轻度水胁迫诱导的启动增强耐受性gydF4y2BaRosellinia necatrixgydF4y2Ba易感鳄梨砧木gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

白根腐病(WRR)由gydF4y2BaRosellinia necatrixgydF4y2Ba是影响温带地区牛油果果园最重要的威胁之一。根除WRR是一项艰巨的任务，需要采用环境友好型控制方法来减轻其影响。用应激源(生物或非生物)启动植物可以是一种增强植物防御/耐受未来应激事件的策略，但是，尽管已知潜在的共同机制，很少有研究使用非生物启动来提高对即将到来的生物应激的耐受性，反之亦然(“gydF4y2Bacross-factor启动”gydF4y2Ba)．来评估gydF4y2Bacross-factor启动gydF4y2Ba可能是提高牛油果对WRR病的耐受力的潜在方法，' Dusa '牛油果砧木易受WRR病的影响gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba在两种不同程度的水分胁迫(轻度ws和重度ws)下，在干旱恢复后接种gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba．研究了干旱启动后植物防御相关基因的生理反应、表达及病害进展。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

水分胁迫下的牛油果植株表现出较低的水势和光合气孔限制。此外，NPQ和gydF4y2Ba问gydF4y2BaN值增加，表明能量耗散机制的激活与氧化应激的缓解密切相关。这种反应与水分胁迫的严重程度成正比，并伴随着根系中病原防御相关基因的失序。复浇水后，两种处理叶片光合作用和植株水分状态均迅速恢复，但轻度ws处理植株根系中与植物防御相关的基因过表达数量高于重度ws处理。接种引物植物后的疾病进展gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba在轻度ws启动的植株中显著延迟。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

这些研究结果表明，轻度ws可诱导WRR易感牛油果砧木' Dusa '进入启动状态，并揭示了'gydF4y2Bacross-factor启动”gydF4y2Ba与水胁迫(非生物应激)是有效的增加牛油果耐受性gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba(生物应激源)，这表明植物对生物和非生物胁迫的反应依赖于共同的机制。这些结果的潜在应用可能包括增强当前牛油果林的WRR耐受性和通过低频亏盈灌溉策略优化用水。gydF4y2Ba

鳄梨(gydF4y2BaPersea美国gydF4y2Ba穆勒)，樟科家族的一员，是一种非常重要的水果作物，在全球50多个国家消费。根据美国和西欧的调查，牛油果被认为是15种最健康的食物之一[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba并且正在成为许多国家消费者饮食的重要组成部分。近年来，牛油果的健康益处引发了人们对它的消费(全球消费量每年增长4.6%;欧洲增加约25% [gydF4y2Ba2gydF4y2Ba];)但产量仍落后一步(每年增长约4.5% [gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba];)，这让人担心在不久的将来很难满足这一需求。gydF4y2Ba

这种产量和需求之间的差距因牛油果病(土壤传播的病原体)的发病率而加剧gydF4y2Ba疫霉、肉桂gydF4y2Ba疫霉根腐病;PRR)是全球牛油果生产的主要限制因素之一[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．鉴于这种病原体的重要性，许多研究都集中在PRR的控制上，并取得了积极的结果，这些结果来自一种综合方法，包括使用磷酸盐、适当的田间管理和商业上可获得的部分耐受的砧木gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba(“托马斯”、“杜克”和“杜莎”)[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]，都已实现。gydF4y2Ba

在南非、以色列、意大利和西班牙(牛油果出口到欧洲市场)等温带产区，影响牛油果树林的另一种重要的土壤传播疾病是白根腐病(WRR)gydF4y2BaRosellinia necatrixgydF4y2Ba金属小球(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba) . .相比之下gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba在美国，这种疾病的控制是一项复杂而艰巨的任务，迄今为止，还没有开发出完全有效的控制方法[8，以及其中的参考文献]。至于gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba，繁殖gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba耐受性砧木可作为控制该病菌传播的有效方法[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba但是，尽管西班牙正在进行一项育种计划(安达卢西亚农业研究和培训研究所;IFAPA)，目前没有商业砧木可用。因此，有必要采取其他方法，重点是实现环境友好型战略，以降低牛油果产区WRR的发生率。gydF4y2Ba

在这方面，许多研究表明，植物预先暴露于应激诱导因子(启动概念)[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]使它们对即将到来的生物(即病原体)更加耐受[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba])或非生物(即水分压力、化合物[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)压力发作。与未启动的植物相比，这种启动诱导的耐受似乎与启动植物中更快速和更强大的细胞防御反应激活有关[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．尽管诱导启动状态的机制是复杂多样的[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]，众所周知，植物对生物或非生物因子的胁迫反应具有共同的途径[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]甚至可以实现交叉容忍[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba］．例如，与活性氧(ROS)信号传递和调节重要植物生理过程相关的水杨酸(SA)水平[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]，均在干旱胁迫下增加[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]和病原体攻击[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．更具体地说，SA的积累诱导致病相关基因1 (non-expressor of related gene 1, NPR1)的转录，进而激活编码致病相关蛋白的基因[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]，在任何一种生物[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]或非生物胁迫[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba)反应。尤其是牛油果的耐受性gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba而且gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba分别与pr基因和蛋白酶抑制剂的诱导有关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba43gydF4y2Ba];两者都与其他非生物胁迫有关，如水胁迫[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．因此，暴露于一种类型的胁迫(即非生物胁迫源)可能会激活植物对即将到来的不同类型的胁迫(即生物胁迫源)的耐受反应[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba];);以下简称“gydF4y2Bacross-factor启动gydF4y2Ba”。事实上，据报道干旱引发了gydF4y2BaEucaliptusgydF4y2Ba植物对gydF4y2BaNeofusicoccumgydF4y2Ba真菌感染与非启动物的比较[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

在此背景下，本研究旨在测试干旱启动是否可以用于牛油果，以增加对WRR疾病的耐受性。为此，研究了干旱启动的作用gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba通过评估生理状态、应激相关基因表达和疾病进展反应，评估了与易感鳄梨“杜萨”砧木的相互作用。gydF4y2Ba

牛油果“杜萨”砧木对轻度和重度水分胁迫水平的生理反应和重新浇水后的恢复gydF4y2Ba

为了研究' Dusa '砧木对轻度和重度水分胁迫(轻度- ws和重度- ws)的启动反应，两组良好灌溉的植物(在大田容量下，Fc ~ 0.4 v/v)分别遭受水分剥夺，直到土壤含水量(SWC)达到Fc的50%和25%(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．在整个实验过程中，每天灌溉一组植物作为对照，而在两组水分胁迫植物中，逐渐减少水分以同时达到两个水分胁迫水平(滞后6天后;无花果。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．一旦达到这些水平，植物重新浇水，Fc值立即达到。所有植株恢复每日灌溉直至接种gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba．gydF4y2Ba

对两种水分胁迫水平和复浇水后进行生理测定。与水分胁迫严重程度一致，正午水势与对照植物相比显著下降(gydF4y2BaPgydF4y2Ba在轻度ws中达到−1.01±0.03 MPa，在重度ws中达到−2.06±0.09 MPa(图5)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa).一致地，净COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化率(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba)和气孔导度(gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})显示，两种压力水平(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05;无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bab, c),gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba在轻度ws和重度ws中分别降低~ 70%和~ 90%以上，而gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}在两种治疗中几乎完全被抑制。叶片相对含水量(RWC)仅显著降低(gydF4y2BaPgydF4y2Ba重度ws组为87.5±0.85%，对照组和轻度ws组为~ 94%。gydF4y2Ba

在光化学层面，光系统II的暗适应光化学效率(PSII;gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)受水分胁迫的影响不显著，各处理的平均值接近0.82gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，表明水胁迫水平并不会导致慢性光抑制。PSII光化学的相对量子产率(ΦPSII)在轻度ws处理中不受影响，但在严重ws处理中显著降低(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．水分胁迫处理对开放状态下PSII中心的比例没有影响(gydF4y2Ba问gydF4y2BaL (gydF4y2Ba47gydF4y2Ba];)而PSII的开放反应中心的最大光化学效率则相反(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba' /gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba’)，随着水压力的加剧，这一数字显著减少(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．这些变化gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba' /gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba同时，其他非光化学猝灭相关参数(NPQ和gydF4y2Ba问gydF4y2BaN;表格gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

相对叶绿素含量(SPAD指数)和叶片质量面积(LMA)在对照和水分胁迫处理之间没有显著差异，在任何水分胁迫处理中都没有观察到叶片褪绿症状。所有处理的平均SPAD值为59.4±0.1,LMA为76.8 g mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}到83.4克米gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．gydF4y2Ba

复浇水后一周内接种gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba，胁迫植株的各项生理参数均恢复到与对照植株相近的值(表2)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．以下，这些水分紧缺的回收植物将被称为gydF4y2Ba启动植物的gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

牛油果“杜萨”砧木对轻度和重度水分胁迫的分子反应以及重新浇水后的恢复gydF4y2Ba

采用实时定量pcr (qrt - pcr)技术，分析了' Dusa '牛油果砧木在轻度ws和重度ws胁迫下和再浇水1周后13个防御相关基因的表达。该选择包括先前研究中显示的诱导基因“BG83”(耐受gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba)和“Dusa”(容忍gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba)感染土传病原体后的牛油果砧木gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba［gydF4y2Ba43gydF4y2Ba),gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba，分别[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．除了它们在病原体防御中的意义外，一些被选择的基因也参与了盐、氧化、渗透和水胁迫反应(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

5个引物来自文献，本研究开发了8个引物(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1)。以肌动蛋白基因作为内源性组成基因对表达结果进行归一化，以阴性对照确认无污染。用ΔΔCt方法对所选基因表达的相对定量如表所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．在轻度ws和重度ws胁迫下，牛油果根系水分剥夺分别导致6个和3个基因的显著抑制(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，基因Contig00582编码BTB/POZ和TAZ结构域含蛋白1-like，在两种处理中均表现出最高的抑制。相比之下，在两种水平的水分胁迫下，6个基因(蛋白酶抑制剂样、谷胱甘肽s-转移酶、金属硫蛋白样蛋白、NAC结构域含蛋白72、通用应激蛋白和奇迹蛋白)的转录水平显著升高(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在轻度ws和重度ws引物植株中，鳄梨根的基因表达模式不同，显著抑制的基因数量均减少至2个。在轻度ws诱导的植物根中，有8个基因显著过表达，其中4个基因(NPR1、PR4、PR5、几丁质内源性酶)在水分胁迫下被抑制。qRT-PCR实验中，72蛋白的NAC结构域诱导水平最高，达到了177的折叠变化(FC)值。只有3个研究基因(蛋白酶抑制剂样基因、通用应激蛋白和奇迹蛋白)在严重ws启动的植物根中被显著诱导。gydF4y2Ba

水分胁迫启动‘杜萨’牛油果砧木的致病性试验gydF4y2Ba

为了测试是否可以用轻度ws和重度ws启动诱导对gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba在牛油果“Dusa”砧木中，用感染了该病毒的小麦颗粒接种了引物的牛油果植株gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba．严重ws引物植株的疾病进展略快于未引物对照植株。可见，接种后42天和53天分别出现了明显的地上部WRR症状。接种60天后，50%的未引物对照植株和严重引物植株表现出明显的空气症状(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba一个)。gydF4y2Ba

用轻度ws启动的植物对WRR表现出较强的耐受性，表现为疾病进展曲线下面积(AUDPC)值(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)(图gydF4y2Ba5gydF4y2Bab).虽然部分叶片在接种后48天出现明显的萎蔫症状，但50%的植株在接种后75天(第一次出现明显症状后30天)后出现地上WRR症状。接种3个半月后，所有未引物对照和重度ws引物植株均处于第5阶段(死亡)，而部分轻度ws引物植株仍处于第3阶段。gydF4y2Ba

植物已经进化出不同的策略来应对不同的环境压力，但许多研究表明，大多数植物对生物和非生物压力的反应依赖于共同的生理和分子机制的组合[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．特别是，据报道，牛油果的“杜萨”根茎反应gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba感染涉及到水关系和光合作用的损害[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]以及诱导与水分胁迫和病原体防御反应相关的基因[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．这些发现与目前关于“杜萨”牛油果对水分胁迫反应的研究结果一致。这种响应依赖于水分胁迫强度，因为轻度ws和重度ws处理对叶片水分状态(即叶片水势和RWC值的降低)以及光合性能的影响是不同的，这表现为光保护机制(即NPQ和RWC)的增强gydF4y2Ba问gydF4y2BaN值)和气体交换参数(即gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba而且gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})．这些生理变化与先前描述的其他木本植物在轻度和重度水分胁迫下的生理变化是一致的[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba，gydF4y2Ba72gydF4y2Ba]和鳄梨树[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．“杜莎”根茎对两者都有反应gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba感染或水分胁迫处理显示出水势gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}低于−1.0 MPa和0.05 mol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，分别表明光合组织中的氧化爆发[gydF4y2Ba75gydF4y2Ba，gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．这与较高的NPQ和gydF4y2Ba问gydF4y2BaN个值[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba，gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]而且可能容易受到气蚀的影响，这可能会限制水从根部流向树木的上部，特别是在严重的ws中[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba，gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．在gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba/鳄梨相互作用时，水流的限制与病原菌定殖期间根系维管系统的大量入侵是一致的[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba，gydF4y2Ba81gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

根系水平的分子反应显示，在两种水分胁迫处理下，13个测试基因中有6个基因表达上调(表1)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．这些基因除了参与牛油果对土壤传播病原体的反应外(gydF4y2Bap、肉桂gydF4y2Ba而且gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba)，也会引起其他园艺和木本植物(即gydF4y2Ba柑橘类gydF4y2Baspp。gydF4y2Ba马吕斯有明显gydF4y2Ba，gydF4y2Ba杨树trichocarpagydF4y2Ba)至水亏缺[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2Ba83gydF4y2Ba，gydF4y2Ba84gydF4y2Ba，gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba］．值得注意的是，NAC转录因子的过表达随着水胁迫水平的强度而增加，这可能支持了严重ws下ROS物种的大量积累，因为除其他功能外，该基因还与非生物胁迫下ROS清除基因的上调有关[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．另一方面，轻度ws抑制了13个基因中的7个，其中3个在重度ws中仍然下调(表2)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．NPR1和PR5的抑制与水胁迫诱导的ABA生物合成和信号传导一致[gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]，已知对水杨酸(SA)通路有拮抗作用[gydF4y2Ba88gydF4y2Ba]其中NPR1作为主调节因子，诱导PR5等发病相关蛋白的表达[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]，它们可能参与维持细胞的渗透调节[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

上述结果表明，牛油果对逐渐施加的水分胁迫的反应途径导致了与真菌病原体不相容相互作用中表达的基因的诱导[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba］．在这方面，水分胁迫和土传病原体同时发生可能对实现对病原体的耐受性有积极作用(即交叉耐受性，[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba])或负相加效应，使植物更容易受影响[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，gydF4y2Ba93gydF4y2Ba，gydF4y2Ba94gydF4y2Ba］．需要对鳄梨进行更多的研究来澄清这一点。gydF4y2Ba

之前的研究表明使用“启动”[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]以达到对即将到来的疾病的耐受性[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．这种获得性耐受性是基于刺激停止后，与未启动的植物相比，启动植物的细胞和分子防御基础水平的持续变化[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．在本研究中，无论干旱前的强度如何，在再次浇水一周后，干旱启动的植物水分状态和光合性能完全恢复。这种快速恢复表明，整个植物蒸腾流和光合作用的损害并没有导致鳄梨发生不可逆的变化，这可能表明鳄梨在一定程度上适应了干旱[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

然而，在根水平上，重新浇水诱导了防御相关基因的上调，这表明先前水分胁迫的鳄梨植物处于“启动状态”。基因过表达，这可能与植物对生物和非生物胁迫的耐受性/抗性的不同信号通路之间的串音有关，如脱落(ABA)、茉莉(JA)和水杨酸(SA)酸[gydF4y2Ba95gydF4y2Ba，gydF4y2Ba96gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba，gydF4y2Ba98gydF4y2Ba]，在轻度ws中比重度ws中更显著。特别是，在轻度ws启动的植物中，NPR1转录因子的诱导表明水杨酸介导的防御反应的激活[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]以及水分胁迫后aba相关反应的失活[gydF4y2Ba99gydF4y2Ba］．此外，这种“引物状态”伴随着PR蛋白(即PR4和PR5)的显著积累，这与系统性获得性耐药的发展相关[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]并被认为是最有希望培养多重抗压能力的候选者[gydF4y2Ba89gydF4y2Ba］．同样值得注意的是，与真菌细胞壁降解相关的基因，如几丁质酶，仅在轻度ws后恢复的植物中表达上调。编码金属硫蛋白、通用应激蛋白、蛋白酶抑制剂和NAC结构域蛋白72的基因在轻度ws启动的植物中仍然过表达。这些基因与植物对逆境的一般反应有关[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba，gydF4y2Ba82gydF4y2Ba，gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101gydF4y2Ba，gydF4y2Ba102gydF4y2Ba，gydF4y2Ba103gydF4y2Ba]，后两者在牛油果的防御中起着基本作用gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba［gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．需要强调的是，与严重ws相比，在轻度ws恢复的根中，编码NAC结构域含有72蛋白的基因显著过表达(是轻度ws的24倍)，这表明根系发育有更高的促进作用[gydF4y2Ba104gydF4y2Ba，gydF4y2Ba105gydF4y2Ba]，尽管还需要进一步的研究来阐明其在水胁迫恢复反应中的重要性。gydF4y2Ba

进行的致病性测试阐明了这种水分胁迫诱导的“启动状态”是否有效地增强了鳄梨对这种坏死性病原体的耐受性。从这个意义上说，与对照和严重ws启动的植物相比，在轻度ws启动的植物中观察到的疾病进展延迟表明植物应对能力增强gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba轻度水胁迫启动后感染。这种能力可能是由于牛油果对含蛋白72的NPR1和NAC结构域等土源病原体耐受力的关键基因表达不同，以及与严重胁迫植物相比，牛油果在克服中度水分胁迫时的能量投入更低[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．此外，尽管轻度ws启动植物中所有过表达基因都参与植物对真菌的防御，但并非所有基因都被描述为与牛油果对真菌的耐受性有关gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba(即NPR1、PR4、PR5和几丁质内源性酶)。然而，在干旱启动(即非生物因子)后，它们的增强表达也可能有利于鳄梨植物克服即将到来的真菌感染(即生物应激源)。gydF4y2Ba

综上所述，这是第一个报告“gydF4y2Bacross-factor启动”gydF4y2Ba对易感的牛油果砧木“Dusa”进行治疗，以增加其对白根腐病的耐受性。轻度ws通过过度表达真菌防御相关基因，在WRR敏感的牛油果砧木' Dusa '中诱导了启动状态，揭示了植物对生物和非生物胁迫的反应依赖于共同的机制。虽然未来的实验必须在嫁接植株上进行，但这里提出的结果表明，使用适度的水分胁迫作为一种减少方法的可能性gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba病菌感染对牛油果果园的影响。这些结果加强了在水资源有限的种植区使用亏缺灌溉策略进行疾病管理和节水[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

植物材料和实验设计gydF4y2Ba

为了测试水分胁迫是否可以作为提高牛油果耐受性的启动因子gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba， a 'gydF4y2Bacross-factor启动gydF4y2Ba'实验于2017年在农业研究和培训研究所(IFAPA) (Málaga，西班牙东南部，36°40′25″N, 04°30′11″W，海拔32米)进行。由Brokaw苗圃(Brokaw España S.L.)采用改良Frohlich方法繁殖的112株2岁无性系“Dusa”植物(南非威斯特法利庄园)[gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]，在16升罐中种植，罐中含有有机基质和沙子的灭菌混合物，并辅以缓释肥料(Basacote Plus 6 M, Compo Expert GmbH)。gydF4y2Ba

“Dusa”植物被保存在日光照明和空气温度(T)和相对湿度(RH)半控制条件下的温室中。温室内的光合光子通量密度(PPFD)、T和RH条件由量子传感器(Apogee SQ-110，美国)和T/RH U23-001 HOBO®Pro v2记录器(Onset Computer Corporation，美国)连续记录。PPFD的最大正午值在440 ~ 1012 μmol m之间gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，允许日T根据外界天气条件波动，但温室内部的变化范围保持在20±10°C之间，通过自动冷却系统，并在必要时加热。温室内RH值始终在40%以上。gydF4y2Ba

实验设计如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在实验开始时(tgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)，通过测定黎明前叶绿素荧光对植物生理状态进行无损检测。植物被随机分成两组，每组56株，进行两次试验。每个试验中，18株植物被随机分配到一个对照组，在整个试验过程中，土壤湿度保持在田间容量(Fc)，两组(19株)分别对基质进行控制干燥，直到Fc达到50%(即轻度水分胁迫，轻度ws)和25%(即重度水分胁迫，严重ws)。一旦达到这些土壤含水量水平(约16-17天后;tgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba)，所有植物恢复充分灌溉，并在复浇水1周后(即约23-24天后)评估干旱恢复反应;tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)．以下简称“gydF4y2Ba启动植物的gydF4y2Ba指的是植物经受不同程度的水分胁迫后的恢复期。致病性试验用gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba在tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba如下所述。gydF4y2Ba

使用湿度传感器(HH2湿度计，Delta-T Devices)监测所有植物的土壤湿度。该方法还允许针对每种水处理(轻度ws和严重ws)调整土壤体积湿度(v/v)，与田间容量下的土壤持水量(Fc~ 0.4 v/v)相关。每周施肥一次，用NPK溶液(Kristalon Blue 17-6-18, Yara，英国)补充铁螯合物(Sequestrene®，先正达，西班牙)。gydF4y2Ba

在整个实验过程中，生理测量和根系取样在tgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．在每次试验中，每个处理在每个采样点测量15株植物。每个未用于致病性试验的处理从9株植物中取样根系。gydF4y2Ba

生理测量gydF4y2Ba

正午(12:00-14:00 am)，测定t时叶片水势gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba(轻度ws和重度ws植株Fc含量分别达到50%和25%时)gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba(重新浇水后一周)使用Schölander压力室(3005型;土壤水分设备公司，圣巴巴拉，CA，美国)。在每次试验中，每个处理在每个采样点测量15株植物。在靠近主茎的每株成熟发育完全的叶片中进行测量。切完后，按照萧[gydF4y2Ba107gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

相对叶片含水量(RWC)、比叶质量面积(LMA)和相对叶绿素含量(SPAD指数)仅在t处理下测定gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba与叶片水势测定相同的植物。RWC测定用叶片(2厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)在中午采样，称重以获得新鲜重量(FgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba)，并立即用蒸馏水在黑暗中5°C浸泡24小时，以获得膨体重量(TgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba)．然后，样品在80°C的烘箱中干燥48小时，得到干重(DgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba)．RWC的计算方法如下:gydF4y2Ba

比叶质量面积(LMA)由叶片干重与叶片面积之比(g cmgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba})．gydF4y2Ba

使用手持SPAD 502 m(美能达，大阪，日本)在正午对每株植物的一片叶子进行非破坏性测量。该指数提供了与叶片绿度一致的叶片叶绿素含量估算[gydF4y2Ba108gydF4y2Ba］．对于每一株植物，平均SPAD值由每片叶子的三次读数计算。gydF4y2Ba

体内叶绿素gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba用便携式荧光计PAM-2100 (Heinz Walz, Effeltrich, Germany)在黎明前(tgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)及午间(tgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)在每株植物的一片叶子上。采用所谓饱和脉冲法确定所有荧光参数[gydF4y2Ba109gydF4y2Ba］．暗适应参数(即最小荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba)，最大荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)和PSII的最大光化学效率(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba= [FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba−FgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba) / FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba)在黎明前(早上05:00-07:00)确定。稳态荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba)，最大荧光(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba’)和预照射样品的最小荧光收率(gydF4y2BaFgydF4y2Ba_0gydF4y2Ba”gydF4y2Ba)在轻度驯化的叶片(gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba450 μmol量子mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})．PSII光化学的相对量子产率(ΦPSII = [gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba”gydF4y2Ba−FgydF4y2Ba_tgydF4y2Ba］gydF4y2Ba/ FgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba”)(gydF4y2Ba110gydF4y2Ba]表示PSII中心处于开放状态的百分比(gydF4y2Ba问gydF4y2BaL) (gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]和“Stern-Volmer”非光化学荧光猝灭程度(NPQ = [gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba−gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba'] / [gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba']) [gydF4y2Ba111gydF4y2Ba的计算。gydF4y2Ba

在正午(11:00-14:00 am)测量叶片气体交换gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在一片成熟裸露的叶子上。测量使用开放式便携式光合作用系统(型号LI-6400, LI-COR，美国)，配备led光源(6400-02B)，耦合到传感器头/IRGA，并带有COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba混合器(6400-01)，以改变进风COgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba浓度。操作流速为500 mL mingydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}和有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba分压为400ppm。饱和光合光子通量密度(1000 μmol mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})作为默认条件。叶温保持在gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba20℃，相对湿度调至50%(蒸汽压亏缺)gydF4y2Ba∼gydF4y2Ba1.4 kPa)。网络有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化率(gydF4y2Ba一个gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba)和气孔导度(gydF4y2BaggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba})用Von Caemmerer和Farquhar的方程估计[gydF4y2Ba112gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

RNA提取gydF4y2Ba

分别从对照、轻度ws和重度ws的9株牛油果植株中提取根系gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba和tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba除用于致病性试验的植物外，在其他植物中。RNA提取采用3个生物重复。每次复制都是从三种植物中提取大量样品。利用CTAB提取法从地根组织中提取RNA [gydF4y2Ba113gydF4y2Ba]，这是一种简单有效的方法，只需稍加修饰即可从松树中分离RNA。氯仿:异戊醇步骤重复3-5次，这取决于间相的稳定性和样品的颜色。RNA数量和质量基于A260/280和A260/230波长比，使用NanoDrop®ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.， Montchanin, USA)分光光度计测定。RNA的完整性通过核糖体RNA带的出现和在2%琼脂糖凝胶分离和Red Safe染色后缺乏降解产物得到证实。RNA的DNase处理通过加入1 U无rnase DNase (Thermo Scientific, Life Technologies Inc.， Carlsbad, California, USA)， 1 μL 10倍反应缓冲液MgCl进行gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 1 μg RNA, 0.5 μL RiboLock RNase Inhibitor (Thermo Scientific Inc.， California, USA)和二乙基焦碳酸盐处理水，最终体积为10 μL。37℃孵育45 min后，加入1 μL 50 mM EDTA, 65℃孵育10 min。gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

单链cDNA使用iScript逆转录Supermix (Bio-Rad Laboratories Inc.， California, USA)根据制造商说明合成。利用基因特异性引物F3H- f (5 ' -TCTGATTTCGGAGATGACTCGC-3 ')和F3H- r (5 ' -TGTAGACTTGGGCCACCTCTTT-3 ')对cDNA进行基因组DNA污染分析，该引物位于黄酮3-羟化酶(F3H)基因的内含子一侧。按照Engelbrecht和van den Berg先前的描述进行PCR扩增[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]以第一链cDNA为模板。gydF4y2Ba

在前人研究的基础上，对13个鳄梨基因的表达进行了研究。肌动蛋白基因作为内源性对照进行归一化。内源控制基因和13个鳄梨基因的引物序列在附加文件中给出gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:表S1。引物对选择产生70 - 140 bp之间的片段，使用引物3软件设计(gydF4y2Bahttp://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/gydF4y2Ba, (gydF4y2Ba114gydF4y2Ba，gydF4y2Ba115gydF4y2Ba])。引物特异性首先通过常规PCR进行检测，并通过qRT-PCR中存在的单个熔化曲线进行确认。从每个处理和时间点的cDNA池中进行序列稀释(1:10,1:20,1:50,1:200)，并对每个基因进行校准曲线。qRT-PCR反应混合物由cDNA第一链模板、引物(终浓度为500 nmol)和SYBR Green Master Mix (SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix, Bio-Rad)组成，总体积为20 μl。PCR条件为:95°C 30 s, 95°C 15 s, 60°C 30 s, 72°C 3 min, 95°C 1 min，循环40次。使用iQ5实时PCR检测系统(Bio-Rad)进行反应。使用ΔΔCt方法分析了靶蛋白表达水平的相对定量[gydF4y2Ba116gydF4y2Ba］．所有反应都进行了三次。gydF4y2Ba

牛油果植物致病性试验gydF4y2Ba

根据Sztejnberg和Madar [gydF4y2Ba117gydF4y2Ba］．简单地说，种子在250毫升装有蒸馏水的Erlenmeyer烧瓶中浸泡12小时。每个瓶子装有100克种子，随后在多余的水分排掉后进行高压灭菌。灭菌后，4个直径0.5厘米的真菌盘，培养2周gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上生长，无菌放置于每个烧瓶中，在24°C的黑暗中孵育三周，直到小麦颗粒均匀地覆盖gydF4y2Bar . necatrixgydF4y2Ba菌丝体。重新浇水后7天(tgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)、各处理的‘Dusa’砧木(对照gydF4y2BangydF4y2Ba= 9，轻度- wsgydF4y2BangydF4y2Ba在2个试验中，每窝底物接种3.75 g定殖小麦种子。为了确保接种体的扩散，接种体被放置在散布在茎周围的8个点上(相距约3.5 cm)，并在两个深度(分别为~ 5 cm和~ 15 cm)引入。通过测量WRR的空中症状来评估疾病进展:1 =健康植物;2 =轻度萎蔫;3 =萎蔫;4 =干燥;5 =死亡。根据Teixeira de Sousa之前的描述，计算每种治疗的疾病指数(DI)和疾病进展曲线下的面积(AUDPC) [gydF4y2Ba118gydF4y2Ba坎贝尔和马登[gydF4y2Ba119gydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

数据使用分析软件STATISTICA 7 (StatSoft, Inc.， USA)进行分析。采用方差分析(ANOVA)评价各处理间生理变量和AUDPC的差异。在每个采样点上，从两个试验获得的数据集进行双向方差分析，其中“试验”和“治疗”是受试者之间的因素。该分析允许测试两个试验之间观察到的变异性是否有显著差异，以及在多大程度上可以合并数据集，为每个采样点执行唯一的单向方差分析。由于在分析的任何变量中都没有观察到“试验”的显著影响，因此联合分析了两个试验的数据。因此，图中描述的每个处理的数据是两个试验中测量值的平均值。除非另有说明，否则在5%概率水平上考虑显著差异。在方差分析之前，分别使用Kolmogorov-Smirnov和Cochran’s C检验检验正态性和同质性假设。当发现显著差异时，使用Fisher 's least significant difference (LSD)检验来比较平均值。采用Sigma Stat 4.0软件(Systat software GmbH)对qRT-PCR数据进行学生t检验进行统计分析。gydF4y2Ba

在这项研究中产生或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章[及其补充信息文件]中。gydF4y2Ba

阿坝:gydF4y2Ba

脱落酸gydF4y2Ba

一个gydF4y2Ba_NgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

网络有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba同化率gydF4y2Ba

AUDPC:gydF4y2Ba

疾病进展曲线下面积gydF4y2Ba

迪:gydF4y2Ba

疾病指数gydF4y2Ba

DgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

干重gydF4y2Ba

舰队指挥官:gydF4y2Ba

田间持水量gydF4y2Ba

舰队指挥官:gydF4y2Ba

褶皱变化gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba/gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

PSII最大光化学效率gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_vgydF4y2Ba' /gydF4y2BaFgydF4y2Ba_米gydF4y2Ba”:gydF4y2Ba

PSII开放反应中心的最大光化学效率gydF4y2Ba

FgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

鲜重gydF4y2Ba

ggydF4y2Ba_{年代gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

气孔导度gydF4y2Ba

是:gydF4y2Ba

茉莉酸gydF4y2Ba

LMA:gydF4y2Ba

叶质量面积gydF4y2Ba

NPQ:gydF4y2Ba

荧光非光化学猝灭gydF4y2Ba

美国国家公共电台:gydF4y2Ba

与发病机制相关的非表达因子gydF4y2Ba

PDA:gydF4y2Ba

马铃薯葡萄糖琼脂gydF4y2Ba

PPFD:gydF4y2Ba

光合光子通量密度gydF4y2Ba

公关:gydF4y2Ba

Pathogenesis-relatedgydF4y2Ba

PRR:gydF4y2Ba

疫霉根腐病gydF4y2Ba

PSII:gydF4y2Ba

光系统IIgydF4y2Ba

问gydF4y2Ba李:gydF4y2Ba

部分PSII中心处于开放状态gydF4y2Ba

问gydF4y2Ba护士:gydF4y2Ba

非光化学猝灭系数gydF4y2Ba

存在:gydF4y2Ba

实时定量PCRgydF4y2Ba

RH:gydF4y2Ba

相对湿度gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

RWC:gydF4y2Ba

相对含水量gydF4y2Ba

山:gydF4y2Ba

水杨酸gydF4y2Ba

师:gydF4y2Ba

温度gydF4y2Ba

Tm:gydF4y2Ba

底漆熔化温度gydF4y2Ba

TgydF4y2Ba_WgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

浮夸的重量gydF4y2Ba

WRR:gydF4y2Ba

白根腐病gydF4y2Ba

WS:gydF4y2Ba

水的压力gydF4y2Ba

ϕPSII:gydF4y2Ba

PSII光化学的相对量子产率gydF4y2Ba

作者要感谢J. Engelbrecht夫人、A. Zumaquero博士和F. Pliego博士对实验室的支持和对实验设计的宝贵意见。gydF4y2Ba

本研究得到RTA2017-00040-00-00 (ia - aei)、AVA201601.14和AVA2019.008项目(20%军政府de Andalucía, 80% FEDER)的支持。资助机构在研究的设计中没有任何作用，在数据的收集、分析和解释或撰写手稿中没有任何作用。C Pliego目前由INIA- ccaa合同支持，由INIA(20%)和FEDER(80%)共同资助。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. IFAPA。Málaga中心。Cortijo de la Cruz s/n, 29140 Churriana, Málaga，西班牙gydF4y2Ba

   E. Martínez-Ferri, G. Moreno-Ortega & C. PliegogydF4y2Ba

2. 比勒陀利亚大学生物化学、遗传学和微生物学系，南非比勒陀利亚gydF4y2Ba

   范登伯格gydF4y2Ba

3. 南非比勒陀利亚大学林业和农业生物技术研究所(FABI)gydF4y2Ba

   范登伯格gydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

CP和EMF策划和设计了实验并获得了资金。CP、EMF、GMO和NB进行实验，收集并分析数据。CP, EMF和GMO准备了草稿。所有作者都撰写、审阅和编辑了手稿。gydF4y2Ba

作者的信息gydF4y2Ba

G. Moreno-Ortega是Málaga大学先进生物技术博士项目的研究生。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Bac . PliegogydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

在本研究中进行的植物材料的获取、培育和测试遵循了国家和地方法规。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

“不适用”。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

“不适用”。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba