种子休眠释放Halenia elliptica对分层温度、持续时间和土壤含水量的响应

背景

虽然对许多物种的冷分层对种子休眠释放的影响已经进行了广泛的研究，但在种群水平上，对分层温度、土壤含水量和分层时间对种子休眠释放的作用的认识有限。在此，我们旨在确定种子休眠释放对这些因素的响应Halenia elliptica。

结果

种子休眠释放对低温的响应强于高温，在8℃时未发生休眠打破。当分层土壤含水量从0增加到24%时，种子发芽率先增加后保持不变。低海拔居群的种子休眠释放对分层温度升高和土壤含水量降低的反应比高海拔居群更敏感。

结论

全球变暖引起的温度和土壤湿度变化会影响种子休眠释放，进而影响幼苗的建立。因此，结合涉及温度、土壤含水量和分层持续时间的种子休眠释放数据，有利于预测气候变化情景下植物的再生、迁移和共存。

种子休眠是一种适应性性状，在许多被子植物和裸子植物中都有[1］．它被定义为在非休眠种子萌发的最佳条件下，有活力的种子在规定的时间内没有萌发[2］．温带夏季一年生植物和许多多年生植物种子普遍存在生理休眠，经过一段时间的冷湿分层后可被打破[1，3.］．

冷湿分层过程中的温度是影响休眠缓解的关键环境因素[4］．一般而言，冷分层过程中种子休眠释放的有效温度约为0至10℃，这取决于不同的物种[1，5，6］．例如，休眠的种子苔属植物remota在5℃下分层4周萌发率较高，而在11℃、13℃或15℃下分层均显著抑制种子萌发，甚至诱发次生休眠[7］．相比之下，Kirdar和Ertekin(2008)报道，9°C的分层比4°C更有效地打破了四个种子的种子休眠冷杉属nordmanniana．低温分层的持续时间也被发现影响种子休眠释放[1，8］．低温分层解除种子休眠的最佳时间为5 d小麦属植物sp。9到20周的士大古安高山［10］．种子萌发两种，Cerastium cerastoides而且Leucanthemopsis阿尔，随着冷分层时间的增加，均先降低后升高[11］．此外，对葡萄(葡萄属仕达屋优先计划．)表明，冷分层过程中休眠释放不仅受分层温度的控制，还受分层时间的控制[12]，表明种子休眠释放的冷分层需求受温度和温度持续时间的影响。

除温度和冷分层时间外，土壤含水量是影响种子休眠释放的另一个关键环境因子。以往的研究[13，14，15]已经报道了种子在冷分层过程中的休眠释放随土壤含水量而变化。种子发芽率赤杨皮需而且桦木属下毛竹随种子含水量增加而减少[14］．相反，种子发芽反屈苋，藜属专辑而且c . hybridum在冷分层过程中，土壤含水率随土壤含水率的增加而先升高后降低[15］．

一些研究确定了种子休眠释放对温度等单一环境因素的响应[5，7，16，17，18]、冬季持续时间[11，19]和种子/土壤含水量[13，14，15]在冷分层过程中。这些研究结果表明，全球变暖可能会影响种子休眠释放的动态，从而延迟或增强种子的植株再生[20.，21，22，23］．然而，气候变化不仅仅是温度的变化，它还可能改变冬季的持续时间和土壤含水量[20.］．因此，在全球气候变化情景下，研究低温分层过程中这些环境因子及其相互作用对种子休眠释放的影响，对于预测物种分布、入侵和植物保护具有重要意义。然而，低温分层过程中温度、持续时间和种子/土壤水分含量对种子休眠释放的交互作用尚不清楚。

此外，不同物种对休眠释放的温度、持续时间和土壤含水量要求不同，这种变化可能是物种对其特定栖息地的适应策略[15］．此外，在广泛的地理范围内出现的物种可能在其休眠释放的特定要求中表现出局部适应。因此，寒冷分层的环境要求预计在分布在当地环境范围内的物种种群之间是不同的。

Halenia elliptica龙胆科(D. Don)属亚高山草本二年生植物，刚成熟的种子具有生理休眠[24］．主要分布于中国青藏高原亚高山地区(海拔2200-4400 m)的草甸、林缘和灌丛草甸[25］．鉴于该物种生长在广泛的海拔范围内，不同海拔的种子打破休眠的要求可能不同。

为了验证我们的预测，我们收集了h . elliptica(i)低温分层过程中温度、土壤含水量及其相互作用是否影响种子休眠释放h . elliptica种子?如果是这样的话，不同人群之间有什么不同吗?(ii)低温分层过程中的温度、持续时间及其相互作用是否影响种子休眠释放?

温度和光照对新鲜种子萌发的影响

所有6个居群新鲜种子的萌发情况h . elliptica是非常低(< 3%)或在不同的测试温度下，无论是在光照下还是在黑暗中(表S1)．此外，除a居群外，所有居群在10/20℃下的发芽率均略高于5/15℃和15/25℃(表S)1)．

冷分层过程中温度和土壤含水量对种子休眠的影响

除温度×土壤含水量×种群外，温度、土壤含水量、种群及其相互作用对种子萌发均有显著影响h . elliptica（P< 0.001)(表1)．6个居群的发芽率随分层温度的升高而显著降低，与土壤含水量无关(P< 0.05)。例如，在土壤含水量高于4%的条件下，2°C下分层，6个居群种子发芽率均高于90%，而在相同土壤含水量条件下，8°C下分层2个月，种子发芽率均低于6%(图2)。1)．此外,人群从低海拔(人口D, E, F)可能更敏感分层温度比从高海拔地区(种群A和C)。例如,土壤含水量16%,增加分层温度从2°C到5°C导致降低发芽从99人口的73%和98年70%人口C .相比之下,发芽从93年开始下降,95年和99%,44岁的42个人口和56% D, E, F,分别在土壤含水量16%的条件下，土壤温度从2°C上升到5°C。1)．

在土壤含水量为0%的所有分层温度下，种子萌发率均≤3%，证明种子在土壤含水量高于4%时开始萌发。土壤含水量对种子萌发的影响随温度和种群的不同而不同。除C居群外，其余6个居群的发芽率均随2℃和5℃土壤含水量的增加而增加。土壤含水量大于4%时，种子发芽率无显著差异(P> 0.05)。在5℃下分层2个月，C居群种子萌发率随土壤含水量的增加先升高后降低。

冷分层温度和时间对种子休眠的影响

温度、持续时间及其交互作用对种子萌发有显著影响h . elliptica（P< 0.001)(表2)．在冷分层过程中，发芽率随温度升高而降低，与时间长短无关。在所有温度下，种子萌发率均随时间的增加而增加，但在相同温度下，当时间大于6周时，种子发芽率无显著差异(P> 0.05)(图2)．此外，本实验将冷分层温度设置为1°C、3°C和5°C，因为在8°C下分层后种子没有萌发或很少萌发(图2)。1)．之所以选择16%的土壤含水量，是因为当土壤含水量高于16%时，A居群的种子休眠释放不受土壤含水量的影响。1)．

本文首次报道了温度、土壤含水量和冷分层时间对不同居群种子休眠释放的影响h . elliptica．研究表明，不同居群对种子休眠释放的温度和土壤含水量要求不同。

冷分层过程中温度和土壤含水量对种子休眠的影响

种子休眠h . elliptica冷分层可释放，但效果随分层温度和土壤含水量的不同而不同。低温更能有效地释放植物的休眠h . elliptica种子比温度相对较高，自萌发h . elliptica从2℃到8℃，层析温度升高，层析温度降低。这一结果与上一项研究的结果一致苔属植物remota［7]随着分层温度从5℃增加到15℃，种子萌发受到抑制。然而，种子发芽了冷杉属nordmanniana随着分层温度从4℃到9℃的升高，均显著增加[16］．

寒冷分层过程中对温度需求的变化可能是由于物种和栖息地的差异[1，26］．在本研究区(> 2200 m a.s.l)，苗木h . elliptica主要出现在5月份(DL Chen, pers。(图S .)，出苗前日平均温度一般低于5℃，持续5 - 6个月1)．因此，当地的温度低到足以释放种子休眠。

此外，对种子休眠释放温度的要求h . elliptica不同人群差异显著(P< 0.001)。低海拔种群的种子休眠释放对温度升高(2℃~ 5℃)比高海拔种群的种子更敏感。这些结果与Kirdar和Ertekin(2008)的一项研究一致，在4°C和9°C连续23天的分层处理中，四个种子批释放了种子休眠答:nordmanniana低海拔(Ortaköy种子场，1600 m)种子对分层温度升高的敏感性高于高海拔(meydancakk种子场，1950 m;Yayla和Veliköy种子批次，1800米)。因此，来自低海拔而非高海拔地区的种群可能表现出由于全球变暖导致的温度升高而导致的休眠释放抑制。

结果表明，土壤含水量对6个居群种子低温分层过程中种子休眠释放起着关键作用。与以往的研究一致[13，14，15]时，土壤含水量必须达到种子在冷分层过程中休眠释放的临界水平。在我们的研究中，在2°C和5°C的冷分层温度下，当土壤含水量为4%或以上时，所有6个居群的种子都开始萌发。这些结果表明，种子是否能够释放休眠主要取决于田间的温度和水分条件。在我们的研究区，青藏高原东部海拔2920 m和3530 m处，采种后的次年10 - 4月，土壤表层到地下7 cm的平均土壤含水量分别为19%和25%(图S .)2)．因此，如果种子扩散后埋在土壤下面，土壤含水量可能不是休眠释放的限制因素。然而，如果种子落在土壤含水量较低的凋落物层或裸露的地面上，则可能无法释放种子休眠[27，28，29］．而且，大多数的种子h . elliptica成熟时被萼片包裹，形成一个空中种子库，这也可能影响种子休眠释放。

另外值得注意的是，土壤含水量对种子休眠释放的要求h . elliptica不同人群差异显著(P< 0.001)。低海拔种群似乎比高海拔种群需要更高的土壤含水量来释放种子休眠。冷分层时(2℃)，高海拔群体C土壤含水量为8%，低海拔群体D、E和F土壤含水量分别为20、16和16%。造成这种差异的一个可能原因是，低海拔群体在春季出苗时比高海拔群体更容易遭受干旱，而低海拔群体对土壤含水量释放种子休眠的高需求可能有利于幼苗出苗后的存活。此外，高海拔种群对休眠释放的土壤含水量要求相对较低，即使在相对干燥的冬季也能确保种子休眠释放，从而使幼苗在春季早出，并拥有整个温暖的生长季节[1，30.］．

低温分层过程中，温度和土壤含水量对种子萌发有显著的交互作用(P< 0.001)。例如，在5℃时达到最高种子萌发对土壤含水量的要求要高于2℃时。一种可能的解释是，某些涉及种子休眠释放的生化反应需要一定的温度和土壤含水量，而这两个因素在种子休眠释放过程中可能存在平衡或关系[31］．然而，这种相互作用对种子休眠释放的影响的原因还有待进一步研究。

冷分层温度和时间对种子休眠的影响

气候变化的另一个后果是低温和积雪的持续时间缩短，这可能会影响冬眠的中断[20.，32，33］．种子萌发随分层时间的延长而增加、减少或不受影响，这取决于物种[9，34，35，36，37］．在本研究中，在所有分层温度下，种子萌发率均随分层时间的增加而先增加后不变化，说明一定的最低低温暴露时间是种子休眠释放的必要条件h . elliptica．因此，缩短冬季长度可能无法满足种子休眠释放的热量要求。然而，这并不是事实h . elliptica由于研究区11月至4月的日平均气温均低于5℃，且这段时间远远超过休眠释放所需的时间。因此，我们的研究结果表明，缩短冬季可能不会影响种子休眠释放h . elliptica．这一结论与以往的研究一致，即冬季时间的缩短不太可能对种子萌发或早苗生长产生直接的负面影响Aciphyllya glacialis,产于澳大利亚的高山物种[35］．

我们的研究清楚地表明，温度、土壤含水量和冷分层时间在调节种子休眠释放中起着关键作用。不同居群对种子休眠释放的温度和土壤含水量要求不同。低海拔居群的种子休眠释放对分层温度升高和土壤含水量降低的反应可能比高海拔居群更敏感。这些结果表明，气候变化引起的温度和土壤水分变化会影响种子休眠释放，进而影响幼苗出苗和建立。总体而言，结合种子休眠释放(包括温度、土壤含水量和冷分层持续时间)数据有利于预测气候变化情景下植物的再生、迁移和共存[20.］．

种子集合

从6个居群中收集新鲜成熟的种子h . elliptica2016年9月生长在青藏高原东部边缘(本研究使用的植物材料由兰州大学生命科学学院副教授刘琨鉴定。一个代金券样本h . elliptica(沉积编号PE-02000818)可在中国虚拟植物标本馆查阅http://www.cvh.ac.cn/spm/PE/02000818．种子是从田里收集的，收集它们不需要许可)。

在六个收集点分别从数百株单株植物中收集了带有成熟种子的果粒(表2)3.)并带到实验室，在那里将种子与其他植物材料分离。种子在室温下干燥1周(RH 20-35%， 18-25℃)，然后在4℃保存至实验使用。在实验开始前，通过称重每个群体的8个重复的100粒种子来确定千粒重。

温度和光照对新鲜种子萌发的影响

为评价温度和光照对成熟种子萌发的影响，将各居群新鲜采集的种子(以下简称新鲜种子)分别在5/15°C、10/20°C和15/25°C光照下(每日光照周期为12/12 h，白色荧光管，光子辐照度为60 μmol m)进行试验⁻²年代⁻¹， 400-700 nm)或持续黑暗。为了持续黑暗，培养皿上覆盖了两层铝箔。每个处理中，将3个重复的50颗种子放在直径为10厘米的培养皿中，培养皿上有2张滤纸(中国杭州双泉)，滤纸上浸有7毫升蒸馏水。根据需要每天添加蒸馏水以保持滤纸的湿润。每天监测在光照下孵育的种子的发芽情况，至少21天，直到连续3天没有萌发，当胚根可见(≥2 mm)时视为种子发芽。在黑暗中培养的种子在28天后才进行发芽检查。本实验于2016年10月进行。

冷分层过程中温度和土壤含水量对种子休眠的影响

将6个居群的种子与100 g水分含量为0、4、8、12、16、20和24%(田间容量为26%)的土壤混合在密封的塑料容器中，在2°C、5°C和8°C低温分层2个月。由于种子数量有限，D居群只能在2°C和5°C进行冷分层。每个处理设3个重复，每重复50粒。土壤田间容量和不同水平土壤含水量的确定基于Hu et al.(2018)的方法。

冷分层2个月后，用0.5 mm孔径的筛子将种子从土壤中除去，并在10/20℃光照下(12 h/12 h)在潮湿的滤纸上进行萌发试验，如上所述。种子仅在光照下(12小时/12小时)进行发芽测试，原因有二。首先，根据我们的观察，种子h . elliptica它们成熟时被萼片包裹，形成了一个空中种子库，大部分从母体植株上脱落的种子即使在冬天也会留在表面。其次，在光照(12/12 h)和连续黑暗条件下，低温分层种子的发芽率无显著差异。

冷分层温度和时间对种子休眠的影响

将一个群体(A群体)的种子与100g水分含量为16%的种子混合在密封的塑料容器中，在1°C、3°C和5°C下保存2、4、6、8、12、16周。之所以只使用A居群进行实验，是因为其他5个居群的种子数量有限。每经过一段时间的冷分层后，将种子从土壤中筛出，并在10/20°C的光照下进行发芽测试，如上所述。每个处理设3个重复，每重复50粒。

数据分析

采用拟合广义线性混合模型(GLMM)检验了培养温度、光照、种群及其相互作用、温度、土壤含水量、种群及其相互作用、温度、分层时间及其相互作用对种子萌发的影响。每个模型均以温度、土壤含水量和种群或温度和分层时间为固定效应，重复为随机效应。种子萌发的概率范围为0到1，因此我们使用logit链接函数对模型进行了二项估计。当发现显著差异时，使用Tukey检验来比较均值。所有数据均使用GenStat 18.0版本(VSN国际有限公司，Hemel Hempstead，英国)进行处理。

在本研究过程中产生或分析的所有数据均包含在本文(及其补充信息文件，表)中。S2)．

我们非常感谢Carol Baskin教授对这篇手稿的严格审查和建设性的建议，也非常感谢刘琨副教授在这项研究中鉴定的植物材料。感谢兰州大学高寒草甸与湿地生态系统研究站对本研究的支持。

国家重点研发计划项目(2019YFC0507702)和国家自然科学基金项目(31672473,31702164)资助。所有这些资金都在研究的设计、收集、分析和撰写手稿中发挥作用。

从属关系

1. 农业农村部草地畜牧业创新重点实验室;草地农业生态系统国家重点实验室;教育部草地产业工程研究中心;兰州大学畜牧农业科技学院，甘肃兰州730000

   陈大丽，罗新平，袁震，孟白洁，胡晓文

贡献

DC和XH构思了这个主题。DC、XL和ZY进行了实验。DC和MB对所有统计数据进行分析。DC和XH撰写了手稿。作者已经阅读并批准了手稿。

作者的信息

不适用。

相应的作者

对应到胡晓文．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

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