技术进步。特别适用于理解宿主和病原体之间的相互作用的分子机制的技术之一是双RNA测序[22那23]．它允许检测具有低丰度的转录物，比微阵列和北方印迹方法更敏感。此外，该方法不需要预测的物种特异性探针，并允许同时检测混合样品中的宿主和病原体特异性转录物。该方法已成功应用于几种植物病原体模型，而是与先前使用的技术相比的适用性和清晰的益处[24那25那26]．

采用双RNA测序方法研究挪威云杉与Heterobasidion在自然感染树木中的真菌，我们能够识别真菌转录本的表达在足底．其中，我们优先考虑几种候选基因，可能在云杉防御响应的调节中发挥重要作用[27]．此外，我们对无症状和症状云杉树的转录和化学分布进行了比较。

寄主定殖过程中真菌基因表达

来自RNA-SEQ数据的分析Heterobasidion-感染云杉树已经鉴定出了一些在云杉树定殖期间表达的真菌转录本(附加文件)1:表S1)。值得注意的是，在有症状和无症状的树中都检测到了真菌转录本。但无症状树的丰度低于有症状树。功能注释分析显示，大部分被鉴定的基因(230个基因)为孤儿基因，对其生物学功能没有任何信息(图)。1a).大多数属于这一类的基因没有保守结构域。值得注意的是，通过EffectorP算法，230个孤儿基因中有49个被鉴定为编码假定效应蛋白[28]．此外，我们列表中的三个基因之前被选为假定基因HeterobasidionHassp22，Hassp49和Hassp52的作用29]．

在其他功能基团中，一些基因在植物细胞壁聚合物的降解和木质素的分解中具有预测作用(图)。1一个;表格1）.我们鉴定了24个编码糖苷水解酶(GH)的基因，4个编码碳水化合物酯酶(CE)的基因和3个编码裂解多糖单加氧酶(LPMO)的基因。在木质素分解中具有预测作用的基因包括四种锰过氧化物酶，一种漆酶，一种GMC氧化还原酶，一种芳醇氧化酶和一种纤维二糖脱氢酶。

木质素降解过氧化物酶的表达可能与观察到的尿卟啉原III合酶的表达有关，尿卟啉原III合酶与血红素生物合成有关。此外，我们还发现了一些可能在木质素降解产物的解毒作用中发挥作用的基因:两个与特征相关的基因Phanerochaete chrysosporiumO-甲基转移酶[30.，以及与之相似的基因Sphingomonas paucimobilisβ-酯酶利格[31]， 也H. urgulare.木质素表达蛋白(lep1)，功能未知。

其他可能与寄主定植和基质利用有关的基因Heterobasidion包括7种预测脂肪酶/羧酯酶和8种蛋白酶(6种丝氨酸蛋白酶和2种天冬氨酸蛋白酶)。表达基因还包括13个编码细胞色素P450家族成员的基因，目前尚无功能特征。20个上调基因的产物可能在转运中发挥作用，包括14个MFS转运体，2个氨基酸转运体和一个ABC转运体(图)。1a). 4个已鉴定的基因可能在次级代谢中起作用:3个(总共13个)未鉴定的nrps样三分域酶和一个萜烯环化酶cyc2．最后一种可能与中间体的生物合成有关途中黄褐素及黄褐素毒素[2]．我们考虑的其他基因值得一提，编码产物产物的酶草酸酶，推定的水杨酸盐单氧化酶，疏水性表面结合蛋白，疏水蛋白，含有在与植物细胞壁的结合中的作用，感染QTL-表达蛋白质[32]和含LRR域的蛋白质。

对已鉴定真菌基因的基因本体论(GO)术语的分析与我们手工注释得出的结论一致。在“生物过程”范畴的氧化石墨烯术语中，“电子传递”、“代谢过程”、“碳水化合物代谢过程”、“蛋白质水解”和“运输”最为丰富(图1)。1b).同样，GO类“分子功能”术语中的“氧化还原酶活性”、“血红素结合”、“单加氧酶活性”、“水解酶活性、水解o -糖基化合物”、“运输活性”和“纤维素结合”也有众多的热点在足底- 表达真菌基因（图。1C）。这些结果强调碳水化合物降解酶，氧化酶（木质素降解过氧化物酶和细胞变色剂P450）和转运蛋白在宿主定植期间的重要性Heterobasidion菌类。

在症状挪威云杉树上显示更高的转录物丰度的基因

我们对RNA-seq数据的分析发现，在症状树中有345个显著更高丰度的转录本(FC > 4, FDR < 0.05)(附加文件2：表S2）和185个转录物，无症状树木具有较高丰度（见下文和附加文件3.:表S3)。在症状树中上调的基因组中，三个氧化石墨烯术语(“催化活性”、“氧化还原酶活性”和“裂解酶活性”)显著富集(FDR < 0.05)2）.

鉴定基因的功能注释表明，许多在症状树上上调的基因在细胞壁生物发生和增强中具有预测的作用，包括褐化。该类别包括13个分泌的过氧化物酶（也称为III类过氧化物酶），4个降低的基因和1个漆基因。我们还发现了两种推定的纤维素合成酶，5个预测果胶/果胶酶和同源物答:芥PDR1 ABC运输器，其功能P.-香豆醇出口，参与木质素的生物合成。其他可能在细胞壁生物发生中发挥作用的基因包括答:芥fl11蛋白和三个推测的毛状体双折射样蛋白家族成员。另一组重要的上调基因由编码预测受体(R蛋白)和受体样激酶的基因组成(分别为12和16个基因)。四个上调的基因暂时参与了苯丙素途径(图。2）：两个咖啡酸O-甲基转移酶，一种咖啡酰基CoA O-甲基转移酶和与之相关的基因答:芥芥子酸:udp -葡萄糖葡萄糖转移酶，是建立非寄主抗性所必需的拟南芥．13个预测基因与萜类生物合成途径相关:2个香叶酰香叶酰焦磷酸合成酶和11个与萜类合成酶相似的基因，其中6个与萜类合成酶相似度最高E.-α-双abolene合酶，1 - to (-)-β-phellandrene合酶，4 - to humulene和长叶烯合酶。然而，值得注意的是，在鉴定的萜类合成酶基因中，只有两个(MA_1830g0010和MA_10196363g0010)是全长基因模型。其余的是部分模型，其中一些实际上可能是同一基因的片段，因此实际上调的萜类合成酶数量可能会稍低一些。

在症状树上上调的基因还包括18个推定的转录因子（其中6个属于ERF / AP2家族）和17种病因相关（PR）蛋白（2 PR-1基因，5个章节酶，1 PR-4 Gene，2 Pr-10基因，1个防御素，4基因编码脂质转移蛋白，以及2种同源物P. Sylvestris.SP-AMP（PR-19））。几个基因可以与JA / ET信号通路连接：一个推定的同源物答:芥细胞色素P450 CYP94B3作为茉莉酸-异亮氨酸-12-羟化酶，通过降低JA-Ile、两个TIFY结构域蛋白和一个公认的ACC氧化酶的水平来减弱茉莉酸信号。其他值得注意的基因是蛋白磷酸酶2C家族的两个假定成员，该家族已知在ABA信号的负调控中发挥作用，是一个同源基因答:芥胰蛋白酶抑制剂KTI1参与调控植物-病原互作中的程序性细胞死亡答:芥脂氧合酶LOX1，赋予抗性黄定的两个同系物答:芥PEN3/PDR8 ABC转运体，在建立对真菌病原体的抗性中起作用。

无症状挪威云杉中转录本丰度较高的基因

无症状树木中具有较高转录物丰度的基因组出现了一些常见特征，但与症状树上上调的基因相比也是一些重要的差异。富集分析证明，在无症状树上上调的基因集中显着富集（FDR <0.05），对跨膜运输，对刺激反应，信号转导和生物调节相关的几种GO术语（FDR <0.05）（表格2）.

在无症状树中表达水平较高的基因中，我们鉴定了17个受体样激酶和12个预测受体基因。9个基因的产物被分配到萜类生物合成途径:3个羟甲基戊二酰辅酶a还原酶和6个预测萜类合成酶，其中2个与(e，E.) -α金合欢烯/ (E.)-β-ocimene合酶，二-到humulene和长叶烯合酶，一-到α-松油醇/1,8-桉油醇合酶和一-到δ-selinene合酶。许多基因可能与苯丙酸途径及其分支相连，包括三个推测的咖啡酸/5-羟基阿鲁酸o -甲基转移酶、肉桂酸-辅酶A连接酶、肉桂酸-辅酶A还原酶、二氢黄酮醇还原酶、白花青素还原酶LAR1和LAR3.(无花果。2）和三个基因显示与苯基苏马兰苄醚还原酶相似。另外，该途径可能涉及三种鉴定的细胞色素P450和一些上调的UDP-葡糖基转移酶。值得注意的是，在无症状树中，不上调III类过氧化物酶，漆酶或脱脂剂样蛋白。

无症状树脂还具有3种预测转录因子的转录水平较高（ERF / AP2家族的2个成员，MYB系列的1个成员）和三种PR-蛋白（2个硫蛋白样蛋白质和1个生殖器样蛋白）。几种鉴定的蛋白质可以在调节植物激素信号传导中具有可能的作用，包括一种含有型畴内蛋白质，两个IAA羧甲基转移酶，Pyr / Pyl / RCar家族的推定脱落酸传感器和四个伴侣流出家族成员在其他中，在SA和ABA的运输中。其他有趣的命中可能在云杉防御中具有对抗病原体的作用包括同源物答:芥LAP2(氨基肽酶扮演关键角色在衰老,应激反应和氨基酸营业额),FMO1(促进阻力和细胞死亡的蛋白质在病原体感染的网站),MLO10(跨膜蛋白参与细胞死亡和防御反应)和TOXICOS LEVADURA 2(泛素连接酶诱导接触甲壳素后)。

无症状和症状挪威云杉树的化学分析

我们分析了挪威云杉无症状和症状的韧皮部和木质部中的酚类化合物(图。3.）.主坐标分析根据木质部中酚类化合物的分布将无症状树和症状树分离出来。4.a)，且PERMANOVA证实此差异具有统计学意义(P. = 0.005). Chemical profiles of phenolic compounds detected in the phloem of asymptomatic and symptomatic trees were not significantly different (P.= 0.08)(图4.）.而在韧皮部中检测到的化合物中，无症状树中黄酮的一种未特征的衍生物穗二醇的浓度约为症状树的3.3倍，差异有统计学意义(P.= 0.038)(图3.a).症状乔木木质部酚类化合物总浓度约为无症状乔木的160倍(P. = 0.031) (Fig.3.c).这种显著差异是由于有症状的树中存在大量的木脂素和新木脂素，而在无症状的树中，大多数木脂素和新木脂素的浓度(木脂素3和7除外)低于检测限(图3)。3.b).同时，苯甲酸和二苯乙烯2和3在无症状树的木质部中均有发现(虽然含量较低)，但在除一株有症状树以外的所有树中均未发现。

我们还确定了在无症状和症状挪威云杉树的韧皮肽和Xylem中占37萜类化合物（17种单萜和20倍萜）（图。5.）.主要坐标分析在基于萜类化合物含量清楚地分离韧皮肌和木耳（图。6.）.然而，vallova分析表明，症状和无症状树木之间的差异在统计学上没有统计学意义（P.= 0.064,P. = 0.594 for phloem and xylem, respectively). Similar results were obtained when data for monoterpenes and sesquiterpenes were analyzed separately: there were significant differences among xylem and phloem samples, but differences among symptomatic and asymptomatic trees were not statistically significant (P. > 0.05 in all possible comparisons).

对单个化合物的数据分析发现，与症状树相比，无症状树的韧皮部中有三种化合物的浓度更高:α-蒎烯(P. = 0.022), tricyclene (P. = 0.025) and α-longipinene (P. = 0.048) (Fig.5.a).无症状树韧皮部积累的单萜类总浓度显著高于症状树(图2)。5.C）。发现任何测试化合物的木质浓度无症状和无症状树木之间没有显着差异（图。5.b）。

组成真菌之间的相互作用Heterobasidion annosum物种复合物及其天然宿主，各种各样的针叶树树，由于这些虚张症病原体的经济重要性，这是众多研究的重点[1那2那5.那6.那7.那8.那9.那10那11那33]．近年来，由于基因组序列的可得性，这些研究大大加快了Heterobasidion irregulare[2]挪威云杉[34]．然而，大多数已发表的结果是在人工接种针叶树后获得的Heterobasidion．作为Heterobasidion真菌不能穿透针叶树茎的完整表面，接种需要人工伤害。这种方法的明显局限性是，损伤本身会引起强烈的转录反应，这与树木对真菌感染的反应有很大的重叠[35]．

在这项研究中，我们使用双RNA测序方法来研究与之间的相互作用Heterobasidion真菌和挪威云杉树。双RNA-seq是研究植物病原与寄主相互作用分子机制的一种有前景的方法[24那25那26]．它被用于研究两者之间的相互作用h . annosum和挪威云杉[12]．然而,很少有Heterobasidion-特异性转录本在该研究中被检测到。这很可能是由于增长缓慢Heterobasidion在宿主组织中，导致收获时的生物量积累非常低，在分离的RNA样本中真菌转录本的丰度很低。克服与人工接种树木有关的局限性Heterobasidion，我们决定将我们的分析集中在自然感染的云杉树上。类似的方法在早些时候成功应用以识别H. Parviporum.挪威云杉殖民化期间表达的基因[16]．我们认识到所选方法具有自身的限制，因为我们没有关于所选树木的感染过程持续时间的信息，我们无法完全控制环境变量。此外，大尺寸的采样树组织可能限制了我们实验的空间分辨率，并且不允许我们评估转录概况的可能差异Heterobasidion分布在不同解剖区域的菌丝(例如，内部和外部心材)。然而，我们认为我们的实验设计更好地反映了管理云杉林的情况，在那里树木不断暴露于病原体。此外，所获得的结果表明所选择的方法可能是有效的，因为许多已鉴定的真菌和云杉基因可以放在宿主和病原体之间的相互作用的背景下。

以前的一些研究专注于改编Heterobasidion真菌在木质纤维素底物上生长[2那13那14那15]．同时，信息上Heterobasidion在活树生长过程中表达的基因仍然很少，这主要是由于上面讨论的方法上的困难。因此，只有11个表达差异HeterobasidionLunden等人鉴定基因。[12奥尔森等人报道了42个上调基因。[2]，但Yakovlev等人从减法杂交文库中发现了近400条ESTs [16]．有趣的是，在之前的研究中没有一个基因被报道[12在本分析中鉴定出来。这可能是由于该实验中的低真菌生物量。然而，Olson等人的结果之间存在一些重叠。[2]和Yakovlev等人。[16以及目前的结果。GH5和GH28糖苷水解酶、CE12碳水化合物酯酶、含cbm1蛋白和3个MFS转运蛋白在大肠杆菌中均有高表达H. urgulare.在坏死的松树山脉的山腰中生长期间[2，在本研究中也检测到了相同的基因。类似于Yakovlev等人的结果[16]，我们鉴定了锰过氧化物酶、漆酶、芳醇氧化酶和一些细胞色素P450基因，以及许多功能未知的蛋白，这些蛋白在云杉定植过程中表达。这些发现强调了碳水化合物和木质素降解酶在寄主定殖过程中的重要性Heterobasidion，而表达的转运蛋白可能与营养获取有关。观察到的草酰乙酰酶表达也与已发表的结果一致[36]．此外，我们还观察到萜类合成酶和nrps类基因的表达，这些基因可能参与了毒素的产生Heterobasidion[2]．但是，我们认为最有趣的发现之一是鉴定识别的未知功能的大量基因，表达Heterobasidion在主机殖民。这些蛋白质中的一些可能被真菌用来克服宿主防御反应，事实上，它们中的一些与已知的真菌效应器具有相同的结构结构:没有保守结构域的富含半胱氨酸的小分泌蛋白[29]．对其功能的研究，可能为研究血吸虫感染策略提供新的线索Heterobasidion菌类。

值得注意的是,Heterobasidion-特异性转录本在症状和无症状树中都被检测到，尽管后者的丰度较低。这与我们之前对挪威云杉树真菌群落的元编码研究结果一致[37]．我们的数据显示有两个otu被归类为h . annosum和H. Parviporum.在用于双rna测序分析的同一棵树上。在大多数取样的树木中，包括用于RNA-seq分析的树木，都同时检测到这两个物种。的识别Heterobasidion这些树木中的特异性转录物证实了我们之前的观察结果，并表明真菌在症状和无症状树脂中代谢活跃。

我们的分析结果提供了进一步深入了解云杉树采用的防御机制Heterobasidion感染。两组均有大量预测受体(R)基因和受体样激酶上调，其中一些基因可能在病原体识别和防御反应调节中发挥重要作用。然而，它们的特性需要额外的实验努力。在症状树中诱导了许多参与木质素形成和细胞壁增强的基因(分泌型III类过氧化物酶、定向类蛋白和漆酶)。这些基因的诱导在针叶树真菌感染反应中普遍存在，并通过JA/ET信号通路被激活。此外，在这些树中，一组致病相关蛋白、苯丙素和萜类途径的一些成分以及一些在抗菌防御中预测作用的基因被上调。然而，所有这些基因的诱导都不足以阻止感染的进展。

在我们看来，与关键监管机构具有高相似性的四种基因的更高记录性丰富答:芥无缝树木中的细胞死亡和防御反应（LAP2，FMO1，MLO10和毒素EN Levadura 2）非常出色。鉴定的基因是用于进一步研究的主要候选者，以阐明其在挪威云杉防御措施中的作用Heterobasidion真菌和其他病原体。

我们的实验结果表明，脱落酸信号可能与云杉的反应有关Heterobasidion感染。与…高度相似的基因答:芥在无症状树中，PYR/PYL/RCAR家族的脱落酸传感器表达上调，而可能参与ABA信号负调控的蛋白磷酸酶2C家族成员在症状树中表达较高。据我们所知，目前还没有观察到ABA信号可能参与云杉对干旱胁迫的响应Heterobasidion之前进行的感染。通常，ABA在植物病原体抗性中的作用尚不完全理解，并且ABA对病原抗性的正面和负效应均取决于所研究的丧失疗法[38]．一方面，ABA可能通过抑制JA/ et依赖的免疫抑制植物对坏死营养病原体的防御反应[39]．另一方面，ABA通常是胼胝质沉积和胼胝质依赖防御反应的正调控因子[40那41那42[因此，它有助于增强的病原体抗性。从可用数据中得出任何结论将是一次什么时候，并需要进一步研究，以解决ABA在针叶树抗性抵抗中的可能作用Heterobasidion菌类。

我们还发现两个预测的IAA羧甲基转移酶基因在无症状树中表达水平较高。这种酶专门将IAA转化为其甲酯形式，以这种方式降低IAA水平。此外，4个预测基因编码的MATE家族转运蛋白在无症状树中上调。据报道，该家族成员参与了ABA和IAA的细胞内运输，但也可能在类黄酮通路中发挥作用(见下文)。我们无法根据现有的序列信息预测已识别的MATE基因的功能，需要实验研究来阐明它们的作用。

我们的结果显示了与类黄酮途径相关的许多基因的无症状的表达水平升高（图。2)，目前被认为是挪威云杉防御机制的重要组成部分。LAR3.白花色素还原酶基因与挪威云杉抗白花色素还原酶基因有关Heterobasidion感染(7.那18那21]．这种基因编码的酶催化儿茶素的形成。值得注意的是，儿茶素的积累对h . annosum在挪威春季基因型中报告接种较少易受病原体的影响[7.]．归纳拉在蓝染真菌中也观察到表达内炎噻吩波尔罗尔氏菌（=长喙壳属polonica） 感染 [43]．在我们的实验中，LAR3.基因及其同源物LAR1在无症状树中表达量显著升高。无症状树也显示了更高的转录丰度推定二氢黄酮醇还原酶基因，另一种酶的类黄酮途径。这些基因的激活来回应H. Parviporum.以前报道了接种[12]．诱导的细胞色素P450中的两种与类黄酮3'，5'-羟化酶的高相似性，其参与儿茶素转化为GallocateChin [44]．一些诱导的伴侣转运蛋白编码基因也可以与黄酮途径相关，因为该家族的成员涉及转运原花青素的黄酮前体[45，但却无法从它们的序列推断出它们的作用。

无症状树的特征是MYB家族转录因子的转录丰度较高PAMYB29．MYB蛋白是植物中最大的转录因子家族之一。它们参与了一系列广泛的发育程序、代谢途径以及生物和非生物应激反应的调控[46]．某些MYB蛋白是苯丙烷型途径的关键调节因子，并控制单烯醇，黄酮类化合物，酚醛酸和斯蒂芬的生物合成。苯丙醇丙烷途径的MYB依赖性调节显示出高度的复杂性，因为不同的MYB因子可能具有相反的作用和功能作为转录活化剂或作为阻遏物[46]．MYB蛋白在调控苯丙素途径不同下游分支之间的代谢物通量中的作用被提出[47]．MYB蛋白也参与了针叶树中苯丙素途径的调控[48那49那50那51那52]．现有数据表明，这种调节可能是通过MYB激活因子和抑制因子的协同作用实现的[50]．转录因子PaMYB29在基因诱导中的作用PaLAR3和PaANR3作为对生物压力的回应最近被提出[20.]．因此，表达水平越高PAMYB29我们在无症状树中观察到的基因可能与类黄酮通路中其他基因转录丰度较高有关。

在无症状树和症状树中观察到的基因表达模式也可以反映出这些群体之间的主要代谢差异。来自苯丙素途径的相同前体也被用于单分子醇和黄酮类化合物的生物合成(图。2)[7.]．III类过氧化物酶，漆酶和令人症状的较弱基因的表达较高可能表明这些前体优先用于形成木质素和/或木兰，而在无症状树上，我们观察到黄酮类化途径的较高表达，反过来，可能表明通过该代谢途径增加前体的流动。酚类化合物的化学分析支持该模型。无症状树脂的黄烷酮ERIODICTYOL的无特异性衍生物的浓度显着高。同时，在症状树木的木耳中观察到木质素的积累，而无症状树木中这些化合物的浓度保持在低水平。木质素是一类广泛分布在裸子植物和植物植物中的酚类化合物。化学上，它们是苯基丙醇单位的二聚体[53]，它们的生物合成始于两个单分子醇(最常见的是松柏醇)单元的二聚反应[54]．该反应是对映选择性的，它是由氧化酶(漆酶和过氧化物酶)介导的，由diriging (DIR)蛋白辅助[55]．因此，观察到的木脂素在症状树中的积累与其生物合成所需的基因编码酶的转录激活是一致的，与早期的报道一致[56]．木质人可能是检测的潜在化学标志Heterobasidion来华的树木。云杉苯基丙素途径下游分支的调控以及特异性MYB转录因子对其的贡献值得进一步研究。综上所述，我们的数据支持了之前的观察，并突出了一些新的细节，这可能对进一步研究类黄酮通路在挪威云杉化学防御中的作用具有重要意义。

另一组代谢产物通常被认为是构成针叶树化学防御的一部分是萜类化合物。我们对挪威云杉木质部和韧皮部中萜类成分的含量进行了综合分析。无症状树和症状树的化学成分差异无统计学意义，但三种化合物(α-蒎烯、三环烯和α-长蒎烯)的浓度在无症状树中显著较高。在更动态的韧皮部中观察到较低的萜烯浓度，表明感染/疾病症状对萜烯合成有一定的干扰。同时，在更稳定的木质部浓度中缺乏类似的效应，可能表明症状树对木质部的敏感性更高Heterobasidion感染不是由其固有的较低水平的木质萜烯造成的。

对RNA-seq数据的分析也发现了一些差异表达的萜烯合成酶基因。然而，很难在两种分析结果之间建立明确的联系，这主要是由于tps的生化功能不能根据序列相似性来预测[57那58那59]．对一些挪威云杉tss进行了实验表征[60那61]，而表现差异表达的基因中唯一具有特征的是(E.）-α-双式合成酶，并且在化学分析中未测定该特定化合物。同时，从挪威云杉报告的迄今为止没有催化三丙烯烯和α-少ineNe的酶，编码挪威云杉（ - ） - α/β-脊烯合酶的基因显示出对转录性的显着差异。在缺乏关于实验表征萜烯合成酶的挪威云杉的信息旁边，我们的化学和转录分析结果之间的一些差异可以部分地解释云杉树皮中的复杂防御反应的复​​杂空间模式[62，而使用我们的抽样策略无法妥善解决。

综上所述，目前的数据表明，在自然生境中研究森林树木真菌病原与各自寄主之间的相互作用，尽管有一定的局限性，但可以补充在控制条件下人工接种的结果。特别是，与人工接种实验相比，我们能够恢复更多的真菌转录本。在寄主定殖过程中，真菌表达了与碳水化合物和木质素降解、转运和次生代谢有关的基因。此外，约40%的表达真菌基因的功能未知，其中一些类似真菌效应物，可能被病原体用于调节宿主防御反应。我们的数据支持类黄酮途径在挪威云杉防御Heterobasidion．我们还鉴定了几个与防御反应关键调控因子相关的候选基因答:芥并且首次发现了ABA信号在防御中可能作用的一些迹象Heterobasidion感染。这些新颖的见解将有助于更好地理解疾病的病理系统Heterobasidion真菌和针叶树树。

研究网站和样品收集

三棵挪威云杉(挪威云杉(l)在Mäntsälä市(芬兰南部Uusimaa地区)以喀斯特地貌为主的森林区域进行取样。抽样地点及抽样程序详载于其他地方[37那63]．所有三个样地都是用于商业木材生产和在可比条件下生长的管理云杉林的典型例子。它们位于一个发病率相对较高的地区Heterobasidion感染。我们的采样是在采伐树木的同时进行的。这些样本是在树木砍伐后立即采集的。通过这种方法，我们可以根据树桩高度是否存在木材腐烂柱来清楚地区分无症状和有症状的树木(附加文件4.:图S1)。

在每种情节中，选择了六棵云杉树：三棵树显示出症状Heterobasidion- 诱导的木材衰减（进一步称为症状树木），以及三棵树，没有腐烂的症状（进一步称为无症状树木）。与所选树木相关的真菌社区的沟通研究表明存在两种Heterobasidion那h . annosum和H. Parviporum.，在所有抽样树中(有症状和无症状)[37]．在树桩水平采集下茎(包括树皮、边材和心材的木圆盘扇区)的样本(附加文件)5.：图S2）。将所有样品保持在-80℃直至使用。

RNA提取和测序

从18株样本树中随机选取10株(无症状5株，有症状5株)进行RNA-seq分析。收集的木圆盘中的材料用无菌液氮冷却的IKA A11基本磨机(IKA- werke GmbH & Co. KG, Germany)磨成粉末。总RNA提取约1克磨碎的组织(结合边材和心材)，如其他地方所述[64]．为了分离RNA，将边材和心材混合在一起，并从混合样品中提取。将纯化后的RNA用Illumina TruSeq链总RNA library Prep Kit构建文库，然后在芬兰赫尔辛基大学生物技术研究所(Institute of Biotechnology)的设施中使用Illumina配对端(2 × 75 bp) RNAseq构建文库。低质量Reads (Q < 20在5-base宽滑动窗)和适配器污染由Trimmomatic v.0.35修剪，最小长度为38 bp [65]．使用FASTQC v0.11.2对修剪过的reads进行质量评估。

处理后的reads被映射到Norway spruce (v 1.0)的基因组组装上[34(下载ftp://plantgenie.org/data/congenie/picea_abies/)和STAR v.2.5.2b索引[66]．原始读取的计数表预测的70,736基因模型是由HTSEQ V.0.6.1p1中的htseq-count脚本产生的[67]使用所获得的唯一映射读取。此外，识别在足底表达的病原体基因，处理后的读取序列也被映射到基因组组装Heterobasidion annosum（v2.0）来自联合基因组倡议网站。在Bioproject Prjna401308下，原始读数已提交给NCBI SRA。

RNAseq数据分析

原始读计数表装入R统计软件[68]，用edgeR软件包对数据进行分析[69]．过滤掉至少5个样本中每百万分之一读取次数少于1的读数[70]．

根据EDGER中的“经典”方法进行差异表达的统计分析，用于简单的实验设计[69那70]．简而言之，通过函数CalcnormFactor和extimateCommondisp / ExclatateTagwiseisp来估计库和常见/ tagwise分散的标准化因子。最后，Aprictest函数用于计算出生成差分表达的特征列表的两组样本之间的手段中的差异的遗传精确测试[69]．FDR的截止值设为0.05。

鉴定的差异表达挪威云杉基因被手动愈合。基于BLASTP搜索的组合结果分配注释拟南芥蒂利亚纳蛋白质集合，BLASTP针对Genbank NR蛋白集进行搜索，限制所有种子植物或松树家庭（PINACEAE）和存在相应蛋白的推导氨基酸序列中的保守结构域。

去浓缩试验

通过丰富分析工具单独检索上调基因列表中富集的基因列表中的富集术语ConGenIE.org平台 （http://congenie.org/)使用挪威云杉(挪威云杉v.1.0）作为背景。选择具有至少3个基因的生物过程（BP），分子函数（MF）和细胞组分（CC）类别中的显着富集术语（FDR <0.05）。

Terpenoid分析

根据Kainulainen等人的改进方法对下茎样品(树桩水平)的韧皮部(内树皮)和木质部(边材+心材)中的萜类化合物进行分析[71]．萃取是从200mg韧皮岩样或300mg木质样品中进行的。基于它们的质谱，保留时间和正宗标准化合物鉴定和定量化合物，如前所述[71]．

将无症状和症状树木中萜类化合物的浓度与SPSS V24（IBM，USA）的单向分析进行了比较（ANOVA）。PCOA用于可视化宿主树三萜和转录组谱的结构。统计测试在引物V.6中进行[72] alplenova +的附加包[73]．

酚醛分析

分别对取自下茎(树桩水平)的韧皮部(内树皮)和木质部(边材+心材)样品进行酚类化合物分析。干燥和碾碎的茎材料(15至20毫克)用于化学分析。提取、高效液相色谱定量和UHPLC-qtof MS鉴定遵循早期发表的方法[74]．将无症状和症状树木中酚类化合物的浓度与SPSS V24（IBM，USA）中的差异（ANOVA）的单向分析进行比较。PCOA用于可视化宿主树三萜和转录组谱的结构。统计测试在引物V.6中进行[72] alplenova +的附加包[73]．

阿坝:

脱盐酸

ABC运输车：

ATP绑定盒式磁带传输车

ACC：

1-aminocyclopropane-1-carboxylic酸

amp：

抗菌蛋白

方差分析:

方差分析

ANR:

花青素还原酶

AP2:

Apetala 2

CBM:

Carbohydrate-binding模块

CE:

碳水化合物酯酶

COA：

辅酶A.

CYP：

细胞色素P450

DIR：

Dirigent-like蛋白质

DPBB域:

双psi -桶域

小块土地:

Ethylene-responsive元件结合的因素

等：

乙烯

FC：

折叠变化

罗斯福:

错误发现率

FMO：

Flavin-dependent单氧酶

“大酒店”:

糖苷水解酶

GMC氧化还原酶:

葡萄糖 - 甲醇 - 胆碱氧化还原酶

走:

基因本体论

国际宇航科学院:

吲哚-3-乙酸

是:

茉莉酸

KTI:

Kunitz胰蛋白酶抑制剂

圈:

亮氨酸氨基肽酶

LAR：

leucoanthocyanidin还原酶

熏鲑鱼：

脂氧合酶

LPMO:

溶解性多糖单氧酶

远程雷达:

富亮氨酸重复

伴侣：

多抗菌挤出蛋白

MFS:

主要代理总科

MLO：

霉菌阻力位于o

nrp:

非核糖体肽合成酶

PCoA:

主坐标分析

PDR运输:

多效耐药转运体

PR蛋白:

病因相关蛋白质

pyl：

PYR1-like蛋白质

PYR蛋白质：

紫鼠抗性蛋白质

QTL:

定量特质基因座

r蛋白：

受体蛋白质

RCAR:

ABA受体的调节成分

RNA-SEQ：

RNA序列

SA：

水杨酸

SNP:

单核苷酸多态性

TPS:

萜烯合酶

UDP：

尿苷二磷酸

CSC(芬兰IT科学中心)因其丰富的计算资源而受到好评。

资金

本研究由芬兰科学院资助(中科院资助项目编号:267360、276862、278424)。资助机构在研究的设计和数据的收集、分析和解释中没有作用。

可用性数据和材料

本研究中生成的原始RNA-SEQ已在Bioproject Prjna401308下提交给NCBI SRA。

从属关系

1. 赫尔辛基大学林业林业学系林科学系。盒子27，Fin-00014，赫尔辛基，芬兰

   Andriy Kovalchuk，Zhen Zeng，Tommaso Raffaello，Mengxia Liu，Mukrimin Mukrimin，Risto Kasanen＆Fred O. Asiegbu

2. 芬兰大学（UEF），Kuopio校区环境与生物科学系，P.O.Box 1627，Fin-70211，Kuopio，芬兰

   Rajendra P. Ghimire, Minna Kivimäenpää & Jarmo K. Holopainen

3. 林业部，大学大学Hasanuddin，JLN。Perintis kemerdekaan公里。10，Makassar，90245，印度尼西亚

   Mukrimin Mukrimin

4. 中国南京林业大学林业学院，中国南方可持续林业协作创新中心，南京

   回族的太阳

5. 东芬兰大学霍恩苏校区环境与生物科学系（UEF），P.O.盒子111，Fin-80101，Joensuu，芬兰

   Riitta Julkunen-Tiitto

贡献

FOA构思了研究和研究计划，并协调了该项目。采用样品收集主要由AK，MM和RK与初始场图的FOA有帮助;ML和MM从样品中提取的RNA;AK，ZZ，TR和ML分析了RNASEQ数据;RPG，MK和JKH对萜类化合物进行了分析;RJ-T分析了酚类化合物;HS进行了PCOA和Persalova分析;AK起草了稿件。FOA，JKH和RJ-T获得资金。所有作者都阅读并批准了稿件的最终版本。

相应的作者

对应到安德烈Kovalchuk或弗雷德·o·Asiegbu．

伦理批准和同意参与

我们的采样时间与采集地点的树木采收时间一致，不需要特别批准。样本收集是在森林所有者的许可下进行的。

同意出版

不适用

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

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再版和权限