一个2 -GydF4y2Ba半胱氨酸的酶类GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba甘蒙柽柳hispidaGydF4y2Ba提高植物的耐盐性GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

过氧化物还原蛋白(Prxs)是一大类抗氧化酶，通过分解活性氧(ROS)来应对生物和非生物胁迫。在本研究中，研究了植物的耐受性GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因被进一步分析。为进一步研究其耐盐分子机制奠定了基础GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba通过转基因植物改善耐盐性。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在本研究中，研究了植物的耐受性GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因被进一步分析。结果表明，转基因烟草在盐胁迫下的种子发芽率、根长和鲜重均高于野生烟草。同时，对转基因烟草的生理指标进行了分析GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba显示,GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba提高抗氧化酶活性，增强ROS去除能力，减少盐胁迫下细胞损伤。此外,GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba改善了四种抗氧化基因的表达水平（GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

总的来说，这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba增强了转基因植物的耐盐性。这些研究结果为进一步研究黄连耐盐分子机制奠定了基础GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba通过转基因植物改善耐盐性。GydF4y2Ba

非生物胁迫，如干旱、盐度和极端温度等，对植物的生长和产量产生负面影响，造成巨大的经济损失。在有害的环境胁迫中，盐胁迫尤其会导致植物生长减缓和栽培植物产量下降[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．在长期的进化过程中，一些植物，如GydF4y2Ba滨藜属canescensGydF4y2Ba[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba摘要盐穗木GydF4y2Ba[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]，GydF4y2Ba碱蓬莎莎GydF4y2Ba[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Ba蓬子有腕门GydF4y2Ba[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，它们逐渐适应了盐胁迫环境，并能在干燥和盐碱地生长。GydF4y2Ba

甘蒙柽柳hispidaGydF4y2Ba是一种典型的木本盐生植物，可在含盐量为1%的盐碱土上形成天然森林。此外，它还能承受干旱胁迫，是克隆干旱耐盐相关基因和研究木本盐生植物耐盐机制的理想材料[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．已经进行了许多以前的研究以检查盐和耐旱性的机制以及应力抗性基因的功能GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba．例如,GydF4y2BaTheIF1AGydF4y2Ba那GydF4y2BaThDREBGydF4y2Ba那GydF4y2BaThZFP1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba和GydF4y2BaThPOD3GydF4y2Ba在GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba通过调节超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性来增加盐和耐旱性以降低反应性氧（ROS）积累[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．以上结果均表明，清除活性氧在大鼠的反应中起重要作用GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba盐胁迫。GydF4y2Ba

圆荚体GydF4y2Ba那GydF4y2Ba草皮GydF4y2Ba那GydF4y2Ba猫GydF4y2Ba（GydF4y2Ba过氧化氢酶GydF4y2Ba），GydF4y2BaGPX.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba谷胱甘肽过氧化物酶GydF4y2Ba),GydF4y2Ba销售税GydF4y2Ba（GydF4y2Ba谷胱甘肽S-transferasesGydF4y2Ba)是清除ros的重要基因。Gao等人[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba)发现,GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba通过增加ABA和甲基紫精(MV)的活性和表达水平，提高了对ABA和甲基紫精胁迫的耐受性GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba,GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba活性氧清除能力。这GydF4y2BaNtSODGydF4y2Ba那GydF4y2BaNtAPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaNTCAT.GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtPOXGydF4y2Ba,GydF4y2BaNtGSTGydF4y2Ba基因在植物逆境中发挥着消除活性氧和提高抗逆性的作用。幸运的是,过表达的小麦GydF4y2BaTawrky44GydF4y2Ba被发现可激活上述五个基因[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．在GydF4y2Ba桦木属platyphyllaGydF4y2Ba那GydF4y2BaBplMYB46GydF4y2Ba可以通过影响基因的表达来提高ros清除能力和脯氨酸含量，从而提高耐盐性和渗透性GydF4y2Ba圆荚体GydF4y2Ba那GydF4y2Ba草皮GydF4y2Ba和GydF4y2BaP5CSGydF4y2Ba(Δ1-pyrroline-5-carboxylate合成酶)[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．Zhang等[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba结果表明，在NaCl胁迫下，ALA提高了番茄中ros -清除抗氧化酶的活性，提高了番茄中ros -清除抗氧化酶的表达GydF4y2Ba草皮GydF4y2Ba那GydF4y2BaAPX型GydF4y2Ba和GydF4y2Ba圆荚体GydF4y2Ba编码这些酶的基因。GydF4y2Ba

过氧化物酶(Prxs)是广泛存在于动物、植物和微生物中的一种非血红过氧化物酶。这些过氧化物酶的生物学功能是通过过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba），烷基氢过氧化物，和过氧化物[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．在植物中，根据保守的Cys残基的数量和位置，Prxs可分为4类:1CysPrx、2CysPrx、type-II Prx和PrxQ。1CysPrxs只有一个保守的Cys残基，而PrxQ包含两个具有催化活性的半胱氨酸残基，并通过分子内二硫化物键连接[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．2-Cys Prx和type-II Prx都有两个保守的Cys残基，但它们之间的区别在于2-Cys Prx是一种基质蛋白[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，PRX-II有各种同种型[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

Prxs在植物生长发育和抗逆性过程中发挥着特殊的作用。例如，Kim等人[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba)发现,GydF4y2Ba2 cysprxsGydF4y2Ba可以消除HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过参与一个替代的水水循环和保护光合结构免受氧化损伤的环境限制。豌豆叶绿体GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba和线粒体GydF4y2Ba插件可以IIFGydF4y2Ba影响光合结构的结构和过氧化物酶活性[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]．Kim等人[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba)发现,GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba从GydF4y2Ba栽培稻GydF4y2Ba能通过改善细胞氧化还原稳态增加对ros诱导的氧化应激的耐受性。过度表达GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba高羊茅增强抗氧化应激和抗氧化活性[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．Prx还能解毒ROS并调节信号反应[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．有趣的是，没有直接证据表明GydF4y2BaPRXS.GydF4y2Ba基因的GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba参与活性氧清除和非生物应激反应。在之前的研究中，Gao等人[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]克隆四个GydF4y2BaPRXS.GydF4y2Ba基因GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba．实时定量PCR（QRT-PCR）分析表明这些基因可以应对几种非生物应激和ABA应用。然而，GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在研究的应力条件下表现出独特的表达模式。在本研究中GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba进一步证明了该基因在盐胁迫下的分子机制。这也为提高耐盐性的分子育种提供了潜在的应用前景。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba提高转基因烟草的耐盐性GydF4y2Ba

研究生物学作用GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在盐胁迫反应中，获得了14个抗性品系。qRT-PCR结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因在所有14个株系中都过表达GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：图S1）。两个代表性的T.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba随机选择纯合转基因系（第7行和第11行）以进行进一步的耐盐性分析。在暴露于正常和125mM NaCl胁迫条件下比较转基因和野生型（WT）烟草的萌发和生长。结果表明，在正常条件下，转基因和WT植物之间的发芽率和幼苗生长没有明显的差异（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa - c)。而在盐胁迫下，转基因植株的发芽率和幼苗生长均显著优于野生型植株。在NaCl胁迫下，转基因株系的发芽率分别为89.7%(7号线)和84.5%(11号线)，而WT植株的发芽率仅为53.5%(图7)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bad)。在NaCl处理下，转基因株系的叶绿素含量分别是野生型植株的1.54倍和1.68倍(图4)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bae)。在NaCl处理下，转基因株系的平均鲜重分别是WT植株的2.15倍和2.10倍(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bag)。NaCl处理下转基因株系的平均根长分别是WT植株的1.99倍和1.87倍(图3)。GydF4y2Ba1GydF4y2BaH）。显然盐胁迫显着抑制转基因和WT植物的生长。然而，转基因植物的生长显着优于WT植物。这些结果表明表达了GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在烟草中可显著提高植株的耐盐性。GydF4y2Ba

这GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因显著提高活性氧清除能力，减少转基因烟草细胞损伤GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和OGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba通过3,3'-二氨基苯并（DAB）和硝基蓝四唑（NBT）染色来检查转基因系和WT植物中的浓度。结果表明，在正常情况下，三条线产生的RO没有显着变化。相比之下，在盐胁迫下，WT植物表现出更深的染色，暗示WT在胁迫条件下的转基因系中的更大的ROS积累（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa). 2,7-二氯荧光素二乙酸酯(HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba分别在盐胁迫1 h和2 h后对转基因株系和WT株系叶片进行DCF-DA)染色。正常情况下，完整保卫细胞的ROS水平无明显差异。然而，在盐胁迫后，与转基因植株相比，WT植株保卫细胞中ROS的积累增加(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。转基因系表现出低于WT植物的ROS含量。这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba导致盐胁迫下植物细胞ROS积累显著减少。GydF4y2Ba

在盐胁迫下测定了转基因株系和WT株系的SOD和POD活性。结果表明，正常条件下，两个独立的转基因株系与野生型植株无显著差异。在NaCl胁迫下，转基因植株的SOD和POD活性均高于野生型植株。其中，转基因植株的SOD活性分别是WT的1.17-和1.10倍(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba与野生型相比，转基因株系的POD活性分别提高了1.40-和1.46倍(图4)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

同样，基于埃文斯蓝染色，丙二醛（MDA）含量和电解质泄漏（EL）速率在正常条件下，转基因和WT植物线之间没有明显差异。在盐胁迫条件下，观察到更深的Evans蓝染色，MDA含量和电解质泄漏显着增加。然而，埃文斯蓝染色较弱，并且在转基因中，MDA含量和EL速率低于WT植物系。在盐胁迫下，转基因系的EL分别为WT植物的71.85和60％（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bac).转基因株系的MDA含量分别为WT株系的81.56和73.76%(图3)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bad）。GydF4y2Ba

综上所述，这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba通过增加活性氧清除和防止细胞损伤来提高烟草的耐盐性，以维持植株更好的生长。与野生型相比，转基因植株的ROS含量更低，损伤程度也更小GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2BaNaCl处理直接影响活性氧清除和细胞保护。GydF4y2Ba

的短暂过度表达的使用GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba进一步评价转基因烟草的结果GydF4y2Ba

确认烟草异源表达的结果，GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba瞬时转移到GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba．QRT-PCR分析表明表达了GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba超表达GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba是对照的12.38倍，说明GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba成功获得（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Baa).然后对两组间的生化染色及相关生理指标进行分析比较GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba和CK植物。DAB与NBT染色结果无显著性差异GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba盐胁迫之前的CK植物。然而，CK植物显示比染色更暗GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba植物在盐胁迫后2小时的着色比1小时更深(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。GydF4y2Ba

SOD和POD活性也无显著差异GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba和正常条件下的CK植株。在盐胁迫下，CK植株SOD活性为对照植株的80.69%GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bac)， POD活性为对照的70.51%GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bad).正常情况下，两组间MDA含量及电解质渗漏量无显著差异GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba和CK植物。然而，GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba叶片MDA含量和电解质渗漏量均显著低于对照，叶片MDA含量和电解质渗漏量显著低于对照GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba分别为对照的74.85和67.70%。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba总的来说，这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba赋予转基因烟草耐盐性GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba植物。GydF4y2Ba

另外，四种抗氧化基因的表达水平（GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba)瞬时转染GydF4y2Bath2cysprx t. hispida.GydF4y2Ba采用qRT-PCR分析。结果表明，这些基因具有相似的表达谱GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在短暂的转染GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2BaNaCl胁迫后，这些基因表达均上调。这些基因的表达量分别是对照植株的1.22、1.55、1.50和1.86倍。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba超表达的影响GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba基因的表达。因此，这些结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba改变其他应激相关基因的表达，表明耐盐胁迫调节涉及一个复杂的网络。GydF4y2Ba

在逆境中，植物通常积累ROS，这导致蛋白质合成和稳定性产生细胞大分子和膜脂质以及产生氧化应激的产生[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．这GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba在清除ROS和调节信号转导中发挥重要作用，作为分子伴侣和DNA损伤反应。在以往的研究中，2CysPrx作为HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．菜籽2cysprx激活叶绿体果糖-1,6-双磷酸酶（FBP酶）并参与Calvin循环[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．Kim等人[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba)表明,GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba2CysPrx具有保护柠檬酸合酶(CS)不受热诱导聚集的作用，并具有分子伴侣的功能。班纳吉等人[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba发现过度的表达GydF4y2Ba藻青菌项圈藻2 cysprxGydF4y2Ba能降低非生物胁迫下细胞内ROS水平，减少细胞损伤。过度表达GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba能有效消除细胞内ROS，提高机体对MV胁迫的耐受性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．然而，在预防DNA损伤的过程中，一些生物使用ROS途径，并且一些植物通过非ROS途径保护细胞免受氧化损伤。例如，2CYSPRX诱导的烟草基因沉默在很大程度上影响抗坏血酸的再生，从而影响了脱落酸的生物合成（ABA）[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．上面的研究表明，2个CYSPRX具有不同的功能，大部分是糖原植物的研究，但在木质烟道中探索了很少。因此，我们需要探索是否GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba通过活性氧途径防止木本盐生植物的细胞损伤GydF4y2BaT.hispidaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

Vidigal等[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba)表明,GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba是HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba清除和调控ROS基因下游的ABA信号。许多研究表明ABA具有重要的生物学功能，是非生物胁迫下的重要信号分子[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．参与ABA信号通路的基因的表达可以增加植物非生物耐受性[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．在本研究中，与野生型植物相比，转基因植物GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba在盐胁迫下，烟草的发芽率、根长和叶绿素含量均有所增加。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.过度表达GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba提高了SOD和POD活性，降低了ROS的积累。的表达式级别GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba转基因基因明显上调GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba在盐胁迫下，这表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因通过提高抗氧化酶活性和增强活性氧清除能力提高耐盐性，导致活性氧积累减少。GydF4y2Ba

我们还发现CK和转基因中的SOD和POD的活动和表达水平GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba在正常情况下不一致。但在NaCl胁迫下，其活性与表达量的总体变化趋势是一致的。结果表明了研究的结果GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba基因可能是响应NaCl胁迫的SOD和POD家族基因中的关键有效基因。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

目前尚不清楚是否GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因通过激活ABA信号通路基因的表达来提高植物对ROS的清除能力。因此，在今后的研究中，我们将进一步分析其耐盐机制GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba基因GydF4y2BaT.hispidaGydF4y2Ba，同时比较植物之间的非生物胁迫的差异GydF4y2Ba2 cysprxGydF4y2Ba在烟草和GydF4y2BaT.hispidaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

PRXS.GydF4y2Ba在植物的生长发育以及对逆境的反应中具有重要的地位。然而，并没有直接的证据证明GydF4y2BaPRXS.GydF4y2Ba基因的GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba参与ROS扫除和非生物应激反应。在本研究中，一个GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba是独立于GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba转基因烟草和GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba在盐胁迫下表现出形态学，生理和生化性状的优点。另外，四种抗氧化基因的表达水平（GydF4y2BaThGSTZ1GydF4y2Ba那GydF4y2BaThGPXGydF4y2Ba那GydF4y2BaThSODGydF4y2Ba和GydF4y2BaThPODGydF4y2Ba)明显高于过表达GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba的GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba而不是在对照组。总的来说，结果表明GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba通过增加抗氧化酶的表达和活性提高耐盐性，提高ROS清除能力。未来的研究应该评估是否GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba参与ABA信号通路。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

烟草种子(龙江911)取自黑龙江省烟草科学研究所[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．并保存在我们的实验室。储存在4℃的烟草3-5天，用70％（W：V）乙醇灭菌1分钟，然后用3％次氯酸钠5分钟，用无菌水冲洗八次，并播种到含有半的板上 -强度Murashige和Skoog（1/2毫秒）中等。然后将它们放入机柜中，在22°C时具有受控环境（16小时光：8小时暗）。一周后，将幼苗移植到含有珍珠岩和土壤混合物的盆中（1：3 V.GydF4y2Ba/GydF4y2Bav)，并在24°C、相对湿度70%的温室(光照14小时:黑暗10小时)中生长。GydF4y2Ba

t . hispidaGydF4y2Ba在哈尔滨(中国)的温室内种植了吐鲁番沙漠植物园(新疆293)的种子。从这些植物中收获繁殖所需的种子GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba植物，种植于1/2 ms培养基中，并在24℃下在温室（14小时光：10小时暗），具有70％相对湿度和250μE的光子通量密度GydF4y2Ba^{−2GydF4y2Ba}年代GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}．GydF4y2Ba

转基因植物的产生GydF4y2Ba

的子GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba被扩增并克隆到Prokii载体中（称为GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba）.引物见表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．这GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba被引入了GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2BaEHA105，通过农杆菌介导的叶盘转化法进一步获得转基因烟草[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．在t中产生了十五条线GydF4y2Ba_0.GydF4y2Ba一代。两个t.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba随机选取纯合子转基因株系(7号和11号)进行进一步分析。GydF4y2Ba

同时，GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba也瞬间过度表达GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba．具体来说，它暂时变成了一个月大GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba幼苗与GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba过度表达GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba和空pROKII质粒(作为对照，CK)根据Zheng等[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba经过一些修改GydF4y2Ba．GydF4y2Ba特别是单一的殖民地GydF4y2Ba农GydF4y2Ba菌株EHA105窝藏GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba或空pROKII培养至ODGydF4y2Ba_600GydF4y2Ba= 0.8，离心收集细胞。转化体[1/ 2ms + 3% (w/v)蔗糖+ 150 μM乙酰丁香酮+ 0.01% (w/v) Tween 20]调整至外径GydF4y2Ba_600GydF4y2Ba= 0.8。GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba浸于转化液中，25°C孵育4h。然后用2%蔗糖快速冲洗1次，冲洗1 min后，垂直种植在1/ 2ms固体培养基上，培养12、24、36或48 h。采用CTAB法从每个样品中分离总RNA [GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]， 1 mg RNA用PrimeScript™RT试剂试剂盒(TaKaRa，中国)进行逆转录。将得到的cDNA稀释至10倍，作为qRT-PCR分析的模板。Real-time RT-PCR采用Bio-Rad (MJ) Opticon™进行GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba以System (Bio-Rad, Hercules, USA) Actin (FJ618517)、α-微管蛋白(FJ618518)和β-微管蛋白(FJ618519)作为内对照，使每个反应中总RNA的数量归一化。所用引物如表所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．PCR条件为94℃30 s, 94℃12 s, 58℃30 s, 72℃40 s, 80℃1 s，共45个循环。在每次运行结束时，生成每个样品的熔化曲线，以评估放大产品的纯度。确定…的表达GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba和一些抗氧化基因。引物如表所示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．qRT-PCR的反应体系和步骤参照Gao等[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．2GydF4y2Ba^{-ΔΔctGydF4y2Ba}方法用于计算相对基因表达[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

应力耐受性分析GydF4y2Ba

T.GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba一代的种子GydF4y2Bath2cysprx.GydF4y2Ba转基因烟草表面消毒后，分别在1/2 MS琼脂培养基或1/2 MS加125 mM NaCl的培养基上播种。在1/ 2ms上播种3日龄幼苗，将其转入1/ 2ms或1/ 2ms加125 mM NaCl处理2周，比较转基因株系和野生株系的鲜重和根长。GydF4y2Ba

生理分析GydF4y2Ba

在1/2 MS上播种7日龄烟草幼苗，将其转入珍珠岩和土壤(1:3 v/v)的混合物中。6周后，用200 mM NaCl溶液浇灌烟草幼苗根系。同时，用水浇灌幼苗作为对照。7 d后，分别收获胁迫烟叶和对照烟叶。GydF4y2Ba

一个月的瞬时转基因幼苗GydF4y2Bat . hispidaGydF4y2Ba苗(GydF4y2Ba35 s:: Th2cysGydF4y2Ba收获暴露于150mM NaCl的CK）被收获12小时，并分别测量生理指数。根据Wang等人测量SOD，POD活性和MDA含量。[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．根据本amor等人测量EL。[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．叶绿素含量按Lichtenthaler方法测定[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

检测ROS和细胞死亡GydF4y2Ba

分别在NaCl处理0、1、2 h后采集转基因和WT/对照幼叶，立即进行组织化学染色分析。为了检测超氧化物积累、过氧化氢积累和细胞死亡，按照Zhang等详细描述的方法，对叶片进行DAB、NBT和Evans blue染色。[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba和Kim等人[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]．用HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA (Sigma-Aldrich) [GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

每个实验至少重复三次。误差栏代表标准偏差。使用学生的T检验比较差异。GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05被认为是显著的，用*表示。GydF4y2Ba

本研究过程中产生或分析的所有数据和资料均包含在本文中，或应相应作者的合理要求提供。GydF4y2Ba

• 2020年8月19日GydF4y2Ba

  这篇文章的修订本已经发表，可以通过原始文章访问。GydF4y2Ba

草皮：GydF4y2Ba

超氧化物歧化酶GydF4y2Ba

圆荚体:GydF4y2Ba

过氧化物酶GydF4y2Ba

ROS:GydF4y2Ba

活性氧GydF4y2Ba

猫GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

过氧化氢酶GydF4y2Ba

GPX.GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

谷胱甘肽过氧化物酶GydF4y2Ba

销售税GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

谷胱甘肽S-transferasesGydF4y2Ba

MV:GydF4y2Ba

甲基紫罗碱GydF4y2Ba

P5CSGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶GydF4y2Ba

插件可以:GydF4y2Ba

抗氧化蛋白GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

过氧化氢GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应GydF4y2Ba

WT:GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

轻拍:GydF4y2Ba

3, 3 ' -DiaminobenzidineGydF4y2Ba

电视台:GydF4y2Ba

硝基蓝色四唑唑唑GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA:GydF4y2Ba

2,7-二氯荧光蛋白GydF4y2Ba

MDA:GydF4y2Ba

丙二醛GydF4y2Ba

el：GydF4y2Ba

电解液泄漏GydF4y2Ba

FBPase:GydF4y2Ba

的特性,6-bisphosphataseGydF4y2Ba

CS:GydF4y2Ba

柠檬酸盐合成酶GydF4y2Ba

阿坝:GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

1/2 ms：GydF4y2Ba

一半力量的murashige和skoogGydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

这项工作得到了中国天然科学基金（31670679），全省黑龙江优秀青年科学基金（JC2017004）和黑龙江巨大创新队计划（树遗传学和繁殖创新团队）。融资机构在研究和收集，分析和解释方面没有在数据和撰写手稿中的设计中发挥作用。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 2 .东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150040GydF4y2Ba

   王媛媛，刘中原，王培龙，姜博，雷晓金，吴静，董文芳，高才秋GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

CG设计研究并修改手稿;YW、ZL、PW和BJ进行了研究;YW, XL, JW, WD主要进行数据分析和撰写论文，所有作者阅读并批准稿件。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba蔡秋高GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约归因于4.0国际许可证，这允许在任何中或格式中使用，共享，适应，分发和复制，只要您向原始作者和来源提供适当的信贷，提供了一个链接到Creative Commons许可证，并指出是否进行了更改。除非信用额度另有说明，否则本文中的图像或其他第三方材料包含在文章的创造性公共许可证中，除非信用额度另有说明。如果物品不包含在物品的创造性的公共许可证中，法定规定不允许您的预期用途或超过允许使用，您需要直接从版权所有者获得许可。要查看本许可证的副本，请访问GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）适用于本文中提供的数据，除非另有用入数据的信用额度。GydF4y2Ba

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