跳到主要内容gydF4y2Ba

比较转录组和代谢分析揭示了褪黑素在延缓香蕉采后果皮炭疽病发生方面的作用gydF4y2Ba

摘要gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

香蕉炭疽病,由gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba是香蕉采后最严重的病害之一。褪黑素因其在增强植物抗逆境能力方面的作用而广为人知。然而,褪黑素对采后香蕉果实炭疽病的控制作用尚不清楚。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

本研究中,外源褪黑素处理可显著降低成熟黄香蕉果实炭疽病的发生率,延缓果实衰老。然而,褪黑素治疗并没有影响生长gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba体外。对香蕉皮的转录组分析显示,与对照组相比,褪黑素处理后香蕉皮中有339个基因上调,241个基因下调。根据GO术语和KEGG通路,这些上调基因主要分为信号转导、细胞壁形成、次生代谢、挥发性化合物合成和应激反应,这可能与褪黑素处理诱导香蕉果实抗炭疽有关。通过代谢组学分析,褪黑激素处理后果皮中挥发性化合物、细胞壁成分和IAA含量的增加也支持了这一观点。褪黑素处理后,生长素、乙烯和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路增强,这可能是通过调节生理特性、抗病蛋白和代谢产物来增强果实抗病性的。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

我们的研究结果更好地理解了褪黑素治疗延缓香蕉果实衰老和炭疽病发病率的分子过程。gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

褪黑素,又称n -乙酰-5-甲氧基色胺,是一种动物激素,参与调节各种生理过程,包括睡眠生理、昼夜节律和性行为[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba].除了上述功能外,褪黑素还是一种强大的自由基清除剂和广谱抗氧化剂[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].自从首次在植物中发现褪黑素以来[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba],褪黑素在植物王国中广泛存在,已被报道存在于相当多的植物物种中,褪黑素在许多生物过程中发挥着重要作用,如种子萌发[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba],花卉发育[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba],叶片衰老[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba],果实成熟[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba],对冷应激的反应[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]和对病原体的反应[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].然而,褪黑素对香蕉衰老的影响尚不清楚,特别是对采后香蕉果实成熟后的影响。gydF4y2Ba

香蕉是典型的更年期水果,采后先成熟,后衰老,果实变质,保质期缩短。在这一过程中,果实容易受到病原微生物和腐生植物的侵袭。一般来说,随着果实衰老的加深,果实病害程度逐渐加重。香蕉炭疽病引起的gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba是世界上香蕉采后最严重的病害之一[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].在我们的初步实验中,褪黑素治疗显著降低了香蕉果实的炭疽病发病率(来自未发表的数据)。从安全性和重要的生物学效应来看,褪黑素可作为控制炭疽病的良好候选药物。褪黑素是植物中的一种信号刺激剂,可显著抑制叶片衰老延缓[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]和病原体攻击[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,从而触发生长素、乙烯和水杨酸信号通路。褪黑素还能增强植物的抗氧化能力,通过增强抗坏血酸过氧化物酶来去除活性氧[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].进一步的研究表明,外源应用褪黑素可提高香蕉的抗病性gydF4y2Ba镰刀菌素gydF4y2Ba诱发mahsp90枯萎[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba].然而,褪黑素在香蕉炭疽病调控中的作用机制尚不清楚。gydF4y2Ba

最近,包括转录组学和代谢组学在内的“组学”技术提供了转录本和代谢物丰度在空间、时间或条件方式上变化的全球视角,使我们能够研究果实采后生理学的复杂性。由于RNA-seq具有明显的优势和敏感性,越来越多的研究人员使用深度rna -测序结合数字基因表达图谱(DGE)分析来快速识别和分析果实生理动态[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].虽然已测序的香蕉基因组为DGE分析提供了很好的参考,但对香蕉转录组学和代谢组学的综合分析研究尚未见文献记载,褪黑素在控制香蕉炭疽病中的作用也未见报道。gydF4y2Ba

本研究为探索褪黑素延缓香蕉炭疽病的调控机制,通过比较转录组学和代谢组学分析,研究和鉴定褪黑素治疗后差异调控基因和代谢产物。本研究结果可为褪黑素在香蕉果实采后品质改良及其他园艺果实采后品质改良中的应用提供参考。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

褪黑素处理后收获香蕉的生理特性gydF4y2Ba

为验证褪黑素诱导果实抗性的作用,将黄色成熟香蕉果实在10 mM褪黑素中浸泡3 min。结果表明,褪黑素处理显著降低了炭疽病发病率和果实衰老(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Baa和b).第4天,对照组的发病率为100%,而褪黑素处理的水果发病率为50%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bac).对照组的百分比严重指数接近100%,而褪黑素处理的水果的百分比严重指数为40%(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bad).对照的病斑直径大于1.5 mm,而褪黑素处理的果实的病斑直径为0.4 mm(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Bae).此外,褪黑素处理显著抑制了果实硬度和色相角值的下降(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Baf和g),降低果实呼吸速率(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Bah).总的来说,褪黑素治疗显著延缓了香蕉果实衰老,显著降低了香蕉果实保质期内炭疽病的发病率。gydF4y2Ba

图1gydF4y2Ba
图1gydF4y2Ba

褪黑素对香蕉炭疽病发病的影响。gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba褪黑激素处理过的香蕉水果。gydF4y2BabgydF4y2Ba控制香蕉水果。gydF4y2BacgydF4y2Ba炭疽病发病率。gydF4y2BadgydF4y2Ba发病面积百分比。gydF4y2BaegydF4y2Ba炭疽病斑平均直径。gydF4y2BafgydF4y2Ba水果坚定。gydF4y2BaggydF4y2Ba水果的颜色。gydF4y2BahgydF4y2Ba果实呼吸速率gydF4y2Ba

生理特征gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba褪黑素治疗后gydF4y2Ba

褪黑素降低香蕉果实炭疽病发病率可能有两种途径;一种是诱导果实抗病,另一种是杀伤gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba在水果表面。验证褪黑素的毒性gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba,gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba从香蕉果实中分离纯化,在加褪黑素和不加褪黑素的PDA培养基上培养。结果表明,在菌落培养期间,三种浓度的褪黑素处理对致病真菌的生长没有明显影响(图;gydF4y2Ba2gydF4y2BaA和b),表明褪黑素治疗可能仅通过诱导水果抗病性来降低香蕉果实炭疽病的发病率。gydF4y2Ba

图2gydF4y2Ba
figure2gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba利用PDA培养基从香蕉果皮中分离纯化了炭疽菌。炭疽菌(Colletotrichum musae)分别在含有0(对照)、0.05、0.1和0.5 mM褪黑素的PDA培养基上培养。gydF4y2BabgydF4y2Ba在培养4 d和6 d时观察并测量菌落直径gydF4y2Ba

褪黑素处理后香蕉皮的转录组分析gydF4y2Ba

为了研究褪黑素处理后香蕉皮的基因表达谱,使用Agilent 2100 Bioanaylzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统对样本文库进行定性和量化。从每个复制中获得超过12,000,000个干净读取,并且在每个复制中总映射读取超过9,000,000个(附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。经基因表达及差异表达基因分析,褪黑素治疗后,339个基因上调,241个基因下调。gydF4y2Ba

为了获得更多关于差异表达基因的信息,根据生物过程、分子功能和细胞成分,使用Blast2GO进行基因功能聚类分析。对于生物过程,基因分布在20个类别中(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1),最大的是“代谢过程”,其次是“细胞过程”、“刺激反应”和“单有机体过程”。KEGG通路分析将580个差异表达基因分为88类,其中前20个显著富集通路如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba.“代谢途径”和“次生代谢产物的生物合成”是最大的组,具有最高的意义,这表明这两类基因在褪黑素诱导的香蕉抗病性中起着关键作用。gydF4y2Ba

图3gydF4y2Ba
图3gydF4y2Ba

KEGG通路分析后差异表达基因通路富集的前20个统计数据gydF4y2Ba

为了验证RNA-seq数据的有效性,我们采用实时定量PCR (real-time quantitative PCR, q-PCR)方法分析了20个基因的表达模式,主要涉及信号转导、转录因子、应激反应、细胞壁等代谢途径。结果显示,这些基因在q-PCR和RNA-seq数据中的表达模式是一致的,大多数基因在RNA-seq数据中的折叠变化大于q-PCR数据(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图4gydF4y2Ba
装具gydF4y2Ba

用qRT-PCR从RNA-seq中筛选20个差异表达基因进行验证gydF4y2Ba

褪黑素治疗后信号转导和转录因子相关基因的差异表达gydF4y2Ba

共有74个参与信号转导的基因存在差异表达,其中15个基因在褪黑素治疗后下调,59个基因上调(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。根据Cytoscape (version 3.3.0)的ClueGo分析,这些基因主要聚集在受体信号通路和细胞壁组织(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:图S2)。19个差异表达基因被注释为转录因子;其中14人因褪黑素治疗而上调,包括gydF4y2BaWRKY, MYB, ERF, ARF和bHLH3gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。经BingGO分析,上调的转录因子主要参与激素信号通路,如生长素信号通路、乙烯信号通路(附加文件)gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba:图S3)。这些基因包括受体信号通路、细胞壁组织、生长素信号通路和乙烯信号通路,可能在褪黑素诱导香蕉果实抗病性中起重要作用。gydF4y2Ba

与应激反应相关的差异表达基因gydF4y2Ba

褪黑素治疗后,145个与应激反应相关的基因表达不同。褪黑素治疗后,其中91例上调,54例下调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。同源序列分析表明,香蕉的580个差异表达基因可以与334个基因相匹配gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因。MapMan (3.6.0RC1)分析采用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因身份证。胁迫主要包括生物胁迫和非生物胁迫。Mapman分析显示,125个基因参与生物胁迫,13个基因参与非生物胁迫(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4),表明褪黑素治疗可以增强香蕉皮对生物应激的抵抗力。在“响应生物应激”中,褪黑素治疗诱导的基因主要涉及生长素、乙烯、MAPK、过氧化物酶、细胞壁、蛋白水解、热休克蛋白和次生代谢产物(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S4)。由于香蕉部分基因序列缺乏同源比对gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因,Mapman分析的基因数量少于实际数量,后续列出的基因数量基于KEGG通路分析。gydF4y2Ba

在信号转导方面,褪黑素处理后26个基因上调,其中8个包括8个乙烯信号相关基因,4个生长素信号相关基因,10个ROS相关基因,4个MAPK信号相关基因(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。此外,褪黑素治疗后8种受体蛋白上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。奇怪的是,只有少数致病相关(PR)蛋白在褪黑素治疗后显著上调,其中包括4种gydF4y2Ba氧化物酶gydF4y2Ba和两个gydF4y2Ba脂质转运蛋白gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

褪黑素治疗后代谢相关基因差异表达gydF4y2Ba

在本研究中,褪黑素治疗后,155个与代谢过程相关的基因表达不同。MapMan分析显示,褪黑素诱导的代谢过程主要涉及细胞壁、脂类、类黄酮、蜡和萜烯的合成以及淀粉的降解(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba).褪黑素治疗后,22个参与细胞壁代谢的基因表达差异。其中只有4个基因在褪黑激素处理的香蕉皮中表达下调,18个基因被预测参与细胞壁生物合成,如可能的木葡聚糖内转葡萄糖酶/水解酶蛋白和纤维素合成酶(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。有32个与脂质代谢相关的差异表达基因,其中22个在褪黑素治疗后上调,主要涉及鞘脂和脂质生物合成过程、脂质氧化和膜脂质生物合成过程(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。对于蜡的合成,5gydF4y2Ba3-ketoacyl-CoA合成酶gydF4y2Ba在褪黑激素处理过的香蕉皮中表达上调(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。对于类黄酮生物合成,褪黑素处理上调了14个基因gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1),包括6个gydF4y2BaS-norcoclaurine合成酶gydF4y2Ba(gydF4y2BaNCS1gydF4y2Ba),两个gydF4y2Ba查耳酮合成酶gydF4y2Ba,gydF4y2Ba鼠李糖生物合成酶gydF4y2Ba和其他基因(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。gydF4y2Ba

图5gydF4y2Ba
figure5gydF4y2Ba

使用MapMan可视化平台的代谢途径示意图。同源序列分析表明,香蕉的580个差异表达基因可以与334个基因相匹配gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因。MapMan分析采用gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因身份证。基因表达比(褪黑素治疗组/对照组)的对数以2为基数进行MapMan分析。红色或绿色方格表示参与相应代谢的上调或下调基因gydF4y2Ba

香蕉皮中挥发性物质的鉴定与分析gydF4y2Ba

为了研究褪黑素处理后香蕉皮的香气变化,采用GC-MS分析了香蕉皮挥发性化合物的含量。在香蕉皮中共鉴定出44种挥发性化合物,主要挥发性化合物见附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S5。其中37种化合物的含量变化较大(gydF4y2BapgydF4y2Ba褪黑素治疗后< 0.05),主要包括酯类和酚类物质(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。利用SIMCA软件(Version 15.0, Umetrics, Umea, Sweden)对这些累积量显著改变的挥发性化合物进行投影到潜在结构鉴别分析(PLS-DA)。结果表明,R2X[1]和R2X[2]占数据集方差的0.781(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa).在对照组和褪黑素处理的样本组之间观察到明显的分离(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Baa). PLS-DA中装载的大部分挥发性化合物沿褪黑素处理过的果皮样品方向分布(图。gydF4y2Ba6gydF4y2BaB),表明褪黑素处理后香蕉皮中挥发性化合物的含量发生了显著变化,这可能在褪黑素延缓香蕉果实衰老中起着至关重要的作用。为了进一步探索本研究中的重要化合物,采用正交投影-潜在结构判别分析(OPLS-DA)。共有14个挥发性化合物被识别为重要化合物,预测VIP > 1,如图红色所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Bab.这些化合物在香蕉皮中含量相对较高。gydF4y2Ba

图6gydF4y2Ba
figure6gydF4y2Ba

香蕉皮中挥发性化合物的PLS-DA和OPLS-DA。对37种挥发性化合物进行了PLS-DA和OPLS-DA测定。OPLS-DA和方差分析结果显示,有14种挥发性化合物是重要的(预测VIP > 1和gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)。gydF4y2Ba一个gydF4y2BaPLS-DA评分散点图。M1为第1天的褪黑素处理样品,C1为第1天的对照样品,后面是重复编号。gydF4y2BabgydF4y2BaPLS-DA加载散点图。重要的化合物用红色表示。圆圈的大小表示第1天对照果皮中化合物的相对含量gydF4y2Ba

果实衰老过程中,13种重要挥发性化合物含量显著降低,只有4-己烯乙酸酯含量升高。褪黑素治疗后,7种重要挥发性化合物的含量在第1天较对照组显著增加,第4天所有挥发性化合物均显著诱导,包括邻苯二甲酸二丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、丁酸异丁酯、异戊酸异丁酯、草酸环己基甲基三烷基甲酯、异丁酸异戊酯、异丁酸异戊酯、乙酸异戊酯、异戊酸异戊酯、异戊酸异戊酯、丁酸异戊酯、乙酸异戊酯。丁酸正丁酯和乙酸4-己烯酯。结果表明,褪黑素处理有利于保持香蕉皮挥发性物质,抑制果实衰老。gydF4y2Ba

褪黑素处理后香蕉皮IAA含量及细胞壁组分gydF4y2Ba

为验证褪黑素治疗中生长素信号的真实性,测定了IAA含量。结果显示,褪黑素治疗后,IAA水平在第1天显著升高,然后下降(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),这表明褪黑素引起了瞬时但不持久的IAA合成诱导。测定了纤维素、半纤维素、水溶性果胶(WSP)、离子溶性果胶(ISP)、共价溶性果胶(CSP)和木质素等细胞壁组分的含量。褪黑素处理后,ISP、CSP、半纤维素含量显著增加,只有WSP含量显著降低(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).有从WSP向ISP和CSP转变的趋势。奇怪的是,褪黑素处理的样品中纤维素含量在第1天低于对照,但在第4天却高于对照(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

图7gydF4y2Ba
figure7gydF4y2Ba

褪黑素治疗后IAA和细胞壁成分含量。FW:新鲜重量。DW:干重。WSP:水溶性果胶。ISP:离子溶果胶。CSP:共价溶果胶gydF4y2Ba

褪黑素处理后香蕉皮差异表达基因与果实生理特性的协调变化gydF4y2Ba

通过相关分析,筛选出与香蕉皮果实生理特性功能相关或共同调节的差异表达基因(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).代谢物的协调转移通过成对相关分析进行评估,302显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05)表达基因和48个生理特征。结果表明,乙烯和生长素信号相关基因大多与果实硬度、色相角、IAA、ISP、CSP、纤维素、半纤维素及大部分挥发性化合物水平较高呈正相关,而上述生理特性与ROS代谢、蜡代谢、抗病、细胞壁代谢等相关基因大多呈正相关(图)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).而在其他聚类中,只有部分基因与上述生理特征呈正相关,包括芳香族代谢、蛋白质修饰、脂质代谢、次生代谢、应激反应等代谢(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).提示褪黑素治疗可以诱导香蕉皮中一系列代谢途径相关基因的上调,导致大部分物质的含量显著增加,包括细胞壁、蜡、脂类和挥发性成分。gydF4y2Ba

图8gydF4y2Ba
figure8gydF4y2Ba

褪黑素处理后香蕉皮差异表达基因与果实生理特性的相关性分析热图共有302项显著(gydF4y2BapgydF4y2Ba以< 0.05)的表达基因和48个生理特征进行相关矩阵分析。相关系数(正或负)由颜色键中所示的虚拟颜色表示gydF4y2Ba

讨论gydF4y2Ba

在过去的二十年中,褪黑素在体内的作用已在叶片衰老、植物发育和应激反应中得到证实[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba],并且在了解褪黑素在延缓叶片衰老中的作用方面取得了显著进展[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].叶片有一个大分子退化和养分循环的过程。然而,果实的衰老与叶片的衰老有很大的不同。果实衰老与果实成熟密切相关,成熟使果实多汁,并吸引包括人类在内的种子传播媒介,通常没有营养循环过程。果实衰老是一个复杂的生理生化过程,涉及碳水化合物和细胞壁退化、风味降低、蜡质退化等一系列生理变化。gydF4y2Ba

褪黑素治疗显著延缓了香蕉果实中的炭疽病gydF4y2Ba

香蕉是典型的更年期水果,成熟后保质期短。炭疽病症状通常随着果实衰老的加深而加重。炭疽病,由gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba真菌,是香蕉果实采后最重要的病害,严重影响香蕉果实的品质和保质期[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba].褪黑素曾被报道可以提高水果对病原体感染的抵抗力[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].在本研究中,褪黑素处理显著延缓了香蕉果实炭疽病的发生,但对真菌的生长发育没有影响(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba2gydF4y2Ba).同时,处理显著延缓了果实衰老,表明果实衰老与病害发生之间可能存在一定的联系。因此,对褪黑素治疗后的香蕉皮进行转录组学和代谢组学对比分析。重点讨论了褪黑素延缓香蕉衰老和炭疽病的分子机制。gydF4y2Ba

褪黑素治疗激活了香蕉皮中的乙烯和生长素信号gydF4y2Ba

植物中的受体样激酶(Receptor-like kinases, RLKs)是一个庞大的超家族蛋白质,参与植物的发育、生长、激素感知和对病原体的反应等一系列反应[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].在本研究中,一些褪黑素显著上调的基因被注释为受体蛋白激酶,如gydF4y2Ba富亮氨酸重复受体蛋白激酶gydF4y2Ba,gydF4y2Ba富半胱氨酸受体样蛋白激酶25gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba壁相关受体激酶5gydF4y2Ba.褪黑素的受体和信号通路也已在动物中得到证实[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].然而,植物体内褪黑素的受体独立机制尚不清楚。虽然到目前为止还没有在植物中发现褪黑素的高亲和受体,但我们的结果可以为研究受体介导的褪黑素机制提供线索。gydF4y2Ba

乙烯对果实成熟和植物防御信号传递很重要[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].在本研究中,乙烯生物合成基因的表达gydF4y2Ba小块土地gydF4y2Ba褪黑素治疗后明显不正常(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。诱导表达gydF4y2Ba小块土地gydF4y2Ba年代和gydF4y2Ba华gydF4y2BaS可调节果实软化、香气释放及抗病性增强[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba].生长素信号在植物发育中的作用是众所周知的。近年来,生长素相关基因被报道参与植物对病原体感染的反应[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].生长素和乙烯信号之间存在串扰,但仍缺乏详细的信息[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].在这项研究中,两个基因编码gydF4y2Ba吲哚-3-乙酸-酰胺合成酶gydF4y2Ba而且gydF4y2Baauxin-induced蛋白质gydF4y2Ba在褪黑激素处理过的香蕉皮中诱导(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。相应地,褪黑素治疗后IAA含量显著增加(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba, IAA也被报道为叶片自然衰老的正向调节剂[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].总的来说,褪黑素处理后,香蕉果实中的乙烯和生长素信号都被激活(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),揭示了褪黑素可能主要通过激活植物激素信号(如乙烯和生长素)来调节香蕉的衰老和抗病性。gydF4y2Ba

图9gydF4y2Ba
figure9gydF4y2Ba

褪黑素延缓香蕉炭疽病发病的主要途径gydF4y2Ba

褪黑素可能通过ros介导的信号通路和MAPK信号通路诱导香蕉果实抗性gydF4y2Ba

活性氧(ROS)被报道参与植物的胁迫反应[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba].此外,呼吸爆裂氧化酶同源物(respiratory burst oxidase homologue)作为植物NADPH氧化酶之一,是植物体内ROS的主要来源。我们的研究结果表明gydF4y2Ba呼吸爆裂氧化酶同源蛋白BgydF4y2Ba在褪黑素治疗后,香蕉皮中的细胞活性显著上调,这可能加速了香蕉皮中抵抗病原体感染的反应信号(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).ROS代谢的平衡对植物的正常生长至关重要。作为ROS清道夫,一gydF4y2Ba过氧化氢酶gydF4y2Ba和四个gydF4y2Ba氧化物酶gydF4y2Ba在褪黑素治疗后上调,这与之前在木薯贮藏根中的发现一致[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].这些基因的上调增强了香蕉果实清除ROS的能力,并通过酚类氧化、suberization和木质化增强了香蕉果实的造壁过程[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].以前的研究也表明褪黑素可以诱发gydF4y2Ba过氧化物酶gydF4y2Ba抑制苹果叶片衰老的表达gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].这表明褪黑素治疗可能通过ros介导的信号通路诱导香蕉果实抗性(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).gydF4y2Ba

MAPKs信号通路也参与植物的胁迫响应[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba].病原体反应性MAPKs可在褪黑素介导的防御反应中被触发gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba烟草可能通过各种磷酸化转录因子诱导一系列防御相关基因[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].此外,MAPK信号通路可与WRKY33相互作用,调控camalexin生物合成基因的表达,从而驱动camalexin生成的代谢流gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].在这项研究中,gydF4y2Ba丝裂原活化蛋白激酶5gydF4y2Ba在褪黑素治疗后升高。同时,包括WRKY33在内的多个WRKY转录因子显著上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。结合我们目前的研究结果和以往的报道,我们推测MAPK信号可能参与了褪黑素诱导的香蕉炭疽病抗性。gydF4y2Ba

褪黑素处理诱导香蕉皮细胞壁和蜡的合成gydF4y2Ba

植物细胞壁在应对病原体感染中起着重要作用,可以有效地将微生物病原体与植物代谢产物隔离开来。完整的细胞壁能有效保护植物不受病原菌感染[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].在这项研究中,18个细胞壁相关基因在褪黑素治疗后显著上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。其中大部分与香蕉皮中的纤维素、半纤维素、果胶和果实硬度呈正相关(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).此外,对比分析显示,在第4天,褪黑素处理的样品中果胶、纤维素和半纤维素含量均高于对照组(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba).这表明,褪黑素处理保持了较高的细胞壁完整性,有利于延缓香蕉果实衰老,保护果实免受病原菌感染。gydF4y2Ba

水果会在表面或角质层分泌蜡质,以防止水分流失、延缓收缩和变质,并改善外观[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].经人工蜡处理的水果,其腐烂指数亦明显下降[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba].植物表皮蜡是取代长链脂肪烃的混合物。甚长链脂肪酸是植物表皮蜡质的重要前体,3-酮酰基辅酶a合成酶是甚长链脂肪酸生物合成的关键酶[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].在这项研究中,是5gydF4y2Ba3-ketoacyl-CoA合成酶gydF4y2Ba在褪黑激素处理的果实中表达量高于对照。转基因植株的总蜡量增加了10-34%gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba叶子overexpressinggydF4y2BaKCS20gydF4y2Ba而且gydF4y2BaKCS2 /黛西gydF4y2Ba的含量下降了15-20%gydF4y2Ba3-ketoacyl-CoA合酶gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].这表明褪黑素治疗诱导香蕉果皮蜡的合成,这对降低炭疽病的发病率也起着至关重要的作用。gydF4y2Ba

角质是角质层的重要组成部分,在植物对病原菌侵染的反应中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].角质生物合成参与脂质转移蛋白,脂质转移蛋白负责磷脂和其他脂肪酸基团在细胞膜之间的穿梭[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba].它们在抵抗生物和非生物胁迫方面也发挥着重要作用[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba].在这项研究中,有两个gydF4y2Ba脂质转移蛋白gydF4y2Ba基因在褪黑激素处理的样本中被鉴定为上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。同时,蜡和角质生物合成相关基因(gydF4y2BaMYBgydF4y2Ba)在褪黑素治疗后也会上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。总之,我们仔细地得出结论,褪黑素治疗可以增加gydF4y2BaMYBgydF4y2Ba表达,促进蜡和角质的生物合成,保护香蕉果实免受gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba感染。gydF4y2Ba

褪黑素治疗可诱导挥发性化合物和脂质代谢gydF4y2Ba

果实成熟过程中会产生挥发性化合物,其中大部分还可以作为吸引动物的“生物贿赂”和抵御病原体的保护剂[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba].我们的研究发现香蕉皮的主要特征挥发性化合物是酯类化合物,这与以往的研究一致[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba].大多数重要的挥发性化合物是由褪黑素治疗诱导的,特别是在第4天(附加文件)gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:表S2)。此外,褪黑素治疗后,与挥发性化合物代谢过程相关的16个基因上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。一些酯类具有抗菌作用,如异丁酸特醇、异丁酸异戊酯等。在本研究中,经过褪黑素处理的香蕉皮在储存4天后,这些挥发性化合物的含量较高,这与芳香化合物代谢过程基因的表达水平较高呈正相关(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba).之前对番茄的研究也表明褪黑素可以通过调控番茄成熟过程中相关基因的表达来改变番茄中挥发性化合物的含量[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].因此,我们推测褪黑素治疗可以诱导香蕉皮中挥发性化合物的释放,这也可能与提高香蕉对病原体感染的防御能力有关。gydF4y2Ba

水果脂类是生物膜的主要成分,可以感知细胞外的情况[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].脂质的主要生物学功能包括能量储存和信号传递[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba].此外,蜡和角质不是脂质双分子层的成分,但它们是脂质衍生的成分,有助于减轻组织损伤[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].在本研究中,KEGG分析有32个基因参与醚脂代谢,其中22个基因在褪黑素处理的香蕉中表达量高于对照,包括gydF4y2Ba环芳香醇-C-24-甲基转移酶,脂肪酸羟化酶,赤霉素2- β -双加氧酶,l-抗坏血酸氧化酶,磷酸肌醇磷脂酶c4,倍半萜合酶5gydF4y2Ba和其他(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。这些特征表明,褪黑素可能通过诱导脂质代谢来提高香蕉皮的抗应激能力。gydF4y2Ba

褪黑素治疗可以激活几丁质介导的防御通路和一些致病相关蛋白gydF4y2Ba

甲壳素是许多病原真菌细胞壁的主要结构成分之一。因此,植物在对抗真菌病原体的防御反应中,总是积累几丁质酶来降解真菌细胞壁[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].然而,所有的差异表示gydF4y2Ba几丁质酶gydF4y2Ba在本研究中,褪黑素治疗后基因下调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。相比之下,褪黑素治疗后,大多数与甲壳素反应相关的基因显著上调(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。据报道,几丁质反应基因的缺失增强了疾病的易感性gydF4y2BaArobidopsisgydF4y2Ba[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].提示褪黑素治疗可以激活香蕉皮中几丁质介导的防御途径,有利于增强香蕉炭疽病的抗性。gydF4y2Ba

病原相关蛋白是指植物受到病原体攻击时产生的蛋白质,植物中发现的许多蛋白质都是病原相关蛋白[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].主要包括索马汀样蛋白,几丁质酶,gydF4y2BaβgydF4y2Ba-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶抑制剂、蛋白酶内源性酶、过氧化物酶、脂质转移蛋白、防御素等[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].在这项研究中,只有少数人在褪黑素治疗后显著上调,包括4人gydF4y2Ba氧化物酶gydF4y2Ba和两个gydF4y2Ba脂质转运蛋白gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba: Excel S1)。由于PR蛋白是作为系统性获得性抵抗(SAR)的一部分被诱导的,我们的结果表明褪黑素治疗可能不能完全激活香蕉果实的SAR。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

本研究结果表明,外源褪黑素处理显著延缓香蕉果实衰老和炭疽病的发生,而不是通过杀死果实表面的病原体。褪黑素处理后,受体蛋白激酶向生长素、乙烯、ROS和MAPK发送信号(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).果实物理性状合成基因上调,细胞壁、蜡质、脂质、挥发性成分等大部分物质含量显著增加。香蕉果实衰老明显延缓,炭疽病对香蕉果实的侵染得到很大程度的阻止(Fig。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba).尽管褪黑激素处理的样品中PR蛋白很少被激活,但褪黑激素处理诱导了大量应激反应相关蛋白和次级代谢产物(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),这可能在应对炭疽病感染方面发挥重要作用。gydF4y2Ba

方法gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

黄香蕉(gydF4y2Ba穆萨渐尖gydF4y2BaL. AAA组,cv。巴西)的水果是从中国广州的一个商业果园购买的。选取形状、颜色、大小均匀、机械损伤小的果指,在蒸馏水(对照组)或10 mM褪黑素中浸泡3分钟(Aladdin, USA)。在25°C、85-90%相对湿度的条件下,分别于处理后1天和4天取样。每个处理设5个生物重复,每个重复12个果指。从每根手指中部取皮组织,用液氮研磨成粉末,保存在-80°C下,供进一步分析。gydF4y2Ba

香蕉果实生理参数的测定gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba

根据我们之前的研究[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba],用公式将颜色变化量化为色相角gydF4y2BahgydF4y2Ba= 180°+ tangydF4y2Ba−1gydF4y2Ba(b * / *)。根据Huang等人的描述,使用GY-1(杭州科学仪器)穿透仪测量果实硬度。[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba].gydF4y2Ba炭疽菌musaegydF4y2Ba采用PDA培养基从香蕉果皮中分离纯化。在4种褪黑素浓度(0、0.05、0.1和0.5 mM)治疗后4天和6天测量病斑直径。gydF4y2Ba

RNA提取和RNA-seq(定量)分析gydF4y2Ba

Li等从香蕉皮中提取总RNA [gydF4y2Ba44gydF4y2Ba], DNA污染首先通过DNase I处理去除。然后用寡核苷酸(dT)磁珠富集mRNA,并将其裂解成短片段。用随机六聚体引物合成第一条cDNA,再加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA聚合酶I合成第二条cDNA。用磁珠进一步纯化双链cDNA。然后进行末端修复和3 '腺嘌呤添加。最后,将测序适配器连接到片段上,通过PCR扩增富集片段。在质控步骤中,采用Agilent 2100 Bioanaylzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR系统对样品库进行定性和定量。文库产品已准备好通过Illumina HiSeq™2000进行测序。RNASeq采用3个生物重复。通过从原始数据中删除包含适配器的读取、包含ploy-N的读取和低质量的读取,可以获得干净的读取。 The read length is 49 basepare. After data quality statistics, clean reads were mapped to banana genome sequences (https://banana-genome-hub.southgreen.fr/gydF4y2Ba)gydF4y2BaBWAgydF4y2Ba软件(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba].通过将参考基因组上的reads映射到每条染色体上的统计分布reads,可以帮助确定reads在染色体上的覆盖范围,以及基因分布的数量。采用RSEM软件包定量检测基因表达水平。采用FPKM法计算表达量。差异表达基因(differential expression genes, DEGs)筛选采用Noiseq包法[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba].Noiseq法可以在两个含有生物重复的组间筛选出差异表达基因。根据以下标准筛选差异表达基因:折叠变化≥2,发散概率≥0.8。最后,WEGO软件[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]和KEGG [gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]用于差异表达基因的生物学功能分类分析。gydF4y2Ba

RNA-seq数据的实时定量PCR验证gydF4y2Ba

q-PCR特异性引物见附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:表S3,使用Primer Premier 6.0设计。用肌动蛋白归一化cDNA含量,按照Li等的方法进行q-PCR [gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].重复了四次。gydF4y2Ba

气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析挥发性化合物gydF4y2Ba

每个样品取2克,用4 mL NaCl饱和溶液均质。然后在40°C下保存15分钟,然后收集挥发性化合物。按照Jing等人描述的方法收集挥发性化合物45分钟。[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba].GC-MS分析参照Jing等方法[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]使用GC-2010气相色谱(岛津,苏州,中国),配备GC MS-QP2010 +质谱仪(岛津,苏州,中国)。挥发性化合物的分离使用30 m Rxi-5MS毛细管柱(0.25 mm内径)和分体式/非分体式注射器进行。将1 μL样品注入进样器,重复分析3次。每种化合物的数量由特定成分的峰面积与用作内部控制的环己酮的峰面积之比确定。gydF4y2Ba

褪黑素处理后香蕉皮中IAA含量及细胞壁组分的测定gydF4y2Ba

IAA含量根据制造商说明书确定。简单地说,将0.1 g果皮悬浮在1ml冷试剂I中12小时。离心8000 g后,收集上清蒸发,再用0.5 mL溶液II洗脱沉淀物3次。下水相用乙酸乙酯萃取两次,蒸发溶解于溶液III进行高效液相色谱(HPLC)分析(Rigol L3000)。细胞壁组分含量参照Zhao等方法测定。gydF4y2Ba50gydF4y2Ba],包括纤维素、半纤维素、WSP、ISP、CSP和木质素。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

使用至少三次生物复制测量生理参数并分析差异表达基因(转录组定量)。这里提供的数据是三个生物重复的平均值。采用错误发现率法,使用“FDR≤0.001”和log的绝对值来确定差异基因表达gydF4y2Ba2gydF4y2Ba以比值≥1’为阈值,判断基因表达差异的显著性。采用Student 's t检验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)。在挥发性化合物分析中也采用了PLS-DA和OPLS-DA。挥发性化合物具有预测VIP > 1 (OPLS-DA)和gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05 (Student 's t检验),被认为是重要的代谢物。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

RNA-seq原始数据已上传至NCBI Sequence Read Archive (SRA),提交日期:SUB5221938。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

CSP:gydF4y2Ba

Covalent-soluble果胶gydF4y2Ba

DGE:gydF4y2Ba

数字基因表达谱gydF4y2Ba

气相:gydF4y2Ba

气相色谱-质谱联用。gydF4y2Ba

高效液相色谱法:gydF4y2Ba

高效液相色谱法gydF4y2Ba

ISP:gydF4y2Ba

Ionic-soluble果胶gydF4y2Ba

MAPK:gydF4y2Ba

丝裂原活化蛋白激酶gydF4y2Ba

NCS1:gydF4y2Ba

六种s -去甲磺酸合成酶gydF4y2Ba

OPLS-DA:gydF4y2Ba

正交投影法对潜在结构的判别分析gydF4y2Ba

PLS-DA:gydF4y2Ba

投影对潜在构造的判别分析gydF4y2Ba

q-PCR:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

RLKs:gydF4y2Ba

受体激酶gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

特别行政区:gydF4y2Ba

全身获得性耐药性gydF4y2Ba

WSP:gydF4y2Ba

水溶性果胶gydF4y2Ba

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    谷歌学者gydF4y2Ba

下载参考gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

我们感谢中国科学院华南植物园的李跃彪和陈曦对采样工作的帮助。感谢贾永霞和陈曦在代谢物鉴定方面的帮助。感谢陈海涛在DGE分析中的帮助。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(No. 2018YFD1000205)、广州市珠江科技新星计划项目(No. 201610010041)、国家自然科学基金项目(Grant No. 31671911、31772371)、中国科委青年精英资助计划项目(No. 2017QNRC001)、国家创新人才博士后培养计划项目(No. 2018YFD1000205)资助。BX201600170)。gydF4y2Ba

作者信息gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

作者gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

ZY和YJ构思并设计了该研究。ZY, TL, HG, QW和YZ进行实验并对数据进行分析。TL, HG和ZY起草了手稿。YJ和HZ参与了稿件的编辑工作。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaHuijun高gydF4y2Ba或gydF4y2Ba泽云gydF4y2Ba.gydF4y2Ba

道德声明gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

所有作者都同意发表。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

额外的信息gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

附加文件gydF4y2Ba

附加文件1:gydF4y2Ba

图S1。gydF4y2Ba褪黑素治疗后差异表达基因的功能分类。(docx363 kb)gydF4y2Ba

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图S2。gydF4y2Ba利用ClueGo在Cytoscape中聚类信号转导相关基因。(docx139kb)gydF4y2Ba

附加文件3:gydF4y2Ba

图S3。gydF4y2Ba利用BinGo在Cytoscape中聚集转录因子相关基因。(docx1516kb)gydF4y2Ba

附加文件4:gydF4y2Ba

图S4gydF4y2Ba.使用MapMan可视化平台的“应激反应”示意图。(docx510 kb)gydF4y2Ba

附加文件5:gydF4y2Ba

图S5。gydF4y2Ba香蕉皮中挥发性化合物的气相色谱分析。(docx51 kb)gydF4y2Ba

附加文件6:gydF4y2Ba

表S1gydF4y2Ba.所有样本与香蕉基因组的比对统计结果。(docx17 kb)gydF4y2Ba

附加文件7:gydF4y2Ba

表S2。gydF4y2Ba香蕉皮中的挥发性成分。(docx24kb)gydF4y2Ba

附加文件8:gydF4y2Ba

表S3。gydF4y2Ba用于q-PCR的引物。(docx25kb)gydF4y2Ba

附加文件9:gydF4y2Ba

Excel S1。gydF4y2Ba褪黑素处理后香蕉皮差异表达基因。(xlsx78 kb)gydF4y2Ba

权利和权限gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba),允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制,前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬,提供到创作共用许可证的链接,并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外,适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

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李,T,吴,Q,朱,H。gydF4y2Baet al。gydF4y2Ba比较转录组和代谢分析揭示了褪黑素在延缓香蕉采后果皮炭疽病发生方面的作用。gydF4y2BaBMC植物生物学gydF4y2Ba19日,gydF4y2Ba289(2019)。https://doi.org/10.1186/s12870-019-1855-2gydF4y2Ba

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关键字gydF4y2Ba

  • 炭疽病gydF4y2Ba
  • 香蕉果实gydF4y2Ba
  • 细胞壁gydF4y2Ba
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  • 挥发性化合物gydF4y2Ba