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陆地棉的转录组和生化分析(陆地棉)和染色体段替代系g .分子×g .取得作为对黄萎病dahliae感染

摘要

背景

黄萎病(Verticillium wilt, VW)又称“棉花癌”,是全球棉花生产中最具破坏性的病害之一,严重影响纤维产量和质量。尽管进行了多次尝试,但在提高陆地棉抗大众性方面仍未取得重大进展。染色体片段替代系(CSSLs)的发育陆地棉×g .取得已成为一种同时培育高产、优质纤维、抗虫性棉花新品种的手段。

结果

在这项研究中,首先在人工温室、自然田野和患病苗圃条件下进行了抗vw的调查,结果鉴定出一种稳定抗vw的CSSL MBI8255和一种vw易感株g .分子随后,在V991感染期间(接种后0、1和2天),对其进行生化测试和转录组测序。采集18份根样,重复3次,进行酶活性和生化物质含量的多重比较。结果表明,大众抗性与过氧化物酶和多酚氧化酶活性呈正相关,与丙二醛含量呈负相关。此外,对同一根样品进行RNA测序,共得到77,412个基因,其中23,180个差异表达基因是通过样品间的多次比较确定的。通过基因本体论和京都基因与基因组百科(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)对Short Time-series expression Miner识别的表达谱进行富集分析,我们发现生物过程中的代谢过程以及苯丙烷生物合成和植物激素信号转导通路显著参与了对VW的响应。基因功能注释和表达量分析表明,苯丙烷代谢途径和氧化还原过程在应对VW中的重要作用,也提供了大量与植物抗性相关的候选基因。

结论

本研究通过比较抗vw的CSSL及其易感染vw的复发亲本,集中于对V991感染的初步反应。我们的发现不仅有助于培育高产、高性能的抗病新品种,而且拓宽了我们对棉花抗VW机制的认识。

背景

棉花作为最重要的经济作物之一,是全球种植最广泛的纤维植物,具有重要的经济和社会意义[1].尽管由46个二倍体(2n = 2x = 26)和5个异体四倍体(2n = 4x = 52)物种组成,但只有4Gossypium物种被广泛栽培,即,g . arboreumg . herbaceumg .,而且g .取得2陆地棉是主要的异体四倍体棉花品种(g .分子)及海岛棉(g .取得)贡献了95%以上的纤维容量,它们起源于两者之间的杂交事件g . arboreum(一个tsub-genome)和g . raimondii就(Dt亚基因组)1 - 200万年前[3.].黄萎病(Verticillium wilt, VW)是一种代表性的血管疾病,主要由黄萎病的感染引起黄萎病dahliaeKleb。,而且the soil-borne fungus can cause leaf yellowing, wilt, defoliation, and even death [4].棉花大众病是最具破坏性的病害,目前极大地影响棉花产量和纤维性能[56].

VW最初于1914年在美国的陆地棉花上描述,随后通过美国棉花品种的进口引入中国,导致棉花产量大幅损失[7].黄萎病dahliae可在200多种植物上引起枯萎病,表明其寄主植物范围广泛[89].由土传病原菌形成的微菌核(黑化的生存结构)可在土壤中存活10年以上,根系分泌物信号可触发其萌发[1011].不幸的是,目前还没有合适的商业杀菌剂g .分子,而g .,取得尽管具有对VW和优质纤维质量的先天抗性,但在感染后纤维产量较低[12].上述情况降低了轮作、化学熏蒸和土壤调理等常见耕作方法的有效性[13].因此,通过传统育种和转基因策略开发具有抗大众病的棉花新品种是管理棉花大众病最实际和最经济的方法。141516].由于人口的增加和耕地的减少,开发高产、优质、抗大众病的棉花新品种仍然是棉花育种的重要课题。因此,染色体片段替代系(CSSLs)作为一种结合陆地棉和海岛棉优势的方法出现了。通过杂交、回交、自交和标记辅助选择(MAS)等传统育种方法,CSSLs被开发为进一步基因组研究和作物改良的理想材料。CSSLs已优先应用于番茄产量、品质、抗病和耐胁迫等基本性状的数量性状位点(QTL)定位[17],小麦[18],大米[1920.]和棉花[212223242526].

植物进化出了两层免疫机制,以保护自己免受不同入侵策略的各种病原体的侵害。第一层防御主要发生在宿主细胞的细胞外表面,模式识别受体(PRRs)检测病原体相关分子模式(PAMPs),通过PRRs的刺激进一步引起pamp触发免疫(PTI) [2728].尽管大多数病原体被基础免疫反应阻断,但一些病原体能够通过III型分泌系统(TTSS)将致病效应蛋白释放到宿主细胞中,从而成功入侵和抑制PTI [29].随后,编码核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复序列(LRR)结构域的特异性抗性(R)基因识别这些病原体效应物,最终激活第二层防御机制,即效应物触发免疫(ETI) [2728].随着PRRs和R基因的识别,针对不同病原体的植物防御反应被触发,进一步引起程序性细胞死亡(PCD)的局部激活,也称为超敏反应(HR) [30.31].植物中大量的R蛋白具有两个典型的结构域:一个核苷酸结合位点(NBS)和一个c端富亮氨酸重复区(LRR) [32].前者是由凋亡蛋白酶激活因子1 (APAF-1)、R蛋白和和共享的核苷酸结合(NB)-ARC适配器的一部分秀丽隐杆线虫同源结构域4 (CED-4) [33],而后者蛋白质在植物生长发育的生物过程中起着核心作用,包括免疫反应[34].植物NBS-LRR蛋白根据n端结构域分类可分为toll/interleukin-1受体(TIR)和coil -coil (CC),分别称为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR [3536].

随着新一代测序技术的快速发展,二倍体和异体四倍体的出现Gossypium物种已成功测序[373839404142],提高了我们对棉花多倍体特性的认识,为进一步的功能基因组学研究提供了坚实的基础。转录组测序,也被称为RNA-Seq,专注于基因表达和转录调控,使其适用于揭示特定生物过程的分子机制。RNA-Seq不仅被广泛应用于棉花中,还被广泛用于识别关键信号通路或抗VW基因[1243],但也在烟草benthamiana44],烟树[45],西红柿[46],向日葵[47]和olive [48].此外,据报道,包括木质素和类黄酮生物合成在内的苯丙氨酸途径与VW抗性有关,并且类似地受到一些酶活性和生化物质的调节,包括多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MAD) [1243].

本研究首先在人工温室、自然大田和苗圃条件下进行了VW抗性调查,随后利用抗VW的CSSL MBI8255和易感的复发亲本CCRI36在V991侵染初期(接种后0、1、2天,DAI)进行了生化试验,包括CAT、POD、SOD、PAL和PPO的活性以及MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白质。此外,对同一样品进行RNA-Seq,鉴定出大量与VW抗性相关的差异表达基因(DEGs),并进行基因本体论(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科(Kyoto Encyclopedia of genes and Genomes, KEGG)富集分析。本报告不仅鉴定出了与VW抗性相关的多种候选基因,还鉴定出了响应V991侵染的关键信号通路,这将阐明棉花VW抗性的分子机制,为棉花育种和基因组学研究提供坚实的基础。

结果

温室试验的表型病害指数(DI)

为评价V991对VW的抗性,2015年采用MBI8255、CCRI36 3个重复和2个对照(中芝面2号和吉面11号)进行温室试验,分别在15和30 DAI收集表型特征(表1).在15 DAI时,对VW敏感的稻稻11号(27.11%)和CCRI36 (15.38%) DI值较高,而抗VW的中芝面2号(1.10%)和MBI8255 (3.26%) DI值较低。基于最小显著性差异(LSD)检验P= 0.05, CSSL MBI8255的DI值与抗性对照中芝面2无显著差异,显著低于复发亲本CCRI36和易感对照Jimian11(图5)。1).此外,在30 DAI时,四种材料的DI值也出现了类似的现象。以蓟县11号DI值最高(51.81%),中芝面2号DI值最低(16.18%)。DI值次高的分别为CCRI36(45.67%)和MBI8255(20.38%)。通过LSD检验,不仅MBI8266与中芝面2之间存在显著差异,CCRI36与集面11之间也存在显著差异,且前两者DI值显著低于后两者。

表1温室、田间和苗圃试验中DI的描述性统计
图1
图1

MBI8255、CCRI36和两个对照的VW DI值,抗性中稻面2和易感稻面11。分别在15和30 DAI收集数据。误差柱表示标准差,a, b, c分别表示15和30 DAI下LSD试验的显著差异

自然田间表型DI和病害苗圃试验

2015年,在河南安阳(1个复制)和新疆石河子(1个复制)分别进行MBI8255、CCRI36和2个对照(中芝面2号和蓟县11号)的自然田间试验,分别在开花期和成熟期进行表型鉴定(表1)1).田间试验中,jimi11和中枝面2个对照的DI值在安阳花期分别为44.74和5.67%,成熟期分别为53.41和17.05%;MBI8255和CCRI36的DI值在安阳花期分别为6.73和27.89%,成熟期分别为23.91和48.16%。在新疆地区的田间试验中,抗大众病的中直棉2号和MBI8255的DI值分别从1.12%和0变化到27.49和29.69%,抗大众病的jimi11号和CCRI36的DI值分别从8.7和5.84%变化到53.52和41.59%。

对MBI8255、CCRI36和jimi11在河南开封进行了一次复制的病害苗圃试验,仅选取成熟期进行表型特征测定,最终得到的DI值分别为6.82、33.33和56.77%。

MBI8255和CCRI36对V991感染的生化反应

为探讨棉花VW与特定信号通路或生化物质之间的关系,对V991侵染后MBI8255和CCRI36在0、1、2 DAI时根系酶活性或生化物质进行生化试验。选择CAT、POD和SOD三种保护酶,分析其在V991感染过程中的活性变化。结果如图所示。2 a - c.CCRI36根系的CAT活性从0 DAI (26.42 U/g)逐渐下降到2 DAI (13.28 U/g),而MBI8255根系样品的CAT活性变化较小,其中0 DAI (19.24 U/g)和1 DAI (17.62 U/g)的CAT活性最高和最低。CCRI36根系的POD活性从0 DAI (1728 U/g)增加到1 DAI (2389.33 U/g),然后在2 DAI (2109.33 U/g)时下降,而MBI8255根系的POD活性则相反,从0 DAI (2957.33 U/g)下降到1 DAI (2189.33 U/g),然后在2 DAI (3528 U/g)时达到峰值。CCRI36根系SOD活性从0 DAI (289.49 U/g)逐渐增加到2 DAI (334.37 U/g), MBI8255根系SOD活性在1 DAI (295.18 U/g)和2 DAI (350.17 U/g)时分别最高和最低。

图2
figure2

MBI8255和CCRI36对V991感染反应的生化分析一个-c: V991侵染0、1、2 DAI时根系中与抗VW相关的3种保护酶(CAT、POD和SOD)活性的变化。d-e: V991侵染后0、1、2 DAI根部与VW抗性相关的2种防御酶(PAL和PPO)活性的变化。f-: V991侵染0、1、2 DAI时根系中与抗VW相关的4种理化物质(MDA、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白)含量变化。进行了三次生物复制,误差条表示标准偏差

我们还选择了两种与VW抗性相关的防御酶,即PAL和PPO,来研究V991感染后的活性变化(图991)。2 d e).只有CCRI36根系的PAL和PPO变化趋势相似,分别从0 DAI时的3.94 U/g和28.32 U/g增加到1 DAI时的5.61 U/g和39.83 U/g, 2 DAI时分别下降到5.45 U/g和38.4 U/g。MBI8255根系在0 DAI时PAL活性最高(5.92 U/g),在1 DAI时PAL活性最低(5.29 U/g),在2 DAI时PPO活性上升至5.55 U/g,在0 DAI时PPO活性最低(33.12 U/g),在2 DAI时PPO活性最高(48.48 U/g)。

同样,在V991侵染过程中,测定了根系中丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白的含量。2外:我).两品系根系中MDA和脯氨酸含量的变化规律相似,CCRI36含量呈逐渐下降趋势,MBI8255含量呈先上升后下降趋势。CCRI36在0 DAI时MDA含量最高,为6 nmol/g, 2 DAI时MDA含量最低,分别为4.29 nmol/g; MBI8255在1 DAI时MDA含量最高,为15.43 nmol/g, 0 DAI时MDA含量最低,为9.43 nmol/g。CCRI36在0 DAI和2 DAI时脯氨酸的最大值和最小值分别为8.87 μg/g和7.73 μg/g, MBI8255在1 DAI和2 DAI时脯氨酸的最大值和最小值分别为8.65 μg/g。CCRI36根系可溶性糖含量从0代处理时的5.76 mg/g增加到1代处理时的6.59 mg/g,然后在2代处理时下降到5.75 mg/g。MBI8255可溶性糖含量从0 DAI时的4.07 mg/g逐渐增加到2 DAI时的6 mg/g。CCRI36根系可溶性蛋白含量从0 DAI时的1.31 mg/g上升到1 DAI时的1.55 mg/g,然后下降到2 DAI时的1.50 mg/g,而MBI8255则相反,从0 DAI时的1.79 mg/g下降到1.54 mg/g,然后上升到2 DAI时的1.63 mg/g。

转录组测序和比对g .分子基因组

本研究从MBI8255和CCRI36的0、1、2 DAI位点采集V991侵染的根系样本,进行3次生物复制,构建了18个RNA-Seq文库,旨在系统识别影响棉花抗VW的关键基因或途径。总共获得了92286.7万个原始读取,对低质量的读取进行了过滤,得到90854.7万个干净读取(约136.27 Gb数据),平均每个库7.57 G(表2)2).RNA-Seq结果计算出Q30值超过91.38%,GC含量不低于43.44%,其中平均值分别为92.23和43.68%。然后,将干净读取映射到g .分子通过TopHat2软件,将87.69 ~ 91.23%的干净数据成功匹配到参考基因组,其中79.13 ~ 84.29%和6.63 ~ 8.39%分别构成唯一reads和多reads。上述结果表明我们的转录组结果是可靠的。

表2 18个文库RNA-seq的吞吐量和质量

在我们的RNA-Seq结果中,共发现77,412个基因,包含6934个新基因,其中的表达量随后根据Fragments Per Kilobase of transcript Per Million mapped reads (FPKM)值进行评估。采用Pearson相关系数(PCC)分析计算18个实验样本之间的相关性,经3次重复计算,每个样本的基因表达相似度约为93.9%以上;然而,在CCRI36-2 III和CCRI36-2 I/ CCRI36-2 II之间分别鉴定出的82.5%和84%的相似性观察到例外(图36 - 2 II)。3.).CCRI36与MBI8255在0 DAI时的基因图谱相似性为92.4 ~ 97%,而在1 DAI和2 DAI时的相似性分别为857 ~ 91.6%和89 ~ 91.5%,说明在V991侵染的同一阶段,两株株的基因表达模式相似,但在1 DAI和2 DAI时的相似性低于0 DAI时。在MBI8255中,CCRI36-0与CCRI36-1 / CCRI36-2的表达基因相似性逐渐降低,从0 DAI下降到1 DAI,然后在2 DAI处上升。这两行之间的差异可能是由带有distinct的CSSL引起的g .取得染色体片段。

图3
图3

从Pearson相关系数分析中鉴定出的总基因

18个样本。Z和C分别代表CCRI36和MBI8255。0 = 0代,24 = 1代,48 = 2代。

差异表达基因的鉴定

为了研究对V991感染的差异反应,将两个品系的每个样品合并3个重复进行两两比较,DEGs采用DESeq R包(v1.18.0)鉴定,以q值为基础,假发现率(FDR)调整临界值< 0.01和绝对对数2变化≥2。共有23180个基因,其中包含1816个新基因在V991感染反应中差异表达(附加文件)1).对这些样品进行氧化石墨烯富集分析(图。4).46个亚类被聚为生物过程、细胞成分和分子功能3类,其中代谢过程和细胞过程、细胞和细胞部分、结合和催化活性是这些类中主要富集的基团。

图4
装具

总差异表达基因GO富集分析

两两比较结果如下图所示。5): CCRI36-0比MBI8255-0有1424个deg, CCRI36-0比CCRI36-1有8122个deg, CCRI36-2有167个deg, MBI8255-0比MBI8255-1有16,441个deg, MBI8255-1比MBI8255-2有4555个deg, MBI8255-1比CCRI36-1有8546个deg, MBI8255-2和CCRI36-2有1110个deg。基于CCRI36-0 vs. CCRI36-1和CCRI36-1 vs. CCRI36-2的比较。6MBI8255-0与MBI8255-1、MBI8255-1与MBI8255-2的比较中共发现了2644个常见的deg(图2)。6 b).从CCRI36-0 vs. MBI8255-0和CCRI36-1 vs. MBI8255-1 / CCRI36-2 vs. MBI8255-2的比较中鉴定出450个和211个常见的DEGs(图2)。6摄氏度),而在CCRI36-1与MBI8255-1和CCRI36-2与MBI8255-2之间观察到508个共同的deg,最终从上述所有比较中鉴定出115个共同的基因。

图5
figure5

不同样本间差异表达基因。红色和蓝色分别代表上调和下调的基因

图6
figure6

不同样本间的多次比较得到的差异表达基因。一个为CCRI36样本在不同阶段的比较,(b)表示MBI8255样本在不同阶段的比较,(c)表示2条直线在同一阶段的比较

基因时间表达模式分析

为了研究所有23180个DEGs的时间模式,对这两个品系进行了短时间序列表达挖掘(STEM)分析。CCRI36中的19,044个deg和MBI8255中的20,316个deg总共被聚成8个基因型(图2)。7),每个剖面代表一组具有相似表达模式的基因(附加文件2).在CCRI36基因图谱中,11,827个deg(19044中的62.1%)被进一步聚类为三个基因图谱(P-value≤0.05),包括一种上调模式,即剖面7 (6024 DEGs, 31.63%),两种下调模式,即剖面2 (4142 DEGs, 21.75%)和剖面1 (1481 DEGs, 7.78%)。同样,MBI8255中的13,598个deg(20,316个deg中的66.93%)被聚成三个配置文件(P值≤0.05)。上调基因7和下调基因2分别含有5912(29.12%)和5288(26.03%)个DEGs,而基因0(2393个DEGs, 11.78%)表达量先下降后升高。

图7
figure7

STEM软件在两行中不同的基因表达模式。每个方格代表一个基因表达的趋势。左上角的数字表示配置文件ID号,左下角的数字表示该配置文件中的族数。聚类和谱分别根据基因数量和显著性(默认)进行排序

然后进行GO富集分析,从两系的谱图中鉴定出可能的功能基因。基因7和基因2的DEGs最多,具有显著值(P-value≤0.05)。8).所有的deg被分为生物过程、分子功能和细胞成分三大类。结合CCRI36和MBI8255两个谱图的GO项结果,代谢过程和细胞过程是生物过程中占主导地位的亚类,结合和催化活性是分子功能中最丰富的亚类,细胞成分中最丰富的两个亚类是细胞部分和细胞。在上调的片段7中,CCRI36的聚类子类数量多于MBI8255,而在MBI8255的聚类子类数量多于下调的片段2。

图8
figure8

两行profile7和profile2的GO分类(CCRI36和MBI8255)

同样,对上述CCRI36和MBI8255中的两个profile进行KEGG通路分析,表中显示了前20条deg数量最多的信号通路3..在谱线7的上调模式中,两系均显著富集了8种常见通路,即苯丙类生物合成(ko00940)、植物激素信号转导(ko04075)、昼夜节律-植物(ko04712)、类黄酮生物合成(ko00941)、二苯乙烯类、二芳基heptanoid和生姜素生物合成(ko00945)、柠檬烯和蒎烯降解(ko00903)、半乳糖代谢(ko00380)和类胡萝卜素生物合成(ko00052)。除了上述途径外,CCRI36中显著富集的途径只有三条,分别是氨基糖和核苷酸糖代谢(ko00520)、糖酵解/糖异生(ko00010)和色氨酸代谢(ko00240)。在这两个品系的谱7中,淀粉和蔗糖代谢通路富集程度最高(ko00500),富集程度最小P-值途径分别被鉴定为CCRI36中的类黄酮生物合成和MBI8255中的苯丙类生物合成。

表3 20条高表达的KEGG通路

在下调谱2中,这两个品系中只有两条共同富集的具有显著意义的途径,即苯丙类生物合成和植物激素信号转导,其中后一条途径不仅最小PCCRI36和MBI8255中的-value,也是MBI8255中deg数量最多的。在CCRI36基因2中,淀粉和蔗糖代谢通路最为富集。与CCRI36基因2的通路相比,只有MBI8255的昼夜节律-植物、类黄酮生物合成、二苯乙烯、二芳基heptanoid和姜辣素生物合成、柠檬烯和蒎烯降解通路显著富集。

与苯丙烷代谢途径相关的DEGs表达谱分析

在植物生长发育过程中,一些苯丙类代谢产物在特定的细胞或组织中有差异地积累,如木质部组织和维管束中沉积的木质素,液泡室和壁室中集中的类黄酮,已被报道在植物防御中发挥重要作用[4950].本研究评估了参与木质素和类黄酮生物合成的关键酶基因的表达谱(图。9).在V991侵染初期,两个品系中上调的基因主要与木质素生物合成有关,下调的基因主要与类黄酮生物合成有关(附加文件)3.).

图9
figure9

苯丙类生物合成途径相关DEGs的表达。红色和蓝色数字分别代表来自MBI8255和CCRI36的deg

在苯丙氨酸生物合成的开始(从苯丙氨酸到对香豆油酰CoA),苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因、肉桂酸。

4-羟化酶(C4H)和4-羟基肉桂酰辅酶a连接酶(4CL)在0 DAI到2 DAI之间几乎没有变化,除了CCRI36 C4H上调后下调,MBI8255 4CL持续上调外。在类黄酮生物合成途径中,查尔酮合成酶(CHS)和黄酮3-羟基(F3H)基因持续上调,而查尔酮异构酶(CHI)和黄酮醇合成酶(FLS)基因除CCRI36中FLS基因持续下调外,两系均无明显变化。在木质素生物合成方面,肉桂酰辅酶a:NADPH氧化还原酶(CCR)、香豆酸-3-羟基化酶(C3H)、咖啡酰辅酶a o -甲基转移酶(CCoAOMT)、羟肉桂酰辅酶a:海草酸羟肉桂酰转移酶(HCT)、肉桂醇脱氢酶(CAD)基因均持续上调表达。咖啡酸o -甲基转移酶(COMT)和针叶醛/阿魏酸5-羟化酶(F5H)基因在0代至2代之间表达下调,变化不大。在MBI8255中,羟肉桂酰- coa:shikimate羟肉桂酰转移酶(HCT)、漆酶(LAC)和POD基因先上调后下调。相比之下,前者的CCRI36表达没有变化,而后两者表达上调。

参与氧化还原过程的DEGs的表达谱分析

活性氧(ROS)在植物生长、发育和胁迫防御中发挥着重要作用[51并控制ros产生和清除途径之间的氧化还原稳态平衡。通过对所有DEGs中GO的富集分析,发现1433个DEGs参与氧化还原过程(GO: 0055114),以此为基础对所有ros相关基因进行下游分析(图。10).

图10
图10

氧化还原过程相关基因的热图分析。一个表示ros产生途径相关基因的表达模式,(b)及(c)表示ros清除途径相关基因的表达模式

NADPH氧化酶,也称为呼吸爆裂氧化酶同源物(RBOHs),在植物ROS生成中起着重要作用[52].本研究共鉴定出11个rboh样蛋白基因,即2个RbohB、5个RbohD和4个RbohF在氧化还原过程中对V991侵染的反应中,前者大多呈上调模式,后者则呈下调模式。

同时,对参与ROS清除途径的DEGs进行表达谱分析。共鉴定出16个抗坏血酸过氧化物酶(APX)蛋白基因,在两个品系中均表达下调。从我们的RNA-Seq数据中鉴定出8个SOD基因,其中大部分在CCRI36中先下调后上调,但在MBI8255中下调。而铜锌SOD 1和锰SOD 1这两个SOD基因在CCRI36中呈持续上调,在MBI8255中呈先上调后下调,这与前面对根系SOD的生化研究一致。5个过氧化氢酶(CAT)基因在CCRI36中大多下调,在MBI8255中先下调后上调,证实了上述CAT研究。一个glutaredoxin (GRX)基因在CCRI36中没有明显变化,但在MBI8255中表达下调。此外,8个单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)、7个谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和3个过氧化物还蛋白(PrxR)基因在CCRI36中主要下调,而在MBI8255中则先上调后下调。在2个品系中,1个铁蛋白和3个硫氧还蛋白(Trx)基因均呈上调表达,4个替代氧化酶(AOX)基因大多呈先下调后上调表达。上述基因复杂多样的变化与ros生成和清除途径的相关性表明,氧化还原过程在V991感染下维持氧化还原稳态平衡方面发挥着非凡的作用。

植物抗性相关DEGs的表达谱分析

在对所有DEGs进行GO富集分析的基础上,在生物防御反应过程中富集了182个DEGs (GO:0006952),并结合的功能注释进一步分析答:芥,最终获得158个免疫相关的DEGs(图;11).在本研究中,大多数与植物抗VW相关的DEGs被标记为R基因,分为CC-NBS-LRR和TIR-NBS-LRR基因。共鉴定出11个CC-NBS-LRR蛋白基因,其中水平较高的Gh_D05G0053和Gh_D05G3603在两个品系中逐渐增加(除Gh_D05G0053从1 DAI增加到2 DAI外)。编码TIR-NBS-LRR蛋白的基因有25个,其中高表达基因有4个,分别为Gh_A10G2076、Gh_A09G2289、Gh_D03G1355、Gh_A11G2680。第一个和中间两个基因在两个品系中均先上调后下调,最后一个基因在MBI8255中持续下调,在CCRI36中先下调后上调。除了上述NBS-LRR蛋白外,我们还发现了22个编码LRR和含NB-ARC结构域的抗病蛋白的基因,42个编码含NB-ARC结构域的抗病蛋白的基因。在LRR和NB-ARC基因中,Gh_D05G2688和Gh_D03G1527表达量极高,其中Gh_D05G2688在两个品系中均为先上调后下调,Gh_D03G1527在CCRI36中为先下调后上调,在MBI8255中为先上调后下调。NB-ARC基因中,Gh_D11G3200表达量最高,在两系中均先上调后下调。

图11
figure11

防御反应相关基因的表达模式分析

许多其他基因参与了植物对VW的抗性,我们进一步分析了这些基因的表达模式。激活抗病(ADR1)基因包括ADR1ADR1-like1和ADR1-like2与小鼠基础和ETI介导的防御调控相关拟南芥53].共鉴定出4个ADR1-like1基因,分别为Gh_A01G0964、Gh_A05G1718、Gh_D05G2487和Gh_D01G1013,其中转录模式主要在CCRI36中上调,在MBI8255中先上调后下调。

MOS2,也被描述为含有D111/G-patch结构域的蛋白,在先天性免疫中是必不可少的答:芥54].一个MOS2基因Gh_A05G2156在两系中持续下调,该基因在MBI8255中的表达量高于CCRI36,不仅在0 DAI时表达量下调,在1 DAI时表达量也下调。

ZED1,也被称为hopz激活的抗性1,在ZED1 -d中负责高温依赖的自身免疫和生长迟缓[55].两个ZED1基因分别为Gh_A12G0580和Gh_D12G0592,在0 DAI到2 DAI之间表达量逐渐增加。

主要乳胶蛋白(Major latex protein, MLP)样蛋白属于Bet v 1家族,也被称为发病相关10 (RP 10)样蛋白家族,其表达模式与防御或应激反应有关[56].Gh_A01G1247、Gh_D01G1452、Gh_D02G1447被标注为mlp样蛋白28基因,其中,Gh_A01G1247和Gh_D02G1447均为下调后上调(除Gh_A01G1247下调外),而Gh_A01G1247在两系中均由0 DAI上调至2 DAI。共鉴定出8个MLP-like 34,其中Gh_D02G1410、Gh_D02G1446和Gh_D07G2407基因相对于其他基因表达水平较高,在CCRI36和MBI8255中,Gh_D02G1410、Gh_D02G1446和Gh_D07G2407对V991感染的反应中,Gh_D02G1410、Gh_D02G1446和Gh_D07G2407的表达水平均为上调,而Gh_D07G2407在CCRI36和MBI8255中均表现为先下调后上调。有12个mlp样423个基因,其中Gh_D02G0560的RPKM值相对于其余基因具有极高的RPKM值,表明两系均为先上调后下调。

三种基因拟南芥与发病机制相关的4 [57],与Gh_A11G2286和Gh_D11G2595相比,Gh_D11G2592的转录水平相对较高,后者在CCRI36中先上调后下调。相比之下,这些基因在MBI8255中持续上调,在2 DAI时,抗vw株系的表达水平高于vw敏感株系。

水稻中的一个抗性(R)基因属于含有核苷三磷酸水解酶超家族蛋白的p环,与水稻稻瘟病的信号通路有关(稻瘟病菌)阻力反应[58].共鉴定出4个含有核苷三磷酸水解酶超家族蛋白基因的p- loop,包括Gh_A11G2323、Gh_A12G1867、Gh_A12G1852和Gh_D12G2022,其中前两个在CCRI36中呈先上调后下调的趋势,后两个在CCRI36中呈逐渐上调的趋势。相比之下,MBI8255中的第一个基因在下调后上调,第二个和第四个基因在上调后下调,而第三个基因则持续下调。

PYR (PYR)/PYR1-like (PYL)/ ABA受体调控组分(RCAR)属于ABA受体家族,ABA在植物抗非生物胁迫中发挥着重要作用[59].PYL2基因Gh_A04G0244在CCRI36中上调,在MBI8255上调后下调。

对丁香假单胞菌5 (RPS5)的抗性,编码卷曲线圈核苷酸结合位点富莱氨酸重复序列(CC-NBS-LRR)结构域,识别来自phaseolocola假单胞菌B (AvrPphB)的致病效应蛋白6061].结果中发现两个rps5样基因,即Gh_A11G2559和Gh_D05G3479,其中FPKM值高于后者的Gh_A11G2559在CCRI36中上调,而在MBI8255中上调后下调。

霉斑位点O (MLO)基因家族在大多数陆生植物中普遍存在,编码7个跨膜(TM)结构域蛋白,参与生物和非生物胁迫下防御和细胞死亡的调控[62].15个标记为MLO家族蛋白的基因表现出不同的表达丰度。Gh_D02G0670和Gh_D06G2377的RPKM值较高,除Gh_D06G2377在CCRI36中持续上调外,其余两系均先上调后下调。有趣的是,除Gh_D02G0670在2 DAI位点外,MBI8255的表达水平均高于CCRI36。

AvrB操作1 (TAO1)的靶点,属于TIR-NB-LRR蛋白家族,据报道有助于疾病抵抗的反应effector AvrB in答:芥63].鉴定出2个TAO1基因,其中Gh_D06G2323在2个品系中均先上调后下调,表达水平显著高于Gh_A12G0912。

通过实时定量pcr (qRT)验证RNA-Seq结果

为了确认我们RNA-Seq结果的可靠性,我们随机选择了20个deg进行qRT-PCR(图。12).引物组列于表中4.内参基因为管家β-Actin基因,qRT-PCR结果中20个基因的表达模式与转录组测序数据高度一致,进一步支持了我们RNA-Seq数据的可靠性。

图12
figure12

RNA-seq数据的qRT-PCR验证。的结果

qRT-PCR和之字形表示转录组测序结果。

表4 qRT-PCR验证所用引物

讨论

实验条件及表型评价

在本研究中,采用人工温室、自然田和苗圃试验,对CSSL、其复发亲本和两个对照进行了抗VW性评价。疾病指数可根据出现坏死和褪绿症状的叶片数量来计算。虽然在温室试验中用不同数量的纸杯进行了三次重复试验(每杯5棵幼苗;第1次复制5杯,第2次复制7杯,第3次复制10杯),抗性对照(中芝面2号)和易感对照(稷面11号)的幼苗总数足以进行病害评价。这样不仅提高了精度,而且减小了实验误差。从温室结果看,MBI8255和CCRI36在15 DAI时的DI值与中芝面2号和稷面11号比较接近。在30 DAI时也观察到类似的现象,尽管DI值高于15 DAI时,这表明所选的CSSL及其复发亲本分别对V991具有抗性和敏感性。

在自然田间试验中,对4个品系进行了抗VW性评价,并在开花期和成熟期分别进行了温室调查(一个在安阳,一个在新疆)。安阳的2个抗性株系(MBI8255和中芝面2)和2个敏感株系(CCRI36和蓟县11)在开花期和成熟期DI值均相对接近。在新疆,MBI8255在自然环境中表现出对VW的抗性,而CCRI36在自然环境中表现出对VW的敏感性。安阳的4个品系在开花期DI值均高于新疆,而在成熟期除CCRI36品系外,安阳的DI值均相对较低。田间结果的这些差异可归因于多种因素,如VW菌株组合对植物的侵染、土壤真菌数量和毒力水平不同的不同地点,以及不同的发育和环境条件[64].苗圃试验中,MBI8255、CCRI36和jimi11在开封只进行了1个重复,易感对照DI为56.77%,略高于温室和大田试验。虽然MBI8255和CCRI36的DI与温室和大田试验的15 DAI或开花期更接近,但分别表现出对VW的抗性和敏感性,这可能是由于取样植株数量不足造成的。综合温室、大田和苗圃的试验结果,所选CSSL MBI8255对VW具有抗性,DI略高于抗性对照中芝面2。相反,循环亲本CCRI36尽管DI略低于易感对照Jimian11,但对VW易感,这为进一步的生化测试和转录组测序提供了坚实的基础。

抗V991感染的生化机制

由于长期与多种病原体相互作用,植物进化出了许多防止微生物损害或入侵的策略,包括植物的物理防御反应和生理生化抗性,其中抗氧化酶的调控和生化物质的合成具有重要意义。ROS已被证明作为关键的二级信使介导信号转导和调节稳态,高浓度的ROS可导致细胞膜损伤、细胞器和生物分子的破坏,最终导致细胞死亡[65].为了修复ROS对病原菌感染造成的损伤,植物增强了抗氧化酶的活性,如CAT、SOD、POD和PPO。除上述酶外,PAL也是一种与木质素和木脂素合成相关的必需酶,在调节水杨酸(SA)的合成和系统获得性抗性(SAR)的建立中起关键作用[66].关于大众造成的诉dahliae, POD、PAL和PPO活性与茄子VW抗性呈正相关[67],在棉花中接种V991菌株后,前两者均增强[43].为了评价关键酶与VW抗性之间的关系,选择了3种保护酶(CAT、SOD和POD)和2种防御酶(PAL和PPO),并在MBI8255和CCRI36的0、1和2 DAI采集的根系样品上进行了测试。根据保护酶的活性结果(图;2),同一时期抗VW和敏感VW株系的根系CAT活性和根系SOD活性均无显著差异,说明本研究未发现抗VW株系与CAT活性和SOD活性之间存在相关性。而MBI8255与CRI36在同一阶段的POD活性除1 DAI外均存在显著差异,说明POD活性与VW抗性密切相关。此外,在0和2 DAI时,MBI8255的POD活性显著高于CCRI36,这表明与易感复发亲本相比,无论V991感染与否,耐药CSSL都具有更高的POD活性。在两种防御酶中,2个品系中只有PPO活性在2 DAI时存在显著差异,而除PAL活性在1 DAI时存在差异外,抗vw品系的PAL和POD活性均高于敏感品系。这表明V991对VW的抗性与POD活性之间存在明显的相关性,而且耐药系对V991感染具有较高的PAL和POD活性。基于上述结果,POD和PPO活性与VW抗性呈正相关,这与之前的研究结果一致[4367].然而,缺乏足够的证据来证明PAL活性与VW抗性之间的密切相关性,尽管在抗性线上发现了较高的活性,但这并不能证实先前的研究。其中一个原因可能与所选CSSL的复杂背景有关,这应该在进一步的研究中加以解决。

植物中的一些生化物质为自卫反应提供能量,或者是病原体入侵引起的损伤和伤害的产物,包括MDA [6869],脯氨酸[7071],以及可溶性糖[72],与植物抗性相关。作为脂质过氧化的最终产物,两个品系的根系MDA含量在同一时期均表现出显著差异,除0 DAI外均呈下降趋势,其中MBI8255的MDA含量较高,可能与VW抗性呈负相关。而抗VW性与脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量之间的相关性不明显,两者在同一生育期之间以及MBI8255和CCRI36在不同生育期之间均无显著差异。我们的结果证实了先前的研究[4367],从而为进一步分析RNA-Seq数据的组合提供了有用的信息。

V991感染后基因表达的变化

RNA-Seq作为一种在转录组水平上关注基因整体表达的强大工具,可以揭示特定生物过程的机制,本研究利用RNA-Seq来识别响应VW的关键候选基因或重要信号通路。在V991感染的0,1,2dai收集了来自抗vw MBI8255和易感vw CCRI36的18个根样本。文库构建和转录组测序共获得90854.7万次清洁reads(约136.27 Gb数据),Q30值超过91.38%,GC含量超过43.44%。不低于87.69%的干净reads成功定位到参比基因组并进行组装,最终获得77,412个基因,其中6934个新基因。PCC分析用于确认不同样品之间的关系,每个样品的三个重复之间以及同一阶段的样品之间都发现了很高的相似性,这证实了我们RNA-Seq数据的可靠性。

通过样本间的多次比较,有23180个基因(1816个新基因)对V991感染有差异表达,其中下调基因多于上调基因。采用STEM分析方法研究了所有DEGs的时间表达模式,得到了三个表达谱(P≤0.05),对上调片段7和下调片段2进行GO和KEGG富集分析,两者表现出相同的模式。在两个剖面中,代谢过程和细胞过程、结合和催化活性、细胞部分和细胞分别是生物过程、分子功能和细胞成分中最丰富的亚类。MBI8255和CCRI36中聚集到相同GO项的基因表现出相反的模式,在7号剖面中CCRI36的基因富集量高于MBI8255,而在2号剖面中CCRI36的基因富集量低于MBI8255。KEGG结果显示,在两种谱线或两种品系中,只有苯丙类生物合成和植物激素信号转导两条通路显著富集,且在上调表达模式(谱7)中,CCRI36中聚集的基因多于MBI8255,而MBI8255的下调基因数量多于CCRI36 (profile 2)。GO和KEGG结果的一致性可能是由于不同抗性或易感株系对V991感染采取了不同的策略。关于我们研究结果中丰富的代谢过程,我们发现次级代谢途径在V991感染的反应中起着特别重要的作用,据报道它们参与了非生物应激反应[73].此外,苯丙类化合物和类黄酮生物合成途径也被认为在病原体感染的反应中积累,如先前的研究所示[74].

苯丙烷代谢途径对V991感染的反应

苯丙烷途径在植物中已被报道参与一些非生物胁迫反应,如干旱、盐度和病原体感染,它是木质素生物合成的主要代谢途径[75].木质素作为细胞壁的主要成分,是植物应对病原体感染的主要机械支撑结构和防御系统[76的氧化偶联作用p-羟基苯基(H),愈创木酰基(G)和丁香基(S)单木质素。在本研究中,基于RNA-Seq和qRT-PCR的结合结果,分析了苯丙烷途径中的大部分关键酶。在V991侵染下,木质素生物合成相关酶的表达呈现多样性,而类黄酮合成相关酶的表达较少,这可能是两种合成途径的拮抗关系所致。尽管如此,我们的研究结果仍然表明V991感染对CCRI36和MBI8255中的苯丙烷途径有积极作用,进一步促进木质素的生物合成。

在G型和S型木质素合成途径中,大部分基因表达上调,包括C3H、CCR和CAD,只有COMT基因表达下调,这代表了S型和G型木质素合成过程中咖啡酸向阿魏酸的艰难转变。此外,上调的CCoAOMT将咖啡基辅酶a转化为阿魏酸辅酶a,可能被有效利用以获得足够的木质素,如柳枝稷和浮萍中所报道的[7778].总的来说,V991感染刺激木质素生物合成途径会产生较高的木质素含量,木质素含量可与其他一些抗氧化剂结合,参与外质体中ROS产生的调控[76].这些结果揭示了苯丙烷代谢途径在V991感染反应中的重要作用。

对V991感染反应的氧化还原过程

在非生物胁迫下,ROS生成基因可以激活植物体内ROS的生成,从而产生氧化应激,从而产生ROS清除途径,以维持ROS的稳态平衡。在本研究中,共有1433种deg参与氧化还原过程,由所有deg的GO分析结果得出。RBOHs在我们的研究中被鉴定为RbohB、RbohD和RbohF,据报道它们参与了ROS的产生过程[52]且大多表现为0 DAI至2 DAI的上调模式,这表明V991感染后氧化应激增加。

为了消除产生的ROS,植物进化出了ROS清除途径,以应对高氧化应激对细胞成分造成的损伤。在抗氧化酶中,SOD作为抗氧化的第一道防线,负责将O2在H2O2,随后APX和CAT进一步转化H2O2在H2O及其对应的化合物[79].在V991侵染下,只有两个SOD基因在CCRI36中表达上调,但在MBI8255中表达先上调后下调,这与生化试验的SOD结果一致,说明两种酶在ROS清除途径中具有重要作用。APX或CAT在CCRI36中主要下调,MBI8255下调后上调。在MDAR、GPXs和PreR的活性变化方面也观察到类似的结果。在这两个系中,除了AOX酶先上调后下调外,铁蛋白和Trx也持续上调,说明它们积极参与了ROS清除途径。因此,在诉dahliae在CCRI36和MBI8255感染时,ROS的生成都增加了,随后导致ROS清除途径的激活以保护植物。抗性品系的活性氧清除相关酶活性高于敏感品系,这可能是由于抗性品系具有相对发达的活性氧清除系统。

植物对V991侵染的抗性

病原体感染的过程始于钙的流入和PAMPs引发的氧化爆发,随后不仅激活MAPK通路和钙依赖性蛋白激酶,还激活气孔关闭和转录重编程,最终导致SA积累和胼胝质沉积[798081].为了应对各种病原体的入侵,植物进化出了两种主要的防御机制。随着对发生在宿主细胞胞外表面的pamp的识别,PPRs及其刺激激活了基础免疫反应,即PTI [2728].病原体入侵成功后,产生的效应子首先被传递到宿主细胞中,进一步抑制PTI,这可以被特定的R基因识别。ETI是第二类免疫反应,由R基因的产生激活。植物对病原体和HR的抗性诱导最终是在PRRs和R基因的特殊识别后触发的[30.31].

在本研究中,抗VW的MBI8255和易感VW的CCRI36这两个品系的相互作用与诉dahliae旨在揭示植物对植物病原体免疫应答的分子机制。基于GO对所有DEGs的富集分析结果,共鉴定出158个与免疫相关的基因答:芥将注释聚类到防御反应GO项(GO: 0006952)中,抗性品系和敏感品系之间的表达模式存在显著差异。在抗性基因中,R基因从结果中鉴定最多,根据n端结构域的不同可分为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR基因[3536].由于大量的基因被标注为R基因,我们只进一步研究了高表达的基因,但更多的基因编码了第二类R结构域。在第一类R基因中,Gh_D05G0053和Gh_D05G3603两个高表达基因均出现表达上调模式,其中Gh_D05G0053在MBI8255中的表达量高于CCRI36(除0 DAI外),而Gh_D05G3603在同一时期两系的表达量无显著差异。2型R基因的数量是1型R基因的2倍多,发现5个高表达基因,分别为Gh_D05G3603、Gh_A10G2076、Gh_A09G2289、Gh_D03G1355和Gh_A11G2680。其中前4个基因在V991侵染初期从0 DAI上调至1 DAI,而后一个基因在V991侵染初期持续下调,有趣的是,在抗性株系中0 DAI处高表达。此外,本研究期内编码LRR和含NB-ARC结构域抗病蛋白的基因有22个,其中高表达基因Gh_D03G1527和Gh_D05G2688的表达模式相反,前者先下调后上调,后者先下调后上调。共鉴定出40多个编码含NB-ARC结构域抗病蛋白的基因,其中只有相对高表达的Gh_D11G3200在两个品系中先上调后下调。

除上述r相关基因外,PTI和ETI中还涉及许多其他耐药基因。标注为ADR1-like 1的两个基因Gh_A05G1718和Gh_D01G1013表达量较高,前者在两系中持续上调,后者在CCRI36中下调,在MBI8255中先上调后下调。两个系中,一个MOS2基因(Gh_A05G2156)持续下调,两个ZED1基因(Gh_A12G0580和Gh_D12G0592)上调。研究了4个高表达的mlp样基因Gh_D02G1410、Gh_D02G1446、Gh_D07G2407和Gh_D02G0560,其中前两个基因在CCRI36中表达上调,在MBI8255中表达先上调后下调,后两个基因在两个品系中表达先上调后下调。致病相关4 (Gh_D11G2592)和PYR1-like 2 (Gh_A04G0244)在两系中均表达上调,CCRI36中编码含核苷三磷酸水解酶p环超家族蛋白的3个基因(Gh_A12G1852、Gh_A12G1867和Gh_D12G2022)表达相同,但前者和后者表达相反。RPS5-like 1基因Gh_A11G2559在CCRI36中表达上调,但在MBI8255中先上调后下调,在一个高表达MLO基因Gh_D06G2377中观察到。其他高水平MLO基因(Gh_D02G0670)和TAO1 (Gh_D06G2323)的表达模式相同,均表现为先上调后下调。有趣的是,在0和1 DAI时,抗性株系的表达水平高于敏感株系,但上述免疫相关基因的表达模式存在差异,这表明棉花对VW的抗性更强可能是由于其防御机制更好。

结论

本研究通过人工温室试验、自然大田试验和苗圃试验,确定了所选的CSSL (MBI8255)及其复发亲本(CCRI36),以及两个对照(中枝棉2号和稷棉11号),得到了抗vw的MBI8255和易vw的CCRI36。随后,利用V991感染初期(0,1,2 DAI)收集的根系样本,分别对这两个品系进行生化测试和RNA-Seq。生化试验中,POD和PPO活性与VW抗性呈显著正相关,MDA含量与VW抗性呈显著负相关。此外,我们的RNA-Seq数据中共鉴定出77,412个基因,其中6934个新基因,通过多次比较进一步鉴定出23,180个DEGs。根据基因时间表达模式分析,两个相同的谱图(P-value≤0.05)通过GO和KEGG富集分析进一步研究了两系的DEGs来源,在生物过程中主要集中在代谢过程和细胞过程,在分子功能中主要集中在结合和催化活性,在细胞成分中主要集中在细胞部分和细胞部分,同时显著参与苯丙类生物合成和植物激素信号转导通路。最后,对苯丙烷代谢途径、氧化还原过程和植物抗性相关的deg进行表达谱分析,筛选出关键的候选基因或途径,为揭示大众抗性机制提供了丰富的信息。本研究结果不仅为棉花育种提供了抗性材料,而且提高了我们对棉花VW抗性机理的认识,为进一步开展棉花VW抗性研究提供了依据。

方法

的制备诉dahliae还有植物材料

诉dahliae本研究中使用的真菌分离株为高侵略性脱叶V991。V991先在固体马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上25℃培养7 d,然后转移到捷克液体培养基中获得分生孢子,然后置于孵育摇床(中国哈尔滨东联电子)中,摇床转速为150 rpm/min,黑暗条件下25℃培养7 - 14 d。将孢子悬液浓度稀释至1 × 10左右7孢子/mL,无菌水用于根接种,使用血细胞计评估[616].

本实验室构建的cssl是2003年在中国农业科学院棉花研究所(CRICAAS;安阳,中国河南省),在那里,种群通过多代回交和自交成功发展,如其他地方所述[82].由CRICAAS开发的CCRI36是一种g .分子种植面积广、纤维产量高的品种,而海1号是由CRICAAS储存的g .取得纤维品质优良,抗黄萎病能力强的品种[24].根据多年来在多个地区对大众抗性的调查,MBI8255和CCRI36分别对大众具有稳定的抗性和易感性。在随后的温室和田间试验中,选择中芝面2号和Jimain11号作为抗大众病和大众病敏感对照。

温室试验

选择MBI8255和CCRI36与对照中芝面2号和稻面11号在中国农业科学院棉花研究所人工温室进行抗VW试验。种子用75%乙醇消毒30 s, 2.5%次氯酸钠消毒10 min后,用无菌水清洗3-5次,然后按4:6的比例放入装有消毒过的沙子和蛭石的纸杯中。每杯播种量为7-10粒种子进行发芽,每杯保留5株生长良好且同步生长的幼苗供进一步使用诉dahliae感染。重复3次:(1)2015年3月28日至2015年5月30日,5个纸杯;(2) 2015年8月26日至2015年10月28日,7个纸杯;(3) 2015年8月28日至2015年10月30日,10个纸杯。当第一片真叶子打开并放平后,将每个纸杯放入纸托盘中,纸托盘底部已用剪刀剪掉,并放入10毫升1 × 107孢子/mL分生孢子悬浮液。

在15和30 DAI分别进行抗VW表型鉴定,并根据植株叶片的疾病症状根据严重程度分级系统(从0到4)对每株幼苗进行评估[83].0表示植株健康,无病征;1表示少于25%的叶片出现病害症状;2表示25-50%的叶子有疾病症状;3表示50-75%的叶子有病害症状;4表示75%以上的叶片出现病状,甚至完全落叶或死亡。采用DI计算VW电阻,公式如下:

$$ \mathrm{DI}=\left[\sum \left(\mathrm{N}\mathrm{i}\times \mathrm{i}\right)/\left(\mathrm{N}\times 4\right)\ times 100 $$

其中i为疾病等级0 - 4,Ni为具有相应疾病等级的植物数量,N为每种材料调查的总植物数量。

自然田和疾病苗圃试验

MBI8255、CCRI36和两个对照分别在河南安阳和新疆石河子两个不同的试验农场进行了自然田间调查。在自然条件下,种植在田间进行抗VW调查的材料混合感染诉dahliae隔离在2015年开花期和成熟期进行抗VW表型鉴定,采用上述公式计算DI。

在蔡英帆教授的帮助下,棉花生物学国家重点实验室、河南省植物胁迫生物学重点实验室、河南大学生命科学学院,对MBI8255、CCRI36和吉米11进行了病害苗圃试验。表型数据采集于2015年成熟期,DI按上述公式计算。

样品收集

基于t将人工温室、自然田和苗圃的抗虫试验结果MBI8255和CCRI36分别作为抗虫和易感品系进行RNA-Seq和生化试验。经过消毒的种子被种植在三个塑料托盘中,里面装满了消毒的沙子和蛭石(4:6),并放在恒温培养箱中,进行三次生物复制。培养条件设置为:25°C,相对湿度60-70%,光周期14 h/10 h(昼夜)。当第一片真叶打开并平整时,将幼苗从塑料托盘中取出,通过蘸根接种到1 × 10培养基中7孢子/mL分生孢子悬浮液或无菌水(用于模拟接种)。接种60 s后,将幼苗移回恒温培养箱的塑料托盘中。根样品分别在0、1和2 DAI下收获,在液氮中快速冷冻,保存在−80°C下,并分为两部分:一部分用于RNA-Seq(3次重复),另一部分用于生化测试(3次重复)。

生化试验

选择与VW抗性相关的保护酶(CAT、SOD、POD)在V991感染初期(0,1,2 DAI)的活性变化进行研究。每个样品的新鲜根(0.1 g)在液氮中研磨,并悬浮在0.9 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或盐水溶液中。CAT样品的10%组织匀浆在2500 rpm下离心10分钟,POD和SOD样品在3500 rpm下离心15分钟。收集获得的上清液,使用南京建成生物工程研究所(南京,中国)的市售试剂盒测定CAT、POD和SOD的活性,并分别使用分光光度计在405、420和550 nm进行测量。

对与VW抗性相关的防御酶,即PAL和PPO,在0、1和2 DAI时进行活性测试。每个样品的新鲜根(0.1 g)在液氮中研磨,然后悬浮在0.9 mL的冰提取液中。PAL样品的组织匀浆在4℃、10000转/分下离心10分钟,PPO样品在4℃、8000转/分下离心10分钟。根据南京建成生物工程研究所PAL和POD检测试剂盒的说明书对所得上清液进行进一步处理,并在209和525 nm分光光度法测定。

选择MDA、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等与VW抗性相关的生化物质,评价V991侵染过程中MDA含量的变化。新鲜根(0.1 g)在液氮中研磨,然后悬浮在0.9 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或生理盐水中进行MDA、可溶性蛋白和脯氨酸测定。MDA样品的匀浆在2500 rpm下离心10 min,可溶性蛋白和脯氨酸样品的匀浆在3500 rpm下离心15 min。可溶性糖含量:用1 mL蒸馏水将0.1-0.2 g新鲜根碾碎,在沸水浴中培养10 min。冷却后,可溶性糖的组织匀浆在室温下以8000转/分离心10分钟。收集上清液按照南京建成生物工程研究所MDA、可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸检测试剂盒说明书进行含量测定,分别在532、620、595和520 nm分光光度法测定。每个样品进行三次生物复制。

RNA提取,文库构建,转录组测序

根据RNAprep Pure Plant Kit (Tiangen, Beijing, China)的说明书,从冷冻根中提取每个样品的总RNA。提取的RNA首先通过1%琼脂糖凝胶电泳进行降解和污染检测,并通过Bioanalyzer 2100系统(Agilent Technologies, CA, USA)的RNA Nano 6000检测试剂盒进行完整性评估,随后在Qubit®2.0荧光计(Life Technologies, CA, USA)中使用Qubit®RNA检测试剂盒进行校准。根据制造商推荐的NEBNext®Ultra™RNA library rep Kit for Illumina®(NEB, USA),每个样品需要高质量的RNA (3 μg)用于cDNA文库构建,并添加索引码以将序列归属于每个样品。用聚t低聚磁性珠纯化总RNA后,将mRNA裂解成150-200 nt RNA插入物,利用随机六聚体引物和M-MuLV逆转录酶(RNase H .)合成第一链cDNA)和第二链cDNA用DNA聚合酶I和RNase h对双链cDNA进行末端修复和适配器连接。合适的片段用AMPure XP系统(Beckman Coulter, Beverly, USA)纯化,PCR扩增富集。随后,PCR产物使用AMPure XP系统进行纯化,并在安捷伦Bioanalyzer 2100系统上进行文库质量评估。对于聚类生成,使用TruSeq cluster Kit v3-cBot-HS (Illumina)的cBot聚类生成系统对索引编码样本进行聚类。总共从18个RNA-Seq样本(分别在0、1和2 DAI处的两条棉花系,进行了3次重复)构建了18个cDNA文库,并使用Illumina HiSeq™2500测序平台在流式细胞上进行了测序。

数据质量控制和参考基因组的读取映射

FASTQ格式的原始数据首先通过内部Perl脚本进行处理,从而产生读取序列及其相应的基本质量。干净的数据是通过过滤适配器和低质量的读取与聚N根据Illumina管线> 10%或Q20 < 20%,然后计算Q30和GC含量。

高质量的干净读取被映射到g .分子作为参考基因组[40]连同基因模型注释文件下载自CottonGen数据库(http://www.cottongen.org).的索引g .分子用Bowtie v2.2.3构建基因组,配对的末端清洁reads与参考基因组对齐(g .分子)使用TopHat v2.0.12 [84].

度分析

为了量化基因表达水平,利用HTSeq v0.6.1计算每个基因映射的读数,然后根据基因长度和该基因映射的读数,利用FPKM值计算每个基因的表达水平。FPKM是目前最常用的估计基因表达水平的方法,它同时考虑了测序深度和基因长度对reads计数的影响[70].

使用DESeq R包(v1.18.0)识别对照组和处理组的差异基因表达,为基于负二项分布的模型识别数字基因表达数据中的差异表达提供了统计例程。为了管理FDR, Benjamini和Hochberg的方法被执行来调整得到的P值。DEGs被设定为调整后的基因P-value≤0.01,由DESeq确定。

用校正后的GOseq R包对DEGs进行GO富集分析P-value≤0.5作为截止值。利用KOBAS软件检测KEGG通路中DEGs的统计富集程度。

表达模式的比较

利用STEM软件(Carnegie Mellon University, USA)鉴定了DEGs对V991感染(0,1,2 DAI)的响应的时间表达模式。GO和KEGG富集分析也用于识别潜在功能基因或描述通过STEM分析识别的表达谱。

RNA-Seq的qRT-PCR验证

为了验证转录组数据的可靠性,对20个随机选择的deg进行qRT-PCR,每个样本进行3个生物学和技术重复。利用NCBI的Primer-BLAST在线工具设计所选DEGs的特异性引物。使用TranScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒(Transgen Biotech, Beijing, China)合成cDNA。qRT-PCR采用TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒(Transgen Biotech,北京,中国)在ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems,美国)上进行。以β-Actin管家基因为参照,以F: 5′-ATCCTCCGTCTTGACCTTG-3′和R: 5′-TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3′为引物,归一化相对表达水平。qRT-PCR在20 μL的体系中进行,条件为:94℃循环1次,持续30s;94°C持续5秒,60°C持续34秒,60°C持续60秒,40个循环。相对基因表达量用2——ΔΔCt方法(85].

缩写

ADR1:

激活抗病能力1

AOX:

替代氧化酶

APX型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

猫:

Cayalse

CSSLs:

染色体段替代系

戴:

接种后天数

度:

差异表达基因

迪:

疾病指数

指数:

Effector-triggered免疫力

罗斯福:

错误发现率

FPKM:

映射读取的每kb每百万的片段数

GPX:

谷胱甘肽过氧化物酶

GRX:

Glutaredoxins

人力资源:

过敏的反应

MAS:

标记辅助选择

MDA:

丙二醛

MDAR:

Monodehydroascorbate还原酶

枣疯病:

O型霉斑

简要:

主要乳胶蛋白

朋友:

苯丙氨酸ammonia-lyase

pamp:

病原体相关的分子模式

PCC:

皮尔逊相关系数

纤毛运动:

程序性细胞死亡

PDA:

马铃薯葡萄糖琼脂

圆荚体:

过氧化物酶

PPO:

多酚氧化酶

PRRs:

模式识别受体

PrxR:

酶类

PTI:

PAMP-triggered免疫力

存在:

定量实时PCR

QTL:

数量性状位点

RBOHs:

呼吸爆裂氧化酶同源物

ROS:

活性氧

RPS5:

对丁香假单胞菌的耐药性

SOD:

超氧化物歧化酶

茎:

短时间序列表达式

TAO1:

AvrB行动目标1

特克斯:

硫氧还蛋白

tts:

III型分泌系统

大众:

Verticillum枯萎

ZED1:

hopz激活的抵抗1

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下载参考

确认

不适用。

资金

本研究的CSSL群体构建得到国家自然科学基金(31101188)的支持,转录组测序和生化分析分别得到国家自然科学基金(31301343)和中央科研单位基本业务费专项资金(Y2017JC48)的支持。

数据和材料的可用性

在当前研究期间生成和分析的数据集可根据合理要求从通讯作者处获得。

作者信息

从属关系

作者

贡献

YLY, YZS和TTC构思并设计了该研究。PTL和MH拉希德起草了手稿。AYL、JWG、JWL和HHS参与了CSSL群体的构建和田间性状鉴定。QWL、QG、SQL和XHX在温室、自然田和苗圃进行了黄萎病抗性鉴定。QZ、LD、RXL和XYZ制备转录组样本并进行RNA-seq分析。ZZ、XJ、XYD、ZY参与生化试验和进一步分析。YLY、WKG、RHP对稿件进行了修改。所有的作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到于震史You-lu元

道德声明

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

附加文件

附加文件1:

样本间差异表达基因。(xl3625kb)

附加文件2:

基因在两种材料中的时间表达。(xl1123kb)

附加文件3:

与苯丙类代谢途径相关的基因名称及其表达量。(xls20kb)

权利和权限

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引用本文

李,Pt.,拉希德,m.h.,陈,Tt.。et al。陆地棉的转录组和生化分析(陆地棉)和染色体段替代系g .分子×g .取得作为对黄萎病dahliae感染。BMC植物生物学19日,19(2019)。https://doi.org/10.1186/s12870-018-1619-4

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关键字

  • 陆地棉
  • 染色体片段替代系
  • 抗黄萎病
  • 生化试验
  • 转录组分析