花生根系对镉的解毒和转运机制存在差异

背景

花生是最重要的油和蛋白质作物之一，它在拍摄CD累积能力方面具有广泛的品种变化。然而，花生射击中的CD积累机制尚未得到很好的理解。在本研究中，在0（CK）和2μMCD条件下，研究了种子CD积累，繁华1（F，低CD品种）和Silihong（S，高CD品种）不同的两种品种的根蛋白质组学。

结果

通过蛋白质组学筛选共鉴定出4676个蛋白。其中，375、1762、1276和771个蛋白被鉴定为差异表达蛋白(DEPs)_光盘/ F_CK.,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/秒_光盘,分别。在根蛋白质组学方面，四里红比奉化1号对Cd暴露更敏感。共鉴定出30和86株DEPs分别与重金属转运和细胞壁修饰有关。四里红Cd暴露后ABCB25、ABCC14、ABCC2、PDR1和V-ATPases的上调可能增强Cd的空泡隔离及其从共质体流出到质外体的能力。四里红根水系中Cd积累量较高，可能是由于其具有较强的CW修饰能力，其中涉及IRX10L、BGLU12-like、BGLU42、EXLB1、XTH30、XTH6、XYL7、PAL3、COMT、CAD1、CCR1等多种蛋白。

结论

四里红镉脱毒的主要机制可能是Cd的空泡隔离、外流和在CW中的吸附。四里红具有较高的Cd积累和转运能力，这可能与ACA8和ZIP1有关。

镉（CD）是最有毒的重金属之一，主要是由人为活动，如污水污泥，废物焚烧和磷肥（磷肥）（磷肥）广泛排放到农田中1]．土壤镉污染直接导致其在作物可食部位的过度积累，通过食物链对人类健康造成危害。为减少镉污染对人类的潜在危害，当局已采取了多种策略[2]．其中，筛选或育种低CD积累品种将是农业安全食品的潜在方式[3.]．这需要完全阐明植物中CD摄取，易位和积累的分子机制。

花生(arachis hypogaea.油料是世界上最重要的油料作物之一，由于其营养价值高，是一种补充食品。花生营养器官和种子中Cd富集能力高，品种间差异较大[3.那4.那5.那6.那7.]．花生种子中的Cd浓度主要是由营养组织的高生物量和种子中Cd结合蛋白对Cd的衰减所决定的[3.那5.]．发现种子Cd浓度与幼苗的芽Cd浓度正相关，表明营养生长阶段的芽Cd浓度对于确定种子中Cd积累中的含量差异可能是重要的[3.那5.]．在低Cd积聚品种的根部中，观察到可溶性级分（主要在真空中）中的镉比例较高，这可能有助于其芽中的低CD积累[8.]．此外，花生中Cd积累与根系形态有关(即高Cd品种比低Cd品种有更长的细根)[7.]．虽然这些研究揭示了花生中CD积累的品种变化的一些生理机制，但分子机制尚未得到很好的研究。

植物芽中CD的积累由诸如CD痉挛流入的诸如根组织，细胞壁吸附，能量驱动的能量驱动的细胞质，在膜，真空螯合和木质载荷的细胞质中的几种方法控制。9.那10]．这些过程中的大多数由几个金属转运蛋白的家族介导，例如固有抗性相关的巨噬细胞蛋白（nramp）[11]、锌/铁转运剂(ZIP-IRT) [12]和p1b-actpases [13那14]．血浆膜局部过度表达OsNramp1在转基因水稻系中，增强芽中的CD积累，这表明涉及细胞CD吸收[11]．质膜定位的OsHMA2 [13]和athma4 [14]已经被证实参与了Cd的木质部装载。细胞壁(CW)修饰可以改变Cd的结合能力，因此可能是根-茎Cd转运的品种差异的原因[15那16]．植物CW的果胶和半纤维素组分可以提供羧基官能团以加入CD^２＋并限制Cd进入根细胞[10]．OsPME14 [17]和Atxth31 [18]有能力在根CW中增加铝（Al）保留，这可能会减少Al易位的射击。此外，已经证实，已经证实了低分子量化合物如谷胱甘肽（GSH），植物素（PCS）和金属硫蛋白（MTS）参与CD的真空封存[19]．

蛋白质组分析提供了一系列生物过程中分子变化的准确信息，是确定所考虑途径中的主要调控因子的有力工具[20.]．迄今为止，在几种植物物种（如苋菜）中已经研究了蛋白质组学的蛋白质组学的蛋白质组学差异[20.]，景天属植物alfredii[21]， 白饭 [22]和大豆[23]．鉴定了与真空Cd螯合，细胞壁代谢，CD-应力防范和其他过程相关的一些差异表达的蛋白质（DEP）[20.那21]．在花生，蛋白质组学方法已被应用于解决生物化学和生理效应以应对干旱胁迫[24]．然而，很少有关于花生品种间蛋白质组学对镉暴露的差异反应的信息。

在本研究中，基于对亲属和绝对量化（ITRAQ）的等因素标记，对种子CD积累的两种花生品种的根，奉化1（低CD品种）和Silihong（高CD品种）进行了比较蛋白质组学分析．主要目标是：（i）在不同CD曝光下评估奉化1和Silihong的根蛋白质组变化;（ii）在不同CD曝光下获得奉花1和Silihwong根系中差异表达蛋白的表达和功能模式;（iii）阐明负责两种品种之间CD积累差异的关键程序。从本研究中获得的结果将有助于了解花生CD积累品种变化的分子机制，并为筛选或育种低CD品种提供有价值的信息。

两种花生品种的CD累积和易位

两品种间根系和地上部镉含量及从根到地上部镉转运因子存在差异，且受Cd处理和Cd ×品种互作的影响显著(图2)。1）.随着营养液中Cd浓度的增加，根系和地上部的Cd浓度增加(图。1(a和b)，而2 μM Cd处理下两品种的转运因子最高(图2)。1C）。相比之下，Silihong在所有CD处理中显示出比奉化1更高的芽CD浓度和IFS（图。1此外，四里红的根系中Cd浓度也高于奉化1号(图2)。1一种）。此处呈现的数据，同意我们以前的结果[5.]，建议奉化1的CD易位容量较低，而不是Silihwong。

奉化1号和四里红根CW组分中Cd、总糖和糖醛酸的含量

两种品种在CW组合物中彼此彼此不同，CD浓度和总糖和尿酸的含量（图。2）.当植物暴露于2 μM Cd时，四里红的CW、半纤维素(HC1、HC2)和纤维素中的Cd含量均高于奉化1号，而果胶中的Cd含量则高于奉化1号(图2)。2a).在CW中，Cd大部分结合在半纤维素上，奉化1号和四里红中Cd分别占57和61%。Cd暴露显著增加了奉化1号CW及其果胶和HC2组分中的糖醛酸含量，而在四里红Cd暴露显著增加了HC2和纤维素中的糖醛酸含量(图2)。2b). Cd没有改变两个品种的CW中总糖含量及其果胶成分(图。2c).四里红的半纤维素(HC1、HC2)和纤维素的总糖含量因Cd处理而增加，而凤花1号的总糖含量未受Cd处理影响(图1)。2c)。在Cd曝光,Silihong显示HC2高糖醛酸含量,纤维素和更高的总糖含量连续波和半纤维素(用盐酸和HC2)比奉化1和纤维素成分,而奉化1已经在果胶糖醛酸含量高于Silihong(无花果。2， b和c)。

奉化1和Silihong鉴定的蛋白质概述

8个样品(2个重复× 2个物种× 2个处理)共鉴定出307,137个MS/MS谱，其中62,850个谱与已知谱相匹配(图2)。3.一种）。其中，52,728个独特的光谱与15,343个独特的肽匹配，并且成功鉴定了4676个蛋白质，用截止造型吉祥物渗滤器FDR≤0.01。分别具有单肽，2-5肽，6-10肽和> 11肽的蛋白质数分别为1897,2006,563和210（图。3.b).鉴定的蛋白质质量大部分分布在11 - 100 kDa之间，平均覆盖率较好。其中，11-50 kDa占62.53%，51-100 kDa占29.58%，> 100 kDa占6.14%(图1)。3.C）。具有肽覆盖率的鉴定的蛋白质，占10％和20％，分别为2127和1035，分别占45.49和22.13％（图。3.d）。基于变异系数（CV）的可重复性分析显示在附加文件中1:图S1。同一处理(0.056 ~ 0.086)的重复CV低于不同处理(0.10 ~ 0.13)，表明本研究数据具有较好的重现性。

差异表达蛋白(DEPs)的鉴定

基于Bonferroni纠正的标准P.-Value <0.05并折叠变化> 1.2或<0.833，在四个比较中识别了总共2669个DEP（附加文件2:表S1)。其中，375和1762个蛋白质分别是繁合1和Silihong的CD响应物。CD暴露上调的166和1314型春华1和Silihong，而春华植物1和Silihong中的448蛋白分别由Cd下调（图。4.一种）。两种品种份额78和52个下调CD响应物（图）（图。4.在对照中，两个品种间共鉴定出1276个DEPs(875个上调蛋白和401个下调蛋白)，而在Cd处理中，共鉴定出771个DEPs(255个上调蛋白和516个下调蛋白)(图2)。4.a).无论Cd暴露与否，奉化1号有120个蛋白的丰度高于四里红，而四里红有58个蛋白的丰度高于奉化1号(图2)。4.B和c）。

DEPS的GO和KEGG途径浓缩分析

共63、171、47及200个经浓缩的氧化石墨烯项(P.-value < 0.05)_光盘/ F_CK.,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/秒_光盘分别代表三类（蜂窝分量，分子函数和生物过程）（附加文件）3.:表S2)。最丰富的GO术语(P.-Value <0.01）在附加文件中列出4.:表S3。对于四里红来说，Cd-responsive DEPs中最丰富的GO项包括2个细胞组分亚类(细胞核和膜质体)，17个分子功能亚类(杂环化合物结合、有机环化合物结合等)，15个生物过程亚类(细胞过程、细胞代谢过程、等等)。将奉化1号的cd响应DEPs分配到分子功能(即谷胱甘肽转移酶活性)和生物过程(即应激反应、氧化应激反应)(附加文件)4.:表S3)。凤花1号和四里红之间的DEPs，有11个细胞组分氧化石墨烯项(即质体、叶绿体和细胞壁)，22个分子功能氧化石墨烯项(催化活性、离子结合、有机环化合物结合和阳离子结合)，47个生物过程氧化石墨烯项(代谢过程、对镉离子的响应、对金属离子和有机酸代谢过程的响应)在Cd暴露下富集最多(附加文件4.:表S3)。

与P.-value < 0.05为截止值，F中共识别出7、8、5和16条显著富集的途径_光盘/ F_CK.,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/秒_光盘分别（表1）.对于cd响应的DEPs，富集量最高的两个途径分别是凤花1号的‘phenylpropanoid biosynthesis’[ko00940]和‘Glutathione metabolism’[ko00480]，以及四里红的‘Spliceosome’[ko03040]和‘Pyruvate metabolism’[ko00620]。此外，两个品种中只有一个途径“谷胱甘肽代谢”显著富集。Cd暴露下丰华1号和四里红之间的DEPs主要通过“代谢途径”[ko01100]、“次生代谢产物的生物合成”[ko01110]、“碳代谢”[ko01200]、“苯丙类生物合成”和“氨基酸的生物合成”[ko01230]。

与重金属运输有关的Deps

共识别出79个Deps与各种运输车具有同源性（附加文件5.：表S4）。Among them, 30 DEPs were identified to be related with heavy metal transport, including ATP-binding cassette (ABC) transporters, zinc transporter (ZIP1), metal tolerance protein (e.g. MTPc2 and MTPc4), oligopeptide transporter 7 (OPT7), pleiotropic drug resistance protein 1 (PDR1), V-type proton ATPase (V-ATPase), endoplasmic reticulum-type calcium-transporting ATPase 4 (ECA4) and plasma membrane-type calcium-transporting ATPase 8 (ACA8) (Table2）.Cd暴露后，四里红体内大部分重金属转运体(20个蛋白)发生改变，包括15个上调蛋白(ABCB11、ABCB25、ABCC4、ABCC2、ABCC14、ABCG8-like、ABCF1、ABCF3、ECA4、MTP2、PAA1、V-ATPase H亚基、V-ATPase d2亚基、V-ATPase H亚型X3)和5个下调蛋白(ATX1、ZIP1、ACA8、相比之下，凤花1号中只有2个重金属转运体被鉴定为cd响应型DEPs，包括一个上调蛋白(ABCG8)和一个下调蛋白(OPT7)(见表)2）.Cd暴露条件下，四里红中11个重金属转运体(ABCB11、ABCB25、ABCC14、PDR1、ECA4、PAA1、MTPc2、MTPc4、V-ATPase催化亚基A)的表达量高于奉化，而V-ATPase亚基G和V-ATPase 16kda蛋白脂亚基X4的表达量低于奉化。在无Cd的情况下，所有这些蛋白都不是两个品种的DEPs(见表)2）.

与细胞壁改性相关的DEP

完全，鉴定了CW修饰中的86型DEP，包括与CW降解有关的66个蛋白质，与CW合成的14个蛋白质和六种扩展蛋白（EPS）（附加档案6.:表S5)。Cd增加了果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂(PPE8B-like, PPE51)、木葡聚糖内转葡萄糖苷酶/水解酶蛋白(XTH1, XTH23)、细胞色素P450、β -葡萄糖苷酶(GLUC45)、内切葡萄糖苷酶9 (EG9)、果胶乙酰酯酶(PAE3)、果胶酯酶(PE2)、几丁质内切酶和葡聚糖-1,3- β -葡萄糖苷酶(XP_015952748.1)，而casparian strip membrane protein 2、葡聚糖-1,3- β -葡萄糖苷酶(XP_015969184.1)、PE (XP_020993886.1)、expansin-like B1和XTH22则降低。32蛋白质属于GLUCs Silihong, EGs,次方,P450, PEs、PPE、棒曲霉素,苷酶(β加),聚半乳糖醛酸酶(后卫)、果胶酸裂解酶(PLs),磷脂酶A-2-activating蛋白质(PLAP) beta 1, 4-xylosyltransferase (IRX10L)和endo-1 3; 1, 4-beta-D-glucanase被Cd曝光差异,和12个蛋白质属于次方,葡萄糖、PEs、P450、PPEs、casparian strip membrane protein 2、几丁质酶-3样蛋白、expansin样蛋白均因Cd暴露而下调。在Cd胁迫下，两个品种共鉴定出41个DEPs。其中31个蛋白在奉化1号中比四里红高表达，其余10个蛋白在奉化1号中的丰度低于四里红。无论是否接触Cd, 13种蛋白质，包括4种葡聚糖内切酶，3- β -葡萄糖苷酶，3种聚半乳糖醛酸酶，以及PE，β-gal，xth31，聚半乳糖醛酸酶抑制剂2（pgip2），β-木糖苷酶/α-l-阿拉伯呋喃氨基磷酸酶2（xla2）和endo-1,3; 1,4-beta-d-葡聚糖酶状，在丰度中较高奉化比于SiliHwa 1，凤凰湖（Chitinase-3样蛋白1，β-β-半乳糖苷酶同种型X2和β-葡糖苷酶12）的丰富。

共鉴定出64个dep参与木质素生物合成(附加文件)7.:表S6)。与对照相比，Cd胁迫下奉化1号和四里红分别上调8和16个蛋白，而Cd胁迫下奉化1号和四里红分别下调5和16个蛋白。奉化1号的漆酶(LACs)和咖啡酰辅酶a o -甲基转移酶(CCoA-OMT)含量高于奉化1号，而只有5种蛋白(LAC3、CCR2、4CL2、HCT、PAL3)含量高于奉化1号7.:表S6)。

RT-QPCR验证ITRAQ数据

为了验证iTRAQ结果，我们使用RT-qPCR对11个候选DEPs进行转录分析(图。5.）.其中11个、10个、8个和7个基因的表达量与其相应蛋白丰度的变化趋势相同或相似_光盘/秒_光盘,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/ F_CK.分别（图。5.；额外的文件2:表S1)。这些结果表明，大多数蛋白质在转录水平上受到直接调控。然而，编码过氧化物酶A2 (F_CK./秒_CK.），果酸酶和脂肪耐药蛋白1（f_光盘/ F_CK.F_CK./秒_CK.）和金属耐受蛋白C2（f_光盘/ F_CK.)，表明mRNA表达模式与蛋白质丰度之间的关系不一致(图。5.；额外的文件2:表S1)。例如，过氧化物酶A2在F_CK./秒_CK.，而在蛋白水平上明显上调。果胶酯酶与多效耐药蛋白1在F_光盘/ F_CK.mRNA水平和相应的蛋白质丰度。RT-qPCR和iTRAQ蛋白质组学之间的这些矛盾差异可能归因于两种分析方法的敏感性以及mRNA翻译和翻译后修饰过程的差异。

奉化1号和四里红对Cd的蛋白质组学响应差异

蛋白质组研究已经成功且越来越多地用于揭示一些植物物种中Cd抗性和积累的机制[20.那22那23]．采用基于itraq的定量蛋白质组学方法，分析了在对照和Cd处理条件下丰华1号和四里红的根系蛋白质组学特征，探讨了不同品种间Cd积累差异的机制。共鉴定出4676个蛋白，其中375个、1762个、1276个和771个蛋白在F_光盘/ F_CK.,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/秒_光盘分别比较（附加文件2:表S1)。Cd诱导凤花1号的根中有375个DEPs，而在四里红0 ~ 2 μM Cd处理下，共鉴定出1762个蛋白，是凤花1号的3.7倍(图2)。4.a).两品种间，在Cd不存在时，奉化1号的大部分DEPs(68.7%)丰度较高，而在Cd存在时，四里红的大部分DEPs(67%)丰度较高。4.a).这些结果表明，两个品种对Cd暴露的反应在分子机制上存在差异。在根蛋白质组学方面，四里红比奉化1号对Cd暴露更敏感。

在奉化1号和四里红中参与镉摄取和转运的转运体

运输C​​D.^２＋植物细胞的跨膜系统已经被证明是由二价离子如锌的转运介导的^２＋、钙^２＋、铁^２＋、锰^２＋、铜^２＋和米格^２＋[9.]．但在不同的植物种类和品种/生态型之间，Cd的吸收和转运机制仍不清楚。在本研究中，我们发现四里红比奉化1号表现出更高的地上部镉浓度和更高的转运因子(图。1）.结果与我们之前的研究结果一致，说明种子Cd积累量高的品种，其幼苗幼苗中Cd浓度较高，反之亦然[3.那5.]．

Cd在植物中从根向茎的转运主要受到细胞壁吸附、质膜流入根细胞、液泡隔离和木质部装载等过程的影响[9.那10]．出乎意料的是，我们的结果表明，Silihong（高CD累积品种）表现出高于繁合1（低CD累积品种）的根CW中的CD积累（图。2）.王等人报告了类似的结果。[25]在两个对比的大豆品种（HX3和BX）中。这些发现驳斥了我们的假设，即细胞壁吸附可能有助于春富1和Silihong之间的CD积累和易位的差异。

因此，凤花1号和四里红的Cd积累差异可能是由转运载体介导的。在目前的研究中，30个DEPs被确定参与重金属运输(表)2）.其中，在四里红检测到20个重金属转运体具有cd响应性DEPs，其中15个蛋白表达上调，5个蛋白表达下调。而在奉化1号中，只有2种重金属转运体被鉴定为DEPs。

已核实一些成员ABC运输车参与植物中CD的摄取和易位[26]．本研究发现四里红中有8个ABC转运体(ABCB11、ABCB25、ABCC2、ABCC4、ABCC14、ABCG8-like、ABCF1、ABCF3)被Cd诱导，而凤花1号中只有1个ABC转运体(ABCG8)被Cd诱导。此外，四里红中四种ABC转运体(ABCB11、ABCB25、ABCC14和PDR1)的表达高于奉化1(表)2）.

ABCB25花生与ATABCB27 / ATALS1同源拟南芥，是根尖脉管系统液泡膜定位转运体，可能参与铝液泡隔离[27]．ABCC14对ATABCC14 / ATMRP10（71％同一性）和ATABCC4 / ATMRP4（68％同一性）高度同源。首先将ATABCC2鉴定为PC - 作为复合物的真菌局部转运蛋白拟南芥，已经证明，它通过将Cd隔离在根液泡中，在镉(和汞)耐受性中发挥作用[28]．AtABCC4被证明可以补充酵母ΔYCF1突变体的CD超敏反应，部分恢复CD耐受性[29]．PDR1 (XP_015937455.1)同源于AtPDR12/ABCG40，是一种质膜转运体，作为Pb的外排泵^２＋排除拟南芥[30.]．黄瓜CsPDR12/CsABCG40在Cd胁迫下表达上调[31]．因此，四里红镉暴露对这些转运体的上调可能通过增加其液泡隔离或从共质体流出到质外体来增强Cd的解毒作用。

有报道称MTPs介导Zn/Cd的摄取和转运[32]．在这项研究中，我们发现MTP2在Silihong的CD暴露的植物中倒塌。此外，在Silihong也比在奉化1.花生MTPC2与ATMTPC2 / ATMTP5中的同源性，MTPC2和MTPC4更高拟南芥，报道与AtMTP12形成异构体配合物将锌转运到高尔基体[32]．MTP2和MTPc4与AtMTP6和AtMTPc4/AtMTP7同源拟南芥,分别。然而，这两种蛋白质的特性没有被分析。这些MTPs是否与花生植株中Cd的吸收和转运有关，还需要进一步研究。

V-ATP酶是一种用于离子输送的能量的仪表骨局部化的质子泵。它是至少11个不同亚基的多重体络合物（即ATPV A-H，ATPV A，C和D）[33]．跨剂量的CD的Antiport活性需要质子梯度，这在很大程度上取决于V-ATP酶的活性[33]．在本研究中，Cd诱导四里红V-ATPase两个亚基(H亚基和d2亚基)的三个蛋白(见表)2）.这些结果表明，V-ATP酶可以将CD促进到根部的内膜系统中，从而提高CD抗性和降低花生植物中的根染色CD易位。同时，较高丰富的V-ATP酶亚单位G和V-ATP酶16KDA蛋白脂酶亚单位同种型X4可以部分地负责繁想1的低CD易位。

同时观察到两种p型atp酶Ca^２＋-ATPase 4和Paa1，被Silihwong中的CD诱导，Silihong的丰度高于CD暴露下的凤凰曲（表2）.花生加利福尼亚州^２＋-ATPase 4与内质网(ER)定位的P蛋白AtECA1具有高度序列相似性₂-type Atpase拟南芥授予Ca^２＋/锰^２＋从细胞质转移到内质网[34]．PAA1为叶绿体包膜P_IB- atp酶，在叶绿体铜转运中起作用[35]．它是未知的吗？^２＋-ATPase 4和Paa1参与CD传输，然而，它们的上调可能会改善Silihong中Ca，Mn和Cu等必需营养素的营养。

上述Cd响应转运体均不能很好地解释四里红和奉化1号Cd积累的差异，我们推测其机制可能是其内在特性。有趣的是，我们发现在无cd条件下，四里红的ATX1、ACA8、ZIP1和v型质子ATPase亚基D都高于奉化1号。Cd在四里红中均被抑制，而在奉化1号中未发生变化。ATX1是一种铜伴侣体，它将Cu和Cd传递给Ccc2, Ccc2是一种内质网膜定位的铜转运atp酶[36]．该蛋白质可能不参与植物中的根对CD输送。ACA8作为粘合来自细胞溶溶胶的p型ATP酶[37已被描述为成为CD累积的候选者，其可能将CD移动到Xylem中Noccaea caerulescens[38]．花生的ZIP1表现出高度的序列相似性拟南芥AtZIP2。AtZIP2在根中柱细胞的质膜中表达[12]，可能参与锌、锰、镉从根向茎的转运[12那39]．四里红根系中ACA8和ZIP1的丰度较高，可能是四里红根系向地上部转运Cd能力较高的原因。

细胞壁改性蛋白质在奉化1和Silihong的根中

根的CW作为与CD接触的植物的第一种组合物，在预防CD进入细胞质中发挥关键作用[9.那10]．水煤浆中含有许多负电荷基团，如-COOH、- OH和-SH，这些基团使金属阳离子能够有效地与水煤浆结合[15]．我们的蛋白质组学分析表明，共有150个DEPs参与了两个花生品种根系细胞壁的修饰6.：表S5和附加文件7.:表S6)。

果胶是CW能与金属阳离子结合的主要原因，因为果胶含有高度负电荷的羧基[17]．据报道，Al的积累与果胶含量呈正相关，但与果胶的甲基酯化程度负相关Zea Mays.[40那41]．在亚麻缺口中发现CD诱导的低甲基酯化果胶的增加[42]，篮子柳[43[米[44]．更有趣的是，超积累生态型景天属植物alfredii结果表明，超积累生态型的果胶含量和果胶甲基酯酶活性均低于非超积累生态型的果胶含量和果胶甲基酯酶活性，导致果胶甲基酯化程度较高，这可能是超积累生态型根-茎间Cd转位较高的原因[15]．

在这项研究中，我们发现一些与果胶分解有关的蛋白质，如β-gal，pg和pl1在CD-Opposate Silihong中显着诱导，而在奉化1中，它们仍未受到影响（附加文件6.:表S5)。结果表明，Cd可诱导四里红根系中果胶的降解，从而降低果胶与水煤浆的结合。此外，丰度更高的PEs, PE8B, PPE61, PGIP2在Fenghua 1(附加文件6.：表S5）表明，奉化1显示了在CD暴露下的防止果胶分解和甲基酯化的较高容量。与Silihong相比，春华1的果胶1中果胶1的果胶中含有较高的糖醛酸和总糖含量（图。2一种）。

半纤维素和纤维素是细胞壁中结合金属离子的主要部位[18那44]．在非poalean单子叶植物和双子叶植物中，木葡聚糖是初生CW的主要半纤维素[18]．我们的结果表明，在CW中的大多数Cd都与两个品种的半纤维素结合(图。2一种）。与奉花1相比，SiliHong在半纤维素（HC1和HC 2）和纤维素中具有更高的CD浓度（图。2a)，同时半纤维素(HC1和HC2)和纤维素的总糖含量较高(图2)。2C）。因此，半纤维素和纤维素的含量较高可能对SiliHong的CW中的更高CD负责。

水煤浆的改性是由几种酶催化的，包括xth和Expansins。xth通过切割和重新连接木葡聚糖链或催化木葡聚糖的水解来促进细胞壁的扩张[18]．膨化蛋白可以通过破坏纤维素微纤维和基质葡聚糖之间的非共价键来诱导植物水煤浆的松散和延伸。在本研究中，我们发现在凤花1号中，Cd暴露诱导了两个XTH蛋白(XTH1和XTH23)，而在四里红中，Cd暴露诱导了5个蛋白(XTH1、XTH2、XTH6、XTH30和XTH32)和两个α-expansins (EXPA11和EXPA8)(补充文件)6.:表S5)。此外，通过Silihong中的CD处理增加了半纤维素（HC1和HC2）和纤维素的总糖含量，而在春华藤（图中）保持不受影响（图。2c).这些结果表明xth和α-expansins可能是在Cd暴露条件下维持四里红连续波延伸能力的原因。

除了XTH和扩展蛋白外，还通过其他多糖降解酶改性CW，由β-葡糖苷酶，糖基转移酶和肠杯 - 木聚糖酶表示。与奉花1相比，SiliHong展示了较高的IRX10L，BGLU12，BGLU42，EXLB1，XTH30，XTH6和XTH7，但是较低的BGLU13样，ENDO-1,3; 1,4-BETA-D-CD曝光下的葡聚糖酶样，XLA1和XLA2（附加文件6.:表S5)。IRX10L是一种糖基转移酶，在半纤维素中木聚糖骨干的延伸中起作用[45]．BGLUs可以分解末端非还原的β- d -葡萄糖残基，释放β- d -葡萄糖。-1,3-1,4- β- d -葡聚糖酶作用于β- d -葡聚糖的(1-3)-或(1-4)键的内水解，而XYLs对后者的低聚物有活性，释放木糖。阿拉伯木聚糖的降解也需要XLAs，因为它们与内木聚糖酶协同作用，从主链上切割阿拉伯糖。结果表明，两个品种在镉胁迫下对水煤浆的修饰存在差异。与奉化1号相比，四里红中有更多的半纤维素修饰酶表现出更高的丰度，表明四里红具有更高的连续波重构能力。这可能更好地解释了四里红根中半纤维素和纤维素含量较高的原因，从总糖(图。2C）。似乎，半纤维素中的较高的CD积累和Silihwong的根CWS的纤维素可能是由于CW修饰的较高能力导致。

Lignin，衍生自羟基氨基醇的酚醛聚合物，也是将CD吸收到根细胞的主要因素[10那46]．木质素含有羟基、酚、羧基、甲氧基、醛和苄醇等官能团，能将金属与水煤浆结合[47]．木质素主要存在于二次加厚的植物细胞中，在那里它与非纤维素多糖共价连接，并为水煤浆提供刚性和不渗透性[48]．木质素主要由对香豆蔻基、针叶树基和辛纳基三种单体醇衍生而来，分别形成对羟基苯基(H)、愈伤木基(G)和丁香基(S)木质素。这些过程受到大量酶的调控，如PAL、COMT、CAD、CCR、HCT、4CL、CCoA-OMTs等[48]．

在目前的研究中，我们发现CD增加了春华州的根系中的CCOA-OMT和CAD6的丰富.CCOA-OMT和CAD6是用于合成Guaiacyl Lignin的关键酶[48]．相比之下，四里红中几乎所有与木质素单质合成相关的酶都被Cd显著诱导，包括PAL3、COMT、CAD1、2个CCR1、2个HCT、3个4cl和3个CCoA-OMTs(附加文件)7.:表S6)。与奉化1相比，SiliHong显示出较高丰富的CCR2，4CL2，PAL3和HCT26，以及较低的CCOA-OMT丰富（附加文件7.:表S6)。这些结果表明，CD暴露可以触发CWS在花生根中CWS的瘫痪，这在Silihwong比在奉化中更加明显1.毒性金属诱导的木质素沉积增加也发生在许多植物物种中[47那49那50那51那52]．因此，我们可以推测，四里红较高的CW木质素化能力可能是其在CW中积累Cd较多的部分原因。

这是响应CD暴露的两种花生品种之间的根源蛋白质组变化的第一个系统报告。完全，在f期间鉴定了375,1762,1276和771型Dep_光盘/ F_CK.,年代_光盘/秒_CK.F_CK./秒_CK.和F_光盘/秒_光盘分别比较。两个品种对镉暴露的分子反应机制不同。在根蛋白质组学方面，四里红比奉化1号对Cd暴露更敏感。四里红Cd暴露后ABCB25、ABCC14、ABCC2、PDR1和V-ATPases的上调可能增强Cd的空泡隔离及其从共质体流出到质外体的能力。四里红根茎中Cd积累量较高，可能是由于其具有较高的CW修饰能力，其中涉及IRX10L、BGLU12-like、BGLU42、EXLB1、XTH30、XTH6、XYL7、PAL3、COMT、CAD1、CCR1等多种蛋白。因此，Cd在CW中的吸附和空泡隔离可能是四里红镉解毒的主要机制。6.）.我们还证实，Silihong根系中的ACA8和ZIP1的较高丰富有助于其较高的根到拍摄CD易位能力。这些调查结果可以提供新颖的洞察力，进一步了解花生中CD积累的分子调节网络。

植物材料和生长条件

基于我们以前的研究[5.以种子Cd积累量不同的两个花生品种奉化1号(F，低Cd品种)和四里红(S，高Cd品种)为材料，进行了试验研究。种子从中国青岛的山东花生研究所获得。用1%次氯酸钠消毒10分钟后，种子播种在洗净的沙土中发芽。出苗后，将大小一致的幼苗移栽到含有3.5 L霍格兰营养液(pH为5.8)的水培盆中(每盆6株)[7.: 5 mM Ca (NO_3.）₂，5毫米的kno_3.， 1毫米KH₂阿宝_4.， 1 mM MgSO_4.， 50mm H_3.博_3.， 4.5 mM锰cl₂，3.8 mm znso_4.， 0.3 mM CuSO_4.，0.1毫米（NH_4.）_6.莫_7.O.₂₄和50 mm的饲料。为了测定植物组织中的Cd，用0,0.2,2或20μMCDCL处理七天幼苗₂1星期。其他分析则采用0 (CK)和2 μM CdCl处理7日龄幼苗₂(Cd)为期一周。试验采用完全随机设计，每项测量采用3或4个重复。植物在生长室中生长，正如Lu等人先前所描述的条件[7.]．

根CW的分馏和测量

每种品种从0（CK）和2μMCD（CD）收集根样品（每次处理的四个重复）。将根样品（0.5g）研磨成粉末，砂浆和液氮研杵，然后在冰冷的水浴中用7ml 75％乙醇均化20分钟。将提取的溶液在4℃下以1000×g离心10分钟，除去上清液。将沉淀物用7ml丙酮，甲醇：氯仿（1,1）和甲醇分别萃取两次，每次20分钟。最终的粗cws冷冻干燥并称重。

CW组分的分馏根据钟和洛奇利进行[53王等人。[25稍作修改。用4 mL 0.5%草酸铵缓冲液(含1% KHB)提取2次果胶_4.）在热水浴（90-100°C）中10分钟。将冷却的溶液以17,000×g离心10分钟，将含有果胶的上清液用于每个样品。用DDH洗涤颗粒两次₂o然后，通过4ml 4％KOH进一步提取它们两次（包括1％KHB_4.)，室温保存12小时。用17,000×g离心10 min，收集含有HC1成分的上清。同样的方法，用4 mL 24% KOH(含1% KHB)提取2次HC2_4.）.碱性不溶性纤维素在72%硫酸中25℃下溶解1 h，然后稀释30倍。用醋酸调节HC1和HC2上清液的pH至6.8-7.2，使所有上清液体积相同。

各馏分的总糖和糖醛酸含量按Wang等人描述的方法测定[25]．

Cd的决心

Cd处理7 d后，将植物根系浸泡在20 mM Na中₂-edta持续15分钟，然后用去离子水冲洗三次。将每种处理的幼苗（三种重复）解剖到根部并射击。此后，将根和芽在65℃下干燥至恒重。将干燥的样品称重并在混合酸中消化[HNO_3. + HClO_4.(3:1,V./ v）]。对于CW CD测定，为每种处理（四个重复）制备粗CWS作为上述方法[53]．用混合酸[HNO]消化干燥的水煤浆_3. + HClO_4.（3：1，v / v）]称重后。通过原子吸收光谱法（WFX-110，北京Rayleigh分析仪器公司，中国）确定CD浓度，如前所述[8.]．从根部到射击的CD的易位因子被计算为枝条中的CD浓度与根部的比率。

蛋白质提取和量化

用于ITRAQ-SEQ（两个生物重复）的根样品与每种品种的0（对照）和2μMCD（CD）处理的植物分开收集。生物复制含有六种不同植物的池。将约1g将每种样品接地为液氮的粉末，其具有10％PVPP。将粉末转移成裂解缓冲液（8M尿素和40mM Tris-HCl含有1mM PMSF，2mM EDTA和10mM DTT，pH 8.5），并在冰上超声处理5分钟。在4℃下用25,000g离心20分钟后，处理上清液以阻断半胱氨酸，在黑暗的房间中用55mm Iam留下45分钟。然后通过在10mM DTT中加入5×体积的10％TCA /丙酮来处理上清液，以在-20℃下沉淀蛋白质2小时。在4℃下用25,000g离心20分钟后，弃去上清液，将蛋白质沉淀在空气中干燥5分钟。然后将蛋白质颗粒溶于200μL0.5M茶叶中，然后以25,000g离心20分钟。然后使用用牛血清白蛋白（BSA）的Bradford方法量定量蛋白质作为标准。

蛋白消化、iTRAQ标记和SCX分离

每个样品用胰蛋白酶金(Promega, Madison, WI, USA)以40:1的质量比在37°C下消化12 h，共100 μg蛋白质。消化后，用Strata X C18色谱柱(Phenomenex)对多肽进行脱盐，并按照制造商的协议真空干燥。肽的iTRAQ标记是使用iTRAQ试剂8-plex试剂盒按照制造商的说明进行的。包括S_光盘_1，S._光盘_2,年代_CK._1，S._CK._2, F_光盘_1，F._光盘_2, F_CK._1和F_CK._2分别用标签113和114,119,121,117,118,115和116标记，并在室温下孵育2小时。对于肽分馏，用LC-20Ab HPLC泵系统（Shimadzu，京都，日本）进行强阳离子交换（SCX）色谱，如前所述，具有Ultrexex SCX列（4.6×250mm）[54]．

LC-ESI-MS / MS分析

将每个级分重悬于缓冲液A（2％乙腈，0.1％甲酸）中，并以20,000rpm离心10分钟。将10μL上清液加载到2cm C18捕集柱（200μm内径）上，并使用LC-20 AD纳米普通系统（Shimadzu，Kyoto，Japan）洗脱到分辨10cm分析C18柱（75μm内径）上。将样品加15μlmin⁻¹4分钟。从2到35%的溶剂B(98%乙腈，0.1%甲酸)的线性梯度在400 nL/min下运行超过44分钟，然后2分钟线性梯度到80%，并在80%的溶剂B维持4分钟，最后在1分钟返回到2%。数据采集使用三倍TOF 5600系统(AB SCIEX, Concord, ON)进行，该系统配备了一个纳米喷射器III源(AB SCIEX, Concord, ON)和一个拉动式石英尖端作为发射器(New Objectives, Woburn, MA)。

数据库搜索和蛋白质量化

蛋白质组发现软件（Thermo Sciencific）用于将原始MS / MS数据转换为MGF格式文件，这些文件被搜索到对花生基因组数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/arachis_duranensis/）使用吉祥物版本2.3.02（矩阵科学，伦敦，英国）。至少一种独特的肽对于鉴定蛋白质是必需的。通过如前所述的IQuant软件进行了用于定量分析的等异标标记的肽，如前所述[55]．为了评估肽的置信度，肽谱匹配(pms)以pms级别的错误发现率(FDR)为1%进行预过滤。然后，根据“简单原理”(parsimony principle)，将识别的肽序列组装成一组自信蛋白。为了控制蛋白水平上的假阳性结果率，根据所选择的蛋白FDR策略，在蛋白推断(蛋白FDR≤0.01)后估计蛋白FDR为1%。定量蛋白质比率按吉祥物中位数加权归一化。一种经过邦菲罗尼校正的蛋白质P.-Value <0.05并折叠变化> 1.2或<0.833被认为是在成对比较中显着表达的显着表达。

基因本体(GO) (http://www.geneontology.org.)利用Blast2GO程序在非冗余蛋白数据库中搜索已鉴定蛋白的功能注释(https://www.blast2go.com/）.京都基因与基因组百科全书(KEGG) (http://www.genome.jp/kegg/patpway.html.)数据库，利用Blastx/Blastp 2.2.24软件对鉴定的蛋白种进行分类。然后，对dep进行GO和KEGG途径富集分析P.值< 0.05。

RT-qPCR分析

以0 μM CdCl和2 μM CdCl处理的花生品种为材料，从3个生物重复中提取总RNA₂治疗分别。然后通过PrimeScript®RT试剂盒（Takara，China）合成第一链cDNA。使用灯塔设计师7.0软件（Premier Biosoft International，USA）设计了RT-QPCR分析的特定引物，以及施基因作为内部标准(附加文件8.:表S7)。RT-qPCR在ABI7300系统(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)上进行，使用SYBR®Green Master ROX (Takara)，按照Yu等人描述的方法进行20 μl反应。[56]．所有反应均以三种技术复制进行。用2加工相对表达水平^-ΔΔCT.方法。

4CL：

4-coumarate-CoA连接酶

美国广播公司(ABC):

atp结合盒转运蛋白

计算机辅助设计:

肉桂醇脱氢酶

CCOA-OMT：

Caffeoyl-CoA O-methyltransferase

CCR：

Cinnamoyl-CoA还原酶

Cd:

镉

部:

差异表达蛋白质

去：

基因本体论

Kegg：

Kyoto基因和基因组的百科全书

MTP:

金属耐受性蛋白质

nramp：

自然抗性相关巨噬细胞蛋白

选择：

寡肽转运体

PDR：

脂肪耐药型ABC转运蛋白

pe：

薄膜酶

RT-QPCR：

逆转录定量PCR

压缩：

锌调节转运体/铁调节转运体样蛋白

不适用。

资金

从中国自然科学基金（第31671599999号）和安徽省科学研究平台创新团队（No.KJ2015TD001）的创新团队得到了支持。资助机构在研究的设计中没有作用;在收集，分析或解释数据;在写作稿件中，并在决定发布结果。

可用性数据和材料

质谱蛋白质组数据已存入ProteomeXchange联盟，数据集标识符为PXD012670 (https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD012670）.

从属关系

1. 淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000

   Rugang Yu，Qun Jiang，Chen XV，Lien Li，Sijia Bu＆Gangrong Shi

贡献

SG设计了实验。XC、JQ、LL和BS进行花生栽培。你们进行了样品收集。SG, YR, XC, JQ, LL和BS进行了实验。SG和YR分析和解释数据。SG和YR撰写并修改了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到甘格隆施．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们对这项研究没有竞争利益。

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

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重印和权限