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GhCIPK6a通过参与ROS清除和MAPK信号通路,增加转基因陆地棉的耐盐性

摘要

背景

盐胁迫是陆地棉生产中危害最大的非生物胁迫之一(陆地棉).陆地棉花被定义为中等耐盐作物。盐碱会阻碍根的发育和芽的生长,降低纤维的质量。

结果

我们之前的研究证实了aGhCIPK6a基因对盐胁迫的反应g .分子.的同系物GhCIPK6a在A中进行分析2g . arboreum),维5Graimondii就)和AD1g .分子)的基因组。GhCIPK6a定位于液泡和细胞膜。GhCBL1-GhCIPK6a和GhCBL8-GhCIPK6a复合物定位于细胞核和细胞膜。过度的GhCIPK6a经RNA-seq分析证实,盐胁迫诱导的共表达基因表达水平升高,这些基因清除ROS并参与MAPK信号通路。种子的吸水能力和细胞膜稳定性GhCIPK6a在吸收萌发阶段,过表达系高于野生型种子。种子发芽率和幼苗出苗率GhCIPK6a盐胁迫下,过表达系高于对照系。此外,过度表达GhCIPK6a在盐胁迫下,棉花的衣分和纤维长度均匀性提高。

结论

我们验证了GhCIPK6a通过转化和RNA-seq分析。GhCIPK6a过表达的细胞系对非生物胁迫表现出更高的耐受性,这通过参与ROS清除和MAPK途径发挥作用。因此,GhCIPK6a在棉花育种中具有提高抗逆性的潜力。

背景

土壤盐分是影响作物生长发育的严重非生物胁迫之一,最终导致作物减产、品质下降[j]。12]。植物对非生物胁迫启动一系列适应机制和生存反应,导致基因表达的一系列变化[3.456]。这些应激反应基因包括钙2 +的诞生(78],转录因子[910]、蛋白激酶[111213],渗透蛋白[141516]和氢过氧化物酶[1718],其中蛋白激酶在植物的反应中起着特别重要的作用。一组丝氨酸-苏氨酸激酶,被称为钙调磷酸酶相互作用蛋白激酶(CIPKs),它们与钙调磷酸酶b样蛋白(CBLs)特异性相互作用,已经在植物基因组中被鉴定[1920.]。

CIPK蛋白由一个保守的n端激酶催化结构域和一个由可变连接结构域与激酶结构域分离的c端调控结构域组成,并且n端激酶结构域包含一个被其他蛋白激酶磷酸化的推定激活环[21]。CIPK蛋白c端高度保守的NAF/FISL结构域是与CBL蛋白相互作用所必需和充分的,并作为自抑制结构域发挥作用[22]。另一个基序,蛋白磷酸酶相互作用(PPI),是与脱落酸不敏感(ABI)蛋白相互作用所必需的[23]。PPI基序控制CIPK和pp2c(蛋白磷酸酶2C)的磷酸化状态[232425]。CBLs通常与cipk相互作用,形成CBLs - cipk复合物,调节下游靶蛋白。CIPK蛋白和CBL-CIPK复合物参与拟南芥和其他植物的各种响应过程,如水稻(栽培稻) [26272829],玉米(玉米) [30.3132],胡杨3334],油菜籽(芸苔属植物显著) [3536]、茄子(茄属植物melongena) [37],西红柿(茄属植物lycopersicum) [38],谷子(Setaria italica(l)P. Beauv) [39],菠萝(菠萝comosus) [40]和棉花[41424344]。CIPKs和CBL-CIPK复合物与植物对非生物胁迫、生物胁迫、植物激素和营养剥夺的反应有关[j]。454647484950]。

在拟南芥中AtCIPK6基因增加对盐胁迫的耐受性[5152]。AtCBL4/SOS3与根中的AtCIPK24/SOS2相互作用介导Na+通过H的作用进行挤压+/ Na+SOS信号通路中质膜上的反转运蛋白SOS1拟南芥在盐胁迫下[5354]。有一种新的SOS通路CBL10-CIPK8-SOS1,其功能是运输积累的Na+细胞外调节耐盐性[50]。AtCBL1/9-AtCIPK23复合体激活质膜上的AKT1通道以增强K+低钾吸收+条件(245556]。同时,AtCIPK23和AtKC1协同作用调节AKT1的活性[57]。AtCBL9-AtCIPK23复合物被证明在初级硝酸盐反应中与硝酸盐转运体NRT1.1相互作用[495859]。

陆地棉(g .分子)被定义为中等耐盐作物[6061]。盐碱会阻碍根的发育和芽的生长,降低纤维质量[62]。新发布的Gossypium物种基因组为功能基因组学研究提供了新的平台[63646566676869]。GhCIPK同族体,GhCIPK1参与棉纤维伸长过程[70],并被证明与GhCBL2/3共表达并优先相互作用[71]。的异源表达GhCIPK6(KC465063)拟南芥在转基因棉花中,该基因介导钾离子的吸收+在Ca2 +−缺陷条件[4244]。

在我们之前的研究中,我们从cDNA文库和微阵列结果中鉴定了一个盐反应基因,GhCIPK6a(GenBank中加入号:HM002633),同源于AtCIPK641]。GhCIPK6a通过转录组分析,在盐胁迫下耐盐和盐敏感的陆地棉花品种中也有不同的表达[72]。我们分离出了整个GhCIPK6a研究了该基因在陆地棉中的功能。生理指标的变化表明GhCIPK6a在陆地棉中显著增强了耐盐性,证实了过表达GhCIPK6aRNA-seq结果显示胁迫信号通路中共表达基因表达水平升高。同时,转基因棉花在盐碱地的生长情况优于野生型。的功能GhCIPK6a以及在转基因棉花育种中的潜在应用。

结果

的分离与基本分析GhCIPK6a

在目前的研究中,cDNA和基因组DNA序列GhCIPK6a从陆地棉‘中G5’中分离得到[41]。基因组DNA和cDNA序列的GSDS比较(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) [73的基因组序列中没有内含子GhCIPK6a

GhCIPK6a含有1296 bp的开放阅读框(ORF),编码431个氨基酸,分子量为48.637 kD的蛋白。使用ScanProsite在线软件(http://au.expasy.org/tools/scanprosite/),基元扫描分析显示,GhCIPK6a在n端包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域,该结构域包含一个atp结合区和一个活性位点,在c端包含一个与ccl相互作用的NAF/FISL模块。GhCIPK6a在氨基酸残基198和217之间含有一个跨膜螺旋结构域。1).

图1
图1

在DNAMAN中使用ClustalW实现CIPK蛋白的多序列比对。保守的功能域下划线。在,拟南芥;钙、中投arietinum;Pt,杨树trichocarpa;Gh,g .分子;Cotton_A,g . arboreum;Gorai,请来g . raimondii就.右边的数字表示氨基酸残基位置

确定…的基因组位置GhCIPK6a,我们比较了GhCIPK6aD5g . raimondii就) [65),一个2g . arboreum) [63]和AD1g .分子lacc。TM-1) [66],并查找同源物(表1)1).我们在D5基因组,包括Gorai.001G032000.1Gorai.009G055400.1Gorai.010G112400.1,Gorai.013G216700.1,其中,Gorai.009G055400.1最认同的是什么GhCIPK6a(附加文件6图S1)。在美国2基因组序列,三个同源物GhCIPK6a被识别,包括Cotton_A_01247Cotton_A_09063,Cotton_A_07248,GhCIPK6a表现出最高的相似性Cotton_A_01247.这则广告1基因组序列包含三个同源物GhCIPK6aID是哪个基因Gh_A05G0418Gh_D05G0536,Gh_D13G1983.Gh_A05G0418和Gh_D05G0536与GhCIPK6a氨基酸序列同源性超过99%。系统发育分析表明,所有cipk可分为4个类群(类群I ~类群IV)6图S1)。将GhCIPK6a归为III类。的核苷酸序列GhCIPK6a有66.22%的认同AtCIPK6AT4G30960http://www.arabidopsis.org/), 70.72%与CaCIPK6(EU492906.1中投arietinumhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/).同时,对GhCIPK6与相关蛋白进行了多序列比对(图2)。1).这些CIPK蛋白激酶包含高度保守的功能域,如催化结构域、激活环、跨膜螺旋结构域和NAF/FISL基元。

表1 A2D5,和AD1基因组

GhCIPK6a的亚细胞定位

使用SubLoc v1.0 (http://www.bioinfo.tsinghua.edu.cn/SubLoc/)表明GhCIPK6a定位于细胞质,通过将GFP融合到细胞质的c端产生构建体证实了这一点GhCIPK6a在CaMV 35S启动子的调控下,在洋葱表皮细胞中短暂表达该构建体。确实,荧光特异地定位于细胞质(图2)。2b)确定细胞膜上是否存在GhCIPK6a与GFP融合;洋葱表皮细胞在蔗糖溶液中被酶解。分析表明,融合蛋白被限制在液泡和细胞膜上(图2)。2c)。

图2
figure2

洋葱表皮细胞GhCIPK6a:GFP融合蛋白的亚细胞定位。一个。表达GFP蛋白的细胞的荧光显微镜图像。b。表达GhCIPK6a:GFP融合的细胞的荧光显微镜图像。c。30%蔗糖溶液中酶解细胞的荧光显微镜图像。红色箭头表示细胞膜,黄色箭头表示液泡膜。转化后22-24 h,获取表皮细胞的共聚焦图像。Bar = 50 μm

体内GhCIPK6a与GhCBLs相互作用的验证

CIPKs的激活是通过与一个或多个CBL蛋白结合来调节的。先前有报道称,GhCIPK1与GhCBL2和GhCBL3相互作用[71]。因此,我们使用BiFC方法检测并研究了哪些GhCBL蛋白与GhCIPK6a相互作用

从NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/): GhCBL1 (EU085038.1), GhCBL2 (EU085042.1), GhCBL3 (EU085040.1)和GhCBL8 (EU085041.1)。当GhCIPK6a-YFPN和GhCBLs-YFPC用粒子轰击法在洋葱表皮细胞中共表达融合基因,当GhCIPK6a与GhCBL1和GhCBL8共表达时,在细胞核和细胞膜上观察到黄色荧光信号(图2)。3.).相比之下,当GhCIPK6a与GhCBL2或GhCBL3在洋葱表皮细胞中共表达时,没有观察到信号(数据未显示)。

图3
图3

bbic实验证实了洋葱表皮细胞中GhCIPK6a与GhCBLs的相互作用。GhCIPK6a与GhCBL1 (一个)及GhCBL8 (b)在体内。转化后22-24 h,获取表皮细胞的共聚焦图像。Bar = 50 μm

GhCIPK6a盐胁迫下盐反应基因显著上调

盐敏品种中G5 [41],GhCIPK6a盐处理1、6、12和24 h后,转录本在根中积累水平较高,表达水平显著提高。在茎组织中GhCIPK6a盐处理时间较根处理时间长,诱导表达量较根处理时间少(附加文件)7图S2a)

探讨GhCIPK6a在棉花增强耐盐性方面,我们进行了改造GhCIPK6a改为陆地棉品种‘11-0516’。11个转基因棉花个体(T1生成)(附加文件8图S3a)。通过卡那霉素耐药试验、PCR分析和Southern blotting试验,获得2个T2产生含有OE1和OE2两个插入片段拷贝的转基因后代植株(附加文件)8图S3b)。采用qRT-PCR方法检测了转基因植株和对照植株三叶期根中GhCIPK6a的表达水平。GhCIPK6aOE2的表达量明显高于未处理的野生型(图2)。4).而OE1系的表达量与野生型相比没有显著升高。因此,我们进一步分析的功能GhCIPK6a使用OE2转基因系

图4
装具

的相对表达GhCIPK6a在正常处理下,转基因系(OE1和OE2)和野生型(WT)植物在三叶期的根组织中均有表达。*,p-value < 0.05;**p-value < 0.01

我们还检测了GhCIPK6a盐胁迫下转基因棉花(OE2)在不同组织中的表现(附加文件)7图开通)。过表达GhCIPK6a盐胁迫对转基因棉花根系的诱导作用较强,特别是在盐处理1、3、6和12 h后。的表达谱GhCIPK6a其他组织中基因与野生型相似。此外,GhCIPK6a随着暴露在盐胁迫下时间的延长,表达量增加(图2)。5).确定…的功能GhCIPK6a在多种非生物胁迫下,我们分析了棉花中GhCIPK6a使用来自PLEXdb和GEO的公共数据集。GhCIPK6a在ABA、寒冷、干旱、盐度和碱度(pH)等多种非生物胁迫条件下,对其基因进行了分析g .分子(附加文件9图S4)。

图5
figure5

qRT-PCR分析GhCIPK6a表达和共表达的基因GhCIPK6a在盐胁迫下的不同组织中。一个。共表达基因的相对表达值GhCIPK6ab。的热图GhCIPK6a表达和基因共表达GhCIPK6a在盐胁迫下的不同组织中。野生型系WT, 11-0516;OE2,转基因棉花。R,根组织;S,茎组织;L,叶组织

CIPKs与CBLs和pp2c相互作用,形成一个调节K活性的复合物+转运蛋白(2474]。因此,我们检测了GhAKT1转基因棉和野生型在盐胁迫和控制下(水培生长)的差异(图2)。5)条件。GhAKT1盐胁迫处理12 h后,OE2仅在三叶期根中表达量显著增加,在茎中表达量也有类似的趋势。三叶期盐处理后, GhAKT1该基因在野生型系的所有组织中均被强烈诱导表达尤其是叶子。表达量的增加可能与K的维持有关+盐胁迫下根系的动态平衡,从而提高转基因品系的耐盐性。

GhCIPK6a分别与GhCBL1/GhCBL8、SnRK2.6和PP2C蛋白相互作用,调控下游基因的表达[2474]。然后,我们分析了GhCBL1GhCBL8GhPP2C(DQ303437.1),GhSnRK2.6(JN872373) [1275(图。5).的转录水平GhCBL1GhCBL8盐胁迫后叶片迅速上升,在盐胁迫后12 h呈下降趋势。与此同时,GhCBL1盐胁迫诱导转基因系OE2的茎部表达。GhPP2C除根外,盐处理后各组织中OE2表达均上调,以叶片居多。GhSnRK2.6在处理1和3小时后,转录本在OE2的所有组织中都被强烈诱导,但在6和12小时后,转录本仅在叶片中积累(图2)。5

GhCIPK6a提高萌发期和幼苗期的耐盐性

在盐胁迫下,棉花的萌发和出苗期是关键时期。在150 mmol·L盐处理条件下,用垂直放置的滤纸卷测定棉花种子的萌发势和种子发芽率−1NaCl)和对照(蒸馏水,CK)(图2)6a、附加文件10图S5)盐胁迫下转基因棉系的种子发芽率(48.89和53.33%)显著高于野生型(17.12%)(图2)。6a、附加文件10图S5)。但转基因系与野生型系在盐胁迫下的萌发势差异显著(数据未显示)。此外,我们还获得了转基因拟南芥的纯合子,分析了盐处理下的种子发芽率和生长情况。在200 mmol·L NaCl浓度下,转基因拟南芥种子萌发率较高,生长正常−1同样如此(数据未显示)。

图6
figure6

转基因系OE1和OE2与野生型系在非生物胁迫下的种子发芽率和电导率分析一个.转基因系(OE1和OE2)和野生型系(WT)在盐、PEG和冷处理下的种子发芽率。b.转基因系(OE1和OE2)和野生型系(WT)在0、100和150 mmol·L浸泡24 h后的电导率分析−1氯化钠溶液。*,p-value < 0.05;**p-value < 0.01

同时,我们分析了转基因型和野生型棉花种子在吸水萌发期吸水率的变化(图2)。7),通过测定不同浓度NaCl溶液浸泡24 h后的电导率,研究盐胁迫对细胞膜通透性的影响(图2)。6b).转基因系OE1和OE2在吸收萌发期细胞膜比野生型更稳定,吸水能力也高于野生型。因此,转基因棉籽在盐胁迫下能够保持较高的种子发芽率,这是由于转基因棉籽细胞膜稳定性的提高,从而保证了在盐胁迫下水分的正常吸收。因此,过度表达GhCIPK6a陆地棉通过增加细胞膜稳定性提高种子萌发期的耐盐性。

图7
figure7

转基因系(OE1和OE2)和野生型系(WT)在不同NaCl浓度(mmol·L)溶液下的吸收萌发期吸水率−1).一个,为对照,为转基因系和野生系在蒸馏水(0 mmol·L)条件下的吸水率−1氯化钠浓度)。B、C、D分别为转基因系和野生系在不同NaCl浓度溶液中的吸水率,(b) 100 mmol·L−1, (c) 150 mmol·L−1,及(d) 200 mmol·L−1,分别。*,p-value < 0.05;**p-value < 0.01

来确认过度表达GhCIPK6a采用150 mmol·L的水培溶液浸泡转基因和野生型三叶期幼苗的根系,提高幼苗期的耐盐性−1生理盐水。测定了盐胁迫下幼苗的丙二醛和脯氨酸含量以及SOD和POD活性。盐处理2、5、10 d后,转基因系MDA相对含量低于对照,但脯氨酸相对含量、POD和SOD相对活性高于野生型(图2)。8).由于丙二醛和脯氨酸促进膜稳定性,而POD和SOD通过减少H的积累来限制膜脂过氧化2O2.所以结果表明过度表达GhCIPK6a增加POD和SOD活性,从而降低H2O2在盐胁迫下积累和保护植物幼苗免受膜损伤

图8
figure8

150 mmol·L下转基因(OE2)系与野生型(WT)系幼苗叶片生理指标的统计分析−1生理盐水治疗。一个.150 mmol·L处理2、5、10天后,转基因系(OE2)和野生型系(WT)叶片中MDA的相对含量−1生理盐水治疗。b.150 mmol·L处理后,转基因系(OE2)和野生型系(WT)叶片中脯氨酸的相对浓度分别为2、5和10 d−1生理盐水治疗。cd.SOD的相对活性(c)及POD (d转基因系(OE2)和野生型系(WT)在150 mmol·L的浓度作用2、5和10天后,叶片中均有不同程度的表达−1生理盐水治疗。*,p-value < 0.05;**p-value < 0.01

耐盐性提高GhCIPK6a转基因棉花田间试验

目的:评价玉米的耐盐性GhCIPK6a-过度表达的棉花植物,我们种植了T6和T7在河北省邯郸市进行了两种不同条件下转基因品系的产生及防治试验。转基因系的产生过程见附加文件8图S3c和S3d。表格2展示了2016年和2017年转基因品系和野生型对照的产量和纤维品质性状。

表2GhCIPK6a2016年和2017年在正常和盐水条件下的转基因系和野生型

苗期,苗田出苗率为GhCIPK6a正常条件下过表达系与WT系相似。盐胁迫下,OE品系2年的苗田出苗率显著高于WT品系(图2)。9).花铃期,2016年6月28日发生冰雹灾害,造成OEs和WT系铃数较2017年有所减少(表1)2).与此同时,转基因品系在冰雹灾害后的恢复情况优于野生品系,尤其是在盐胁迫下。2016年盐条件下OE系的抗逆性较WT系表现为铃数多、衣分高(表1)2).否则,纤维均匀率GhCIPK6a过表达系明显高于WT系,表明GhCIPK6a过表达系在极端环境中表现出更强的适应性和恢复力。

图9
figure9

2016年和2017年正常和盐水条件下转基因品系(OE1和OE2)和野生品系(WT)的田间出苗率。*,p-value < 0.05;**p-value < 0.01

2017年转基因品系的铃数显著高于正常条件下的WT品系,盐胁迫下差异不显著。此外,OE系和WT系的铃重和衣分无显著差异。可以推测GhCIPK6a在正常条件下,过量表达在陆地棉中可提高产量。对纤维品质性状无影响。盐胁迫下,过表达系和野生型系在产量和纤维品质性状上也无差异(表2)2).因此, GhCIPK6a棉花过表达提高了盐胁迫下的苗田出苗率和籽棉产量,并在极端处理下保持了产量和纤维品质性状的稳定性。

我们还于2013年在中国新疆阿克苏市对转基因棉和对照棉在开花和结铃阶段的耐盐性进行了田间评价(附加文件)11图S6)。5 ~ 10 cm土层含盐量约为0.92%,显著高于棉花的耐盐量。在严重的盐胁迫下,野生型和盐敏棉品种ZG5的叶片出现大面积坏死[4172]。然而,转基因植株和耐盐棉花品种Z9806 [12])可以长得很好,叶子没有坏死(附加文件)11图S6)。

GhCIPK6a参与MAPK信号通路和植物激素信号转导通路对盐胁迫的响应

为了理解的机制GhCIPK6a为了提高转基因棉花的耐盐性,我们分析了转基因棉花的转录组GhCIPK6a-过表达(OE2)系和野生型植物。共有252个基因被上调,79个基因被下调GhCIPK6a -与野生型植物的过表达比较(附加文件12图S7,附加文件1表S1)。在252个上调的DEGs中,GO-term分析显示78个基因在响应信号、应激、ROS和刺激过程中富集(附加文件)13图S8a, b)。在78个候选基因中,有33个基因对盐、锇和干旱胁迫有反应(图S8a, b)。10a, b), 8个基因参与MAPK级联(GO:0000165)。的基因Gh_A11G1875在MAPKK活性过程的激活(GO:0000186)和气孔关闭调控(GO:0090333)中预测。有一个基因,Gh_D02G00577个基因对赤霉素酸有响应(GO:0009739)。KEGG通路分析显示,78个基因主要富集于2条信号转导通路,尤其是MAPK信号通路(ko04016)和植物激素信号转导通路(ko04075)(图2)。10a, b,附加文件13图S8c)。

图10
图10

OE2植物中特异表达的DEGs分析。一个b.DEGs富集了KEGG通路和表达谱分析。c。使用STRING程序对PPI网络进行预测。红色菱形背景的基因是DEGs上调的共表达基因。绿色椭圆背景基因为下调DEGs共表达基因。具有灰色矩形背景的基因是在同一PPI网络中预测的基因GhCIPK6a来自上调的DEGs。d。共表达的上调deg的表达谱验证GhCIPK6ae。共表达的下调deg的表达谱验证GhCIPK6a

利用在线STRING程序检测了deg之间的蛋白相互作用,共表达了23个基因GhCIPK6a在78个上调基因中,与2个基因共表达GhCIPK6a在79个下调的deg(附加文件2表S2)。结合上调和下调基因的边和节点信息,利用Cytoscape软件进行PPI网络构建(图5)。10c)。

在PPI网络中,有8个基因预测与之共表达GhCIPK6a直接,6个上调和2个下调的deg。6个上调的deg为Gh_A03G0309(18.5 kD I类热休克蛋白,HSP18.5-C);Gh_A05G3030(蛋白磷酸酶2C 37, PP2CA),Gh_A12G2380(可能是蛋白磷酸酶2C - 75, AHG1),Gh_A13G1741(蛋白磷酸酶2C 56, ABI1);Gh_D04G0015(可能是蛋白磷酸酶2C8, PP2C8),和Gh_D09G1525(18.2 kD I类热休克蛋白,HSP18.2)。所有PP2C基因均参与MAPK信号通路(ko04016)和植物激素信号转导通路(ko04075)。10c)。HSP基因参与内质网蛋白加工(ko04141)。两个下调的deg是Gh_D05G1740(丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STY46)和Gh_D07G1409(可能是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶),没有KEGG注释,都在MAPKKK活性过程中富集(GO:0004709)。使用qRT-PCR验证PPI网络中的所有deg(图2)。10d, e,附加文件14图S9),与RNA-seq数据一致。

过表达GhCIPK6a还能提高对渗透和低温胁迫的耐受性

为了研究转基因棉花品系对非生物胁迫的耐受性,我们还分别测定了在干旱(15% PEG 6000)和低温(15°C蒸馏水)胁迫下的种子萌发势和种子发芽率。转基因棉花在干旱(15% PEG 6000)和低温胁迫下的种子发芽率显著高于野生型(图2)。6一个)。

讨论

开发基因源进行分子育种是改善非生物胁迫遗传改良的一种常用策略。在这里,GhCIPK6a(HM002633)具有提高棉花耐盐性的潜力.GhCIPK6a具有66.22%的核苷酸序列同源性AtCIPK6GhCIPK6a盐处理显著增加了表达(附加文件7图S2)。过度的GhCIPK6a不同胁迫处理均能提高种子发芽率。

GhCIPK6a (HM002633)与GhCIPK6 (KC465063)的区别

另一个GhCIPK6基因(GhCIPK6(KC465063)))曾在陆地棉[4244]。的GhCIPK6a(HM002633)与GhCIPK6(KC465063),氨基酸序列一致性为90.49%。我们进一步分析了GhCIPK6a(HM002633)和GhCIPK6(KC465063)序列2D5,和AD1基因组(表1).的同源idGhCIPK6a(HM002633)2D5和广告1基因组Cotton_A_01247Gorai.009G055400.1Gh_A05G0418Gh_D05G0536,分别。的有三个同系物GhCIPK6(KC465063), Gorai.010G112400.1在D5基因组,Gh_A06G0873Gh_D06G1020在广告1但在A基因中没有同源物2基因组。每个预测的染色体位置GhCIPK6a(HM002633)和GhCIPK6(KC465063) in A2D5,和AD1基因组数据见表1.多个序列比对和系统发育分析证实了两者的存在GhCIPK6s是两个不同的基因序列。的基因GhCIPK6(KC465063)可能与GhCIPK6a(HM002633),由棉花特异性复制和进化产生。

来确认两者的区别GhCIPK6a(HM002633)和GhCIPK6(KC465063)不仅涉及它们的核苷酸序列,我们还分析了氨基酸序列中的磷酸化位点(附加文件)3.表S3,附加文件15图S10)。氨基酸序列的差异导致可能激活下游基因的磷酸化位点的差异。

利用公开数据,我们分析了GhCIPK6a(HM002633)和GhCIPK6(KC465063)在不同的棉花组织中,在纤维发育的不同阶段,受到不同的应力(附加文件9图S4)。我们发现GhCIPK6a(HM002633)强高于GhCIPK6(KC465063)。GhCIPK6a(HM002633)对盐胁迫的敏感性高于GhCIPK6(KC465063)。会议记录GhCIPK6a(HM002633)在耐盐和盐敏感棉花品种根系中经不同盐处理次数均有较大程度的上调。的异源表达GhCIPK6(KC465063)显著提高了转基因拟南芥对盐、干旱和ABA处理的耐受性,但该基因在棉花中过表达后,没有证据表明该基因可以提高非生物耐受性。因此,非生物胁迫对GhCIPK6a(HM002633)的表达比onGhCIPK6(KC465063)。

GhCIPK6a可用于棉花抗逆性育种

种子萌发期是棉花发育对盐胁迫最敏感的时期[j]。76],以及过表达的种子发芽率GhCIPK6a在非生物胁迫下,品系的产量高于野生型。棉花在萌发阶段对非生物胁迫特别敏感,因此在不同浓度的NaCl溶液中浸泡24 h后,通过测定电导率来检测盐胁迫对细胞膜透性的影响。在不同胁迫条件下,转基因系的种子发芽率均高于对照。在盐胁迫下,转基因棉花的吸水率也保持在正常稳定的水平。在NaCl溶液中浸泡24 h后,转基因系(OE2)的细胞膜比对照更稳定(图2)。67b)。

种子萌发指标包括根长和下胚轴长,分别在盐处理和对照处理下测定。在盐处理和正常条件下,转基因棉花和野生型棉花的幼苗生长无显著差异(数据未显示)。在正常大田和盐碱地,研究了油菜苗期和开花期的生长性能GhCIPK6a过表达行和野生型行。盐胁迫对转基因棉和野生型棉的生长均有抑制作用,但差异不显著(数据未显示)。这些结果提示过表达GhCIPK6a不能缓解盐胁迫对幼苗生长的抑制作用。

在强烈盐胁迫下,过度表达GhCIPK6a棉花植株比野生型棉花生长得更好(附加文件)11图S6)。2013年,在新疆阿克苏地区5 ~ 10 cm以下土壤含盐量约为0.92%的天然盐碱地种植了盐敏感和抗盐品种的转基因品系和受体。OE2系在盐碱地生长较好。OE2棉花的盐胁迫损害程度较对照轻(附加文件)11图S6)。与野生型棉花相比,转基因棉花品系的种子萌发、生长、产量和纤维品质等性状均未降低,尤其是过表达GhCIPK6a在极端环境下,植物表现出比受体植物更高的适应能力(图2)。9表格2).

GhCIPK6a参与多种盐反应途径以应对盐胁迫

在本研究中,我们测定了盐胁迫和正常条件下转基因和野生型棉花枝条中丙二醛的相对含量(图2)。8).盐胁迫下,OE2系的MDA相对含量维持在1.00左右。而在野生型棉花中,MDA的相对含量随处理时间的延长而增加。盐胁迫10 d后,野生型棉花丙二醛含量约为对照的1.40倍。脯氨酸含量在OE2和野生型系中均有增加,但OE2的增加幅度更大。土壤盐会引起植物在逆境中生理指标的变化。MDA、脯氨酸含量和抗氧化酶(POD和SOD)活性等生理指标是评价非生物胁迫耐受性的典型参数。MDA相对水平较低而脯氨酸相对水平较高的植物在逆境下往往能维持细胞膜的稳定性[77]。盐处理下,耐盐棉花基因型表现出更高的植株干重、光合作用和抗氧化酶活性[j]。78]。同样,在盐胁迫下,OE2中POD和SOD的活性高于野生型,说明转基因棉花在盐胁迫下具有更强的清除ROS的能力。此外,POD和SOD在胁迫下的活性越高,植物清除过量产生的ROS和保护细胞免受ROS损伤的能力就越强[16]。在RNA-seq分析结果中,有一些deg参与了OE2植物对活性氧途径的响应(GO:0000302)(另附文件)13图S8),这表明GhCIPK6a过表达可提高过氧化物酶相关基因的表达水平,增强活性氧清除能力。

CIPKs参与多种应激反应过程,在多种调控通路中发挥作用,如SOS通路、Low-K通路等+反应途径[2474], ABA信号通路[79]。GhPP2CGhSnRK2.6在盐胁迫下,在OE2植物中均被强烈诱导。此外,在RNA-seq分析中,有四个PP2C基因预测与GhCIPK6a在盐处理下转基因植物(图2)10额外的文件2表S2)。推测GhCIPK6a通过与GhPP2C蛋白共表达参与MAPK信号通路和植物激素信号转导通路。

CIPK蛋白激酶家族通过与CBL蛋白形成复合物来调节离子稳态。拟南芥中的CBL4/CIPK6复合物调节质膜中的AKT2钾通道[j]80]。体外实验中,CBL1、CIPK23和AKT1可以共同作用介导CIPKs对CBL1依赖性的靶蛋白磷酸化增强[81]。CIPKs调节编码K的基因的活性+调解根K的通道+摄取,如拟南芥中的AtAKT1和AtAKT2 [24558082]。在野生盐生植物中大麦brevisubulatumHbCIPK2与hbbcbl1结合可激活HbVGKC1吸收K+,与hbbcbl4 /10联合可调节HbSOS1L排除Na+83]。过度的GhCIPK6a通过与GhCBLs、GhPP2C和GhSnRK2.6的相互作用,棉花可能增强了对非生物胁迫的耐受性,还调节过氧化物酶活性,这一点也通过OE2和WT棉花之间的RNA-seq分析得到了验证(图2)。10、附加文件13图S8)。因此,GhCIPK6a可能在多种信号通路中起作用,介导棉花对非生物胁迫的反应。总之,GhCIPK6a可能在多种应激反应途径中起作用,比如K+摄取途径(图2)5), ROS清除途径(图2)。8、附加文件13图8a)、MAPK信号通路和植物激素信号转导通路(图8a)。10A、b),提高转基因棉花的耐盐性。总之,这项工作表明GhCIPK6a过表达能提高棉花的耐盐性。

结论

我们把GhCIPK6a在盐胁迫下,从陆地棉中提取GhCIPK6a通过转化和RNA-seq分析。GhCIPK6a在非生物胁迫下,过表达系的种子发芽率高于野生型棉花,这可能涉及多种胁迫响应途径,如K+摄取途径、ROS清除途径、MAPK信号通路和植物激素信号转导途径。此外,GhCIPK6a过表达系提高了田间盐胁迫下的衣分率和纤维长度均匀性。因此,GhCIPK6a在棉花育种中具有提高抗逆性的潜力。

方法

植物材料和植物生长条件

以陆地棉品种‘11-0516’(本实验室从CCRI 12育种而来)为材料进行遗传转化。为扩增候选基因序列,从陆地棉品种‘中G5’中分离cDNA和基因组DNA [4172]。“中G5”种子由中国农业科学院原始提供。品种‘11-0516’和‘中G5’现由本实验室保存。

在改良的1/2 Hoagland溶液中培养陆地棉花幼苗。植株在28/20°C、600 mol·cm光强下生长2∙年代−1,光周期为14 h光照/10 h黑暗[41]。在三叶期,一半的幼苗转移到150mmol·L的培养皿上−1生长介质中NaCl溶液;剩余幼苗在正常营养液中生长作为对照。分别于盐胁迫后1、2、3、6、12 h采集处理苗和对照苗的根、茎、叶,立即用液氮冷冻,保存于- 80°C,用于RNA提取和qRT-PCR分析。

提取总RNA,鉴定并定量,用DNase I消化污染的基因组DNA,并按照先前描述的方法将RNA逆转录成cDNA [41]。

全长菌株的分离及生物信息学分析GhCIPK6a

引物使用Primer Premier 5软件(Premier Biosoft International)设计,并在附加文件中显示4使用表S4,扩增了先前报道的陆地棉花根中ccl相互作用蛋白激酶(GW691274)的全长cDNA [41]。该片段使用TaKaRa PCR热循环器(TaKaRa Bio Inc.)获得。扩增条件为:94°C 5 min,然后在94°C 30 s, 55°C 30 s, 72°C 2 min, 72°C 10 min下进行30个循环。然后对该片段进行纯化和测序。

利用Lasergene软件(DNAStar, MD, USA)分析扩增的cDNA序列。利用GSDS (gene structure Display Server,基因结构显示服务器)预测基因结构。http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) [73]。使用ScanProsite在线软件(http://au.expasy.org/tools/scanprosite/).

利用DNAMAN软件中的ClustalW程序将GhCIPK6a与其他物种的CIPK蛋白进行多序列比对,利用MEGA5.2软件采用邻接法和1000个bootstrap测试重复构建系统发育树。

GhCIPK6a的亚细胞定位

为了制作gfp标记的GhCIPK6aGhCIPK6a用含有Kpn我和BamH首先将PCR产物克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa)中,然后进行测序。后Kpn我和BamH经酶切,将PCR片段克隆到p3301-GFP质粒中,得到p3301-GhCIPK6a: GFP。

洋葱的亚细胞定位洋葱将融合构建物p3301-GhCIPK6a: GFP转化为洋葱表皮细胞。同时引入p3301-GFP载体作为对照。转化和观察的方案如上文所述[10]。洋葱表皮细胞在30%蔗糖溶液中被酶解。

GhCIPK6a与GhCBLs相互作用的BiFC分析

融合载体pucc - ghcipk6a - yfpN和pUC-GhCBLs-YFPC使用带限制性位点的基因特异性引物构建(附加文件4表S4)。这些构建体在洋葱表皮细胞中短暂共表达[10]。28℃孵育22-24 h后,用共聚焦激光扫描显微镜(Nikon, EZ C1)观察转化细胞的YFP荧光。

过表达载体构建与棉花转化

的编码序列GhCIPK6a使用LA-Taq DNA聚合酶和含有限制性内切酶位点的基因特异性引物进行PCR扩增(附加文件4表S4)。GhCIPK6a被克隆并插入Xba我- - - - - -pBI121载体的I位点,在CaMV 35S启动子的控制下。重组质粒命名为pBI-GhCIPK6a。利用花粉管途径法将该结构转移到棉花品种(11-0516)中[84]。独立系的幼苗GhCIPK6a转基因植株用5 g L进行鉴定−1硫酸卡那霉素溶液,并通过扩增进一步证实《不扩散核武器条约》II,哪些引物在附加文件中显示4表S4。插入片段的拷贝数通过Southern Blotting分析确定。

生理指标测定

为研究转基因棉系对非生物胁迫的耐受性,采用滤纸卷竖法进行萌发试验。每个转基因或对照棉系各30粒种子置于一卷滤纸中,外加蒸馏水(对照)、150 mmol·L的NaCl溶液−1)和PEG6000溶液(15%,w/w),在28℃下保存9 d, 3个重复。第9天测定种子发芽率。种子发芽率=第9天萌发的种子数/总种子数× 100%。第9天测定幼苗的根长和下胚轴长。此外,为了评价转基因品系的耐冷性,将种子置于15℃15 d,测定种子发芽率,共3次重复。为了确定盐胁迫对发芽期的影响,测定了吸胀期的吸水率。将每个转基因系或对照系的20粒种子分别暴露于不同NaCl浓度(0、100、150和200 mmol·L)的溶液中−1),并保持在28°C,重复4次。每2h测定一次种子的重量。吸水率=(吸水后的种子重量-浸泡前种子的初始重量)/浸泡前种子的初始重量× 100%。

在幼苗生长试验中,将转基因苗和对照苗分别生长在1/2 Hoagland改性溶液中。在三叶期,将转基因棉苗和对照棉苗转移到1/2 Hoagland溶液或添加150 mmol·L的溶液中−1生理盐水。分别于处理后1、2、3、6和12 h取样盐胁迫和对照幼苗的根,立即在液氮中冷冻,然后在- 80°C保存,用于RNA提取和qRT-PCR分析。在盐胁迫下生长2、5和10 d后,取叶片取样,按照以往方法测定叶片的生理指标,包括丙二醛和脯氨酸含量,以及抗氧化酶(SOD和POD)活性[858687]。所有的测定包括三个生物重复,每个重复有六个植物,误差条表示标准偏差(SD)。

田间表型测定

为评价转基因棉花品系全生育期的耐盐性,于2016 - 2017年夏季在河北省邯郸市(36°78′n, 114°92′e)中国农业大学衢州试验站进行了田间试验。棉花种植在4行地块上,每行13个孔。试验样地长4 m,行距80 cm。植株每行间隔33厘米。每个洞种下八颗种子。现场设计采用随机完全区组设计,分别设4个重复。现场管理遵循当地常规标准现场操作。盐田播前用0.4%的盐水灌溉,对照田用淡水灌溉[12]。以受体品种‘11-0516’为对照,在正常和盐度条件下进行对照。

播种30 d后调查苗田出苗率,反映苗苗紧急状况和成活情况。出苗率=成活苗数/总播种种子数(每孔8粒×每行13孔× 4行)× 100%。9月15日对每个小区44个个体进行铃数调查。产量相关性状包括铃重(g)和衣分(%)。纤维长度(mm)、纤维长度均匀度(%)、纤维强度(cN·tex)−1)、纤维伸长率(%)和马克隆值由中国河南省安阳市农业部棉花质量监督检验测试中心使用HVI 1000 (Uster®HVISPECTRUM, Spinlab, USA)进行测定。

基于棉花公开表达数据的表达分析

公开棉花表达数据(附加文件5表S5)从PLEXdb (http://www.plexdb.org/index.php)和Gene expression Omnibus (GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).研究了耐盐棉花‘中07’和盐敏感棉花‘中G5’在盐胁迫3、12和48 h后根系转录组的差异[j]。72],并分析候选基因的表达谱。使用鲁棒多芯片分析(RMA)将所有微阵列数据归一化。利用RT-PCR技术检测了盐胁迫下转基因棉花中多个候选基因的表达谱。热图由Mev软件(http://mev.tm4.org/).

RNA测序与分析

从OE2转基因系和受体品种‘11-0516’幼苗的根样品中提取总RNA,分别处理0、1、6、12、24和48 h,并进行3次生物重复。RNA-seq文库在Illumina Hiseq2500平台(biomker Technology Corporation, Beijing, China)上制备并测序。所有原始数据均在NCBI序列读取档案(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra),项目编号PRJNA644135 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA644135).

采用DEGSeq法进行显著差异表达分析[88],定义为折叠变化(盐处理cv 0 h) > 2且FDR < 0.01,则使用BMKCloud (www.biocloud.net).基因本体(Gene Ontology, GO)分析采用WEGO在线软件。DEGs富集通路分析使用京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库。利用互作基因/蛋白检索工具(STRING) v11 (http://string-db.org/)和Cytoscape应用程式(http://apps.cytoscape.org/apps/stringapp) [8990]。综合评分≥0.4分进行PPI网络建设。

定量RT-PCR分析

定量RT-PCR分析了盐胁迫下转基因棉花和野生型棉花候选基因的表达谱。定量RT-PCR采用ABI PRISM®7500 Real-Time PCR系统,采用SYBR®Premix Ex Taq™试剂盒(TaKaRa, DRR041A),一式三份。基因特异性引物见附加文件4表S4。的GhUBQ7转录本被用作标准化控制来量化相对水平。计算相对表达水平t -∆∆方法(9192]。计算三个生物重复的标准差。

统计分析

采用SPSS软件(13.0 for Windows Evaluation Version, SPSS Inc., LEAD Technologies, USA)进行统计分析。所有显著差异均采用t检验并标记为*;p-value < 0.05;**p-value < 0.01。

数据和材料的可用性

所有转录组原始数据可在NCBI项目ID PRJNA644135 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA644135).

缩写

阿坝:

脱落酸

ABI:

脱落acid-insensitive

BiFC:

双分子荧光互补

CaMV:

花椰菜花叶病毒

CBL:

钙调磷酸酶b样蛋白

CIPK:

cbl相互作用蛋白激酶

度:

差异表达基因

地理:

基因表达综合

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

走:

基因本体论

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

MAPK:

丝裂原活化蛋白激酶

MDA:

二元羧酸醛

OE:

超表达

PLEXdb:

植物表达数据库

圆荚体:

过氧化物酶

PP2C:

蛋白磷酸酶2C

PPI:

蛋白磷酸酶相互作用

存在:

实时定量PCR

ROS:

活性氧

SD:

标准偏差

SnRK:

Sucrose-nonfermenting-related激酶

SOD:

超氧化物歧化酶

紧急求救信号:

盐过度敏感

WT:

野生型

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下载参考

致谢

我们感谢张利达博士(上海交通大学)的有益讨论和郑俊波先生(河北省农林科学院)参与基因克隆的部分工作。我们感谢jianheng博士和Xiaoli Tian博士(中国农业大学)分别提供用于bic检测和亚细胞定位检测的载体。我们感谢王坤波博士(中国农业科学院)提供的‘钟G5’种子。

资金

本研究得到了国家自然科学基金项目(项目编号:31530053)和国家作物育种重点研发计划项目(项目编号:2016YFD0100305)的部分资助,为我们的研究提供了资金支持,但资助机构没有参与研究的设计、数据收集、数据分析和论文的撰写。

作者信息

从属关系

作者

贡献

YS完成了所有的实验,数据分析,并准备了稿件。AG参与制备RNA样品进行RNA-seq。YH参加了讨论并修改了稿件。YW维护实验平台,进行台架工作。JH构思实验,提供实验平台修改了原稿所有作者都同意最后的手稿。

相应的作者

对应到

道德声明

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

额外的信息

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

补充信息

附加文件1:表S1。

通过RNA-seq分析筛选盐胁迫下OE2棉花DEGs的上调和下调。

附加文件2:表S2。

共表达基因的边和节点信息GhCIPK6a在PPI网络中使用STRING在线程序进行预测。

附加文件3:表S3。

KinasePhos预测GhCIPK6a (HM002633)和GhCIPK6 (KC465063)磷酸化位点http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/).

附加文件4:表S4。

构建载体的引物及qRT-PCR。下划线序列为限制性内切酶序列。

附加文件5:表S5。

公众棉花表达数据来自PLEXdb (http://www.plexdb.org/index.php)和基因表达总汇(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/).

附加文件6:图S1。

其他物种中GhCIPK6a (HM002633)和CIPK同源蛋白的系统发育分析。使用集成的ClustalW对全长氨基酸序列进行比对,并使用MEGA5.2中的邻居连接法构建系统发育树(1000个bootstrap测试重复)。黑色三角形表示GhCIPK6a (HM002633)和来自A的同源物2D5,和AD1分别的基因组。黑色圆圈表示GhCIPK6 (KC465063)和D5和广告1分别的基因组。复制树的百分比显示在树枝上。不同颜色的树枝代表不同的群体。位于蓝色三角形标记的分支上的蛋白质被选择用于使用DNAMAN软件进行多次比对。

附加文件7:图S2。

的表达分析GhCIPK6a在盐处理后的不同组织中。A.陆地棉品种中G5的表达分析;B. OE2和野生型系的表达谱。

附加文件8:图S3。

转基因阳性植株的PCR分析和Southern blotting试验。解析:选a1通过扩增抗性基因来转基因植物《不扩散核武器条约》2红框内标记的样品为阳性T1GhCIPK6a转基因植物。M, D2000 DNA阶梯;阳性个体:J100-1、J100-2、J100-7、J100-8、J100-12、J100-15、J100-21、J100-24、J100-27、J100-34、J100-35分别为11个、11个。CK+:阳性对照。红框内的样品不在此范围内。B.使用抗性基因的转基因棉花植株的Southern印迹试验《不扩散核武器条约》作为探针。红框中:M, D2000 DNA阶梯;1,1,1 (12d44);2, OE2 (12D47),这是本研究使用的样品。3-8代表不同个体,分别为12D48-12D53。C和D. OE1 (12D44)和OE2 (12D47)系及其后代的家谱图。

附加文件9:图S4。

的表达谱GhCIPK6s在非生物胁迫下使用公共数据集。1、来自PLEXdb的公共数据。II, GSE50770,分析了响应多种非生物胁迫的基因之间的串扰,包括ABA、寒冷、干旱、盐度和碱度(pH)g .分子.III .耐盐品种‘中07’和盐敏感品种‘中G5’在150 mmol·L胁迫下3、12和48 h的根系转录组分析−1生理盐水治疗。

附加文件10:图S5。

在盐处理(NaCl)和对照(CK)条件下,转基因系(OE1和OE2)和野生型系(WT)的萌发性能。杆= 1厘米。

附加文件11:图S6。

2013年新疆阿克苏转基因棉和对照棉花铃期大田耐盐性试验地表5 ~ 10 cm以下土壤含盐量约为0.92%。

附加文件12:图S7。

通过RNA-seq分析,确定了OE2和WT植物在不同盐胁迫时间点上的deg上调和下调的Venn图。

附加文件13:图S8。

上调和下调deg的GO-term和KEGG分析。A.盐处理后OE植物中特定上调和下调deg的GO-term分析。B. 78个候选deg的KEGG通路分析。

附加文件14:图S9。

qRT-PCR验证候选deg表达谱。A. PPI网络中共表达deg的RNA-seq分析和qRT-PCR分析。B. RNA-seq与qRT-PCR分析表达谱的相关性。

附加文件15:图S10。

GhCIPK6a (HM002633)和GhCIPK6 (KC465063)氨基酸序列和磷酸化位点差异分析。A. GhCIPK6a (HM002633)和GhCIPK6 (KC465063)的序列比对。B. KinasePhos预测的GhCIPK6s磷酸化位点示意图(http://kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/).

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苏勇,郭安,黄勇。et al。GhCIPK6a通过参与ROS清除和MAPK信号通路,增加转基因陆地棉的耐盐性。BMC Plant Biol20.421(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-02548-4

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关键字

  • CIPK
  • 盐胁迫
  • Co-expression
  • 陆地棉
  • 信号通路