叶色、色素含量和化感物质对四种芸香科寄主植物木虱取向的影响

背景

亚洲柑橘木虱（ACP）是韧皮部限制性细菌传播的主要媒介CandidatusLiberibacter spp.，与黄龙病(HLB)伴生，给柑橘产业造成巨大损失。虽然叶色和挥发性物质在ACP定位中的作用已被证实，但对寄主植物的颜色和化感物质的定量研究尚不清楚，特别是野生柑橘种质。

结果

在四选择和嗅觉分析中，崇义野生柑桔、甘南枣脐橙和茉莉花对ACP的吸引力显著高于香港野生金桔。崇义野柑嫩叶的颜色参数与甘南枣相近。两种植物的黄色饱和度均低于其他两种植物，但崇义野生柑桔类胡萝卜素含量显著低于野生柑桔(P< 0.05)。通过UPLC-QQQ-MS和GC-MS分析，4种供试植物的健康嫩枝之间存在显著的代谢谱差异。与其他3种植物比较，崇义野生柑桔中66种和50种含量差异显著的代谢物经uplc和gc鉴定为感兴趣的代谢物(P分别为< 0.05)。黄酮类化合物是一组重要的次级代谢产物，可能具有刺激或排斥ACP的作用。较高的水杨酸邻己糖含量和较低的(+)茉莉酸含量可能导致水杨酸甲酯(ACP引诱剂)和反式新新烯(食草动物天敌引诱剂)的含量升高，并抑制ja介导的伤害反应。这种差异积累的代谢产物之间的协同或拮抗作用，使崇义野生柑桔对ACP更具吸引力。

结论

不饱和黄色、引诱剂含量高、驱避剂含量低、ja介导的伤害反应不敏感是崇益野生柑桔吸引更多ACP的可能原因。本研究为进一步研究ACP对野生柑橘种质寄主的嗅觉和视觉反应提供了依据，并为开发基于潜在代谢物的ACP引诱剂或驱避剂提供了可能。

黄龙病(Huanglongbing, HLB)又称柑橘黄龙病(citrus greening)，是全球柑桔病害中最具经济破坏性的病害之一。CandidatusLiberibacter asiaticus”(C拉斯维加斯），”加利福尼亚州。非洲L. "和"加利福尼亚州。l .也”[1]．在这三个物种中，CLas被认为是最主要的一个，已经给全球柑橘产业造成了巨大的经济损失[2]．在早期，受感染的树木出现斑点斑驳或完全黄色的褪绿叶片，畸形的小果实和流产的种子[3.]．在病原菌的操纵下，受感染的树木会发生源库碳水化合物转运功能障碍，导致显著的果实脱落和产量下降[4]．目前还没有具有较强耐受性的商品化柑橘品种C拉斯维加斯(2，5]．已经测试了许多措施来解决这种功能障碍或控制操作CLas，例如应用增强叶面营养和热疗[3.，6]．然而，柑橘种植者主要依靠三个步骤来减少HLB的发病率，即根除受感染的树木、使用健康的苗木和使用杀虫剂控制虫媒[2，7]．

虽然C亚洲柑桔木虱(ACP)、Diaphorina citriKuwayama(半翅目:利维科)，被认为是HLB致病细菌的主要载体[2，8].植物的寄主d . citri包括默里拉帕尼特拉塔(l)杰克,m .新奇事物lm . koenigiiL.和几乎所有的柑橘品种[9，10，11]．然而，野生柑橘属植物作为ACP寄主或用于HLB研究的报道甚少。

过量使用农药可使ACP得到控制，但也可能造成严重的环境破坏、昆虫抗性和食品安全问题，并对ACP的天敌产生不利影响[12，13，14]．人们提出了许多环保的替代方案，如精油、寄生蜂、昆虫病原真菌和其他影响ACP视觉线索的策略，如反射覆盖和高岭土[15，16，17，18，19，20.，21]．鉴于ACP能够准确地检测、评估和区分视觉线索，如物体的色调、饱和度和轮廓，黄色粘卡被证明是一种有效的绿色方法来监控和陷阱ACP [22，23，24]．尽管它也可以条件反射地识别蓝色的探测基质[22]，d . citri人天生就会被人类可见光谱中明亮的黄色和绿色所吸引，这些颜色可能类似于发红的芽[25，26，27]．此外，紫外光的加入也能增强其吸引力d . citri变为绿色或黄色[27，28]．虽然颜色在ACP定位中的作用已经有了大量的研究，但对颜色和叶片中相关化感物质的量化仍然不清楚。

除颜色刺激外，嗅觉线索在植物选择过程中也起着关键作用d . citri［25]．因此，在挥发性化合物上使用驱避剂或引诱剂也被认为是保护柑橘类植物免受HLB侵害的一种潜在方法，该方法已被引入到ACP管理的推拉策略中[29，30.，31]．(E) -β-从番石榴中鉴定的石竹烯[30.]、大蒜香葱叶中的三硫醚(二甲基三硫醚)[32]，非寄主腰果中的萜类均对ACP有驱避作用[33]．这些驱避挥发物主要来源于非芸香科植物。在引诱剂方面，雌ACP对咖喱叶的偏好分析显示，有10种单萜和4种倍半萜以及2种未知化合物可能具有引诱作用[34]．鉴定出的代谢物相当少。为了更好地实施推拉策略，需要识别大量可以影响ACP行为的挥发物。

在这项研究中，我们首先试图通过ACP来确定哪些寄主植物是最受欢迎的。然后，我们应用组合代谢组学技术来研究四种受试植物嫩枝之间的代谢物差异。我们的目标是确定潜在的挥发性化学物或负责吸引或排斥的代谢物这可能有助于ACP的检测和监测。

崇义野柑是最受欢迎的寄主d . citri对芸香科四种植物进行四选择和嗅觉测定

在四个选择试验的一个月观测期间，野生香港金刚（财富hindisii与崇义野柑(C)、甘南枣(Y)脐橙(素类， G)和橙茉莉(九里新奇事物L.， J .)， 2 - 3株(图。1一个,P< 0.05)。G、J、Y在15个时间点的嫩芽数均值无显著差异(图3)。1一个,P> 0.05）。此外，d . citri只采食G、J、y的嫩叶和嫩叶，但除崇义野柑的嫩叶外，很少采食d . citri四选择试验的结果表明，C总是吸引更多的昆虫d . citri在每一个计数时间点(图2)。1b).在15个时间点中，有4次C吸引了更多的人D.citri是G和Y的10倍，但是J的10倍。1b,P< 0.05)。总的来说，是d . citri在一个月内被C吸引显着高于其他三种植物物种在意义水平P< 0.05(图。1c)。

在两臂堵塞的六臂嗅计中，与冲义野柑嫩枝相连的臂总能显著吸引更多的雌性d . citri与其他五只手臂相比(图。2，P< 0.01)。由于同伴效应，崇义野柑左右两臂总比其余三臂招来更多的昆虫。将香橙茉莉、“甘南枣”、野生香港金桔与崇义野生柑橘逐一放置，也得到了类似的结果。因此，只显示了一个具有代表性的数字。因为它是最受欢迎的宿主d . citri在4种供试植物中，以崇义野生柑桔为对照。

崇义野生普通话和“甘南枣”共有类似叶子颜色参数

颜色参数l^∗，一个^∗，b^∗，C^∗和H^∗从嫩叶进行分析，以检查四种植物之间的叶子颜色差异。的值一个^∗和b^∗4个植株嫩叶中分别为阴性和阳性，表明叶片为绿色和黄色色调系统(图。3.)。此外H^∗这些叶片在60°（黄色）和120°（绿色）之间，约105°（图。3.)，进一步证明所有被测植物的叶子都是绿色和黄色的组合。各值间无显著性差异一个^∗（P> 0.05)，表明所有被测叶片均呈较绿色(图。3.）.的值l^∗，b^∗，C^∗C和G嫩叶的产量显著低于J和Y (P< 0.05)，说明J和Y的嫩叶比C和G的嫩叶更亮、更黄、更饱和(图。3.）.的价值H^∗C嫩叶中叶绿素含量最高，显著高于J和Y(图2)。3.，P< 0.05)。

崇义野柑嫩叶中类胡萝卜素含量最低

叶绿素(Chl)含量一个的背影,b在显著水平上，橙茉莉的类胡萝卜素(Car)和总Chl显著高于崇义野生柑、‘甘南藻’和香港野生金桔P< 0.05，其中崇义野柑的Car含量最低(图。4）.

未确定的代谢分析揭示了肾上野生普通话与其他三种植物物种之间不同内容物的异丙胺化学

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱(UPLC-QQQ-MS)和固相微萃取-气相色谱-质谱(GC-MS)分析结果表明，嫩枝之间的代谢谱存在显著的基因型差异崇义野生柑桔(C)，甘南枣脐橙(G)和橙茉莉(J)和香港野生金桔(Y)正常生长条件下(附加文件1:图S1和图S2)。

UPLC-identified代谢分析

非偏倚UPLC-QQQ-MS共检测到391个峰，其中126个为未知代谢物，其余为已知代谢物，如穗双酚、甜菜碱、punicic acid和l -缬氨酸。代谢产物在三个分析的生物复制中具有高度的重复性。根据主成分分析(PCA)结果，观察到样本分离，第一主成分(PC1)分别对G/C、J/C、Y/C数据集的变异贡献率为65.8%、76.6%、57.4% (Additional file 1:Figure S1)。

为了识别与宿主对ACP的偏好相关的重要代谢物，在投影(VIP)和学生的变量重要性的第一个主成分t- 最低。共有237,259,196个二次代谢物，具有显着不同的（VIP> 1和P-value < 0.05)1）.作为图1所示的Venn图。5我,66年G UPLC-identified代谢物积累有差异,J和Y与c相比他们积累的差异说明了四种植物样品的热图,表明每个代谢物在每个样本的内容多样,复制的数据有很好的可重复性(无花果。6）.

这66种代谢物列于表中2UPLC确定了感兴趣的代谢物。氨基酸是最大的差异累积代谢物类别，其中两种含量较高，七种含量较低（表1）2)，说明氨酰- trna生物合成是最重要的富集途径(P< 0.05)1:图S3)。据我们所知，除了l -酪氨酸(一种芳香氨基酸)、反式肉桂醛、载脂蛋白13-玉米黄嘌呤和香叶酰乙酸外，没有其他uplc鉴定的感兴趣的代谢物与芳香直接相关。因此，我们重点寻找与颜色相关的代谢物，如叶绿素、类胡萝卜素、黄酮类化合物。

KEGG分析发现了相应的代谢途径:卟啉和叶绿素代谢途径、类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径。在通路分析中，后两个通路在气泡图中被挑选出来(附加文件)1:图S3)。由于KEGG分析和pathway分析采用了两种不同的计算方法，气泡图中没有出现卟啉和叶绿素代谢，其中叶绿素生物合成的关键化合物5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)在C中含量显著降低。

C中黄酮含量较高的有6种，较低的有2种，其中8种黄酮均为黄色代谢物(见表)2）.值得注意的是，C中含量较高的3种黄酮(芹菜素-7-芦丁苷、tricin -o-芦丁苷和chrysoeriol -7- o-芦丁苷)均为芸香科植物所独有。绒毛膜二醇和黄精-邻己糖苷是两种差异积累的黄色黄酮类化合物。此外，还鉴定了一种黄色萜类化合物(apo-13-玉米黄嘌呤酮)和一种黄色苯丙类化合物(反式肉桂醛)。通过UPLC-QQQ-MS分析鉴定的这些差异积累的黄色化合物和5-ALA可能在C对ACPs的吸引力中起重要作用。

GC-identified代谢分析

采用四分位范围去噪法GC-MS分析，共检测到525个峰，残留522个经gc鉴定的代谢物，即挥发性化合物。PCA模型的得分散点图显示，所有样本的原始数据都分布在Hotelling的95%置信区间内T-平方椭圆（附加文件）1:图S2I)。PC1对崇义野生柑、甘南枣、香橙茉莉和香港野生金桔的分离率分别为68.2%、71.7%和77.5%(附文件)1:图S2II, S2III和S2IV)。

与C相比，共有205、309、301种代谢物(VIP > 1和P< 0.05)，分别为G、J、Y1）.G中有99个代谢产物含量显著升高，210个代谢产物含量显著降低(见表2)1）.j和y的近74％和68％代谢物的内容分别显着高于C（表）1）.

与uplc鉴定的代谢物不同，很少有gc鉴定的代谢物参与KEGG分析和pathway分析。在通路分析的气泡图中，G/C、J/C和Y/C数据集中均出现丙酮酸代谢、硫代谢和TAC循环(附加文件)1(图S4)，但实际上他们只有一两款热门游戏。这一结果表明，只有一到两个差异gc鉴定的代谢物直接参与了这些差异代谢途径。

如图所示的维恩图。5b，从崇义野生柑桔嫩枝中鉴别出50种VOCs，其中含量较高的34种，含量较低的16种。这50种VOCs在C、G、J和Y中的含量在热图分层聚类中变得明显(图3)。7)，选择为感兴趣的gc鉴定代谢物，列于表3.．有趣的是，除乙烷和12种未知化合物外，gc鉴定的其他37种感兴趣的代谢物均为已知芳香族化合物(表1)3.）.其中以蒎烯、樟脑、芳樟醇、莰烯、香芹醇、香芹酮、柠檬烯等单萜类化合物为最大的芳香代谢物群，其含量在崇义野生柑中显著较高(表1)3.）.崇义野生柑桔中双环[3.1.1]庚-2-烯、对薄荷-1,5,8-三烯和顺式-(-)-1,2-环氧-对薄荷-8-烯含量也高于其他三种植物(表1)3.）.崇义野生柑桔挥发性有机化合物含量较高的代谢产物释放的气味可能是其对ACP吸引力的原因之一。

uplc鉴定的代谢物与gc鉴定的代谢物之间存在密切的相关性

计算UPLC和gc鉴定的感兴趣代谢物之间的Spearman相关系数，结果用Heatmap(图)表示。8)， UPLC-QQQ-MS和GC-MS鉴定两组代谢物之间存在明显的相关性。各特征之间的关系达到显著水平(P< 0.05)用“*”表示(图;8）.蒎烯、2,3-戊二酮、3-己烯-1-醇、2-己烯-1-醇、2-己胺、芳樟醇、莰烯、未知的2,5,7,12 (GC-identified代谢物)、1,2-环己二醇与超过50个UPLC-identified的感兴趣的代谢物呈正相关或负相关(图)。8).而黄嘌呤、sn-甘油-3-磷酸胆碱、柚皮素、胞苷、3-羟基犬尿氨酸与37种选定的GC鉴定的感兴趣代谢物相关（图。8）.

与相关系数>、0.8相对应P-value < 0.05通过Cytoscape显示(v3.5.1)。相关网络包含116个节点和534条边(图1)。9）.uplc鉴定的代谢物和gc鉴定的代谢物一般是单独聚类的。gc鉴定的蒎烯、2-己烯-1-醇、2-己胺、2,3-戊二酮、芳樟醇、未知2和7分别与uplc鉴定的感兴趣代谢物38、38、37、37、36、35和35强相关，形成Fig下部最大的循环。9．值得注意的是，这7个gc鉴定的代谢物与超过50个uplc鉴定的感兴趣的代谢物相关。将7种代谢产物分为A组(蒎烯、芳樟醇和未知2)和B组(2-己烯-1-醇、2-己胺、2,3-戊二酮和未知7)，其在崇义野生柑桔嫩枝中的含量分别较高和较低。与A组呈正相关的uplc鉴定的代谢物与B组呈负相关，反之亦然(Additional file)2:表S1)。

在uplc鉴定的代谢物中，胞苷、未知1、金钱菊醇、穗二酚和香叶酯分别与gc鉴定的27、22、16、16和14种感兴趣的代谢物有很强的相关性(图)。9）.胞苷和未知1 (UPLC-identified)具有相似的相关代谢物，而金桔醇、绒毛膜酚和香叶醇醋酸酯具有相似的相关代谢物。

现在柑橘种植者严重依赖使用杀虫剂来控制ACP，这是昂贵的，并造成严重的环境问题。因此，视觉提示加驱避或引诱剂控制柑橘木虱是监测和控制ACP的有力选择[29]但这一策略的效率在很大程度上取决于从ACP宿主中识别出的挥发性或有色化学物质，因为它们通常依赖视觉和嗅觉来选择宿主[25]．因为冲芽会直接影响ACP的产卵和发育[35，36，很容易推断，更多的冲洗芽将导致更多的ACP供食。然而，四选择试验结果表明，香港金桔的新芽不断增加，而崇义野柑对ACP的吸引力不断增加。因此，崇义野生柑桔嫩枝产生的视觉和嗅觉刺激可能是ACP刺激反应的关键。

ACP更有吸引力Ca．这可能是由于受感染的叶片在黄色(591 nm)波长的偏振面发生了改变[27，37，38]．这些报道与我们的结果一致，即偏好acp的崇义野生柑桔嫩叶的黄色饱和度较低。黄绿色叶片的颜色主要由叶绿素(Chl)和类胡萝卜素(Car)主导[39]．由谷氨酸衍生而来的5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的形成是叶绿素和其他四吡咯生物合成的关键步骤[40，41]．但崇义野生柑桔5-ALA含量显著低于其他3种寄主植物，并不是总Chl含量最低的原因。但5-ALA含量的降低可能导致叶绿素含量的降低一个，柑橘中的一种抗草食化合物[42，这可能会使崇义野柑吸引更多的ACP。在Car的情况下，崇义野生柑橘的Car含量最低，apo-13-玉米黄嘌呤酮含量最高，这是合理的，因为类胡萝卜素裂解双加氧酶(CCDs)可以产生类胡萝卜素[43]．有趣的是，类胡萝卜素是一种用途广泛的芳香化学物质[44]， apo-13-玉米黄酮可能是ACP的首选。

另外两条富含黄色次生代谢产物的途径是类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径[26]，因此，在acp偏好的崇义野生柑中，8种黄酮中有6种黄酮和1种黄酮的含量较高。除了黄酮/黄酮/黄酮醇的黄色特性外，黄酮/黄酮/黄酮醇已被建议在害虫防治实验中作为饲料抑制剂或刺激剂[45，46，47]．例如，在3龄白粘虫(Mamestra configurataWalker），而Naringenine，7,40-二羟基氟和二氢喹啉，用作刺激剂[46]．而UPLC-QQQ-MS结果显示，在崇义野生柑桔中，芹菜素、穗二酚和柚皮素积累量较高，可能对ACP有促进作用。此外，崇义野生柑橘中2,3-二羟基黄酮含量较低，可能具有威慑作用。这种差异可以解释为，一种特定的类黄酮/黄酮/黄酮醇可能具有威慑或刺激不同害虫的双重性质[45]．另一种可能性是昆虫对化合物的行为响应可以根据所测试昆虫的浓度和阶段而变化[48]．

除了UPLC-QQQ-MS鉴定的颜色相关代谢产物外，ACP对崇义山柑的偏好可能与两种植物激素有关:水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)。SA多次被报道参与生物和非生物胁迫[49，50，51]．茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)的去甲基化产物JA可以抑制SA向水杨酸甲酯(methyl salicyate, MeSA)的转化，而MeJA本身可以抑制MeSA的排放[50，51，52]．在崇义野生柑桔中，SA o-hexoside含量较高和JA含量较低均可能导致MeSA/SA含量较高。MeSA原来是ACP的关键引诱剂[51，53]，高水平的SA可阻断JA的生物合成，而JA是伤口诱导的系统防御反应所必需的[48，54]．此外，上述叶绿素一个提出诱导ja介导的途径，该途径对保护柑橘草食动物具有积极作用[41]．因此，较低的JA含量和较高的MeSA含量可能使崇义野生柑桔成为较好的寄主植物。

在四项选择测试中，ACP的宿主偏好主要受视觉和嗅觉刺激的影响。崇义野生普通话和'甘南ZAO'共同的颜色参数。除了视觉刺激外，ACP宿主偏好受到来自宿主植物的挥发物的强烈影响[28，33，55]．因此，崇义野柑的嗅觉刺激可能使其比甘南枣更适合于ACP。这一假设在以下的嗅觉测定中得到了证实，强烈地说明了崇义野生柑桔嫩枝中某些挥发性物质具有引诱作用d . citri．

单萜类与单萜类酯类和sequ萜类化合物一般存在于黄酮类化合物的叶片中柑橘类物种(56，57]崇义野生柑桔中的蒎烯、樟脑、芳樟醇、樟脑、卡维醇、香芹酮和柠檬烯等单萜类化合物的含量显著高于其他三种植物，表明它们可能在影响野生柑桔的觅食行为中起到刺激作用D.citri．然而，一些单萜，比如β-蒎烯、芳樟醇和樟脑被认为在昆虫行为中具有驱避作用[58，59，60]．很少有报道表明芳樟醇，一种无环单萜醇，可以用于驱虫玉米耳虫(Helicoverpa armigera)、蜘蛛螨(测定了)，蚊子(埃及伊蚊)还有甲虫(t . castaneum和多米尼加Rhyzopertha） ［60，61，62]．但芳樟醇被认为是一种引诱剂，至少在寄主植物寻找西花蓟马(Frankliniella occidentalis） ［63]．而芳樟醇、杨梅烯和蒎烯等萜类化合物的组合似乎协同吸引了西方(Diabrotica virgifera virgifera)及北方玉米根虫(d . barberi） ［64]．此外，还有一项中国专利。华南农业大学应用的104222078A)结果表明，γ-萜烯、α-蒎烯和芳樟醇组合的捕集量显著增加d . citri说明崇义野生柑橘中萜类或挥发性有机化合物的适宜浓度和组合可能对ACP具有吸引力。此外,d . citri可能更喜欢这些单萜，因为它们在芸香科中普遍存在，可能代表着红晕的存在，而红晕对芸香科植物的交配、产卵和发育至关重要d . citri［36，55]．

相关分析显示UPLC鉴定和GC鉴定的兴趣代谢物之间存在密切关系。正相关和负相关的代谢物可能对彼此具有协同和拮抗作用，这可以共同影响宿主偏好d . citri．例如,β- 萜类途径中的-Ocimene合成酶在JA途径的控制下[65]，这与我们的结果一致，即trans-ocimene与JA正相关，而与SA o-hexoside负相关，因为在柑橘植物中JA和SA通路之间存在负交叉[66]．此外，外源施用MeJA和SA可增强或抑制E-的含量β-ocimene，即trans-ocimene，被认为是一种对许多食草动物天敌具有吸引力的挥发性物质[51，67]．对天敌具有吸引力的挥发物较少的寄主植物对天敌的吸引力更大，这是可以接受的d . citri，如崇义野柑。

综上所述，崇义野生柑桔对ACP的吸引力高于其他3种寄主，表明野生柑桔种质资源在hlb相关研究中具有很大的潜力。对芸香科四种植物嫩枝的代谢谱分析表明了四种可能的原因。第一个原因可能是嫩芽的黄色不够饱和。第二个原因可能是崇义野生柑中含有较多的acp偏好代谢物，如MeSA、夹竹桃素和部分单萜。第三个原因可能是驱避剂的含量较低，如ACP的天敌所青睐的化合物(trans-ocimene)和具有抗草食作用的代谢物(叶绿素类)一个）.第四个原因可能是ja介导的寄主植物伤害反应不敏感，这会对ACP的发育或产卵产生负面影响。尽管ACP寄主植物的偏好是基于复杂的形态组合，但我们的研究结果可能有助于进一步阐明其潜在的机制。

植物材料

亚洲柑橘木虱（ACP，Diaphorina citri崇义野生柑桔(C)、橙茉莉(J，九里新奇事物L.)、‘甘南枣’脐橙(G .)素类)及香港野生金桔(Y，财富hindisii击打)。它们都是芸香科的宿主CandidatusLiberibacter asiaticus”(C拉斯维加斯)。茉莉花的种子是从中国江苏一家经过认证的种子公司购买的。崇义野生柑桔和香港野生金桔的种子分别采自中国赣州崇义县和安源县的山区。“甘南枣”是国家脐橙工程技术研究中心发布的早熟新品种枳壳triafoliata繁殖用砧木和其他三种供试植物均为幼苗。盆栽植物在NORC苗圃中培养一年半Clas阴性植株移入25±3℃负压实验室，14 h:10 h(光:暗)光周期(相对湿度60±5%，RH)培养半年后使用。以2年生植株为研究对象，进行ACP的寄主选择试验。取未受感染植株的嫩枝，立即在液氮中冷冻，并在-80℃下保存^o直到使用C。

亚洲柑橘氏植物

Diaphorina citri成年人是从诺伦的实验室饲养的殖民地获得。使用从2012年成熟的肚脐橙块收集的成年人铺设的人的蛋白蛋白来建立殖民地。常规PCR（每两个月）证明了后代是CLas-negative。然后在笼子里的甜橙(c . sinensis(l)奥斯贝克。)和橙茉莉在负压实验室上面提到。

Four-choice测试

在进行寄主偏好分析的前半个月，采用回切法以促进更多的拍摄。每一株橙茉莉、Chongyi野生柑桔、香港野生金桔和甘南枣被放置在同一个由聚氯乙烯管(直径2厘米)75*75*90(长*宽*高)制成的笼子的四个角落里。笼子用直径0.25 mm的尼龙网包裹，以防止木虱的扩散。另外准备两个植物笼作为复制。从实验室饲养的蜂群中采集了一瓶木虱(约100只)，不分性别和年龄。饥饿1小时后，将小瓶木虱放在笼子中央的地板上，让它们飞起来自由进食。在释放两天后，在没有干扰的情况下对每棵植物上的木虱数量进行统计。然后，将木虱从植物中移除，再释放100个木虱。通过持续一个月的释放、计数和去除过程，分析木虱在四种植物上的寄主偏好动态情况。因为ACP的生活史与其寄主植物的生长模式密切相关[36]，在四选试验同期内，统计各受试植物的嫩枝数目。

然而，寄主选择并不是一个静态的过程，因为昆虫在不同发育阶段的需求可能不同，植物对昆虫的适宜性也可能随时间而变化[48]．因此，在1个月的四选择试验中，植株未发生变化，随机采集acp，不考虑性别和年龄作为种群。

d . citri嗅觉测定法

的偏好d . citri用6臂嗅觉仪(BL6-300M，上海比隆仪器有限公司)对4种植物进行了嗅觉检测。有两个相反的条目被手工阻断，因为只有4个样本被调查，并且在NORC中没有四臂嗅计可用。因为它是最受欢迎的d . citri在四选试验中，崇义野柑桔嫩枝的位置不变，而将其他三棵嫩枝依次放在其旁边，以消除其同侪效应。炭过滤空气以0.4 L min的速率流动^－1与每一根嫩枝相连。含有每种植物气味的气流通过聚四氟乙烯管汇聚到活动室(35厘米*35厘米*3厘米)。当嫩枝的位置被改变时，这些管子就会被木炭过滤的空气净化。进行了两种嗅觉因子生物测定。在第一个实验中，80个成年人d . citri无论性别和年龄，在使用前饥饿1小时，通过盖子（直径6厘米）在活动室中心释放，盖子边缘覆盖凡士林。十分钟后，统计了不同手臂上的昆虫数量。第一次嗅觉仪生物测定进行了三次重复。在另一个实验中，一只成年雌性在使用前饥饿1小时，被放在活动室的中心。十分钟后，女死者的位置d . citri被记录。如果昆虫留在扶手的胳膊上，那么它均得分为1，等等。每天进行十项重复，并在数据分析中使用来自8个独立日的数据集。所有实验均在室温下进行，60±5％RH和恒定光（2300勒克斯）进行。

测定叶片颜色参数，叶绿素和类胡萝卜素浓度

采用NR200精密比色仪(深圳3nhh科技有限公司)测定4种植物嫩叶的颜色参数，并采用CIELAB颜色空间系统进行量化。的值l^∗，一个^∗,b^∗解释一个三维色彩空间。的价值l^∗是垂直轴，定义了亮度。的值一个^∗和b^∗是垂直的水平轴，并分别定义红到绿和蓝到黄。积极的价值一个^∗表示红色，负1表示绿色。积极的价值b^∗表示黄色和负面表示蓝色。的值l^∗，一个^∗和b^∗直接从色度计中得到。浓度(C^∗，颜色饱和度)及色相(H^∗(彩色明暗)的计算公式如下:C^∗= (一个^∗2+b^∗2）^1/2和H^∗= 180 + tan^－1（b^∗/一个^∗),(如果一个^∗< 0和b^∗> 0).值越大C^∗，更饱和的颜色是。H^∗定义360°网格上表示的颜色:0°=红色;60°=黄色;120°=绿色;180°=青色;240°=蓝色;300°=红色(68，69]．

叶绿素和类胡萝卜素浓度的测量由Liu等人(2008)所描述，并进行了一些修改[70]．随机采集4份未受侵染植物的鲜嫩叶片。将约0.2 g叶组织细粉匀浆于2 mL 80%丙酮中，室温黑暗保存15分钟。粗提物在10,000 r min下离心^－1上清液用分光光度计(Shimadzu UV-2600, Japan)在663,645和480 nm处测定吸光度。叶绿素浓度(mg/L)一个（C_一个),叶绿素b（C_b)、总叶绿素(C_t)及类胡萝卜素(C_x.c)计算如下:C_一个= 12.21₆₆₅- - - - - - 2.81₆₄₉，C_b= 20.13₆₄₉- - - - - - 5.03₆₆₅，C_t＝C_一个+C_b，C_x.c= (1000₄₇₀- 3.27C_一个- 104C_b) / 229。

UPLC-QQQ-MS分析

使用混合器轧机（MM 400，RETSCH）用氧化锆珠粉碎四种植物品种的冷冻干燥的嫩芽分别以30Hz为1.5分钟。然后将100mg粉末在4℃下萃取过夜，含有0.1mg L的1.0mL 70％甲醇^－1以利多卡因为内标。混合物每隔一段时间旋转三次。上清液在10000 g离心10 min后，用孔径为0.22-μm的有机相针滤器(SCAA-104, ANPEL, Shanghai, China)过滤，然后进行LC/MS分析。

采用LC-ESI-MS/MS (HPLC, SHIMADZU CBM20A, Japan;MS, Applied Biosystems 4000 QTRAP，美国)。采用VP-ODS C18色谱柱(粒径5.0 μm, 2 mm × 150 mm;Shim-pack、日本)。流动相为0.04%乙酸水溶液和0.04%乙酸乙腈。梯度洗脱程序为:水:乙腈，95:5 V/V 0 min, 5:95 V/V 11.0 min, 5:95 V/V 12.0 min, 95:5 V/V 12.1 min, 95:5 V/V 15.0 min。流速、温度、进样量均为0.4 mL min^－1， 40°C, 5 μL。

线性离子阱和三重四极杆扫描是在配备ESI-Turbo离子喷雾接口的4500 Q trap®LC/MS/MS系统(API，美国)上进行的。ESI源操作参数设置如下:源温度550°C;离子喷淋电压5500 V;帘气，25.0 psi;碰撞气体，高。

gc - ms分析

基于固相微萃取(SPME)气相色谱-质谱(GC-MS)的挥发物分析以其高效鉴定挥发性芳香化合物而闻名[71]．将冻干的嫩枝放入20ml顶空瓶中。CTC rail system (CTC Analytics, Switzerland)固相微萃取循环中，萃取温度保持在50℃，以250 r/m的速度摇瓶15 min。在PDMS上，纤维组件为50/30 μm DVB/CAR，提取时间为30 min。解吸4 min后，挥发分直接进行GC-MS分析，在安捷伦7890气相色谱仪和安捷伦5975C质谱联用系统上进行分析。该系统采用DB-Wax毛细管柱，内径30 m×250 μm，膜厚0.25 μm (J&W Scientific, Folsom, CA, USA)。分析物以不分裂方式注入。氦气作为载气，前入口吹扫流量为3ml min^－1．通过色谱柱的气体流速为1ml min^－1．初始温度保持在40℃^oC, 5分钟，然后提高到250^oC速率为5°C min^－1，然后保持在250^o注射温度、传递线温度、离子源温度和四轴温度均为260℃^oC、 260^oC, 230^oC, 150^o电子碰撞模式下的能量为–70 eV。在溶剂延迟0 s后，在m/z范围为33-459的全扫描模式下获得质谱数据。

数据分析

数据通过SAS软件包(版本9.4,SAS Institution, USA)进行分析。采用Duncan多重距离检验在显著性水平下比较统计学差异P< 0.05或0.01。

UPLC-QQQ-MS数据分析通过与内部代谢物串联MS/MS数据库MWDB (metware数据库)匹配准确的质谱和串联MS/MS谱来确定。在一些代谢物的鉴定中去掉了同位素、加合物和质量片段的特征。代谢物注释使用MassBank (http://www.massbank.jp/),背包(http://kanaya.naist.jp/KNApSAcK/), HMDB (http://www.hmdb.ca/)，MoTo DB(http://www.ab.wur.nl/moto/)，和梅特林(http://metlin.scripps.edu/index.php）.代谢产物定量采用多反应监测方法[72]和分析师1.6.1®软件（Sciex，USA）。为了鉴定来自GC-MS分析的代谢物，LECO CORPORATION和NIST数据库的Chroma TOF 4.3x软件用于原始峰精确，数据基线滤波和基线的校准，峰值对准，解卷积分析，峰值识别和整合峰面积。

所有涉及峰数、样本名称和归一化峰面积的结果三维数据都被输入SIMCA14.1软件包(MKS data Analytics Solutions, Umea, Sweden)进行主成分分析(PCA)和潜在结构识别分析(OPLS-DA)的正交投影。为了完善分析，我们得到了投影中变量重要性的第一个主成分(VIP)。首先选择VIP值超过1.0的作为改变代谢物。此外，其余的变量由学生的评估t-试验(P-value > 0.05)，两组变量均弃用。即选择差异代谢物的条件为VIP > 1和P值< 0.05。此外，包括KEGG (http://www.genome.jp/kegg/)及代谢分析(http://www.metaboanalyst.ca/)，用来寻找代谢物的途径。

采用Spearman相关系数评估gc鉴定和uplc鉴定的感兴趣代谢物之间的相关性。这些代谢产物与相关系数> .8和相应的P-value < 0.05通过Cytoscape (v3.5.1)处理得到相关网络。

−一个^＊：

绿色

机场核心计划:

亚洲柑橘木虱

+b^＊：

黄色

C:

重一野生普通话

C^＊：

色彩饱和度

C_一个：

叶绿素含量一个

车：

类胡萝卜素

排名:

叶绿素

C_b：

叶绿素含量b

C_t：

总叶绿素含量

C_x.c：

类胡萝卜素含量

C拉斯维加斯:

CandidatusLiberibacter asiaticus

相关系数:

相关系数

D。citri:

Diaphorina citri

5-ALA:

5-aminolevulinate

旅客:

‘甘南枣’脐橙

H^∗：

色差

滴:

huanglongbing

气相:

气相色谱分析-质谱法

珍:

桔子茉莉

是:

茉莉酸

Kegg：

京都基因和基因组百科全书

l^＊：

颜色的亮度

惩罚:

甲基jasmonate

台面：

水杨酸甲酯

NORC:

国家脐橙工程研究中心

OPLS-DA:

潜在结构识别分析的正交投影

主成分分析:

主成分分析

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

RH:

相对湿度

山:

水杨酸

情景应用程序:

统计分析系统

萃取:

固相微萃取

UPLC-QQQ-MS:

超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱

贵宾:

投影中第一个重要程度可变的主成分

挥发性有机化合物的仪器:

挥发性化合物

Y:

野生香港金桔

感谢BIOTREE对代谢数据分析的支持。

资金

江西省自然科学基金项目(no . 20152ACB21005, no . 2016BBF60071);国家自然科学基金项目(no . 31760563)。

数据和材料的可用性

本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本文[及其补充信息文件]中。这两种野生柑橘种质可通过当地政府获得。NORC可提供“赣南早”脐橙幼苗。

作者指出

1. 钟早发、周晓娟对这部作品贡献良多。

从属关系

1. 甘南师范大学生命科学学院国家脐橙工程研究中心，赣州

   钟早发，周晓娟，林金蓓，刘新军，邵佳，钟八连，彭婷

贡献

TP构思并设计了实验。ZFZ、XJZ、JBL、XJL、JS进行了实验和数据采集。TP和BLZ分析数据并撰写初稿。所有的作者都对手稿的最终版本进行了编辑和修改。

相应的作者

对应到Ting彭．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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再版和权限