PdWND3A是一种含有木相关NAC结构域的蛋白，影响木质素的生物合成和组成杨树

背景

植物次生细胞壁是生产生物燃料和生物材料的可再生原料。拟南芥血管相关NAC结构域(VND)已被证明是调控次生细胞壁生物合成的关键转录因子。然而，人们对其在木本物种中的作用知之甚少。

结果

在这里，我们报告的功能特征摘要木相关NAC结构域蛋白3 (PdWND3A)，是木相关NAC结构域蛋白3的同源序列拟南芥VND4和VND5是调控次生细胞壁生物合成的转录因子网络的成员。PdWND3A木质部的表达量高于其他组织。转基因的茎组织p .摘要overexpressingPdWND3A（OXPdWND3A)含有比野生型植物更多的导管细胞。此外，木质素含量和木质素单体丁香基和愈创木酯(S/G)比值较高OXPdWND3A转基因植物比野生型植物。的表达式与这些观察相一致阿魏酸5-羟基lase1 (f5h1)，编码一种参与辛纳醇(S单位单酚)生物合成的酶，在OXPdWND3A转基因植物。糖化分析表明，转基因植株的糖释放速率降低。此外,OXPdWND3A转基因植物比野生型植物产生的生物量更低。

结论

PdWND3A影响木质素的生物合成和组成，并对糖的释放和生物量的产生产生负面影响。

植物细胞壁定义细胞空间，保护细胞内部成分免受细胞外生物和非生物刺激。除了结构作用外，植物细胞壁由于其丰富性、交替的化学成分特性和可再生性，已成为转化为生物燃料和生物材料的一个有吸引力的目标。植物细胞壁一般由两类细胞壁组成，即初生细胞壁和次生细胞壁。初生细胞壁通常由纤维素、半纤维素和果胶组成，而次生细胞壁含有较大比例的木质素[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e980">22，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 56" title="56" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e983">56］．在这些次生细胞壁成分中，纤维素和半纤维素是多糖，正被考虑作为转化为生物燃料的底物[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 4" title="4" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e986">4，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 10" title="10" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e989">10，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 26" title="26" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e992">26］．木质素作为多酚类生物聚合物有助于细胞刚性和抵御病原体[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 3" title="3." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e996">3.］．此外，木质素通过包裹在容器内部来促进亲水运输，这有助于调节植物中的水关系。然而，从生物燃料生产的角度来看，木质素被认为是限制获得细胞壁多糖的主要顽抗因素。因此，对木质素生物合成途径进行基因改造已成为降低木质素抗性、提高生物燃料转化和产量的有效途径。

从苯丙氨酸中提取的苯丙类化合物是合成单木酚的关键代谢前体[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1002">16，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1005">29，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1008">45］．一般苯丙酸途径包括三个初始步骤，由l -苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)和4-香豆酸:辅酶a连接酶(4CL)催化[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1011">15，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 35" title="35" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1014">35，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 37" title="37" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1018">37］．4-香豆酰辅酶a是一般苯丙烷途径的最终产物，是合成三个不同化学家族的前体化学物质，即黄酮类化合物、单木酚醇和酚酸。木质素生物合成途径已被很好地描述，大多数生物合成酶已被鉴定[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 2" title="2" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1021">2，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1024">29，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 44" title="44" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1027">44］．木质素由三种单体组成，分别是羟基苯基(H)、愈创木酯(G)和丁香基(S)p它们的产生受咖啡基辅酶a o -甲基转移酶(CCoAOMT)、阿魏酸5-羟化酶(F5H)、肉桂基辅酶a还原酶(CCR)和肉桂醇脱氢酶(CAD)调控[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 12" title="12" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1033">12，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1037">14，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 25" title="25" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1040">25，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1043">29，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 31" title="31" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1046">31，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 52" title="52" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1049">52］．木质素生物合成基因的调控和表达与几种转录因子有关，包括NAC (No Apical Meristem, No Apical Meristem, No Apical Meristem, No Apical Meristem)。N点),拟南芥转录激活因子(一个TAF1/2)、杯状子叶(CUC2))和V-myb成髓细胞病病毒癌基因同源物(MYB) [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 11" title="11" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1065">11，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1068">16，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 56" title="56" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1071">56］．在这些转录因子中，NAC家族蛋白起着次级细胞壁形成的主开关调节作用。久保等人[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1075">13提示VND 1-7亚家族的NAC转录因子在木质部内原木质部和后木质部血管形成中起主要调控作用拟南芥根。NAC次级细胞壁增厚促进因子1 (NST1)和NST3/次级细胞壁相关的NAC域蛋白1 (SND1)也被证明是次级细胞壁形成和纤维细胞分化的主要转录调节因子[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1081">13，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1084">20.，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 21" title="21" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1087">21，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1090">23，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 41" title="41" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1094">41，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 47" title="47" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1097">47］．据报道，SND1直接与蛋白的启动子结合MYB46［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 53" title="53" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1103">53］．SND1还作为一个开关调节许多与次生细胞壁生物合成相关的下游基因的表达，包括纤维素和木质素生物合成。在拟南芥，在最近的几篇综述文章中总结了二级细胞壁生物合成的转录调节的复杂网络[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 16" title="16" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1109">16，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1113">22，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 49" title="49" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1116">49，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 55" title="55" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1119">55，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 56" title="56" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1122">56］．

作为NAC家族成员，拟南芥VND 1-7 (AtVND1-7)最初在木质部导管细胞转分化早期被鉴定拟南芥悬浮培养[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 5" title="5" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1134">5］．转基因拟南芥overexpressingAtVND1-7导致木质部导管元件异位形成[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1144">6，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1147">13，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 39" title="39" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1150">39，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 58" title="58" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1153">58］．AtVND6和AtSND1转基因诱导表达的比较转录组分析拟南芥AtVND6上调的基因与AtSND1上调的基因重叠[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1159">23］．然而，也有基因优先受到AtVND6或AtSND1的调控[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1163">23］．此外，在一项过表达研究中，共有63个编码多种蛋白质的基因，包括参与细胞程序性死亡的转录因子和非转录因子，被确定为AtVND7的靶基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 40" title="40" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1166">40］．因此，AtVNDs与AtSND共享一组共同的下游靶基因，但也调控不同于AtSND调控的靶基因的表达。AtVND1-7的电泳迁移迁移分析和AtVND6和AtVND7的转活化分析表明，AtVND1-7与次生壁NAC结合元件(SNBE) 19 bp的一致DNA序列和11 bp的tractracy -element-regulating结合独联体-元件(TERE)在一组基因的启动子区域，涉及二级细胞壁生物合成，细胞壁修饰和程序性细胞死亡[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1172">6，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1175">23，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1178">48］．在AtSND1部分直接靶基因的启动子序列中也发现了TERE和SNBE [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1182">23，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 28" title="28" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1185">28，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1188">48，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 50" title="50" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1191">50，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1194">51］．

多年生木本植物杨树trichocarpa在16个基因中，共有8个杨树NAC结构域蛋白基因分为杨树VND (PtrWND/PtVNS) [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1209">22，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1212">24，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1216">48］．杂交中PtrWND2B/PtVNS10和PtrWND6B/PtVNS08的显性抑制采用ear诱导的显性抑制方法杨树（p . tremula×p·阿尔巴)导致木纤维壁厚减少[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1228">51]，而在转基因中观察到异位次生壁增厚表型杨树植物过度表达PtrWND/PtVNS花椰菜花叶病毒35S启动子驱动基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1241">24］．此外，在转基因中观察到木质素、纤维素和半纤维素的异位沉积拟南芥而且杨树overexpressingPtrWND6B(一个AtVND7同族体)[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1257">48，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1260">51］．因此,杨树vnd相关蛋白(PtVND)在调控血管形成和次生细胞壁生物合成方面的功能似乎与AtVND相似[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1266">24，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1269">48，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1273">51］．PtrWND3A/PtVNS05和PtrWND3B/PtVNS06 (AtVND4和5同源体)的异源表达进一步支持了这一观点拟南芥导致叶片异位次壁沉积[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1279">24］．

在这里我们报道了AtVND4/5序列同源物PdWND3A的功能表征杨树基因转移。转基因杨树overexpressingPdWND3A茎部血管形成增加。转基因植株的木质素含量和S/G比均有所提高。有趣的是，RT-PCR分析表明，在所检测的二级细胞壁生物合成相关基因中，F5H1在转基因植物中显著上调，提示PdWND3A可能通过调控F5H1表达式。

的系统发育分析杨树含有NAC结构域的蛋白质

在之前的研究中，Zhong和Ye [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 54" title="54" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1317">54]使用AtSND1 (AT1G32770)作为模板进行搜索杨树同源词并定义了它们的命名法。在另一项研究中，Ohtani等人鉴定了16个NAC结构域蛋白基因杨树基于基因组的蛋白质同源性分析拟南芥VND/NST/SND蛋白<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1329">24］．随着最新的可用性p . trichocarpa基因组注释(v3.1)，我们使用AtSND1作为模板，在Phytozome中搜索所有可能的AtSND1序列同源物(https://phytozome.jgi.doe.gov) [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1336">8]并确定了总共21个杨树具有截断氨基酸序列标识> 30%的位点(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2)．在这些蛋白质中，一组有8种杨树与相应AtVND蛋白显示高氨基酸序列相同的蛋白质被选择用于进一步研究(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．两支，包括四支杨树蛋白(Potri.012G126500, Potri.015G127400, Potri.001G120000和Potri.003G113000)与AtVND4和AtVND5共享一个簇。基于这些结果，我们选择了Potri.015G127400，它之前被指定为PtrWND3A [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 54" title="54" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1355">54]作进一步的描述。PtrWND3B (Potri.012G126500)与PtrWND3A同属一个进化支，氨基酸水平与PtrWND3A的相似性为95.3%(附加文件)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．的编码序列中间缺少一个24 bp的DNA片段PtrWND3A；因此，我们可以使用基因特异性引物对该区域进行区分PtrWND3A从PtrWND3B(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4)．类似于拟南芥VND蛋白中，PtrWND3A n端NAC结构域是唯一可预测的结构域(附加文件)<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．

表达模式PdWND3A

从功能上描述PdWND3A，我们首先检查了PdWND3A定量RT-PCR检测各组织器官转录本丰度。PdWND3A在所有测试的组织和器官中都检测到转录物，木质部中含量最高，这表明它在次生细胞壁生物合成中起作用(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)．

转基因杨树植物overexpressingPdWND3A

随后，我们产生了转基因p .摘要植物overexpressingPdWND3A(无花果。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2a).共获得14个独立的转基因株系，其中6个被证实过表达PdWND3A(附加文件<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">5)．我们选择了两条独立的线进行进一步分析。这两个转基因株系被命名为OXPdWND3A-1而且OXPdWND3A-2经定量RT-PCR证实为PdWND3Aoverexpressors(无花果。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2b)。

AtVND家族蛋白被认为是木质部组织中调控血管形成的主开关转录因子[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1517">22］．来检验这样一个函数是否守恒杨树，我们检查了血管的形成OXPdWND3A转基因植物。成熟茎的横切面标本的细胞学分析显示，在茎的致密血管形成OXPdWND3A(无花果。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2C)，其中木质部导管数量显著增加OXPdWND3A与野生型WV94相比，转基因植物(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2d).这些结果支持这一观点，即血管形成的调节是VND蛋白在两者中的共同功能拟南芥而且杨树．

植物次生细胞壁成分的化学成分分析OXPdWND3A转基因植物

目的:观察植物茎组织中次生细胞壁成分含量的变化OXPdWND3A，进行化学成分分析。我们发现OXPdWND3A木质素含量显著高于WV94 (p<0.01;无花果。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．作为一种可预测的纤维素单糖，葡萄糖含量降低OXPdWND3A而木糖含量无显著差异(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．其他化学成分如阿拉伯糖和甘露糖的含量也没有变化OXPdWND3As与WV94的比较(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)．

木质素物理化学表征

由于木质素含量增加OXPdWND3A转基因植物(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.)，我们寻求进一步的证据，以支持PdWND3A在木质素生物合成中。我们对同一植物的叶和茎组织进行了Klason木质素(酸不溶性木质素)分析。木质素含量的茎组织OXPdWND3A-1和OxPdWND3A-2分别比野生型WV94高12.71和11.89%(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4一个)。OXPdWND3A-1而且OXPdWND3A-2叶片组织中木质素含量也分别比WV94高16.42和13.36%。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4一个)。

为了进一步研究木质素的结构特征，采用二维¹H -¹³对茎组织进行C NMR分析。的OXPdWND3A与WV94相比，S含量较高，G含量较低，S/G比较高(表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)．木质素亚基之间的化学连接发生了改变OXPdWND3A．树脂醇(β-β)键等碳-碳键的相对含量显著增加OXPdWND3A与WV94相比(表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)．

基因表达分析

为了确定PdWND3A是否影响木质素生物合成或单体组成相关基因的表达，我们对木质素生物合成基因的表达进行了定量分析。我们测量了8个代表性木质素生物合成基因的相对转录丰度，包括PAL1而且PAL4，cad 1而且4 cl对于一般的苯丙苯途径，和CCoAOMT1，F5H1, COMT3而且COMT4用于单木酚生物合成。在这8个测试基因中，F5H1与野生型对照相比，转基因株系中S单位木质素单体生物合成基因在叶片和年轻茎组织中都被上调(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4b).虽然有报道COMT和CAD可以调节S单位木质素单体的生物合成[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 27" title="27" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1872">27]，两组间转录水平无显著差异OXPdWND3A转基因植物和野生型WV94。转录水平CCoAOMT1，另一种参与G型和s型木质素单木质素生物合成的关键酶[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 18" title="18" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1882">18，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 19" title="19" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1885">19]，在转基因植株叶片组织中的含量也高于WV94。在转基因株系和WV94之间的任何组织中，其他测试的基因都没有改变。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4b).总的来说，这些结果支持PdWND3A在调节木质素生物合成和木质素单体组成相关基因的表达中发挥作用。

的糖化效率OXPdWND3A

糖化效率是转基因植物生物质在生物燃料生产中有用性的重要指标。人们普遍认为高木质素含量对糖化效率有负面影响[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1903">34］．相比之下，在硬木品种中，较高的S/G (S/G)比值通常被认为是影响糖化效率的积极因素[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1906">34，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 43" title="43" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e1909">43］．OXPdWND3A与对照相比，转基因株系木质素含量较高，S/G比较高。因此，我们想研究这两个相对的因素(即高木质素含量和高S/G比)是如何影响糖化效率的。我们测量葡萄糖释放，未经预处理，酶处理48小时。的OXPdWND3A与对照组相比，转基因植物表现出更低的葡萄糖释放(图2)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">5)．因此,在OXPdWND3A高木质素含量的转基因株系在糖化过程中表现出高S/G比的优势。

OXPdWND3A生物质生产

最后，确定是否过度表达PdWND3A影响生物量产量，我们测量直径和高度来估计茎体积。的整体植物高度OXPdWND3A比在温室条件下生长的野生型WV94植物小(图。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">6a).两个转基因株系的茎体积均显著小于WV94(图v94)。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">6B)，暗示过度表达PdWND3A对生物量生产产生负面影响。

木质生物质主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。生物质能转化为生物燃料的方法研究已成为低成本生物燃料生产的关键。近十年来，木本植物的分子遗传学研究表明，转录因子在调控次生细胞壁生物合成中起着重要作用。在这些转录因子中，NAC家族蛋白被视为主开关[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 22" title="22" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2013">22，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 56" title="56" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2016">56］．本文证明，PdWND3A是NAC结构域蛋白家族成员，参与木质素生物合成和组成的调控。

PdWND3A与木质素的生物合成与组成

的物理化学分析OXPdWND3A转基因株系提示过表达PdWND3A影响木质素生物合成(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4)．与理化分析一致，组织化学图像显示更多的木质部导管形成OXPdWND3A比WV94(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">2c和d).在较早的报道中，AtVND7蛋白同源物PtrWND6B的过表达诱导木质素在叶表皮和叶肉细胞中异位沉积[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2042">48，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 51" title="51" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2045">51］．此外，AtVND6或AtVND7可诱导表达杨树导致木质素异位沉积[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 39" title="39" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2051">39］．更具体地说，过度表达PtrWND3A在杨树叶片中诱导异位继发细胞壁沉积[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2057">24］．虽然显微镜检查异位次生细胞壁沉积在转基因植物叶片过表达PdWND3A在本研究中没有进行，我们提供的理化分析证实了木质素在叶和茎都有积累OXPdWND3A转基因植物(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4a).此外，过表达PdWND3A改变了S单元和G单元之间的单木质素组成(表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)．木质素的结构性质也发生了变化OXPdWND3A．我们观察到树脂醇(β-β)键显著增加(表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)．据报道，β-β谱系主要与S单位有关，而苯香豆聚糖与G单位有关[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 33" title="33" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2080">33］．因此，观察到的木质素树脂醇丰度增加与观察到的木质素S/G比增加是一致的OXPdWND3A转基因线。总的来说，这些结果表明PdWND3A既参与木质素生物合成的调节，也参与木质素单体组成的调节。目前尚不清楚PdWND3A是否优先调节木质素的生物合成或组成，以及PdWND3A是如何实现这一目标的。由于PdWND3A是一种转录因子，它可能通过调控特定的木质素通路基因来发挥作用。

PdWND3A和F5H1表达式

木质素生物合成基因的基因表达分析OXPdWND3A转基因植物表明，在所有测试的基因中，PdWND3A过度表达主要影响的表达F5H1在茎和叶。这与之前的研究形成了对比拟南芥在其中过度表达每一个AtVND基因(AtVND1来AtVND7的表达PAL1，CCoAOMT1而且4 cl木质素生物合成基因，但不是F5H1［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2133">23，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 40" title="40" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2136">40，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 58" title="58" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2139">58］．周等人，[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 58" title="58" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2142">58的发起人证明了CCoAOMT1而且4 cl直接被AtVND蛋白(AtVND1到AtVND5)激活。在另一项研究中，杨树转基因植物表达AtVND7与木质素生物合成相关的阳离子过氧化物酶、漆酶、CCR和苯香豆素苯醚还原酶基因表达增加[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2158">24］．拟南芥表达PtrWND6B的转基因植物杨树AtVND6同源蛋白的表达也增加4 cl1而且CCoAMT1［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 54" title="54" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2174">54］．以PtrWND6B为效应子的转活化试验鉴定了漆酶，CCoAMT1而且COMT1作为PtrWND6B的直接靶基因[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2183">24，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2186">48］．因此，VND同源物对木质素生物合成基因表达的调控表现为保守拟南芥而且杨树．然而，没有报告显示两者之间的关系F5H1既往研究中表达与VND的关系。我们的研究表明F5H1被PdWND3A上调，提示VND/WND转录因子家族成员对其下游直接或间接靶基因可能存在调控特异性。

F5H在单木酚生物合成途径中介导针叶醛向5-OH针叶醛的化学转化[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 33" title="33" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2205">33］．F5H的过表达枫styraciflua在松果体辐射在木质素聚合物中产生更多的辛纳醇[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 36" title="36" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2214">36］．积累的证据表明，调节F5H1基因表达可能不同于其他木质素生物合成基因的共同调控。例如，AtMYB58和AtMYB63的过表达激活了木质素生物合成基因F5H1［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2224">45，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 57" title="57" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2227">57］．这一结果与AtMYB58启动子中缺失AC顺式作用元件的观察结果一致F5H1［<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 46" title="46" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2233">46，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 57" title="57" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2236">57］．在拟南芥， AtSND1已被报道调节F5H1基因表达[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 46" title="46" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2246">46］．在本研究中，我们证明了F5H1被PdWND3A过表达上调(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4b).因为atvndds (AtVND1至AtVND7)已被证明与一组与细胞壁生物合成相关的基因的启动子区域的次级壁NAC结合元件(SNBE)的一致DNA序列结合[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2255">6，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2259">23，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2262">48]， SNBE共识存在于F5H1启动子(<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 50" title="50" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2268">50)，这是合理的F5H1可以作为PdWND3A的直接靶标。生物化学测定F5H1作为一个潜在的PdWND3A靶基因(即通过蛋白质- dna结合试验)值得进一步研究。

PdWND3A和糖释放

以前的研究使用p . trichocarpa天然变异表明，木质素含量和S/G比都影响糖化效率[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2288">34，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 43" title="43" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2291">43］．葡萄糖释放量与木质素含量及S/G比均显著相关[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2294">34，<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 43" title="43" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2297">43］．然而，在不进行预处理的情况下测定糖的释放量时，葡萄糖的释放量与木质素含量有关，而与S/G比无关[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2301">34］．在本研究中，OXPdWND3A转基因株系表现出较高的木质素含量和较高的S/G比。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">3.,无花果。<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">4、表<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1)，在不进行预处理的情况下，糖化效率较低(图;<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">5)，这与p . trichocarpa自然变异[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2323">34］．因此，在不进行预处理的糖化过程中，木质素含量似乎比S/G比发挥更大的主导作用。总的来说，PdWND3A过表达时，会对糖化效率产生负面影响。作为未来的研究，创造和刻画杨树PdWND3A敲除或敲除转基因植物可能补充并可能加强从过表达研究中得出的关于PdWND3A在木质素生物合成和糖释放中的作用的结论。

结果表明，PdWND3A是含NAC结构域蛋白家族的一员，对木质素的生物合成和木质素单体组成均有影响。具体来说，PdWND3A调控蛋白的表达F5H基因。过度表达PdWND3A会对糖化效率和生物量产量产生负面影响。

植物材料

全长的开式阅读架PdWND3A从摘要克隆到pAGW560二元载体中转化WV94。我们在温室中种植和维护转基因植物的程序与之前的出版物中报道的相同[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 38" title="38" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2359">38］．生长条件为恒定25℃，光周期为16 h/8 h。

氨基酸序列比对及系统发育分析

AtSND1 (AT1G32770)检测Phytozome v12.0 (https://phytozome.jgi.doe.gov) [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2370">8]和BLAST (<一个href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) [<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 1" title="1" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2377">1]以鉴定含NAC结构域的蛋白杨树（p . trichocarpa),拟南芥（答:芥)的基因组。然后利用各种AtSND1全长氨基酸序列同源物，以> 30%氨基酸相似度截断值(e-value<0.01)。收集到的蛋白质被用作Pfam数据库的主题，以预测假定的蛋白质结构域和功能基序[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2396">7］．基于最大似然原理的系统发育软件PhyML采用氨基酸取代的JTT (Jones-Taylor-Thornton)模型矩阵，1000次自举复制构建系统发育树[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 9" title="9" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2399">9］．采用最近邻交换(NNI)算法进行树的拓扑搜索。

Phloroglucinol-HCl染色

得到木质部导管形成的图像OXPdWND3A转基因植株和WV94野生型植株，茎组织采集于6月龄植株茎基部上方15cm处。采用Leica RM2255显微切片机(Leica biosystems, IL)按100 μm厚度进行切片，不进行任何固定。每个切片直接在2%间苯三酚(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)中染色，95%乙醇溶解在黑暗中5分钟。红色是通过加入2-3滴浓缩盐酸(HCl)而形成的。图像采集使用SteREO Discovery V8解剖显微镜(蔡司，Thornwood, NY)。每张图像中血管的总数由ImageJ1开源程序确定[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 30" title="30." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2413">30.］．

RNA提取和RT-PCR

测量相对转录丰度PdWND3A二级细胞壁生物合成相关基因，从6月龄幼茎组织(1-3节间)和成熟叶片(4-6叶尖)中提取总RNA杨树使用植物谱RNA提取试剂盒，柱内DNase处理，遵循制造商手册(Sigma-Aldrich)。我们进行了定量逆转录聚合酶链反应(sq-或qRT-PCR)来确定所选基因的相对转录丰度。单链互补DNA (cDNA)由1 μg总RNA经RevertAid逆转录酶(Thermo Fisher Scientific, Hudson, NH)在42°C下孵育1小时合成。用1 μl 2倍稀释的cDNA进行实时PCR反应。PCR反应采用Maxima SYBR Green/ROX qPCR主混合，包括尿酰DNA糖基酶(UDG)(赛默飞世尔科学公司)。用于PCR反应的基因特异性引物在附加文件中列出<一个d一个ta-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5">1．PCR反应开始，UDG在50°C激活2 min, 95°C预变性10 min，然后95°C 15 s和60°C 30 s的两步组合40个循环。用2计算相对基因表达量^——ΔΔCt方程(<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 17" title="17" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2438">17］．泛白杨(PdUBCc, Potri.006G205700)作为所有相关定量分析的内部对照。

化学成分分析

化学成分包括碳水化合物和木质素OXPdWND3A根据NREL程序，采用两步硫酸水解法对转基因株系(野生型WV94)进行分析和比较[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 32" title="32" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2457">32］．Wiley-milled, 6个月大杨树茎用乙醇/甲苯(1:2,v/v)索氏提取12 h。对叶片组织进行分析，再进行12 h乙醇/甲苯提取和12 h丙酮提取。无浸出物样品风干，两步酸法水解。简单地说，生物量在72% H水解₂所以₄在30°C 1 h和4% h₂所以₄在121°C下放置1小时。用过量去离子水过滤和洗涤固体残渣，并在105°C烘箱干燥24小时。用马弗炉在575℃下测定灰分12 h。Klason木质素含量计算如下:

碳水化合物含量分析采用Dionex ICS-3000离子色谱系统与外部标准。

木质素S/G比分析

用核磁共振(NMR)分析测定了木质素的S/G比。茎样本按上述方法提取。纤维素分解酶木质素从无提取物的生物质中分离出来，如先前的研究所述[<一个d一个ta-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 42" title="42" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-019-2111-5" id="ref-link-section-d40054908e2517">42］．分离得到的木质素(~ 30 mg)用DMSO-溶解d₆5毫米核磁共振管。使用Bruker Avance III 400 MHz波谱仪，配备5 mm宽频观察探头和Bruker标准脉冲序列(' hsqcetgpsi2 ')进行二维(2D)¹H -¹³300 K C异核单量子相干(HSQC)核磁共振分析。光谱宽度为11ppm (¹H, 2048个数据点)和F1中的190 ppm (¹³C, 256个数据点)¹H和¹³分别C-dimensions。瞬态数为64，耦合常数为(¹J_CH)的频率为145赫兹。数据处理采用Bruker Topspin软件(v3.5)。

糖化效率测定

在6个月大的植株茎基部上方15厘米处收集的茎组织被干燥并威利磨碎至40目，用于糖释放量测量。将约250 mg样品置于50 mM柠檬酸缓冲溶液(pH 4.8)中，加入70 mg/g-生物量的Novozymes CTec2 (Novozymes, Franklinton, NC)。酶解在50°C, 200 rpm的孵育振动筛中进行48 h。水解物中的酶在沸水中失活5分钟，然后使用Dionex ICS-3000离子色谱系统分析释放糖。每次分析都是从每个转基因系的单株植物中重复进行的。

统计分析

t检验(对WV94)于p<0.01通过t检验函数集成在Excel软件(Microsoft, Redmond, WA)进行所有统计分析。图中星号表示与WV94或对照样本有显著差异(p<0.01)。

在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。

4 cl:

4-coumarate:辅酶a连接酶

C4H:

肉桂酸4-hydroxylase

计算机辅助设计:

肉桂醇脱氢酶

CCoAOMT:

Caffeoyl-CoA O-methyltransferase

CCR:

肉桂酰辅酶a还原酶

F5H:

Ferulate 5-hydroxylase

F5H1:

FERULATE 5-hydroxylase1

旅客:

愈创木基monolignol

H:

羟苯基monolignol

MYB:

V-myb成髓细胞病病毒癌基因同源物

南京:

无尖分生组织(NAM)，拟南芥转录激活因子(ATAF1/2)，杯状子叶(CUC2)

NST1:

NAC次生壁增厚促进因子1

OXPdWND3A：

摘要转基因植物过度表达PdWND3A

朋友:

L-phenylalanine ammonia-lyase

PdWND3A:

摘要木相关NAC结构域蛋白3A;Potri.015G127400

PdWND3B:

摘要木相关NAC结构域蛋白3B;Potri.012G126500

史:

Syringyl monolignol

SNBE:

副壁NAC结合元件

SND1:

NAC次级壁相关域蛋白1

特雷:

Tracheary-element-regulating独联体元素

盾:

血管相关的NAC结构域

橡树岭国家实验室由UT-Battelle有限责任公司为美国能源部管理，合同编号为DE-AC05-00OR22725。

这项研究得到了美国能源部生物能源科学中心和生物能源创新中心的支持。生物能源科学中心和生物能源创新中心是美国能源部生物能源研究中心，由美国能源部科学办公室生物与环境研究办公室支持。资助机构在研究设计、数据收集、分析和解释以及撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 美国橡树岭国家实验室，美国橡树岭37831，生物能源科学中心和生物科学部

   杨永吉，刘昌根，Lee E. Gunter, Sara S. Jawdy，杨晓涵，朴云桥，Arthur J. Ragauskas, Gerald A. Tuskan &陈金贵

2. 生物能源创新中心，橡树岭国家实验室，橡树岭，TN, 37831，美国

   刘常根，Lee E. Gunter, Sara S. Jawdy，杨晓涵，朴云桥，Arthur J. Ragauskas, Gerald A. Tuskan，陈金贵

3. UT-ORNL生物科学联合研究所，橡树岭国家实验室，橡树岭，TN, 37831，美国

   刘昌根，朴云桥，Arthur J. Ragauskas

4. ArborGen公司，Ridgeville, SC, 29472, USA

   威廉·罗特曼，金伯利·a·温克尔和卡桑德拉·m·柯林斯

5. 田纳西大学化学与生物分子工程系，林业、野生动物和渔业系，美国诺克斯维尔，TN, 37996

   亚瑟·j·拉格斯卡斯

贡献

YY公司进行了生物信息学、RT-PCR和qRT-PCR分析以及显微成像。对CGY、YP和AJR进行化学成分分析和糖释放量测定。生成WR, KAW和CMC杨树转基因线。LEG和SSJ测量了生物量产量。XY设计的基因结构杨树转换。GAT和JGC构思了这项研究，协调了研究，并为实验设计和数据解释做出了贡献。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到<一个id="corresp-c1" href="mailto:chenj@ornl.gov">金贵陈．

开放获取本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(<一个href="http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/" rel="license" itemprop="license">http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(<一个href="http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/" rel="license" itemprop="license">http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。

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