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Calrr-RLK1,一种新的RD受体样激酶甜椒并被CaHDZ27转录激活,作为正调节因子Ralstonia solanacearum电阻

摘要

背景

青枯病由Ralstonia solanacearum青枯病是世界范围内辣椒最重要的病害之一,但青枯病抗性的分子机制尚不清楚。

结果

本文报道了一种新型的RD富亮氨酸重复受体样激酶CaLRR-RLK1的功能特征R. Solanacearum..Calrr-RLK1专门针对质膜靶向,并由下调R. Solanacearum.接种(RSI)以及水杨酸(SA),茉莉酸甲酯(MEJA)或Ethephon(Eth)的外源应用。沉默Calrr-RLK1.导致辣椒植株对RSI的敏感性增强,并伴随着免疫相关基因的下调,包括CaACO1,cahir1.CaPR4CaPO2.相反,短暂的过度表达Calrr-RLK1.引发辣椒叶片超敏反应(HR)样细胞死亡和H2O2积累,锥虫蓝较暗,DAB染色较暗。此外,异位过表达Calrr-RLK1.在烟草植株中增强了抗性r . solanacearum伴随免疫相关标记基因包括NtPR2NtPR2nthsr203.NtHSR515.此外,在我们之前的研究中发现辣椒RSI反应的正调控因子CaHDZ27被转录激活Calrr-RLK1.可能以依赖于caattg的方式直接靶向其启动子。

结论

这项研究显示Calrr-RLK1.使胡椒具有抵抗力R. Solanacearum.作为CaHDZ27的直接靶标。

背景

细菌枯萎,由Ralstonia solanacearum1,是辣椒(甜椒),一个巨大的农业重要性植物。据信,应对这种疾病的最有效方法是开发作物品种,具有高水平的抗病性,更好地了解辣椒抗性的分子基础R. Solanacearum.将有利于其基因改良。

当受到病原体的攻击时,植物利用两个相互关联的免疫层来保护它们,包括病原体相关分子模式(PAMP)触发免疫(PTI)和效应体触发免疫(ETI) [23.].植物通过细胞表面定位蛋白感知来自微生物病原体的外源PAMPs,即模式识别受体(PRRs),从而产生PTI。此外,PRRs还可以通过识别内源性损伤相关分子模式(DAMPs)来激活免疫反应,这是病原体感染和感知的结果[4].适应的病原体发展效应剂,这些效应剂被分泌并注射到宿主细胞中,在那里它们通过靶向特定的信号元件来抑制PTI,主要效应剂触发敏感性(ETS) [56].PTI,也被称为基础防御,是必需的,但不足以抵抗疾病。在ETS的选择压力下,植物可能进化出特异性受体(典型的抗性(R)蛋白),以检测其效应体,从而导致ETI的产生。ETI通常伴随着超敏反应(HR)和系统获得性抗性(SAR)。尽管ETI比PTI更强大,更密集,更直接地与防御基因表达的转录调控相关,但在PTI和ETI之间已经发现了下游分子事件的重叠[7].

富含亮氨酸的重复受体样蛋白激酶(LRR-RLK)是典型的植物细胞表面局部PRR,它们含有多达30个富含亮氨酸的重复(LRRS)的细胞外结构域,以感知包括小分子,肽和整体的配体蛋白质[89],一个TMD(跨膜结构域),用于细胞膜靶向,一个胞内丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶结构域磷酸化特定底物,用于信号转导。大约223个LRR-RLKs拟南芥1011],226 in玉米12,西红柿[13],379在人口众多[14],303 in芸苔属植物拉伯15, 188胡椒[16]已被确定。一些LRR-RLK涉及调节植物先天免疫力[171819].例如,一个研究充分的PRR LAGELLIN SENSITIVE 2 (FLS2)识别并结合细菌鞭毛蛋白的22氨基酸表位flg22 [20.21].在感知FLG22后,FLS2与另一LRR-RLK,BRI1相关受体激酶1(BAK1)相互作用[2223,并通过与受体样胞质激酶(RLCK), BOTRYTIS-INDUCED kinase 1 (BIK1)的结合使NADPH氧化酶RbohD磷酸化[2425],导致钙突发和反应性氧(ROS)生产,从而安装粘合触发的免疫(PTI)。通过感测和结合衍生自病原体的AX21,XA21将广谱抗性赋予由病原体引起的细菌疾病黄oryzaepv。oryzaeXoo语)[2627].此外,LRR-RLKs可能参与其他生物过程,如植物的生长、发育和对非生物胁迫的响应[28].例如,Clavata1(CLV1)决定了拍摄和花卉公司尺寸拟南芥29].OsGIRL1-overexpressing转基因拟南芥植物响应于盐胁迫和热应激,或响应于γ射线处理和渗透胁迫而过敏的过敏[30.].然而,LRR-RLKs家族在不同植物中的大部分成员仍未被识别。特别是,迄今为止,在辣椒应答过程中还没有发现LRR-RLK的功能特征r . solanacearum。

PTI和ETI的一个关键步骤是由各种转录因子决定的大量转录重编程。通过整合信号起始并沿着信号通路将其传递到包括PRRs, R蛋白和其他信号成分在内的许多防御相关基因的适当转录中[313233,转录因子在植物免疫调节中起重要作用[3435363738].HD-ZIP转录因子,其特征在于两个保守的结构域,DNA结合的同性恋(HD)和相邻的亮氨酸拉链(LZ)基序是植物的独特[39].HD-Zip蛋白根据其保守的HD-Zip结构域、基因结构和额外的保守基序分为4个亚家族(I-IV) [40].据报道,I成员据报道,响应环境条件而发挥基本作用[4142].辣椒中的HD-Zip I蛋白CaHDZ27此前被发现在植物免疫中起正调控作用R. Solanacearum.通过形成同型二聚体[42].但是,如何阐明与上游信令组件连接的CAHDZ27。

在本研究中,推测辣椒的LRR-RLK基因Calrr-RLK1.哪个是通过接种而上调的R. Solanacearum.在功能性上表现出免疫,并确定其通过CaHDZ27的转录调节。结果表明Calrr-RLK1.作为辣椒响应的阳性调节剂,启动子Calrr-RLK1.在辣椒对RSI的反应中,它被CaHDZ27以假opalindromic DNA (CAATTATTG)依赖的方式靶向,并被CaHDZ27上调。

结果

分离和序列分析Calrr-RLK1.

辣椒中的推定的LRR-RLK基因最初被识别为辣椒植物的上调挑战R. Solanacearum.在我们以前的基因差异表达通过CDNA-AFLP(cDNA扩增的碎片长度多态性)显示。对于cDNA-AFLP分析,64个引物对用于选择性PCR扩增,得到总共400种转录物衍生片段(TDF)。其中,接种后,114显示了改变的表达模式R. Solanacearum.,其中上调35例,下调79例。利用辣椒基因组序列(http://peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp.jsp.jsp.).基因产物指定Calrr-RLK1.(GenBank登录号:XP_016560889)因为它代表了Pepper的LRR-RLK的第一个报告。全长互补DNA(cDNA)序列Calrr-RLK1.通过PCR克隆与特定的一对引物。通过序列分析,CDNA含有长度为2955 bps的开放读数框架(ORF),其推导的氨基酸序列的长度为984AA,含有N-末端信号肽的预测细胞外区域(SP,残基1-25),LRR_NT2(富含亮氨酸的重复N-末端结构域(残留物24-66),21个细胞外亮氨酸的重复(LRRS,残基96-596),跨膜结构域(TMD,残基626-648)和激酶结构域(残留物684-946)(图。1一个)。

图1
图1

推导的CaLRR-RLK1氨基酸序列分析。一个CaLRR-RLK1蛋白结构域示意图。bcalrr - rlk1蛋白激酶亚结构域与来自的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶亚结构域的比较Ipomoea nil.(XP_019195246),木薯耐(XP_021632827),石榴(OWM66138),胡麻属indicum(XP_011073656),Helianthus Annuus.(XP_021998473),Solanum lycopersicum(XP_004231961),茄属植物tuberosum(XP_006357742),Solanum Pennellii.(XP_015067035),烟草的抗旱性(XP_009804629),尼科尼亚塔哈瓦姆(XP_016449272),Nicotiana tomentosiformis.(XP_009618480)和Coffea Canephora.(CDP02659)

该激酶结构域与其他RLK蛋白具有高序列同源性(图)。1b).保守活性位点特征基序(VHRDVKSNNILLD残基)和G-T/S-XX-Y/F-X-APE基序[43]表明Calrr-RLK1是Ser / Thr激酶而不是Tyr激酶。此外,Calrr-RLK1似乎是RD型蛋白激酶,因为它在其激酶子域中含有保守的精氨酸 - 天冬氨酸基序[4].

基于CaLRR-RLK1的氨基酸序列及其在其他植物中的亲缘关系进行系统发育树分析。结果表明,CaLRR-RLK1属于具有茄属植物tuberosumLRR-RLK (XP_006357742),Solanum lycopersicumLRR-RLK (XP_004231961)和Solanum Pennellii.LRR-RLK (XP_015067035)(附加文件1:图S1)。

的表达Calrr-RLK1.由...介绍R. Solanacearum.或外源激素

确定的可诱导表达Calrr-RLK1.在胡椒植物反对R. Solanacearum.接种我们通过QRT-PCR分析检测到辣椒叶中的转录水平。结果表明,转录水平Calrr-RLK1.在12 ~ 48 h接种R. Solanacearum.与模拟处理相比(图。2一种)

图2
图2.

的转录Calrr-RLK1.在胡椒叶中接种R. Solanacearum.以及外源施用茉莉酸甲酯(MeJA)、乙烯利(ETH)或水杨酸(SA)。一个QRT-PCR分析转录水平Calrr-RLK1.在胡椒叶挑战R. Solanacearum.与模拟处理相比。b-d相对转录水平Calrr-RLK1.SA、MeJA和ETH处理后辣椒叶片中基因的表达。值为平均值±标准误差(n = 6).Asterisks (P< 0.05)表示经学生分析有显著差异t-测试

SA,JA和ET是参与植物免疫调节的信号分子[44454647].来证实这个结果Calrr-RLK1.是由RSI诱导的,Calrr-RLK1.通过QRT-PCR测量用外源性外源性应用处理的辣椒植物。结果表明,转录水平Calrr-RLK1.在施用MeJA后6 h (hpa)达到峰值。2B),随后在12-48 hpa逐渐减弱。如果申请ETH,则Calrr-RLK1.转录本丰度早在3 hpa就被诱导(图。2c).同样,最大转录量出现在SA的3 hpa时,然后在12 hpa时下降到基础水平(图)。2这些结果表明Calrr-RLK1.参与胡椒防御吗R. Solanacearum.由Sa,Ja和Et介导的信号传导调节。

CaLRR-RLK1的亚细胞定位

为了研究CALRR-RLK1的亚细胞定位,我们将CALRR-RLK1的全长ORF融合,没有终止密码子至5'末端的绿色荧光蛋白(GFP),产生35个年代CaLRR-RLK1-GFP构造,使用35个年代绿色荧光蛋白35个年代CBL1n-RFP(特别针对质膜)[48)控制。agro-infiltration,CaLRR-RLK1-GFPCBL1n-RFP要么绿色荧光蛋白CBL1n-RFP短暂的共同过度表达烟草benthamiana叶子。结果显示,CaLRR-RLK1-GFP的绿色荧光信号与质膜上的红色荧光信号完全重叠,而对照GFP则遍布整个细胞(图2)。3.),表明CaLRR-RLK1在质膜中的定位。

图3
图3.

Calrr-RLK1的亚细胞定位通过在叶片细胞中的农业渗透烟草benthamiana叶子。瞬时共过表达CBL1n-RFP和calrr - rlk1 -GFP或GFPn benthamiana叶子。使用共聚焦显微镜检测荧光。GFP,绿色荧光蛋白;RFP,红色荧光蛋白。条=50μm

Calrr-RLK1.辣椒的沉默增强了对R. Solanacearum.

进一步分析可能的作用Calrr-RLK1.在辣椒对RSI的反应中,采用病毒诱导基因沉默(VIGS)方法研究了沉默对辣椒RSI的影响Calrr-RLK1.辣椒对RSI的抗性。全长182 bps的片段在3 ' -UTR区域内Calrr-RLK1.被克隆到pTRV2载体中导致TRV.Calrr-RLK1.(使用TRV.00作为一个控制)。的农杆菌属GV3101细胞窝藏TRV.Calrr-RLK1.渗透到12 ~ 14日龄辣椒植株子叶中,TRV.利用辣椒植株监测基因沉默过程。当幼苗生长约25天时,植物渗透TRV.在新出现的叶子中表现出漂白表型TRV.00TRV.Calrr-RLK1.对辣椒进行了接种r . solanacearum以及他们的转录水平Calrr-RLK1.采用qRT-PCR方法,随机选取6TRV.Calrr-RLK1.检测辣椒植株的沉默效率Calrr-RLK1..结果表明转录水平TRV.Calrr-RLK1.R. Solanacearum.接种或模拟处理的植株约为对照植株的20-30% (TRV.00植物(图)。4A),表示成功Calrr-RLK1.用VIGS对辣椒植株进行沉默

图4
图4.

沉默Calrr-RLK1.增强辣椒植株对RSI的敏感性。一个的效率Calrr-RLK1.采用qRT-PCR检测TRV.Calrr-RLK1.TRV.00植物受到r.solanacearum。b10 dpi辣椒植株的病状R. Solanacearum.c疾病指数R. Solanacearum.每天使用0〜4的等级进行14天进行评估。至少有50种植物接种R. Solanacearum.通过根灌溉TRV.Calrr-RLK1.要么TRV.00植物。所示结果是三个独立实验的方法,每种植物有10个TRV.Calrr-RLK1.要么TRV.00,柱状图表示平均值的标准误差。d的增长R. Solanacearum.在茎的TRV:Calrr-RLK1TRV.00在接种后9天的植物R. Solanacearum.由根灌溉。e的增长R. Solanacearum.叶子的TRV:Calrr-RLK1TRV.00植物在叶片接种后3天R. Solanacearum.f叶片中防御相关基因的相对转录水平TRV.Calrr-RLK1.TRV.00植物。在一个def,值是平均值±标准误差(n = 6)。星号(P< 0.05)表示经学生分析有显著差异t-测试

与之Calrr-RLK1.通过qRT-PCR分别验证了对辣椒植株的沉默效果Calrr-RLK1.测定了辣椒对RSI免疫的沉默。所有的Calrr-RLK1.与对照相比,沉默的辣椒植株没有任何形态变化。接种R. Solanacearum.通过根灌溉,TRV.Calrr-RLK1.与对照植物相比,植物显示出对RSI的显着增强的易感性(图。4b)。接种后6天后(DPI),TRV.Calrr-RLK1.植物呈现出更高的疾病指数比对照。TRV.Calrr-RLK1.植物在6 dpi中开始显示细菌枯萎的症状,并在12 dpi中彻底枯萎的表型,而对照植物并未开始显示细菌枯萎病症,直到7 dpi并完全枯萎,直到14 dpi直到14 dpi(图。4c)。始终如一地,人口密度较高R. Solanacearum.被检测到茎TRV.Calrr-RLK1.通过根灌溉在9 dpi处植物(图。4D)和也在R. Solanacearum.以3dpi接种叶片(图。4E),与控制植物相比。

进一步调查是否沉默Calrr-RLK1.影响辣椒中免疫相关基因的表达,进行QRT-PCR分析。结果表明,HR的表达相关cahir1.49), ROS detoxification-associatedCaPO250],et-enveryiveACC.氧化酶基因Caaco1.51, JA/ET信号相关CaPR452]明显下调Calrr-RLK1.与RSI挑战的对照植物相比,沉默的叶子相比。然而,SA信号相关的转录水平没有显着差异CaPR153),CaNPR154] (图。4F)。这些结果表明沉默Calrr-RLK1.增加辣椒植物对RSI的易感性

交通工具的表达Calrr-RLK1.触发HR细胞死亡,诱导免疫相关基因转录

确认由Vigs的基因沉默的结果,Calrr-RLK1.通过农业渗透瞬时过表达。含35S的GV3101细胞:HA-CaLRR-RLK1或35s:,通过qRT-PCR验证了瞬时过表达的成功。5a)或HA抗体免疫印迹(附加文件)2:图S2)。锥虫蓝染色较暗,DAB染色较暗Calrr-RLK1.瞬时过度抑制辣椒围绕渗透部位叶,而在对照植物叶中没有检测到这种较深的染色(35s:),表明通过瞬态过度表达触发HR细胞死亡和H2O2积累Calrr-RLK1.(无花果。5b)一致地,还检测到显著增强的电解质泄漏Calrr-RLK1.在浸渍48和72 h后,辣椒叶片的瞬时过表达量与对照相比(图2)。5c)。

图5
图5.

瞬态超表达的Calrr-RLK1.触发了辣椒叶的HR模拟细胞死亡一个的转录水平Calrr-RLK1.在QRT-PCR检测到的辣椒叶中。b台盼蓝和DAB染色瞬时表达Calrr-RLK1.在浸润后48小时。c叶片漏光的电解质泄漏Calrr-RLK1.短暂过度表达的胡椒叶子。d检测免疫相关基因的转录水平Calrr-RLK1.辣椒叶片瞬时过表达的qRT-PCR方法在一个cd,值是平均值±标准误差(n = 6)。星号(P< 0.05)表示经学生分析有显著差异t-测试

使用定量RT-PCR分析来研究是否瞬态表达Calrr-RLK1.影响防御相关基因包括CaACO1,cahir1.CaPR4CaPO2, CaNPR1CaPR1在胡椒树叶。结果表明CaACO1,cahir1.CaPR4CaPO2表现出增强的转录水平Calrr-RLK1.与控制中的转录水平相比,瞬时过度抑制辣椒叶48 HPICaNPR1CaPR1没有改变(图。5d)。

异位的超Calrr-RLK1.增强烟草植株对RSI的抗性

为了进一步证实,Calrr-RLK1作为植物免疫力阳性调节剂的结果,我们通过开发转基因烟草线通过通过开发转基因烟草线来研究其异位过度表达对烟草植物抗性的影响农杆菌属调节方法。6个转基因株系(T3.)通过Kanamycin抗性分析确认至少10种幼苗。使用两条线来测定转录表达Calrr-RLK1,幼苗被接种R. Solanacearum.细胞。RT-PCR结果表明Calrr-RLK1.以两行(#2和#8)的叶子组成表示(附加文件3.:图S3)。

接种了8周龄烟草植株R. Solanacearum.用根灌法监测青枯病症状的发展。在7 dpi时,野生型植株的茎部出现萎蔫和感染症状,而野生型植株的茎部没有明显的症状Calrr-RLK1.overexpressing行(无花果。6a)在21 dpi时,野生型植株表现出非常严重的萎蔫症状,而野生型植株仅表现出轻微的萎蔫症状Calrr-RLK1.overexpressing行(无花果。6b)。在28 dpi,在野生型植物中发现显着的较高的死亡率(76.1%),比两条线的植物分别为36.5和51.1%(图。6c)。

图6
图6.

异位的超Calrr-RLK1.增强烟草植物对RSI的电阻。一个野生型与野生型茎部症状比较Calrr-RLK1.7 dpi过度表达线r . solanacearum。b青枯病苗期萎蔫症状比较Calrr-RLK1.过表达系和野生型在21 dpi。c在28 dpi时死亡植株的百分比R. Solanacearum.由根灌溉。数据来自每个株系至少10株。进行了三个独立的实验。柱状图代表平均值的标准误差。d免疫相关基因的相对转录水平Calrr-RLK1.过表达品系和野生型在48 h后接种R. Solanacearum..值为平均值±标准误差(n= 3)。星号(P< 0.05)表示经学生分析有显著差异t-测试

此外,免疫相关基因的转录水平,包括sa诱导的发病相关NtPR255),NtPR356],HR相关nthsr201.NtHSR51557],采用qRT-PCR检测Calrr-RLK1.过表达系和野生型,结果表明转录水平NtPR2NtPR3nthsr201.NtHSR515与野生型植物相比,转基因植物中的增加响应于R. Solanacearum.感染(图。6d)。

启动子的Calrr-RLK1.被CaHDZ27直接结合和转录调控

沉默Calrr-RLK1.吞吐辣椒对RSI的抗性,而其过度表达增强了胡椒或烟草的阻力至RSI。因此,RSI在挑战下的诱导表达对于其作为阳性调节剂的作用至关重要。为了研究这种诱导表达的潜在的分子机制,独联体-元素的启动子区域Calrr-RLK1.1574 bps的长度进行了分析(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/).值得注意的是,一个9 bp的伪opalindromic DNA序列(CAATTATTG)可能被HD-Zip转录因子结合[4258发现,发现存在于启动子中(图。7一个)。由于我们以前的研究发现,CAHDZ27,HD-ZIP I转录因子作用于CAPPER对RSI的持续反应,我们推测CAHDZ27可能充当上游调节器Calrr-RLK1.通过将MOTIF CAATTATTG与其启动子结合。测试是否是这种情况,我们使用染色质免疫沉淀(芯片)测定通过HA-CaHDZ27在辣椒叶片中瞬时过表达,从辣椒叶片中分离得到染色质HA-CaHDZ27瞬时过度抑制胡椒叶与1%甲醛交联后,剪切成300-500bp的片段,通过HA的抗体,将去交联和纯化的DNA片段作为QRT的模板免疫沉淀到CaHDZ27的片段。基于序列的序列(CAATTATTG)在启动子的序列中具有特异性引物对的PCRCalrr-RLK1.,结果表明Calrr-RLK1.CaHDZ27显著地丰富了R. Solanacearum., CaHDZ27结合富集明显增加(图。7b),表明CaHDZ27与的启动子结合Calrr-RLK1.可能通过主题caattattg。

图7
图7.

CaHDZ27可以结合CAATTATTG基序在启动子中Calrr-RLK1.andactivateCalrr-RLK1.转录。一个方案Calrr-RLK1.ChIP-qPCR检测的启动子区域、引物用箭头标记。b利用含有该motif区域的特异性引物(CAATTATTG)进行ChIP-qPCR检测。c的转录水平Calrr-RLK1.HA-CAHDZ27-SRDX要么HA-CaHDZ27短暂过度表达的胡椒叶子。d的转录水平Calrr-RLK1.CaHDZ2沉默的叶子受到挑战R. Solanacearum.eGUS活性由启动子驱动Calrr-RLK1.在瞬时过度表达时进行测定HA-CAHDZ27-SRDX要么HA-CaHDZ27在胡椒树叶。fGUS酶活性由pCalrr-RLK1.要么pcalrr-rlk1mut,其中CA取代CAATAATTG段勇TTG,当与HA-CaHDZ27在胡椒树叶。在bce,数值为平均值±标准误差(n = 3),不同的字母表示显著差异,由LSD检验(P< 0.05)。在df,星号表示根据学生的不同有显著差异t考试P < 0.05

分析如果Calrr-RLK1.通过CAHDZ27转录调节,我们进行了瞬态过度表达HA-CaHDZ27在辣椒叶中通过GV3101细胞浸润35HA-CaHDZ27要么35个年代,农业渗透后2天,转录水平Calrr-RLK1.采用qRT-PCR检测。结果表明Calrr-RLK1.在患有叶子渗透的叶子上调35 s: HA-CaHDZ27,并没有在叶子渗透的叶子下调35个年代HA-CAHDZ27-SRDX的一种阻遏物HA-CAHDZ27),相比之下,35 s:哈(无花果。7此外,我们沉默了CaHDZ27用VIGS检测辣椒植株的转录水平Calrr-RLK1.CaHDZ27 -通过qRT-PCR检测沉默的植株,结果表明Calrr-RLK1.减少TRV.CaHDZ27个胡椒叶R. Solanacearum.与控制中的接种相比(TRV.00植物(图)。7d)提供额外的证据证明Calrr-RLK1.的启动子CaHDZ27激活Calrr-RLK1.克隆并插入pMDC163 [59]获得构造PCALRR-RLK1格斯.GV3101细胞含有PCALRR-RLK1格斯混合了35 s: HA-CaHDZ2735S:HA-CAHDZ27-SRDX要么35 s:哈以1:1的比例,渗透到胡椒叶中。在2 dpi下测定了GUS酶活性,结果表明,GUS酶活性增强HA-CaHDZ27短暂过表达,而不减少HA-CAHDZ27-SRDX与对照叶片相比(图。7e),始终如一的QRT-PCR结果。这些结果表明Calrr-RLK1.是由CaHDZ27激活的吗

进一步确定转录激活Calrr-RLK1.CaHDZ27是通过启动子内的CAATTATTG基序CaHDZ27我们改变了独联体-作用元件(CAGGGGTTG)的启动子区域Calrr-RLK1.,并导致构建pCaLRR-RLK1mut格斯。GV3101细胞包含PCALRR-RLK1格斯要么pCaLRR-RLK1mut:格斯混合了35个年代HA-CaHDZ27并合并到叶子中n benthamiana.浸液48或72 h后测定GUS活性。结果表明,共同表达的叶片中GUS活性明显升高PCALRR-RLK1格斯35个年代HA-CaHDZ27pCaLRR-RLK1mut格斯35个年代HA-CaHDZ27共表达的辣椒叶(图。7f).综上所述,这些数据支持CaHDZ27激活的转录的观点Calrr-RLK1.通过直接结合到caattg基序。

讨论

CaLRR-RLK1在辣椒免疫中起积极作用

细菌性青枯病由R. Solanacearum.造成辣椒的严重损失,而辣椒是一种在世界范围内具有重要农业意义的蔬菜。在本研究中,我们的数据表明Calrr-RLK1.对辣椒免疫起积极调节作用R. Solanacearum.它直接由CaHDZ27转录调节。

根据胞外结构域的序列基序,典型的RLKs可分为21个以上的亚科[11].到目前为止,包括CaRLK1在内的三种RLKs [606162],capik11 [63646566)和CaLecRK-S。5 (67]在辣椒上有功能表征。与本研究中的Calrr-RLK1一样,Carlk1含有细胞质激酶结构域,跨膜跨度和细胞外结构域,其显示出与其他已知植物RLK具有低同源性的细胞外结构域。它在细胞死亡中起作用[62,抗缺氧[61细胞分裂[60].Capik1以SA依赖方式作为防御反应和细胞死亡的正调节因子[6566].L型凝集素受体Kinase Calecrk-S.5积极介导辣椒的宽谱抗性[67].然而,目前还没有发现辣椒LRR-RLK在植物免疫中的功能特征。

CaLRR-RLK1包含一个n端信号肽的细胞外区域,21个富含亮氨酸的细胞外重复序列,一个跨膜结构域和一个细胞内激酶结构域。由于CaLRR-RLK1在其激酶亚结构域中含有一个保守的精氨酸-天冬氨酸基序,因此它似乎是RD丝氨酸/苏氨酸激酶。与跨膜结构域一致,CaLRR-RLK1只定位于质膜。CaLRR-RLK1作为正调控因子的直接证据来自以下数据Calrr-RLK1.VIGS沉默显著降低了辣椒植株对RSI的抗性,下调了免疫相关基因。相比之下,短暂的过度表达Calrr-RLK1.显著增强了HR细胞死亡,这在ETI中经常出现,在PTI中偶尔出现[68], H2O2的积累,DAB染色表现为H2O2的积累,与HR细胞死亡密切相关[69[和测试的免疫相关标记基因的诱导。来自辣椒植物的这些数据表明Calrr-RLK1作为辣椒免疫反对RSI的阳性调节剂的作用,并且通过来自烟草植物的Calrr-RLK1的异位表达的数据进一步支持。过度表达Calrr-RLK1.显着提高了烟草植物对RSI的抵抗力,伴随着所述免疫相关标记基因的显着上下规定,包括NtPR255],ntpr3 [56],nthsr201.NtHSR51557].

根据激酶域中的RD基序分类为RD激酶和非RD激酶[70].到目前为止,研究充分的LRR-RLK PRRs,如FLS2或Xa21 [7172,在抗病过程中识别外源性PAMPs为非rd激酶[70].特征植物的DAMP受体均含有RD激酶结构域[4].例如,PEPR1 / 2和RLK7通过感知ATPEP1的感知涉及激活PTI对病原体的激活[7374]及PIP1 [75] 在拟南芥, 分别。作为含有RLK的RD激酶结构域,我们推测CALRR-RLK1可能充当辣椒防御反应中未识别的潮湿的受体R. Solanacearum.

表达Calrr-RLK1.被CaHDZ27直接结合其启动子中的CAATTATTG基序激活

我们的数据表示诱导型表达Calrr-RLK1.上的挑战r . solanacearum这种增强的表达可能对防御信号的深刻放大,以避免构成性免疫反应的负面影响至关重要。一些PRRs,如FLS276和R基因最后77]在病原体攻击时表现出诱导表达。探讨上调的机制Calrr-RLK1.RSI的上游转录因子被鉴定。我们的数据显示,CaHDZ27是一种HD-Zip蛋白,在辣椒抵抗中起正调控作用R. Solanacearum.42,直接针对的发起人Calrr-RLK1.,并激活表达式Calrr-RLK1.在一个motif CAATAATTG依赖方式。类似于CaHDZ2742],转录Calrr-RLK1.外源SA、MeJA和ETH的表达也上调,说明CaHDZ27和Calrr-RLK1.在辣椒对RSI反应期间,作为植物免疫的阳性调节剂。Calrr-RLK1包含21 LRR在细胞外结构域中。虽然LRRS的配体未知,但Calrr-RLK1可以通过与配体结合的这些LRR域在胡椒防御信号通路中发挥作用,并且由转录因子CaHDZ27引起的增强表达有利于胡椒抗性R. Solanacearum.

结论

本研究的数据表明Calrr-RLK1.被诱发了R. Solanacearum.接种或外施SA、MeJA或ETH。抑制其在辣椒中的表达破坏了植物的防御能力R. Solanacearum.感染。辣椒叶中该基因的转运表达可导致细胞死亡,并且这种基因的过表达使转基因烟草植物具有增加的疾病耐受性。此外,表达Calrr-RLK1.是由CaHDZ27以假假蛋白DNA (CAATTATTG)依赖方式激活的。实验证据表明,CaLRR-RLK1在辣椒应答中起正调控作用R. Solanacearum.它被CaHDZ27转录激活。

方法

植物材料和生长条件

胡椒(甜椒栽培品种L.CV。FJ8),具有中等阻力r . solanacearum来自福建农林大学辣椒育种组。烟草(尼科尼亚塔哈瓦姆l .简历。宏华达金源欧洲省福建农业和林业大学烟草繁殖集团提供。植物在26℃温度,60%相对湿度的条件下生长,60-70μmol光子M−2年代−1亮16小时/暗8小时。

病原体接种

强毒株FJC100301和FJ1003R. Solanacearum.分别来自辣椒和烟草。按照前面介绍的方法扩增病原体菌株[78].的R. Solanacearum.菌株在PSA培养基中生长(200g / L的马铃薯,20克/升蔗糖,3g / L牛肉提取物,5g / L的胰蛋白酶)。用无菌DDH收获细菌2O,重新悬浮至1.0 × 108 CFU/ mL. Seedlings were root inoculated by pouring either 30 mL bacterial inoculum or sterile ddH2o作为每个锅里的嘲弄。在接种之前,通过在每个罐的土壤中制造孔来损坏根部。对于叶片接种,八叶阶段顶部的第三叶八叶阶段的渗透植物的渗透用10μlR. Solanacearum.用无针注射器进行悬浮液,用无菌ddH进行模拟治疗2O。

外源激素治疗

用6株叶期辣椒植株进行基因表达研究。对于水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)和乙烯利(ETH)处理,在辣椒叶片上喷施1 mM SA、100 μM MeJA和100 μM ETH;在平行实验中,以相应的溶剂或无菌水作为对照。在不同时间点采集辣椒叶片,冷冻保存于−80°C,用于RNA分离。

亚细胞定位

的开放阅读框(ORF)Calrr-RLK1.从植株cDNA中PCR扩增出无终止密码子的片段,克隆到pMDC83中获得35个年代Calrr-RLK1-GFP。农杆菌肿瘤术菌株GV3101含有该结构体35个年代CaLRR-RLK1-GFP要么35个年代绿色荧光蛋白(作为对照)再次悬浮(OD600 = 0.8) in the induction medium (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 200 μM乙酰丁香酮,pH 5.6)烟草benthamiana。渗透后2天后,使用激光扫描共聚焦显微镜(TCS SP8,Leica,Solms,Germany)对GFP荧光进行成像,其激发波长为488nm和505-530nm带通发射过滤器。

辣椒植物中的胜利

如前所述,进行了基于TRV(烟草响尾蛇病毒)的VIGS分析[42].182-BP基因特异性3'未转换区域Calrr-RLK1.被插入到TRV2载体中来产生pTRV2Calrr-RLK1.采用网关克隆技术。TRV1和TRV2.00(控制)或pTRV2Calrr-RLK1.将GV3101将GV3101共渗透到完全膨胀的辣椒植物的完全膨胀的子叶中。然后,将幼苗在16℃温育56小时,并在26℃下生长。

农杆菌属-介导的辣椒叶片瞬时表达

的全长cDNACalrr-RLK1.要么CaHDZ27被克隆到PearleyGate201中以获得35个年代-Calrr-RLK1.建造或者35个年代-CaHDZ27采用网关克隆技术。的CaHDZ27显性压抑构念(35个年代HA-CAHDZ27-SRDX)是通过融合来创造的CaHDZ27框架中的cDNA与显性耳压序列[79],它在35s启动子的下游连接到载体PearleyGate201中。

将含上上述载体的菌株Gv3101使用没有针的注射器渗透到八叶阶段的胡椒叶中。在渗透后48或72小时后,收获注入的叶片以进一步使用。

组织化学染色及离子电导率测定

二氨基苯甲酸(DAB)和台盼蓝染色,以及根据先前描述的方法进行离子电导率测量测定[5178].收获细菌渗透叶并在1mg ml中孵育−1用乳酸/甘油/乙醇(1:1:3)用乳酸/甘油/乙醇饮用为了使细胞死亡可视化,渗透叶用耳蛋白蓝染色并用氯水合物溶液饮用。通过离子电导率测量量化细胞死亡,切除八个圆盘(直径为11mm)并在无菌DDH中洗涤2O.在20 mL双蒸馏水中轻轻摇匀培养3小时后,使用梅特勒托莱多326(梅特勒,苏黎世,瑞士)测量离子电导率。

实时定量rt - pcr

对于定量实时PCR分析,使用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,Ca)提取来自植物叶中的总RNA。使用一步Primescript TM cDNA合成试剂盒(Takara,Shigo,Japan)合成第一链cDNA。实时PCR实验是根据制造商的Bio-RAD实时PCR系统(Foster City,CA,USA)和Sybr Premix EXQ II系统(Takara)的说明进行。标准化转录水平,辣椒CaActin(GQ339766)或18S核糖体RNA(EF564281)和烟草ntef1α.(D63396)或NtActin(U60489)在每种反应中监测表达作为参考基因。用于定量实时RT-PCR分析的基因特异性引物在附加文件中列出4:表S1和表S2。根据三种实验重复计算每个基因表达,以确保结果的再现性。

ChIP-qPCR分析

ChIP-qPCR检测基本如前所述[51].简单地说,从辣椒叶中分离出染色质35个年代-CaHDZ27.分离的染色质与1%甲醛,剪切的交联并使用抗HA沉淀。通过定量实时PCR分析DNA样品的富集。将每个芯片值标准化为其各自的输入DNA值。

β-葡萄糖苷酶(GUS)酶学分析

Calrr-RLK1.将启动子或其突变克隆到PMDC163中以产生PCALRR-RLK1格斯要么pCaLRR-RLK1mut格斯构造。冻植物收集树叶的瞬变改变了胡椒粉,地面用杵在提取缓冲(50 mM磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,10毫米EDTA, 0.1% Triton x - 100, 0.1%月桂醇肌氨酸钠盐,和10毫米β巯基乙醇)和离心机在4°C 11000 g 10分钟。采用Bradford法定量测定上清液中的可溶性粗蛋白[80].用4-甲基umb蛋糖-D-葡糖酸(4-Mug)为基质测量GUS活性的定量分析[54].

植物转化

的全长cDNACalrr-RLK1.被克隆到植物二元载体pk7wg2以产生35个年代Calrr-RLK1.构造。农杆菌属-介导烟草转化(尼科尼亚塔哈瓦姆l .简历。Honghuadajinyuan)。在含有50 μg mL的Murashige和Skoog (MS)琼脂平板上筛选转化子−1卡那霉素。通过RT-PCR证实转化成功Calrr-RLK1.gene-specific引物。在筛选出的转基因植株中,选用T2品系#2和#8。

缩写

芯片:

染色质免疫沉淀反应

指数:

Effector-triggered免疫力

美国教育考试服务中心:

效应器引发敏感

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

hpa:

H后申请

LRR-RLK:

富氨酸富含重复受体样激酶

non-RD:

非精氨酸 - 天冬氨酸

子:

开放阅读框

PAMP:

其分子模式

PTI:

PAMP-triggered免疫力

肢体重复性劳损症:

Ralstonia solanacearum接种

特别行政区:

系统获得性耐药

战区导弹防御系统:

转移膜域

伟大的人:

病毒诱导的基因沉默

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下载参考

确认

我们感谢Mark D. Curtis提供的Gateway目的载体和耶鲁大学的S. P. Dinesh-Kumar博士提供的pTRV1和pTRV2载体。

资金

来自中国国家自然科学基金的补助金(31301254,31601761,31401890,31401312和31260482)和福建省自然科学基金(2018 J01616)的自然科学基金支持这项工作。该资助者没有参与研究的设计,数据收集和分析以及写作稿件。

可用性数据和材料

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本文(及其附加文件)中4).

作者信息

从属关系

贡献

SM和SH构思和设计了这项研究。SM、FG、LS、SY和WH进行实验。WC进行了数据分析。YW帮助获得了转基因烟草株系。SH和YW对该步道的设计、文章的撰写和修改作了重点评述。SM和SH写了这篇文章。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应于杨吴要么树林他

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

附加文件

附加文件1:

图S1。CaLRR-RLK1与其他植物LRR-RLKs的系统发育关系。MEGA 4.0构建了一个无根邻居连接树。(TIF 30 kb)

附加文件2:

图S2。免疫印迹法检测辣椒叶片中HA-CaLRR-RLK1瞬时过表达。(TIF 36 kb)

附加文件3:

图S3。表达Calrr-RLK1.在代表性的T.3.通过RT-PCR检查转基因烟草植物。野生型(WT)烟草植物作为空白控制,ntef1α.用作内源性控制。(TIF 21 KB)

附加文件4:

表S1。本研究利用辣椒引物进行qPCR。表S2。本研究中用于QPCR的烟草引物。表S3。这些实验中用到的引物。(多克斯21 kb)

权利和权限

开放获取本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)如果您向原始作者和源给出适当的信用,则允许在任何介质中进行不受限制的使用,分发和再现,提供指向Creative Commons许可证的链接,并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除非另有说明,否则适用于本文中提供的数据。

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牟胜,高芳,沈林。et al。Calrr-RLK1,一种新的RD受体样激酶甜椒并被CaHDZ27转录激活,作为正调节因子Ralstonia solanacearum反抗。BMC植物杂志19,28(2019)。https://doi.org/10.1186/s12870-018-1609-6

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关键字

  • Calrr-RLK1.
  • CaHDZ27
  • 胡椒
  • Ralstonia solanacearum
  • 植物免疫