时间和空间的检测Candidatus.亚洲Liberibacter asiaticus假定效应转录本与黄龙冰敏感、−耐和抗柑橘寄主互作

背景

柑橘黄龙兵（HLB）是一种具有高经济意义的细菌疾病。相关代理人Candidatus.亚洲Liberibacter asiaticus是一种挑剔的，韧皮部限制，胞内细菌，由昆虫载体亚洲柑橘木虱(ACP)传播。的基因组加利福尼亚州。L. Asiaticus含有蛋白质分泌机制，表明该细菌的宿主细胞调节能力。

结果

从Ca中预测了28个候选效应器，这是一类重要的分泌蛋白。L. Asiaticus.基因组。设计序列特异性引物进行反转录(RT)和定量PCR (qPCR)，验证20个效应候选基因在多遗传背景感染柑橘中的表达。采用离体叶片接种法，在ACP暴露后6 h ~ 7 d检测效应体mRNA的表达。可以观察到，较高的细菌滴度与在所有样品中显示扩增的大量效应器相关。效应器的表达式比较柑橘主机级别不同的HLB宽容,包括易感邓肯葡萄柚和华盛顿脐橙,宽容的锌和克利奥帕特拉的普通话,和耐幽灵三叶的和卡里佐citrange。在所有基因型中均观察到相对高的表达CLIBASIA_03695那CLIBASIA_00460那CLIBASIA_00420那CLIBASIA_04580那CLIBASIA_05320那CLIBASIA_04425那CLIBASIA_00525和CLIBASIA_05315以宿主特定的或非专题方式。每个HLB响应组中的两种基因型也显示似乎不同的效应表达谱。在伴随研究中，在患有已加入的自己根生根柑橘的叶子和根之间比较了效果料的表达。L. Asiaticus.-感染了一年多结果显示表达较高CLIBASIA_03875那CLIBASIA_04800和CLIBASIA_05640在所有叶子和杜鹃和克利奥帕特拉的一些根组织。

结论

本文对Ca的时空表达进行了分析。L. Asiaticus.效应器识别出了可能对早期细菌定植、宿主耐受抑制和长期生存至关重要的候选者，这些都值得进一步研究。

黄龙病(HLB)是目前柑桔作物中最具破坏性的病害，严重影响了美国和世界柑桔产业的生产。在美国，它与细菌有关Candidatus.单独的asiaticus（CA.L. Asiaticus.）.加利福尼亚州。L. Asiaticus.是否受到柑橘的α-蛋白杆菌到韧皮植物细胞，并由昆虫载体亚洲柑橘类糖脂糖（ACP，Diaphorina citri）.可能与它的细胞内性质有关。L. Asiaticus.苛求，在无菌条件下不能持续培养[1那2］.因此，对该病原体的Koch假设尚不完整，对细菌致病机理的研究尤其具有挑战性。然而，一些Ca的全基因组序列。L. Asiaticus.已报告并向公众提供分离菌株[3.那4.那5.那6.］.序列数据为该细菌的进化提供了有用的遗传信息，并允许对毒力机制和基本代谢进行推断。基因组数据集包括许多可用于功能分析的反向遗传学假定基因。

植物已经进化了分层先天免疫系统，通过间和细胞内防御功能[7.］.细胞表面受体可以感知病原体来源的分子，如病原体相关分子模式(PAMPs)，然后激活pamp触发免疫(PTI)。反过来，病原菌分泌效应蛋白抑制PTI或调节植物生理以促进疾病的发展，从而导致效应触发易感性(ETS)。不相容的宿主维持抗性(R)基因，能够识别效应体，然后引起快速免疫反应，被归类为效应触发免疫(ETI)。在Ca。L. Asiaticus.基因组，已经确定了一组鞭毛相关基因[3.),包括弗拉基因包括22-氨基酸PAMP FLG22 [8.］.用柑橘宿主指示CA.L. Asiaticus.Flg22诱导的植物防御在敏感和耐寒柑橘之间的强度不同，表明这可能在抗病中起作用[9.］.在Ca的研究中。L. Asiaticus.效果，在网上基因组搜索发现了一系列候选基因[10.那11.］.蛋白功能研究表明，效应子CLIBASIA_05315诱导了白蛋白的eti样反应烟草benthamiana(11.]，并导致细胞淀粉过度积累，这是一种典型的与HLB相关的生理紊乱[12.］.最近，一种木瓜样半胱氨酸蛋白酶被鉴定为CLIBASIA_05315在柑橘中的靶标，这揭示了HLB毒力机制的一个有趣方面[13.］.

效应生物学是作为对植物病原体相互作用的调查的一个重要方面，因为分泌的效应蛋白在致病性中发挥着许多作用，导致初始感染和宿主定植。对基本效应生物学的理解是揭示病原体进化以实现毒力的关键，包括亚细胞本地化，宿主细胞调制机制，以及在Planta.结合目标包括易感基因和R基因[14.那15.那16.］.重要的是，效果的表征为作物抗性育种提供了指导和加速。在打击马铃薯后期枯萎Phytophthora Infestans.，越来越多的R基因效应对[17.那18.]，并用于育种，以选择自然产生的具有持久抗性的R基因[19.］.另外，从生化或遗传方法鉴定的R基因也可以克隆并用于转基因生产抗病品种，这一策略已在番茄中得到证实[20.)、大米(21.]， 土豆 [22.]及紫花苜蓿[23.]作为例子。

对HLB的遗传抵抗似乎缺乏柑橘类属。然而，在受控接种中，已经观察到疾病耐受性，如轻度症状和树木发育的减少损伤[24.那25.]和野外病原体接触[26.那27.那28.］.在佛罗里达州，评估为83柑橘类和柑橘类亲属加入6年的HLB鉴定的Citron（柑橘类的书）作为遗传源的遗传来源[28.］.这柑橘类亲缘三叶橙(poncirus trifoliata)及其杂交种已成为重要的砧木资源，并在多项研究中表现出明显的抗HLB [27.那29.那30.］.另一方面，具有重要商业价值的柑橘类，如葡萄柚(c .天堂金花蛇），甜橙（C. Sinensis.）和普通话（c .试)均受到HLB的负面影响，但病情严重程度差异很大。一些研究报告了一些普通话中可能有用的耐受性[24.那26.那31.]，这也似乎是可遗传的（橄榄球，未发表的结果）。

在这项研究中，我们进行了在网上对CA的分析。L. Asiaticus.基因组并鉴定了总共28例疗效候选者。在CA中检测到20个效应器的mRNA。L. Asiaticus.通过RT-qPCR检测感染的柑橘用离体叶片法检测虫媒细菌的传播，在ACP侵染后6 h至7 d均能检测到效应体mRNA，且检测到的效应体数量与细菌效价呈正相关。在HLB耐受性不同的6种柑橘类型中，分别是佛手柑、邓肯柚、克利奥帕特拉柑橘、三叶Pomeroy trifoliate、华盛顿脐橙和Carrizo citrange。结果表明，一些效应候选基因在不同的柑橘基因型中均有较高的表达，而其他效应基因则具有宿主特异性表达模式。本实验还比较了侵染钙的柑桔叶片和根组织中效应子的表达情况。L. Asiaticus.超过一年。发现几种候选效应源在叶组织中具有相对高的转录水平，有些在根中具有更高的表达。在一起，这些研究提供了关于CA的指导信息。L. Asiaticus.在早期和晚期定植阶段和不同组织和宿主的利用/部署效应器，这可能导致有希望的功能性分析和直接柑橘抗性育种的候选者。

加利福尼亚州。L. Asiaticus.分泌物组分析用于效应器候选识别

加利福尼亚州。L. Asiaticus.psy62 v1 genome (Genbank accession NC_012985.3) [3.]用于生物信息化的效果预测。基于细菌分泌蛋白的共同特征，使用SignalP过滤1136蛋白编码序列[32.]预测信号肽（SP）的存在（附加文件1:表S1A)，然后受到TMHMM v2的影响[33.那34.]消除跨膜结构域的蛋白质[35.］.随后，筛选出小于200个氨基酸的候选基因，并使用国家生物技术信息中心(NCBI) BLAST工具进行同源性搜索。本研究对无注释同源物的蛋白进行分析。由28个假定的Ca组成的一组。L. Asiaticus.鉴定效应器并用于以下实验（附加文件1：表S1B和图3B。1）.

利用RT-qPCR检测柑橘Ca感染多基因型中可能的效应子。L. Asiaticus.

设计了反转录和qPCR的序列特异性引物(Sequence specific primer, SSPs)，以提高特异性和低富集效应子的扩增能力。在mrna的3 '端选择逆转录引物，引导cDNA第一链的合成。设计cDNA合成引物结合区域下游的正向引物和反向引物(附加文件)2:图S1)。由于目的之一是确定HLB敏感、−耐受和抗抗柑橘之间效应子的表达模式是否不同，因此使用多个柑橘品种对SSPs有效性进行了测试，特异性被定义为在Ca中阳性扩增。L. Asiaticus.-受感染的组织，但未受感染时没有从Ca中分离得到RNA。L. Asiaticus.对香橼、邓肯柚子、克利奥帕特拉柑桔、华盛顿肚脐、三叶Pomeroy trifoliate和Carrizo citrange等阳性和阴性叶片进行cDNA合成和qPCR。20个候选效应器的sps显示出Ca。L. Asiaticus.所有柑橘基因型中靶标的特异性扩增（图。1和额外的文件3.：表S2），而在至少一种未感染的柑橘基因型中剩余扩增。

Ca早期效应体表达。L. Asiaticus.-柑橘互作和细菌效价依赖效应mRNA检测

由于这种生物的苛刻性质，常见的细菌接种方法不能用于研究CA之间的早期相互作用。L. Asiaticus.和柑橘。本研究采用前文所述的离体叶ACP侵染进行接种[36.] （无花果。2研究早期感染的时间进程。比较Ca。L. Asiaticus.使用具有不同HLB耐受性水平，Citron，Duncan和Cleopatra Citrus的柑橘基因型中的效应表达。将来自每个基因型的叶片暴露于ACP饲料6小时（h），1,3和7天（d）。Midrib DNA分析表明了所有时间点和柑橘基因型的一些成功的细菌传输，其提供多个CA.L. Asiaticus.效应表达研究的阳性样品（图。2b）。在每个时间点和基因型的三个随机选择的受感染样品用于RT-QPCR，并且在所研究的所有时间点和基因型中显示出效应器mRNA的检测（附加文件4.：表S3）。RT-QPCR检测的效果次数通常在大多数样本中难以施加平均计算和统计数据;虽然一些效应表现出在邓肯和克利奥帕特拉的“4025”等两个以上的时间点（例如Citron和'5315'）（来自CA的最后4位数字）。L. Asiaticus.基因座位名称用于简单起见）。明显的是，在6小时和3D中具有较高细菌滴度的两个样品提供了较大数量的效果的可检测的mRNA（附加文件4.：表S3），其导致假设，即RT-QPCR检测到的细菌滴度和效应器的数量是正相关的。

要测试这个假设，额外的CA.L. Asiaticus.为了更大的数据集和更多样化的样本池，我们将感染较晚阶段的感染样本包括在内。这些RNA样本来自之前对柑橘对Ca的转录组反应的研究。L. Asiaticus.接种后2、4、6、8和10周[9.[来自每个时间点的多个样品用于效应mRNA检测。从RT-QPCR数据，表达的效果数量被计算并绘制了C_t值量化Ca。L. Asiaticus 16 S.在每个样本和每个基因型。结果表明，在三个柑橘基因型测试的两组变量之间存在显著的线性关系，其中克利奥帕特拉(R²= 0.80)，邓肯组最低(R²= 0.33)(图3.A-C）。

柑橘种类中的差异效应表达，具有各种HLB耐受性

为了确定HLB耐受性、易感性和抗性宿主在同一侵染阶段的效应表达模式是否不同，本研究采用了两个高度敏感的柑橘基因型(邓肯和华盛顿脐橙)、两个耐受性基因型(克利奥帕特拉和香橼)、两种抗性基因型(三叶Pomeroy trifoliate和Carrizo citrange)。对6个基因型的柑橘叶片进行了7天的接种接种，只接种了Ca。L. Asiaticus.效应分析采用阳性。比较每个柑橘类型内效应子的相对定量(RQ)，以确定可能对毒力至关重要的高表达候选因子。在敏感邓肯中，只有' 4425 '有高表达，而其他检测到的效应蛋白水平相似(图2)。4.a).效应子‘0460’和‘3695’在华盛顿脐带中表达最多(图3)。4.b）。在Citron'3695'中，显示了所有效果的最高表达，并且“0460”和'0420'也高度排列（图。4.c).同样，在克利奥帕特拉中，‘3695’的表达量最高，而‘4580’和‘5320’的表达量高于其他大多数基因(图2)。4.d）。Trifoliate Orange Pomeroy显示为“0420”和“0460”，作为最高表达组，其次是“0525”和“5315”作为下一组（图。4.e).在Carrizo中，' 0460 '和' 4580 '表现出显著高于其他效应因子的水平，而其他效应因子之间没有差异(图4)。4.f).因此，我们注意到‘4425’在敏感邓肯中基因型特异性高表达，而‘3695’和‘0460’在多个柑橘中基因型非特异性表达。每个hlb反应组中的两种基因型也显示出似乎彼此不同的效应体表达谱。

叶片和根组织之间的差异效应表达在CA.L. Asiaticus.来华的柑橘

众所周知，感染CA。L. Asiaticus.发生在柑橘根中，直接影响树的健康，也作为接种源，通过维管运动的细菌[37.］.对叶片和根部的效应表达的比较分析进行研究，研究效应表达是否具有组织特异性模式，表明细菌采用不同的致病策略来定植在地下植物器官上方和低于地下植物。加利福尼亚州。L. Asiaticus.-受ACP感染的自根香橼、邓肯和克利奥帕特拉于2016年被接种[9.］.对所有植物进行Ca。L. Asiaticus.一年后，耐受性香橼和克利奥帕特拉植株出现了症状，但仍保持了与未感染对照植株相似的生长(图1)。5.A和C），而Duncan工厂表现出显然的生长和分支死囚（图。5.b）。

细菌滴度由16 S.邓肯和克利奥帕特拉根的定量比叶低，但这一差异在香橼中不显著(图2)。5.d）。相应地，RT-QPCR的效果分析表明，在根中检测到少量的效应器，而不是所有柑橘类别中的叶片（图。5.e)，这与之前对效价依赖效应mRNA检测的观察结果一致(图)。3.）.在检测到的效应子中，‘5640’在香橼叶片和根组织中表达量最高，‘3875’和‘4800’在叶片中表达量也最高(图2)。6.a - b)。在Duncan中，‘3875’和‘4800’是表达最高的效应子，尽管‘4800’在根中与检测到的其他效应子相比差异不显著(图3)。6.c - d)。CA的表达。L. Asiaticus.在克利奥帕特拉的叶片中，效应候选基因的表达量普遍高于香橼和邓肯，其中叶片中表达量最高的是‘4800’、‘3875’和‘5640’，它们是克利奥帕特拉根中检测到的唯一的效应基因(图2)。6.e-f)。

病原细菌的分泌体是在定殖过程中发挥攻击作用的一系列分子，其中效应体是一类重要的蛋白质，能够抑制防御和/或操纵宿主生理。Ca全基因组测序。L. Asiaticus.提示这种胞内挑剔的细菌缺乏胞外病原体典型的III型和IV型分泌系统，但维持编码总分泌途径/秒转位的基因[3.]，这是建议成为CA的主要途径。L. Asiaticus.效应分泌[10.］.由于诸如分泌SP的存在的常见特征，可以计算地预测效果？38.这加快了关键毒力因子和目标宿主耐药/易感基因的发现[39.］.在本研究中，通过过滤Ca，共识别出28个候选效应器。L. Asiaticus.基因组存在SP的存在，不存在跨膜结构域和相对较小的蛋白质大小（附加文件1：表S1）。此候选名单列表包含在先前筛选中识别的效果，不同参数[11.]还在分析SEC-Valsiocon依赖性蛋白质中发现[10.]，确认本研究中使用的生物信息学方法的细菌效应特征和可靠性的共性。

病原菌效应体研究的一个重要方面是分析微生物与植物相互作用的初始表达水平。具有高水平转录的效应候选物提示了病原体在感染过程中对活性蛋白的利用，这可能为进一步功能研究的效应物的选择提供指导。决定Ca。L. Asiaticus.通过RT-QPCR表达，我们使用SSP进行cDNA合成和不同组SSP的QPCR（附加文件2：图S1），其在目标扩增中具有更高的特异性，比使用CDNA的随机引物或用于cDNA合成的相同反向SSP和QPCR（数据未示出的数据）更高的性能。结果，总共20个inter集（附加文件3.:表S2)提供良好的Ca。L. Asiaticus.多种柑橘基因型中的特异性扩增，包括相对较远的物种poncirus trifoliata。CA的表达。L. Asiaticus.效应器已经在一些研究中被报道过。例如,Ca。L. Asiaticus.比较了感染柑橘和ACP之间的效应基因表达谱，发现了有趣的候选基因在两个宿主中有差异表达[40］.在另一项研究中，半定量RT-qPCR检测了CLIBASIA_05315那CLIBASIA_00460那CLIBASIA_03230和CLIBASIA_05640在几种柑橘类类型中CLIBASIA_05315承诺作为疾病早期检测的标记基因，因为它在无症状组织中表达[41.］.然而，由于细菌接种是通过嫁接进行的，这些研究中的植物材料来自相对较晚的感染阶段，可能至少在最初的疾病暴露后的几个月[40］.分子事件如效应器的防御抑制和etil相关的超敏反应发生在接触的早期阶段，从最初接触病原体的数小时到数天[42.］.因此我们假设高表达的Ca。L. Asiaticus.在寄主早期互作过程中，效应体对细菌毒力的影响尤为重要，对其的鉴定可能有助于发现柑橘的抗病/易感基因。

为了验证这一假设，我们使用离体叶片接种来研究初次细菌接触后7天内效应体的表达(图。2）.有效的CA。L. Asiaticus.在侵染后，在6小时内观察接种，导致多个柑橘基因型中的宽范围的细菌滴度（图。2罪犯)。RT-qPCR分析显示，在不同时间点仅能检测到几个效应基因的mRNA，这使得大多数基因难以进行平均比较。然而，‘4025’在citron中的表达，以及‘5315’在Duncan和Cleopatra中的表达在连续的时间点上是一致的(附加文件4.：表S3），提出早期宿主相互作用期间可能的作用，特别是'5315'，其操纵淀粉积累的宿主细胞[12.并抑制植物的防御[13.］.在所有样品中，效应mRNA的检测是滴度依赖的，在细菌定量较高的样品中，扩增的效应子数量较高。这一点通过对香橼、邓肯和克利奥帕特拉的更大样本量的分析得到进一步证实(图。3.）.这表明效应mRNA随细菌细胞数增加，因此低于QPCR检测极限的效果可能在具有高细菌滴度的柑橘样品中变得明显。值得注意的是，本研究中使用的时间点可能与“接种后的小时/天（HPI / DPI）”，而是接收访问期（IAP）'[36.]，在其中接种发生。在我们的研究中，这种持续七天的接种可能解释了效应剂在时间点比较中的模糊表达模式。因此，为了简单起见，我们在接下来的研究中只选择7天IAP作为早期细菌-宿主相互作用的代表。

为了在柑橘宿主中发现具有各种HLB耐受性的疗效，六种基因型，包括Citron，Duncan，Cleopatra，Pomeroy Trifoliate，华盛顿肚脐和Carrizo通过常见的ACP人口受到分离的叶片接种（7天）。成对比较在每个基因型中排名效应表达水平以鉴定较高表达的候选物（图。4.）.一些效应子在多个基因型中显示相对高表达，包括' 3695 '在citron, Cleopatra和Washington navy， ' 0460 '在citron, Washington navy, Pomeroy和Carrizo， ' 0420 '在citron和Pomeroy， ' 4580 '在Cleopatra和Carrizo(图2)。4.A-f)，表明这些毒力因子在感染早期广泛活跃。在这些效应子中，‘3695’和‘0460’的mRNA在耐hlb和敏感柑橘中均检测到较高水平，表明它们为细菌定殖提供核心毒力功能。然而，一些效应子显示了耐受性/敏感性相关或宿主特异性的高表达，包括' 0420 '在citron和Pomeroy中，' 4580 '在Cleopatra和Carrizo中，' 5320 '在Cleopatra中，' 4425 '在Duncan中，' 0525 '和' 5315 '在Pomeroy中，表明宿主遗传可能影响病原菌毒力因子的表达。如果得到证实，这些耐受性或抗性相关效应可能被用作从柑橘育种材料中筛选HLB耐受性/抗性的生物标志物。此外，这些高表达的效应子可作为生物化学分析识别宿主结合靶点的候选基因，从而揭示重要的毒力机制，并导致抗性柑橘的产生。

本研究以侵染一年以上的香橼、邓肯和克利奥帕特拉(Cleopatra)植物为研究对象，在耐性和敏感的柑橘寄主中充分建立病原体后，评估其叶和根组织的效应表达。5.）.遍布所有三种柑橘基因型，叶片之间的表达模式在叶子中相似（图。6.f)。RT-qPCR检测到的效应体数量在根中比在叶中少(图2)。5.D-E）可能是由于低细菌滴度。候选人'3875'，'4800'和'5640'的叶子表达是最高的，无论柑橘基因型/ HLB耐受水平如何，最高（图。6.a, c和e)。与感染早期相比，香橼、Duncan和Cleopatra的表达谱明显不同(图2)。4.a-c)，这可能表明Ca。L. Asiaticus.在感染的时间过程中部署不同的效果。这与报告一致，即这是通过成功殖民化的病原体使用的共同策略[15.］.我们基于离体组织的早期寄主相互作用研究可能受到与母株分离相关的植物生理变化的影响。然而，许多研究人员利用离体叶片接种研究植物-病原体相互作用的结果，包括了解微生物致病性和筛选抗性寄主，并被证明与整株试验结果一致[43.那44.那45.那46.那47.］.此外，在每个样本时间，我们也评估了柑橘内源性基因的mRNAUPL7而且在所有时间点和所有基因型的表达都是相似的，这表明在整个研究期间新陈代谢没有受到影响。在根部,高mRNA丰富的锌和“3875”“5640”在邓肯和克利奥帕特拉,甚至细菌浓度较低,可能是证据表明其功能可能导致HLB-related根损伤如根淀粉消耗和枯死因果而不是HLB疾病的结果(37.那48.］.综上所述，本部分研究确定了在HLB耐受性和易感性柑橘定殖后表现出更高表达的效应候选基因。这些候选基因的功能分析可能会加深对慢性Ca过程中细菌毒力和宿主相互作用的了解。L. Asiaticus.感染。

从CA中鉴定了一组28个候选效果。L. Asiaticus.通过生物信息学的基因组。研究了易感邓肯柚子和华盛顿脐橙、耐受性香橼和克利奥帕特拉柑桔和抗性三叶Pomeroy trifoliate和Carrizo citrange 7天内接触ACP的感染柑橘叶片的转录水平。候选人效应物CLIBASIA_03695那CLIBASIA_00460那CLIBASIA_00420那CLIBASIA_04580那CLIBASIA_05320那CLIBASIA_04425那CLIBASIA_00525和CLIBASIA_05315表现出较高的宿主特异性或非特异性表达。在HLB暴露1年以上的柑橘植株中，叶和根组织中效应子的表达量比较表明，效应子的表达量较高CLIBASIA_03875那CLIBASIA_04800和CLIBASIA_05640在所有的叶片和部分根组织中，邓肯和克利奥帕特拉基因型。所确定的Ca。L. Asiaticus.具有高颞率和空间表达水平的候选者可能在早期细菌定植，宿主耐受性抑制和长期存活中具有作用，这将受到进一步的功能研究。

植物材料

所有的植物材料都是在美国园艺研究实验室温室设施中无性繁殖和维护的。邓肯柚子、克利奥帕特拉柑橘、香橼、三叶Pomeroy trifoliate、华盛顿海军橙和Carrizo citrange的健康幼苗被种植在温室的花盆里，每天浇水，每周施肥。按需施用园艺矿物油防治害虫，不施用其他杀虫剂。对于离体叶片接种，每个柑橘类型的叶片在相似的成熟度和大小采集，清洗后立即用于描述实验。叶子和根的分析使用了从种子中提取的香橼、邓肯和克利奥帕特拉植物，并在一年多前接种，证实为Ca。L. Asiaticus.- 在检疫温室中进行。

分离叶接种和样品收集

上午10点至中午采集叶片样品，在实验室中轻轻冲洗并晾干，叶柄置于1.5 mL离心管中，用parafilet密封。将每片叶柄浸泡在水中的离体叶片置于50 mL带网顶的塑料离心管中，并与10个木虱接触。L. Asiaticus.受感染的植物。含有叶片和椎间盘润滑灯的管保持在实验室长凳上，每天16小时的补充光线。前面的光线设置在9687±3460 lm / m的光强度下描述²(49.］.在破坏性取样时，通过真空除去ACP，并在取样之前擦拭叶子。在6小时，1D，3D和7D后，每次收集10-15个叶子，或者在7D时间点处的每个柑橘基因型收集。为PCR定量CA切除MIDRIB组织。L. Asiaticus 16 S.rDNA，其余叶片组织先置于液氮中，然后在−80℃下保存，用于RNA分离和表达分析。

整株接种和样品采集

加利福尼亚州。L. Asiaticus.在2016年之前的一项研究中，受ACP感染的香橼、邓肯和克利奥帕特拉植物都是从种子中获得的，它们都被接种了ACP感染，并与未受感染的对照植物一起在温室中保持[9.］.简单地说，六种年轻的柑橘植物被400年左右的细菌侵染。L. Asiaticus.圆顶笼中的阳性ACP或阴性ACP（嘲弄）2周。然后通过抽吸除去昆虫，并用碳酸杀虫剂处理植物，并恢复了温室生长条件。从每株植物中收集4至6个叶子的池，并用于效应表达的叶片分析。从每种植物的根部质量进行纤维状根，漂洗并储存在-80℃以进行分析。

Ca的决心。L. Asiaticus.细菌滴度

量化CA.L. Asiaticus.在柑橘叶片中，使用DNeasy plant mini试剂盒(Qiagen, Gaithersburg, MD, USA)从叶片中脉或须根中分离DNA，并使用NanoDrop分光光度计(Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA)测定DNA的数量和质量。每个样品用100 ng DNA进行Ca的qPCR。L. Asiaticus 16 S.RDNA使用LAS长底漆和Sybr Chemistry（Thermo Fisher Scientific，Waltham，Ma，USA）和ABI7500热循环仪（应用生物系统，福斯特城，USA）。阈值循环（C_t)，用标准曲线法计算细菌效价[9.］.

RT-QPCR效应候选的表达分析

从Ca中分离得到总RNA。L. Asiaticus.按照制造商的说明使用TriZol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)检测阳性叶子或根样品。使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)进行柱上DNase处理和RNA纯化。使用纳米滴分光光度计(Thermo Scientific)测定RNA的数量和质量。取1 μg RNA，用quantitative Reverse Transcription Kit (Qiagen)合成cDNA。ssp的混合(附加文件3.：表S2）瞄准CA.L. Asiaticus.效果，16 S.和柑橘的内源性基因UPL7用于每个终浓度为0.5μm的cDNA合成。根据试剂盒方案进行每个样品的20μL逆转录反应。随后，将CDNA稀释至5ng /μl，在每个QPCR反应中使用2μL和向前和反向SSPS（附加文件3.:表S2)来放大候选效应器。

机场核心计划:

亚洲柑橘类洋谷

加利福尼亚州。l . asiaticus:

Candidatus.Liberibacter asiaticus

C_t：

循环阈值

eti：

Effector-triggered免疫力

美国教育考试服务中心:

Effector-triggered易感性

HLB：

huanglongbing

hpi / dpi:

小时/天接种

IAP：

接种访问期间

NCBI：

国家生物技术信息中心

PAMPS：

其分子模式

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

RT-qPCR:

逆转录定量PCR

SP:

信号肽

SSPs:

序列特异性引物

我们感谢Ellen Cochrane在使用各种柑橘类植物材料方面的支持，以及Kathy Moulton为亚洲香橼接种提供ACP种群。我们也感谢Chelsea Veith, Spencer Marshall和Shelby Durden提供的实验室技术支持，Yolanda Avila提供的一般实验室支持，以及张朔在数据统计分析方面的帮助。

资金

资金由美国佛罗里达州阿尔弗雷德湖的柑橘研究和发展基金会(CRDF)提供。资助机构通过资助的项目目标指导研究的设计和实验的进行。

数据和材料的可用性

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。

从属关系

1. 美国农业部农业研究局美国园艺研究实验室，美国佛罗里达州皮尔斯堡

   青春史，水剑张，约瑟夫克里斯特，罗伯特G. Shatters JR，David G. Hall＆Ed Stop

2. 美国佛罗里达州皮尔斯堡佛罗里达大学印度河研究与教育中心植物病理系食品与农业科学研究所

   Marco Pitino＆Liliana M. Cano

贡献

QS, MP, LC和ES提出了这个项目的想法。实验由QS和MP设计。QS, MP和LC进行了实验。QS, MP, LC, SZ, JK对数据进行分析。RS和DG贡献了材料和分析工具。论文由QS, MP和ES撰写。所有作者均已阅读并批准本稿件。

相应的作者

对应到埃德斯托弗。

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有利益冲突。美国农业部是一个机会均等的提供者和雇主。本文中提到的商品名称或商业产品仅为提供具体信息的目的，并不意味着美国农业部的推荐或认可。

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