浮游植物社区中的定量大分子模式通过单细胞同步型FTIR-Spectroscopy在分类水平处解决

背景

关于浮游植物生物质的批量分析的技术限制限制了我们对天然群体中的碳通量的理解，因此，在水生生态系统中碳，营养素和能量循环。在这项研究中，我们利用了同步的FTIR微光谱和部分最小二乘回归（PLSR）算法，同时在模拟浮游植物群落中的单细胞水平同时量化蛋白质，脂质和碳水化合物含量（由蓝色细菌组成，生长在两个温度（15°C和25°C）中生长的绿色藻类和硅藻。

结果

产生的PLSR模型为量化细胞大分子呈现出高质量的合适（R.² ≥ 0.90) and low error of prediction (RMSEP 2–6% of dry weight). The regression coefficients revealed that the prediction of each macromolecule was not exclusively dependent on spectral features corresponding to that compound, but rather on all major macromolecular pools, reflecting adjustments in the overall cell carbon balance.

通过内核密度估计研究研究的单细胞分析表明，大分子密度分布模式在15℃和25℃下不同。然而，由于群体异质性，在两个温度下，大部分细胞在两个温度下具有生物化学相同。

结论

本研究中呈现的光谱方法允许在单一浮游植物细胞中定量大分子。该方法表明，群体异质性最有可能确保可能迅速利用新的有利地位基因的非适应细胞的备份。这一发现可能对浮游植物群体的生态学产生重要影响，并表明“平均细胞”概念可能大大限制了水生生态系统中的人口动态和生物地球化学循环的理解。

将无机营养成分分化为有机大分子允许浮游植物生长。基因型和环境限定了新细胞的大分子化学计量（即蛋白质：脂质：碳水化合物），因此需要产生它们的电子和碳（c）[1]．因此，细胞大分子的精确量化将阐明生物质生产的成本和质量[2那3.那4.]．从生理学的角度来看，这可能揭示了不同生长条件下有趣的适应模式，而从生态学的角度来看，它可能提供关于食物网中的能量转移和水生生态系统中的生物地球化学循环的重要信息[5.那6.那7.]．

虽然对环境变化的常见适应策略的识别可能有助于模拟自然界的主要生产[2]最近的实验研究报道，C型分配模式的调整是响应于确定的外部扰动的强烈特异性的4.那7.那8.]．值得注意的是，在克隆植物植物植物中，已经观察到细胞之间的相对大分子差异[9.那10]，由于基因表达中的群体异质性激烈[11]．这反过来又限制了我们对自然界浮游植物动态的理解，以及我们模拟初级生产的能力。预测模型确实没有考虑到如此高分辨率的调整。然而，最近的生态学理论已经在单细胞水平上缩小了(病毒-浮游植物、细菌-浮游植物、浮游植物-浮游植物相互作用等)，因此，关于种群单个生物单位的信息可能对更好地理解群落动态有很大帮助[12]．在考虑不同分类群（甚至物种）采用的巨额分配策略时，特别需要这种高分辨率，以应对环境变化[4.那7.那13那14]．

迄今为止，最多使用的技术用于确定浮游植物的大分子组成的植物成分由标准生化测定表示[15]或用C孵育样品¹⁴[16]．然而，批量测量只能提供群体的平均生化曲线，忽视单细胞之间的表型变异性。此外，生物化学测定是耗时且相对昂贵的[17那18]．其他方法使用统计学将大分子与更容易接近的细胞特征(例如，细胞特征可以描述它们在特定环境中的生长速度或适应性)联系起来。最近，Finkel等人[6.]编译了浮游植物的大分子组成的更新估计，并基于其细胞体积对大分子定量的预测线性模型进行了预测的线性模型[6.]．这项研究为浮游植物生物量中易于测量的特征(如细胞体积)和更复杂的大分子成分之间提供了一个有趣的桥梁。

诸如流式细胞术以及基因组和转录组分析的方法可能具有在单细胞水平处解析浮游植物的浮游植物[19那20.]．然而，这些方法都不能提供单个浮游植物细胞的大分子组成的概述。另一方面，傅立叶变换红外(FTIR)光谱技术已被广泛应用于单藻培养中浮游植物的大分子表征[17那21.那22.]．这种光谱技术允许获得浮游植物样品的总生化组成的快速和精确的快照，并且呈现出标准化学批量分析的许多优点[18那23.那24.那25.]．它便宜，快速，可以在单电池级别进行，当使用同步辐射作为IR源的同时与显微镜（同步rotron fTIR微谱）相结合时[7.那10那14那26.]．

使用若干方法测试了通过FTIR-Spectrowpopt的散装浮游植物样品中大分子量化的大分子[18]．然而，到目前为止，缺少单细胞中的绝对量化，确实是我们知识的最佳，文献中存在的研究仅报告了单细胞的频段强度的相对变化[9.那10那26.那27.]．为此目的，特别有用的是偶联FTIR-光谱对高级统计分析（即化学计量学）的可能性，用于构建预测模型[8.那23.那28.那29.]．化学计量学可用于将FTIR光谱链接到参考测量，产生旨在预测未知样品参数的多变量校准。在应用植物学领域中，这种模型提供了一种快速可靠的方法，用于估计否则难以评估的特定蜂窝状性状[23.那28.那29.]．几种从元素比率到更复杂的代谢过程（例如生长速率和C生产）的几种细胞性状已经在FTIR-Spectra的基础上进行了建模[8.那23.那28.那29.]．然而，这种预测模型的适用性从未在单细胞水平上进行测试。

在本研究中，我们开发了一种方法，将同步FTIR微光谱和基于偏最小二乘回归算法(PLSr)的化学计量预测模型相结合[30.那31.]，量化单浮游植物细胞的整个大分子组成。由于水生社区的天然样本可能含有大量的有机物质，细菌和其他污染物，因此作为测试该方法的应用的第一试，与天然样品相比，实验室培养物优选。为了模仿自然群群的条件，我们使用了三种不同植物物种（绿藻，蓝藻和硅藻）的定义混合物，以建立经受两个温度的模拟社区。选择温度作为诱导C型分配变化的外部因素，因为在全球变暖的背景下，它将发挥影响Phytoplankton生产力和水质的至关重要作用。尽管如此，缺乏关于温度对大分子池中C型C-分配影响的信息限制了未来预测的精度[25.那32.那33.]．Fanesi等[28.]最近报道了与温度有关的浮游植物组成的大量生化变化。然而，考虑到单细胞光谱学允许的更高分辨率，目前的方法旨在揭示有趣的种群和群落模式，否则将仍然未知。例如，不均匀的基因表达和随机水平的转录本通常被翻译成细胞在群体中可能完成的各种生理状态和功能[34.]．因此，我们假设由于表型异质性，群体与温度的响应不均匀，但其特征在于从表型的多样性产生的不同次响应。

因此，本研究的目的是利用FTIR光谱首次量化单个浮游植物细胞中主要大分子的绝对含量，并确定浮游植物群落中的亚响应。

通过参考生物化学方法进行大分子量化

干重（DW）的答:obliquus和M. eruginosa.没有受到温度的影响。另一方面，温度似乎影响更多的DW答:granulata在25°C时显著升高(见表1)1）.

不管温度如何变化，答:obliquus和M. eruginosa.显示相似的大分子组成(表1）.生物质中碳水化合物占15-35%，蛋白质占27-46%，脂类占38-46%。在答:granulata近40％的DW由SI代表。与...相比，硅藻化生物量的有机级分呈现出类似的脂质量（〜40％）答:obliquus和M. eruginosa.但较少的蛋白质（16-21％的DW）和碳水化合物（〜5％的DW）（表1）.

温度诱导大分子组成中的相关变化答:granulata和M. eruginosa.但不是在答:obliquus（桌子1）.碳水化合物在15℃下显着高，相对于25℃，答:granulata和M. eruginosa.．蛋白质显着提高M. eruginosa.在25℃，相对于15°C。在所有物种中，脂质池不受温度的影响，对于二氧化硅含量也是如此答:granulata在两个温度下导致不变（表1）.

使用PLSR的FTIR-Spectra的化学计量分析

校准图（图。1结果表明，单藻台式ftir光谱与细胞的蛋白质、脂质和碳水化合物含量高度相关。使用7个分量的R²蛋白质的模型为0.94，碳水化合物0.96，脂质0.91（表2， 图。1），RMSEC低于所有型号的DW的3％。通过休假交叉验证评估每个模型的预测性能。预测未知样品（RMSEP）的估计误差为蛋白质为6.27（DW％），碳水化合物2.49，脂质的4.89（表2）.r.²预测估计为蛋白质为0.68，碳水化合物0.76，脂质为0.70（附加档案1：图S1）。

对于每个大分子池，前7个PLSR主成分（PC）解释了与描述符矩阵，即光谱数据集和响应变量相关的最多（> 90％）（即蛋白质，脂质或碳水化合物）（表2，附加文件2：表S2，附加文件3.：表S3和附加文件4.：表S4）。

回归系数突出显示哪个光谱带主要与细胞组成的大分子变化相关，因此这是建模过程中最重要的峰值。我们专注于我们对前三个PLSR-PC的分析，因为解释了描述性和响应矩阵中的最高差异的差异。三个大分子的预测主要由相同的光谱特征驱动（图。2， 桌子2）：不对称和对称CH₂拉伸模式（2915和2848厘米^{- 1}），与脂质的C = O键的拉伸有关的带（在1740厘米处^{- 1}），酰胺I（1658厘米^{- 1}）和酰胺II（1544厘米^{- 1}）蛋白质的带。在下波数，对应于碳水化合物的峰（1153,1108,1080和1020cm^{- 1}）也被确定为模型很重要。

光谱特征对预测每个大分子的含量的贡献是特异性的。脂质驱动蛋白质预测（CH₂和C = O拉伸模式），蛋白质（酰胺I和II）和碳水化合物带（C-O和C-O-C）。碳水化合物预测主要基于多糖的C-O和C-O-C带。最后，脂质含量估计依赖于脂质CH₂拉伸，酰胺I和C-O，多糖的C-O-C条带（图。1， 桌子2）.

FTIR 2nd衍生光谱和主成分分析（PCA）

同步傅里叶变换红外微光谱技术获得了在15°C和25°C混合环境下生长的浮游植物种类的平均光谱，为每个种群的生物化学组成提供了有用的信息，这通常与生物化学分析的结果一致。为了突出与生长温度相关的细微变化，图中显示了平均二阶导数光谱。3.．M. eruginosa.在15°C时，碳水化合物区域的谱带强度更强，但在两种温度下，蛋白质谱带略有不同。的光谱答:obliquus除了在碳水化合物频率下存在的小差异，少数峰（1153和1020cm^{- 1})在15°C时高于25°C时。同样,在答:granulata，细胞光谱主要是由于950到1250cm之间的光谱窗口中存在的差异^{- 1}，这是碳水化合物和二氧化硅吸收的特征（图。3.）.

分别对每个物种进行PCA，以探讨人群如何在两个温度下生效。在这种情况下，对整个细胞群进行分析，并且每个光谱对应于一个单个细胞的整体组成。

没有考虑的人群在分数图中显示出明显的分离。相反，可以为所有人识别渐进趋势。这对人口更加明显M. eruginosa.，其中较高生长温度的效果反映在沿PC1的负分数的细胞聚类中。另外，载荷表明，碳水化合物是该趋势的负责任化合物（图。4.，附加文件5.：图S2）。

这种趋势不太明显，但仍然是可检测的答:obliquus和答:granulata．这里，观察到作为阳性PC1分数的连续梯度形式作为生长温度的函数。该载荷表明，对于这两个物种，蛋白质带负责沿PC1的细胞分离（附加文件5.：图S2）。

大分子频率分布的内核密度估计

经过校准和验证后，利用PLSr模型估算模拟群落中单个浮游植物细胞的生化组成。通过核密度估计，研究了预测模型得到的结果的频率分布，以表征群落在大分子条件下的异质性。

除蛋白质含量外，大分子的分布通常是对称的单态态度答:obliquus在15°C和25°C时，蛋白质含量M. eruginosa.在25°C，碳水化合物含量在15°C，其中观察到二级模式(图。5.）.

对于每个MacromoleCule，预测值的模式类似于通过参考方法执行的量化，但是它还出现了在两个温度下大部分重叠的密度分布（图。5.）.与从生物化学和FTIR-光谱获得的结果一致，M. eruginosa.与所有其他物种相比，经历了组合物（即，密度分布的最大移位和分离）的最大变化。当细胞在25℃生长时，蛋白质密度分布朝向更高的值移动。碳水化合物含量观察到相反的趋势。在两个温度上重叠的脂质分布（图。5.）.

答:obliquus呈现的密度分布随温度的函数而变化M. eruginosa.．在15℃下，蛋白质的分布是双峰的，两种模式在强度相似（图。5.）.在25℃下，主模式朝向更高的蛋白质含量转移，第二种模式仍然存在，但强度下降。碳水化合物的模式在15℃下略高，相对于在25℃下生长的细胞的模式，尽管具有相似的碳水化合物含量的大部分细胞（图。5.）.此外，在25℃时，分布是双峰型的。在15℃和25℃时，脂质的主要模式相同，但在15℃时，还存在另一种强度较小的模式。

答:granulata在两种温度下的调整不明显(图。5.）.有趣的是，虽然蛋白质和碳水化合物的密度分布大部分是重叠的，但脂质似乎更受影响。25℃时，分布呈双峰型，且两种分布模式均较高，而15℃时主要分布模式较高。

高分子复合建模

开发的PLSr模型对新样本的估计精度非常高(为预测值的±2-6%)(图2)。1， 桌子2)，反映傅氏红外光谱包含有关浮游植物大分子组成的主要信息[17]．

从回归系数的分析中可以看出，对每个大分子的预测并不完全依赖于与特定化合物相关的光谱特征(例如，蛋白质的酰胺I和II)。相反，每个化合物的预测是基于与细胞中存在的所有主要大分子库相对应的光谱波段(图。2）.在我们的实验中，蛋白质，脂质和碳水化合物含量的预测依赖于酰胺I和II的变化，碳水化合物的C-O-C键，以及CH₂脂质酰基链中的键（图。2）.这种大分子预测的多波段依赖性可以用ftir光谱代表一个细胞整体c代谢的快照来解释[23.]．外部扰动通常在所有主要有机池中诱导C的重新分配[3.那4.那29.那35.]．例如，在n限制下，蛋白质含量的降低通常伴随着碳水化合物和/或脂质的增加[3.那4.]．因此，除了酰胺I和II条带中的变化，蛋白质的预测也可以受益于与脂质或碳水化合物相对应的光谱带中的变化。Sackett等人报告了类似的发现。[23.]，使用对应于脂质的光谱窗口（CH₂拉伸）和碳水化合物预测南极硅藻中的蛋白质含量。最后，大分子呈现不同的振动消光系数[15]．因此，例如，通过蛋白质含量的变化，对脂质的预测更多地影响，因为酰胺I和II相对于脂质的C = O键具有更高的消光系数。即使经过类似的定量变化，这些化合物也会表现出峰强度的不可比较变化。

单细胞分析和人口特征动态

虽然Dean等人。[9.那26.那35.和Sackett等人[14使用FTIR-Spectroscopy在现场样本上，实验室中创建的预测模型尚未应用于天然样本。这里，利用模拟浮游植物群落来模拟天然样品的复杂性，并在受控条件下首次测试方法的效率。一旦校准和验证，PLSR模型用于估计由同步慢速微谱微谱扫描的单一浮游植物细胞中的绝对大分子内容物。然后通过核密度估计研究使用预测模型获得的结果的频率分布，以表征群体中的大分子术语的异质性。

从定量的观点来看，每个分布的模式类似于生物化学鉴定的变化，并根据最近的研究调查浮游植物的生化反应至温度（图。5.）.蛋白质含量似乎与温度呈正相关，而储存和结构化合物如碳水化合物，具有相反的行为[7.那25.那28.那36.]．

有趣的是，就大分子可塑性而言，种间差异是温度的函数(图。5.）.M. eruginosa.和答:obliquus是最塑料的品种答:granulata大分子的分布只发生了微小的变化。正如Sackett等人所报道的[14这种分类群特异性大分子可塑性可能是物种占用的不同生态龛的结果。支持该观察，Fanesi等人。[32.]发现与温度相同的相同结果，关于光生物学适应策略的结果。

在考虑人口内变异性时出现了不同的图片。当我们假设时，内核密度估计显示，每个浮游植物群体没有选择相对于温度均匀的响应（图。5.）.类似的结果早前也有报道[10那26.]但是，虽然对这些作者的分析是指大分子的相对量而不是绝对量化。在人口层面，响应似乎是相当复杂的，从曲线转移，歪曲和模式数量的变化。只有一小部分细胞呈现温度特异性表型。大多数剩余细胞在15°C和25℃下呈现出共用表型的池。因此，平均人口的结果可能导致错误的解释，或者，他们将无法对外部提示表示整个人口流动[37.那38.]．

随着单细胞技术的发展，群体异质性被解释为功能性状，仅仅是由基因表达和翻译水平的随机事件产生的“黑噪声”[39.那40那41.]．例如，有证据支持“赌注”理论：人口中多种表型的共存，但只有一个适用于特定条件的一个表型。这样的策略赋予了外部扰动和/或访问多个利基的恢复力，而不是只是生物学非线性的被动后果[38.]．在那些外部条件快速波动的环境中(如淡水生态系统)，这可能特别有利，在这些环境中，多种细胞表型可能确保一个种群可以占据的连续的壁龛。在这些术语中，一个种群的表型异质性可能被视为一种策略，除了适应[41.]和稳态[35.那42.]，旨在最大化物种适应性相对于外部环境．我们不能排除两个温度的增长和代谢率的差异（见附加文件6.：表S1）可能负责由单细胞分析识别的一些模式。例如，在25℃下蛋白质的高合成率[36.又可以通过表达和翻译误差来影响，提高产生和累积不同表型的可能性。

虽然我们的观察结果基于微观态度，但必须在自然栖息地进一步测试，但他们已经对基于功能特征的社区建模的知识提供了重要意义[43.那44.那45.]．例如，在克隆群体中鉴定多种表型（并且因此多个功能单元）可以使其更难以在规定的官能团中包含物种[6.]．显然，批量分析仅反映了冰山掩藏复杂人群动态的尖端。需要更多的研究是为了理解，在哪个程度的细胞功能与人口的异质性重叠，并深入了解在植物植物群体对外部扰动的反应中发挥的作用。

在该研究中，我们利用PLSR算法将FTIR-Spectra与化妆浮游植物细胞（即蛋白质，脂质和碳水化合物）相关联的主要大分子。模型用于预测单细胞的大分子含量（同步rotron Micro FTIR光谱扫描），在模拟浮游植物组合中，以研究温度对C型分配的影响。结果表明，大部分细胞表达特异性地适应于生长温度的化学表型。同时，存在另一个众多“非适应”表型存在于相同的人群中。响应于外部条件的快速和激烈变化，这种宽的群体异质性可能是有利的。实际上，具有具有新物理设置的拟合的化学表型的细胞的存在可以允许快速响应避免预先存在的细胞的适应步骤。

从技术角度来看，这种方法可能在浮游植物动态的生态研究中找到应用。在deed, a single spectral dataset may be calibrated to predict several different phenotypic traits (e.g. macromolecules, elemental ratios, growth rate etc.), opening the opportunity to obtain a complete “check-up” of single-cells in field samples and better resolve biomass quality and production in aquatic ecosystems.

文化维护

本研究中使用的物种被选择为其生态重要性和在实验室条件下生长的能力。股票培养微囊杆菌铜绿假单胞菌那Acuctodesmus倾斜和Aulacoseira granulata.半连续种植在1升Erlenmeyer烧瓶中，填充有500ml WC生长培养基[46.]在140μmol光子M的光子通量密度下保持在15和25℃。^{- 2} s^{- 1}在灯光下：14:10 h的黑暗周期。通过添加硅藻介质的维生素溶液，对原始配方进行了改性的WC培养基[47.]和双倍的二氧化硅。

为了模拟类似自然的浮游植物群落的条件，将三种浮游植物的单一培养物稀释到一个Chl一种浓度为0.01 mg^{- 1}然后以相等的量混合在一起至1L Erlenmeyer烧瓶中500ml的最终体积以产生模拟群落。对于所有实验，培养物分批生长不超过1周，并且在早期中期阶段中收获细胞（通常在5-6天后从初始接种物中发生5天）。在单一栽培和混合群体中，每种物种的日常微观细胞计数随后是每种物种的生长。生长速率被确定为细胞自然对数对时间的线性回归的斜率（附加文件6.：表S1）。

“湿法”植物植物细胞的生化特征

对每种物种的纯培养物和每种生长条件进行大分子的生化定量。在5个独立的生物学复制（即5种不同的培养物）上重复测定。通过T检验鉴定了统计学上不同的方法，其显着性水平设定为95％。

干重量量化

细胞干重测定:取细胞悬液400 mL, 20℃，2000×g离心10 min。颗粒在2ml蒸馏水中洗涤，并在5000×g室温下在预先称重的Eppendorf管(迷你旋转，Eppendorf，德国)中离心10分钟。然后将细胞颗粒在液氮中冷冻，冷冻干燥过夜。然后在分析天平中对含有干电池颗粒的Eppendorf管进行称重，以估计干重。

蛋白质量化

将30ml细胞悬浮液（约0.5-1mg dw）在20℃下以2000×g离心10分钟。将沉淀物在2ml蒸馏水中洗涤，在室温下以5000×g离心（迷你 - 旋转，Eppendorf，德国）10分钟。最终将细胞在液氮中冷冻并随后冷冻干燥过夜并储存在干燥器内的封闭的Eppendorf管中，直至进行测量。

样品用1ml盐酸重悬(18%;6 N)在2ml Eppendorf管中水解，在100°C, 800 rpm的热水瓶中水解24小时。离心(12,000×g室温离心10分钟)后，将上清转移到另一个Eppendorf管中。将等量的100 μL转移到新鲜试管中，酸在真空浓缩器中蒸发1.5 h。蛋白定量依据Starcher的茚三酮含量测定[48.]使用牛血清白蛋白（Carl Roth GmbH，德国）作为校准标准。在575nm（Spopord 250，Analytic Jena，Germany）的分光光度测定吸收。

碳水化合物量化

如上所述收获30ml细胞悬浮液。根据Dubois等人所述的酚醛硫酸方法量化碳水化合物。[49.]．将样品重新悬浮在1ml H中₂所以_4.（98％;v/ v）在2ml Eppendorf管中，在80℃，800rpm的热振荡器中水解2小时。然后将等分试样（10μL或100μL）将样品转移到新的Eppendorf管中并取决于初始细胞密度稀释（1:10或1：100，最终体积= 1mL）。最后，100μl苯酚（0.1％;w/v）加入样品中并在室温下冷却。使用葡萄糖作为校准标准，在485nm（Spopord 250，Inalytic Jena，Germany）的485nm（Spogord 250，Inalytic Jena，德国）测定吸收。

脂质量化

根据Lee等人的重量脂质定量。[50.]．如上所述收获细胞，但从400ml培养物（约7-10mg dw）开始。首先将冷冻干燥的颗粒重悬于2ml磷酸盐缓冲液（0.1M和pH 7.4）中以避免副反应。样品比在冰中冷却，然后用细胞均化器中的玻璃珠子以6000rpm（Bercellys 24，Bertin Technologies，Erlangen，Erlangen，Erlangen）中断40秒中断。该过程重复3次。然后将悬浮液冷却并在黑暗中保持在冰中以避免光氧化。将提取物转移到密封的玻璃管和有机溶剂中（约4-5ml氯仿的混合物：甲醇2：1 v/ v）加入以产生相分离。将混合物剧烈混合并以2400×g离心10分钟，得到清洁相分离。离心步骤后，用Hamilton注射器除去较低相（含有脂质提取物），转移到密封玻璃管中并保持在黑暗和冰中。重复提取步骤（通常是两次），直到插入有机溶剂和水相之间的电池沉淀得到完全漂白。

最后，在n的流下蒸发有机溶剂在化学柜中干燥₂并且脂质在分析平衡中以重量分析定量。

生物成因二氧化硅答:granulata）量化

对于二氧化硅（Si）的定量，开发了一种基于重量定量的方案。如上所述收获50-70ml培养悬浮液（约1.5-2mg dw）。将沉淀重悬于1ml蒸馏水中，并在2ml终体积中用NaClO（12％v / v）进一步稀释至6％（v / v）的终浓度。然后将悬浮液混合并在室温下在黑暗中保持不超过1.5小时。在此步骤中，所有有机化合物脱离突发性。通过短的离心旋转，排出的上清液与有机悬浮液分离出脱粉，并将颗粒重新悬浮并在蒸馏水中洗涤5-6次以摆脱残留的有机材料和NaClO。在100％丙酮（v / v）中进行进一步的洗涤步骤，最后将样品在蒸馏水中洗涤，离心并在40℃下在烘箱中干燥的截肢颗粒。

FTIR光谱法的生化表征浮游植物细胞

台式ftir光谱测量:样品制备和光谱采集

为了产生预测模型的大分子量化，还使用台式FTIR光谱仪测量通过“湿”生物化学方法测定的相同样品。已经进行了台式FTIR测量，如其他地方详细描述的[28.]．简而言之，通过温和过滤收获1.5-2毫升细胞悬浮液，重悬于蒸馏水中，以除去盐和细胞碎片。然后将样品离心（8000g 8分钟）并重新悬浮在10-20μl蒸馏水中。最后，将2μL藻类悬浮液沉积在硅微板（384孔，Bruker）上并在机柜干燥器中干燥。在传输模式中记录光谱，共加入32个扫描并在光谱范围内平均4000-700 cm^{- 1}分辨率为4厘米^{- 1}．使用相同的采集设置扫描空井测量背景信号。

FTIR-Spectra的化学计量分析：PLSR预测模型

通过参考方法（即生物化学测定）确定FTIR-SCHITE和大分子内容物之间的定量关系，建立了校准三个PLSR模型[31.]，一个用于每个大分子池（即蛋白质，脂质和碳水化合物）。使用从在15℃和25℃下生长的三种浮游植物纯培养物的FTIR台面培养物中获得的SPECTA校准每个PLSR模型作为预测矩阵，以及作为响应的相应生物化学数据[28.那29.]．基于不同的分类群的模型的发展是优选使用物种特定的，因为它们将包含不同的C分区策略，由浮游植物的进化轨迹引起[4.]．

如扇形等人的详细描述的，进行光谱预处理。[28.]．简而言之，光谱从Opus软件（V.5.0; Bruker Optics，Ettlingen，德国）出口到R环境（第3.2.3版）[51.，在3019-2819和1800-950厘米的光谱范围内切割^{- 1}，通过Savitzky-Golay算法转换为第二衍生物[52.使用一个有九个平滑点的二次多项式函数，最终以均值为中心。

PLSR已在R软件中使用Mevik和Wehrens开发的“PLS”包在R软件中实现了[53.]．正交分数算法用于PLSR。研究了模型拟合质量计算r²各大分子库的校正均方根误差(RMSEC)。该模型的预测性能由遗漏一交叉验证(LOOCV)计算的预测均方根误差(RMSEP，以%的DW表示)推断。回归系数分析了光谱特征与细胞中大分子含量的关系。

PLSR预测模型进行单细胞分析的应用

同步rotron FTIR微光谱测量：样品制备和谱采集

一旦校准和验证，PLSR预测模型被应用于在两个温度（15°C和25℃）的模拟浮游植物群体中，以研究温度对单细胞大分子含量的影响。然而，由于标准台式FTIR - 光谱仪没有单细胞测量所需的分辨率，因此通过在里雅斯特的意大利同步rotron的同步rotron ftir微谱仪获得单一浮游植物细胞谱（Elettra-sincrotrone Trieste，提案20145158号，光束线锡松，化学和生命科学分支，Basovizza，Trieste，意大利）[54.]．

将等分试样（2mL）分离心，然后固定在磷酸盐缓冲盐水溶液（2mL PBS; 0.1M，pH 7.4）和2％（v/v)福尔马林，并保持在4°C黑暗中，直到进行测量(少于2个月)。在测量前，所有样品都用蒸馏水洗涤两次，以去除细胞中的PBS残留和福尔马林。最后用100 μL蒸馏水重悬细胞;2 μL的分配量沉积在CaF上₂/ Si样品保持器并在无菌长凳下在室温下干燥。

用Hyperion 3000 IR显微镜记录光谱，其连接到Bruker顶点70干涉仪（Bruker Optics，Ettlingen，德国）连接到同步rol梁线。在传输模式下获得光谱，共加入256次扫描并在光谱范围内平均4000-700厘米^{- 1}光谱分辨率为4厘米^{- 1}和根据电池尺寸（从8×8μm至10×10μm）设置的横向分辨率。空斑的测量用作背景，采用相同的仪器设置。对每个生长条件重复混合群落实验（即两个不同的培养物）。测量每个样品的至少50个细胞（即每个条件下的每个物种），导致整个模拟社区数据集总共998个谱。

如上所述，对混合社区数据集进行了光谱预处理。然后利用“pls”软件包中的“预测”功能，根据PLSr模型估计单细胞的大分子组成。这样，在同步加速器上获得的每个单细胞光谱，都可以评估蛋白质、碳水化合物和脂质含量。

PCA进一步分析混合组合中存在的每个物种的单细胞光谱（包装“素食”）[55.来探索数据集，并强调温度函数的质量差异。

核心密度估计器用于模拟群落分析

核密度估计[56.那57.应用于PLSR模型预测的值（即单细胞蛋白，碳水化合物和脂质含量），以研究大分子频率分布作为模拟群落的温度的函数。kde已被使用，因为与标准方法（例如直方图）相比，它赋予了更多已解析的频率分布。使用R软件中存在的基本统计包来计算KDE，将平滑内核（高斯）的标准偏差为平滑带宽。

C：

碳

Chla:

叶绿素A.

DW:

净重

FTIR：

傅里叶变换红外线

KDE：

内核密度估计

LOOCV:

分析交叉验证

PBS：

磷酸盐缓冲盐水溶液

个人电脑：

主要成分

PCA：

主要成分分析

PLSR：

部分最小二乘回归

RMSEC：

校准的根均匀误差

RMSEP：

预测的根均匀误差

如果:

二氧化硅

我们承认德国研究基金会（DFG）的支持，德国研究基金会（DFG），BundesanstaltFürGewässerkunde（BFG）和公开访问公开计划中的大学莱比锡。

资金

不适用。

可用性数据和材料

在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。

隶属关系

1. 莱比锡大学植物生理学系，生物学研究所，约翰尼亚斯酒店21-23,04103，莱比锡，德国

   andrea fanesi，heiko wagner＆christian wilhelm

2. 德国综合生物多样性研究中心（IDIV）Halle-Jena-Leipzig，Deutscher Platz 5e，04103，德国莱比锡

   基督徒威廉

3. Elettra - Sincrotrone Trieste，用于光谱和成像的同步红外源- SISSI, 34149，里雅斯特，巴索维扎，意大利

   Giovanni Birarda＆Lisa Vaccari

贡献

af -计划和执行实验，分析数据，撰写和修正手稿，hw -计划和执行实验，分析数据，撰写和修正手稿，GB-进行实验，分析数据，修正手稿，lv -撰写和修正手稿。CW-planned experiment, written and corrected manuscript。所有作者都已阅读并批准了本手稿的最终版本。

通讯作者

对应于Heiko Wagner.．

伦理批准和同意参与

本研究的植物材料（硅藻答:granulata菌株CCAP-1002/1)从藻类原生动物(CCAP)培养物中分离得到;（M. eruginosa.SAG-14.85和答:obliquusSAG 276-3A）是从Göttingen大学的藻类的SAG培养集合中获得。

同意出版

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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重印和权限