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冷胁迫下萌发种子的转录组分析及耐冷基因的特性LTG5米饭中

抽象的

背景

低温是限制水稻产量和地理分布的因素。野生稻(oryza rufipogon.Griff.)是一种重要的水稻种质资源,对包括冷胁迫在内的多种非生物胁迫具有优异的耐性,但对其抗寒机理知之甚少。

结果

本研究阐明了耐盐分耐受低温的分子遗传机制。相对分析了在冷应激下发芽阶段的两种水稻基因型(冷敏Ce253和冷耐寒Y12-4)的综合转录组谱。总共获得了42.44-68.71百万读数,导致基因型253和Y12-4中的29,128和30,131个基因的对准。在冷敏和耐冷的基因型中分析许多常见和差异表达的基因(DEGS)。结果表明,在冷应激下的四个阶段的冷敏基因型中表现出更加上调的耐寒基因型。基于细胞过程,代谢过程,响应刺激,膜部和催化活性的基因本体富集分析表明了比在冷敏基因型中的耐寒基因型中的下调的基因更加上调的基因。在七个随机选择的末端进行定量实时聚合酶链反应,以确认RNA测序(RNA-SEQ)数据。这些基因显示出与RNA-SEQ方法相对应的类似表达模式。加权基因共表达网络分析(WGCNA)显示Y12-4在冷应激下显示出比253更大的阳性基因。我们还探讨了耐寒性基因LTG5(低温生长5)编码udp -葡萄糖基转移酶。过度表达LTG5基因赋予籼稻耐冷性。

结论

与野生稻的冷应激相关的基因资源对于改善作物的耐寒性可能是有价值的。

背景

水稻是世界粮食生产的重要主食作物。世界上近一半的人口食用稻米[1].由于人口的快速增长和耕地的减少,提高水稻产量已成为事关全球经济和粮食安全的重要问题。来自热带或亚热带地区的水稻对低温(LT)很敏感[23.].LT是全球水稻生产中的主要限制因素[4.].低温可引起黄化、坏死和萌发时生长迟缓。低温胁迫诱导活性氧(ROS)和丙二醛水平升高,电解质渗漏,脯氨酸含量变化,膜变硬,蛋白质复合物不稳定,组织褐变和光合作用受损,导致萌发和活力降低,幼苗出苗延迟,初期增长滞后,百分比低[5.6.].在中国,年亏损3-5百万(M)公吨是由于LTS [7.].野生的相对oryza rufipogon.是最接近栽培的米饭。O. Rufipogon.具有广泛的地理分布,具有对生物和非生物胁迫的各种特征,以适应不同的生态和农艺条件[8.].因此,野生稻可以提供丰富的遗传多样性资源,为水稻遗传改良提供宝贵的基因库。耐寒野生稻可为培育耐寒水稻品种提供良好的遗传资源。

RNA测序技术和数字基因表达是通过分析表达谱,单核苷酸多态性(SNP)鉴定稻耐寒基因非生物胁迫下的高效率的方法,以及选择性剪接[9.10.11.].转录组资源有几种应用,例如核桃的功能基因组学,建立玉米的最佳基因共存网络,在小麦中研究开花和避免避免途径,并分析转录组变化Pinus Koraiensis.在寒冷的压力下[12.13.14.15.].对两种籼稻基因型(耐冷和冷敏感)的转录组分析表明,耐冷幼苗的生理过程包括膜运输能力、蔗糖合成、激素和钙2+信令。同时,热休克蛋白和脱氢的合成应对冷敏幼苗的LT胁迫[16.].基因型oro(耐麸米)和TiO taka(敏感水稻)的转录om的比较表明,冷治疗影响了信号转导,植物激素,抗氧化系统和生物应激代谢途径的基因的表达[9.].三种耐冷耐寒基因型的转录组分析(RNA-SEQ)和一种冷敏感基因型表明,钙信号转导和RNA Helicase在水稻的冷应激反应中起主要作用[17.].RNA-SEQ技术已被用于评估培养稻(Kongyu 131和9311)和吞咽米(WR 03-35和WR 03-26)的全基因组转录组[18.]利用耐冷基因型和耐冷敏感基因型的基因表达谱进行转录组分析,结果表明,在水稻低温胁迫下,多种调控途径共同作用[19.].

在本研究中,我们使用Illumina测序平台来调查耐寒野生稻(oryza rufipogon.Griff。)和在萌发阶段的LT(4℃)的冷敏感的籼稻基因型。筛选和鉴定普通野生水稻和籼稻中的差异表达基因(egs)。进行基因本体(GO)富集分析以鉴定和表征稻米对冷应激的响应的生物学过程。在过去的二十年中,许多研究表明,水稻中的冷压力应对涉及复杂的监管网络[20.21].不同生长阶段的水稻的耐寒性(CT)由不同的基因控制[22].已经识别了一些赋予CT的基因,例如冷1QLTG3-1LTG1CTB1.CTB4A, 和LTT7.[23].冷却耐受性分歧1是可以感测冷信号的血浆膜局部化蛋白,并且冷的1-RGA1复合物介导细胞内Ca的冷诱导的涌入2+,导致COR基因活化[23].QLTG3-1编码未知的蛋白质,并将覆盖胚胎的组织的真空紧密相关,以改善萌发阶段的CT [24].LTG1编码酪蛋白激酶并在适应性生长中起重要作用[25].F-box蛋白基因CTB1.赋予与更大的花药长度相关的CT [26].CTB4A(引导阶段的CT)编码保守的亮氨酸富含重复受体样激酶,并在靴子阶段改善CT在造成阶段[10.].LTT7.是一种蛋白质基因,在水稻苗期早期对LT具有很强的耐受性[27].在分子机制上,水稻在低温胁迫下的响应涉及多种生理代谢途径,冷信号通路决定了植物的CT。LT刺激膜流动性,导致冷信号的膜蛋白构象在细胞内区域传递[2829].膜和温度传感器(冷1 / RGA1)接收冷信号,导致CA的涌入2+,ROS生产,脱落酸积累和丝裂剂活化蛋白激酶(MAPK)级联(osmkk6.-osmpk3.)反应[2130.31].ICE-CBF-COR是报道最广泛的途径之一[32].CBF Orthologs已被分离在米中[21].组蛋白乙酰化osdreb1b.在米饭中由LT诱导[33].osmybs3.抑制了DREB1.稻米延长冷胁迫下的依赖性途径[34].加利福尼亚州2+- 依赖性Kinase24(OSCPK24)可以通过使谷胱甘肽依赖巯基的磷酸转移Grx10 [管制大米赋予耐寒性35].osmpk3.增强了OsICE1磷酸化蛋白质稳定性OsICE1并阻断其与E3泛素连接酶O的相互作用Shos1.,从而提高稻米的耐冷性[36].尽管有这些研究,由于相关遗传途径的复杂性,萌发阶段的CT下CT的分子机制仍不清楚。

这些分析说明了野生水稻中存在的许多抗寒基因。然而,野生稻耐冷机制的分子基础尚不清楚。这项研究表明,野生稻的基因LTG5比较了野生稻、籼稻和野生稻的CT或冷适应机制LTG5本研究旨在探索CT基因,从而提高水稻耐寒育种水平。本研究结果有助于我们了解水稻和野生稻的冷反应机制,并为改进水稻生物技术和分子育种提供技术资源。

结果

冷胁迫下冷敏感系ce 253与耐寒野生稻Y12-4的表型差异

冷敏感的籼稻253和普通野生稻(O. Rufipogon.格里夫)Y12-4拥有一个CT表型,使用了这项研究。这两种基因型从桂林,广西省,中国获得的。Under cold stress, the seeds were prepared with a coleoptile length of ≥5 mm. A marked difference in survival rate was observed between 253 and Y12–4 (Fig.1),Y12-4显示比253更好的CT和回收能力。Y12-4的发芽率为76%,253的萌发率为4℃下为0%10天,并回收5天(平均值比较Student’s t test,P. ≤ 0.01) (Fig.1).

图1
图1

253和Y12-4在对照和冷处理下的低温发芽率比较CK为对照处理;CT示冷处理。竖条表示标准误差。一种: 253和Y12-4 25°C下7d;B.: 253和Y12-4在4°C下处理10d,恢复5d;C:在正常和冷处理下发芽率为253和Y12-4

图书馆施工和测序

从每个样本中收集干净的reads,并获得了一个有限的转录组,该转录组提供了冷胁迫下的转录动态图谱。寒冷(4°C)条件影响基因表达,并在全球转录组水平上诱导不同种类的水稻(图。2a) 此外,主成分分析揭示了253和Y12–4之间参与冷诱导反应的基因网络的不同激活(图。2b)。PC1(49.9%)和PC2(18.4%)在30个变量中解释了68.3%的程度。相关分析表明样品处理中的差异很大(补充图1).

图2
figure2

FPKM分布和水稻PCA采样

高通量测序从每个文库中生成42.44-68.71 M 100 bp的对端reads(表2)1).共有31577个基因被定义为已知基因(占模型总37358个基因的84.53%)。在过滤掉短于200 bp的新转录本和只有一个外显子的新转录本后,2238个转录本被预测为新基因。RNA-Seq结果表明577(451调节/ 126下调),4949(1524调节/ 3425下调),8393(2054调节/ 6339下调),和12010度(2811调节/ 9199下调)被发现在水稻芽后3、6、12、24 h 253年相同的寒冷条件下,而2310(1373调节/ 937下调),在Y12-4培养3、6、12和24 h后,水稻芽中发现4309(1694上调/2615下调)、7677(2576上调/5101下调)和11,296(3266上调/8030下调)基因。3.).值得注意的是,在耐冷耐寒性Y12-4中发现比在3,6,12和24小时的冷敏感剂253中发现更加上调的基因。在3小时后,Y12-4比在3小时后比上调的次数更少。结果表明,响应于Y12-4中LT应力而主动上调更多基因。发芽阶段的253和Y12-4基因型对0,3,6,12和24小时进行冷(4℃)。冷治疗影响了基因表达的全球模式。在冷应激下,分别显示253和Y12-4,分别显示1128和1401个差异表达的转录物(图。4.A和B)。

表1 RNA-Seq文库质量和输出统计
图3
图3

每对差异表达基因的比较。样品的标签显示为“冷处理后的小时”(H)

图4
装具

低温下两种水稻基因型差异表达基因的维恩图。一种:Venn地图显示253个基因型中不同冷响应基因的表达基因。B.:维恩图显示Y12-4基因型中不同冷应答基因的表达

为了鉴定基因表达模式,根据LOG2(折叠变化)值> 1并校正,我们在0,3,6,12和24小时下对两种稻米进行两种稻米的分层聚类。P.-value < 0.05 (Fig.5.).RNA-SEQ数据分析分别揭示了4566和4220°(分别为253和Y12-4)(表S1S2).在253和Y12-4中将复杂的转录响应模式与早期冷应激的复位可以通过分层聚类来观察。除了冷处理后上调和下调基因的显着增加,表达比也相对于对照的253和Y12-4的显着变化,如热爱分析所示(图。5.).长期暴露(24小时)冷应激增加了受调节基因的数量。很少有基因支持两种品种的基本机制,但在253和Y12-4中LT响应了几种不同的基因。

图5
figure5

冷处理下两种水稻品种的二甲基异丁酯的层次聚类。一种: 253个基因型不同冷应答基因表达模式的热图。B.:显示Y12-4基因型不同冷应答基因表达模式的热图

CONE表达网络分析,用于识别冷相关的DEG

为了鉴定水稻冷处理相关基因,我们对所有基因进行了加权基因共表达网络分析(WGCNA)。分析发现253个WGGNA模块中有18个,Y12-4中有14个WGGNA模块(图)。6.A和B)。这P.两个模块的值和颜色灰度显示模块之间的相关性。为了确定与CT相关的基因的连接,我们使用学生的T检验进行了热爱图。模块的基因特征值显示样品中模块的综合表达水平。共有3970和5829个基因分别在253和Y12-4的“棕色”模块中发现。此外,在两个“棕色”模块中发现了1962个基因。在途径中,总共包括218个基因,包括氨基酸代谢,其他次级代谢物的生物合成,碳水化合物代谢,能量代谢,环境适应,折叠,分类和降解,翻译,信号转导,膜输送,核苷酸代谢和脂质代谢。这种基因对LT的水稻适应的重要途径调节了重要的途径。

图6
figure6

冷应力后253和Y12-4鉴定的加权基因共表达网络分析(WGCNA)。一种分层集群树显示253中的共同表达基因的18个模块。每个段由树叶和每个模块由主要树枝表示。下面的面板显示了指定颜色的模块。B.层次聚类树显示Y12-4中共表达基因的14个模块。每个DEG由一个树叶表示,每个模块由一个主干树枝表示。下面板以指定颜色显示模块。CM模块特性关系在Y12-4和253中。每条线代表一个基因模块。每个模块中的数字表示模块和特征之间的相关性。靠近1的值,模块与特征之间的正相关性更强。靠近 - 1的值,模块和特征之间的负相关性更强。括号中的数字代表了重要性P.值,值较小,特征与模块之间的相关性的重要性更强。D.Y12-4绿黄色模块中CBF2及其相关基因网络Osl_21453是CBF2的数量。Osl_20698为LTG5的编号。每个数字代表一个基因

三个模块呈正相关(R.= 0.56,R.= 0.35,R. = 0.43 for yellow, greenyellow, and pink, respectively) with cold stress, indicating that genes in these modules positively regulate cold stress in Y12–4 (Fig.6.C)。七个模块具有负相关(R.=−0.98,R. = − 0.92,R. = − 0.63,R. = − 0.926,R. = − 0.33,R.=−0.32,和R. = − 0.46 for blue, brown, red, magenta, salmon, green, and black, respectively) with cold stress, suggesting that the genes in these modules negatively regulate cold stress in Y12–4 (Fig.6.c).在黄色模块中,基因表达水平在冷胁迫24 h时上调,在0、3、6和12 h时下调。在绿黄色和粉红色模块中,基因表达水平在冷胁迫6和12 h时上调,而在0、3和24 h时下调。在蓝色模块中,基因表达水平在冷胁迫0、3和6 h时上调,而在12和24 h时下调。在brown模块中,基因表达水平在低温胁迫0和3 h时上调,而在6、12和24 h时下调。在红色模块中,基因表达水平在低温胁迫0 h时上调,而在3、6、12和24 h时下调。在鲑鱼模块中,基因表达水平在冷胁迫3 h时上调,而在0、6、12和24 h时下调。在黑色组中,基因表达水平在冷胁迫3、6和12 h时上调,而在0和24 h时下调(补充图)3.).

四个模块呈正相关(R. = 0.091,R. = 0.17,R. = 0.095, andR.= 0.24,表明在253中,这些模块中的tge基因正调节冷胁迫(图。6.d). 12个模块呈负相关(R.=−0.43,R.=−0.86,R.=−0.53,R. = − 0.32,R.=−0.42,R. = − 0.63,R.=−0.74,R.=−0.81,R. = − 0.99,R. = − 0.24,R. = − 0.77, andR. = − 0.36 for cyan, brown, pink, greenyellow, lightyellow, lightcyan, red, black, blue, lightgreen, green, and salmon, respectively) with cold stress, suggesting that the genes in these modules negatively regulate cold stress in 253 (Fig.6.d).在浅绿色模块中,基因表达水平在冷胁迫24 h时上调,在0、3、6和12 h时下调。253基因型比Y12-4基因型表现出更多的负模。Y12-4的正相关大于253。结果表明Y12-4是一个耐寒品种(补充图)4.).

在本研究中,我们对基因进行了分类冷1CTB4ALTG1CTB1ICE1在蓝色模块中;QLTG3-1棕色模块中;CBF1.CBF3.在紫色模块中;和CBF2.在Y12-4的绿色模块中[10.23242537].然而,LTT7.在Y12-4的所有模块中都没有。这一结果提示,蓝色、棕色、紫色和黄绿色模块中的基因参与了CT。KEGG分析显示,常见的富集代谢途径为“刺激反应”和“信号传导”。蓝色、棕色、紫色和黄绿色模块中的基因与ct相关的代谢物和植物激素有关。WGCNA检测到的基因对冷的响应与绿黄色模块呈正相关。CBF2(Osl_21453)是一个重要的转录因子,调控下游基因对LT的反应(图)。6.e)。

比较耐受和敏感转录组的氧化石墨烯术语的富集

使用GO术语搜索比较每个数据集的丰富类别,以比较来自两种基因型的萌发种子的转录组(图。7.).GO赋值系统用于获取DEGs的功能信息,这一过程可以帮助理解基因功能在宏观水平上的分布。所有基因被划分为三个主要的氧化石墨烯类别:生物过程、细胞成分和分子功能。其中34项差异富集。在Y12-4-0 h和Y12-4-3 h耐冷数据集中,除节奏过程、细胞连接和膜封闭管腔外,大部分基因表达上调。此外,生物调节、细胞过程、定位、代谢过程、反应刺激、单生物过程、细胞部分、胞外基质、胞外基质成分膜、膜部分、细胞器、结合、催化活性、分子功能调节剂、核酸结合转录因子活性显示上调基因多于下调基因。在253- 0h中,除结构分子活性高于253-3 h外,所有项均显示下调基因多于上调基因。此外,当基因受到相同的LT胁迫时,上调基因数量大于下调基因数量的模型可以随着时间的推移而不断减少。y12 - 4- 0h与Y12-4-6 h相比,y12 - 4- 0h的生长、免疫系统过程、代谢过程、分子功能调节剂、核酸结合转录因子活性、信号转导活性均表现出上调高于下调。 Biological regulation, immune system process, extracellular region part, molecular function regulator, and nucleic acid binding transcription factor activity revealed a uniform trend in 253-0 h vs. 253-6 h. The growth, nucleic acid binding transcription factor activity, signal transducer activity, and structural molecular activity uncovered more upregulated genes in Y12–4-0 h than in Y12–4-12 h. Immune system process and extracellular region part revealed a uniform trend in 253-0 h vs. 253–12 h. Rhythmic process and extracellular region part displayed more upregulated genes in Y12–4-0 h than in Y12–4-24 h. Nucleic acid binding transcription factor activity and extracellular region part revealed more upregulated genes in 253-0 h than in 253-24 h. These terms could be related to known cold-induced processes, such as increased cellulose synthesis, accumulation of unsaturated membrane lipids, osmoregulation, and antioxidant defense activation (Fig.7.).

图7
figure7

在L响应阶段期间对基因的功能分类纤细。发现的基因是通常或基因型 - 在253和Y12-4中特别诱导3,6,12和24小时。酒吧显示253(蓝色)和Y12-4(红色)诱导基因的数量

通过BLASTX搜索分配给每个转录物和基因的基因,用于四个公共数据库的植物蛋白收集(NR,瑞士 - Prot,Kegg和Kog),36种富含耐冷耐寒萌发和53型冷敏感在0小时的萌发萌发,61,61在耐冷耐寒萌发中,在0小时的冷敏感萌发中富集,53在冷耐冷萌发中富集和75在0h的0小时萌发和81,富含耐冷耐寒萌发和54的冷敏感萌发,在0小时与24小时(图。7.).

有趣的是,0小时和3小时时,在耐冷数据集中发现了“碳水化合物代谢过程”、“脂质代谢过程”、“转运”、“离子转运”、“免疫反应”、“磷脂结合”、“葡萄糖醛酸转移酶活性”和“抗氧化活性”等术语,而在冷敏感数据集中没有发现。因此,这些机制可能与在耐受基因型中观察到的CT有关。在冷敏感数据集中丰富的术语中,“脂质运输”和“对其他生物的防御反应”在0小时和3小时观察到。

在富含耐冷耐耐寒性数据集中的术语中,在0小时与6小时的情况下观察到“脂质转运”和“对氧化应激的反应”。在富集在冷敏感数据集中的术语中,“防御响应”和“对外刺激的响应”被调节了0小时的许多过程。

在富含耐冷耐寒性数据集的术语中,“对外部刺激的反应”,“对生物刺激的响应调节”和“氧化还原酶活性”在0h vs.12h中存在。在冷敏感的数据集中,在0h与12小时,发现“对外刺激,”对外部刺激,“响应”和“氧化还原酶活性”的“防御反应”。

在耐寒数据集中富集的术语中,“膜蛋白复合物”和“对外部生物刺激的反应”分别在0 h和24 h观察到。在冷敏感数据集中富集的术语中,“氧化还原酶活性”在0 h和24 h观察到。这些数据提供了可能参与Y12-4萌发CT机制的过程的指示。耐寒基因触发了其他机制,这些机制对CT赋值更有效。这些结果可能反映了耐寒基因型和敏感基因型对冷胁迫反应的不同性质。从3 h的早期反应基因到12和24 h的晚期反应基因,调控通路的基因是动态的、连续的过程。在253和Y12-4基因型中,测定了耐、敏感基因型之间的不同GO项。

在不同基因型富集途径

基因调控途径是一个动态的、连续的过程。途径富集被广泛应用于理解水稻对lt响应的生物学进展。因此,我们在253和Y12-4中分析了途径富集。特别是,除253- 0h相对于253-3 h外,苯基丙素生物合成是所有项中最重要的富集(补充图)2).随着冷治疗时间的延伸,信号转导通路的基因数量增加(补充图2).此外,在253-0 h和253-6 h的代谢通路中发现了相当数量的基因。然而,Y12-4 -0 h与Y12-4 -24 h单通路中的基因数量大于Y12-4其他三个术语的基因数量(补充图)2).对于富含植物激素信号转导的基因,在253中逐渐滴加冷处理下的重要途径。植物激素信号转导途径为253-0小时,但下降在253-0h,253-6 h,253-0h与253-12小时和253-0h与253-24小时中,253-6 h中的前3名,前6名和前三名。随着时间的推移,Q值下降。然而,植物激素信号转导途径为Y12-4-0H的前2,但达到y12-4-3h,但掉至前3个,前3个,前9个,在Y12-4-6小时,y12-4-0h vs y12-4-12 h,分别为y12-4-0h与y12-4-24 h(补充图2).Q值在冷处理下显示出密切相关,直至12小时。这些结果表明LT在两种基因型中导致途径和不同调节基因的动态变化。这些数据表明,植物激素信号转导在Y12-4的高水平保持。此外,LT导致芸薹类化合物生物合成在耐冷耐寒萌发中的上调。冷耐寒萌发可以比冷敏萌发更有效地维持植物激素信号转导。

qRT-PCR验证RNA-seq数据

通过QRT-PCR分析具有显着改变的表达的七种基因,以验证RNA-SEQ数据结果。预计所有这些基因与CT相关,这些基因的功能注释列于表中S3.表达模式OS01G0695700.Os07g0515100Os05g0149400OS12G0576600.OS11G0523700.Os02g0312600, 和OS02G0535400.qRT-PCR与RNA-Seq分析结果相似。这一结果表明了RNA-seq研究的有效性(图。8.).

图8
figure8

用RNA-Seq和qRT-PCR比较基因表达水平。相对表达值归一化到水稻UBQ基因。误差条表示标准差

LTG5克隆和序列分析

基于RNA-Seq检测到的核苷酸多态性,我们从253和Y12-4之间相对表达量高且表达模式不同的WGCNA褐黄模块中选择3个基因进行克隆和功能鉴定。WGCNA的结果表明CBF2.管理LTG5(补充图5.).LTG5负责编码UDP葡萄糖基转移酶,并负责Y12–4中绿黄色模块对LT的敏感性。一对引物(附录S1在补充材料中)设计用于放大LTG5ORFs来自“Y12-4”(附录S2) 的O.鲁菲蓬贡格里夫.以其他日本货为基础LTG5核苷酸序列(Genbank accession:ORUFI05G24900.1.).在启动子区发现1个SNP和1个IndelORUFI05G24900.1.在Y12-4和253之间。表达LTG5在Y12-4中,在萌发阶段CT上起重要作用(图。9.).

图9
figure9

的功能分析LTG5在萌芽期。一种冷应力下生长过表达线的植物和胰腺的表型。B.新界及新界种子结实统计结果LTG5冷凝压力下的一线。数据表示意味着±S.D。(N = 15).C根的显微结构观察LTG5oe线。D.NT休假微观结构的观察LTG5oe线

LTG5调节萌发阶段的CT

进行了几个实验以估计效果LTG5.首先,一个包含LTG5从由35s启动子驱动的来自烟草花椰菜马赛克病毒(CAMV35S)驱动的Y12-4分别引入253.反转转录PCR表明独立的T0转基因系显示出不同的表达水平LTG5,并通过qRT-PCR验证该基因在T3系中的表达。每一种都有三种过表达的转基因株系LTG5用于进一步的分析。OE -LTG5在LT条件下,与非转基因系(NT)相比,CT表现出稳定和明显的增强-LTG5-1,OE-LTG5-2,和oe-LTG5-3分别在LT延续96.97,61.11和37.78%(图。9.).在OE线的叶片中,牛肉和实质细胞被破裂,但叶肉组织,血管束和机械组织在冷应激下保留了它们的结构和形态。然而,在NT的叶片中破裂了牛种细胞,机械组织和实质细胞(图。9.).

LTG5其基因产物的表达模式及亚细胞定位

采用荧光定量法检测LTG5在不同组织中的表达,检测LTG5的时空表达模式

的表达LTG5在许多用于QRT-PCR的大米组织中检测到确认空间表达模式LTG5(无花果。10.).LTG5广泛表达在几种水稻组织中,例如护套,叶子,茎,根,尖峰,节点,颈部,种子,旗叶和耕作组织。最高的表达LTG5(图。10.).LTG5-绿色荧光蛋白(GFP)是一种融合蛋白,在35S启动子的控制下在水稻叶片原生质体中表达,以保证其亚细胞定位LTG5.如图1所示。10.B,35岁的GFP荧光:LTG5-GFP转基因状原生质体细胞仅在膜中观察。因此,这结果表明LTG5是一种膜和核定位蛋白,与其在水稻生长和发育中的调控功能一致。

图10.
图10.

在组织中的表达和亚细胞定位LTG5一种的组织中的表达LTG5B.亚细胞本地化LTG5

暗示

稻米起源于热带或亚热带地区。冷应力是一种重大的非生物应力限制水稻生产率。因此,研究稻米冷应激反应的机制很重要。广西桂林的野生米在发芽阶段拥有强大的CT,是冷耐寒稻的分子育种的优秀资源[383940].在目前的研究中,RNA-SEQ分析用于评估冷治疗后发芽阶段的耐冷耐寒和冷敏水稻基因型的转录组。耐冷野生稻y12-4显示比冷敏水稻253更少。在LT下的两种水稻基因型中的次数增加。植物激素信号转导在Y12-4的高水平保持。一种新的基因,LTG5,它编码一种udp -葡萄糖基转移酶。该基因提高了水稻萌发期的CT水平。

水稻冷胁迫动态响应机制的RNA-Seq分析

RNA测序是用于识别在水稻对冷胁迫的响应机制转录变化的强大工具。本研究提供了全面的转录组调查,以了解在水稻发芽阶段响应/处理到LT的基因。冷的反应是复杂的特质,涉及许多信号通路,转录调节和代谢物[41.].

在冷应力下,更多Degs下调冷敏水稻253中的响应机制比冷耐冷米Y12-4。随着冷应力暴露的时间,°的数量增加。该模块在Y12-4中具有比253更高的正相关性。Maia等人。在敏感基因型中显示出更多的对准基因,并在冷敏基因型中显示比冷耐寒基因型在耐寒性基因型中的含量增加19倍。此外,在oro中上调了钙结合EF-HAND,丝裂原,丝裂原,激活蛋白激酶,Cy2H2型锌手指,DREB和WRKY的信号转导相关基因,但在TIO TAKA中下调[9.].Shen等人。表明,含核碱基化合物代谢过程的调节,氮化合物的调节,以及初级代谢过程的调节在三种耐冷耐寒基因型中,而丝氨酸氨基酸代谢过程,M相,和组蛋白修饰在冷耐寒基因型中调节[17.].在本研究中,在Y12-4中上调膜部件,膜的内在成分和局部化的果味。

Y12–4中的上调基因包括钙调素家族蛋白、细胞色素P450家族蛋白、乙烯反应因子、茉莉酸zim结构域蛋白、含NB-ARC结构域蛋白、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、冷休克蛋白、MYB转录因子、UDP葡糖基转移酶家族蛋白和WRKY基因。涉及的基因更多d在信号转导和能量代谢方面。冷1[23],CTB4A[10.],LTG1[25],CTB1[37],ICE1[42.],QLTG3-1[24], 和CBF2.[32可以在正相关模块中检测到。显然,许多基因在短暂的曝光时间内迅速且呈耐冷耐寒基因型迅速且肯定地反应冷应力。筛分元素细胞骨架和MAPK级联途径中的钙信号级联[43.].加利福尼亚州2+可以归纳的表达CBF/cor在寒冷的信号传导途径的基因和转录因子(MYB)42.44.].

然而,在耐冷氧基型蛋白质,甘氨酸水解酶和Harpin诱导的含有1个含有型域蛋白质的耐冷氧基因型中的下调基因与过氧化物酶类似。ROS Generatuon被生物和非生物胁迫引发。氧化胁迫破坏细胞膜并限制水稻营养生长[45.].

在暴露于24小时的冷应激暴露于冷应激的耐寒基因型中,含有脱钙酸(ABA)应激成熟的可诱导蛋白,钙调素家族蛋白,茉莉酸脲Zim-域蛋白,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,UDP-葡萄糖蛋白酶基/ UDP- 葡萄糖基转移酶家庭蛋白,等等。ABA信号通路涉及由ABF1 / 2和水稻中含有含爪的奥纳克基因转导的冷应激响应的调节。ospyl10过度表达调节其配体ABA积累,以改善籼稻的干旱和冷应激耐受性[46.].CTB4A编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在引导阶段改善水稻CT [10.].JAs表明CBF途径与通过诱导ROS回避酶来抵消冷胁迫之间的复杂关系[47.].

基因表达是通过诱导冷一个动态和连续的过程。冷应激可以影响细胞膜的流动性和细胞骨架解聚[29].钙信号激活具有EF-hand结构域的cam、cls、CBLs和CDPKs蛋白,调节下游信号[48.49.50.].信号转导的基因在早期阶段显示出更活力,长期冷应激诱导功能基因上调。通过长期冷应激诱导不同类型和数量的基因。对LT的电阻机制被上调。此外,LT摧毁了大米中的整个系统。目前的研究提供了在耐冷耐野生水稻和冷敏感籼稻之间的动态响应机制和响应冷应激的特定基因型的洞察力。

LTG5在冷胁迫下萌发阶段的作用

植物需要UDP-葡萄糖基转移酶给糖基植物激素和所有主要植物代谢物的主要类别[51.].糖基转移酶可以催化加成糖结合到不同的受体分子,如蛋白质,核酸,寡糖和脂质。糖苷配基的糖基化可以改变活性,溶解性,和糖基转移酶转运的[52.].在拟南芥蒂利亚纳,过氧化氢响应性UDP-葡糖糖基转移酶UGT74E2参与了植物结构和水分应激反应的调节[53.].马铃薯葡萄糖基转移酶基因启动子通过LT增加酶活性,这表明启动子在植物保护中起对非生物应激的影响[54.].拟南芥葡萄糖基转移酶UGT71B6影响ABA及相关ABA代谢物和ABA葡萄糖酯(ABA- ge) [30.]在马铃薯中,UDP葡萄糖基转移酶基因与冷诱导甜味下的葡萄糖和基因表达高度相关[55.].基因组围绕腕基因的识别及其对冷压力的反应Coffea canephora表明UDP-葡糖糖基转移酶活性显着代表[56.].过度的LTG5增加水稻在发芽阶段的CT。LTG5是植物中保守的UDP-葡糖基转移酶。目前的结果表明LTG5通过分子育种技术具有改善萌发阶段的水稻CT的巨大潜力。

结论

我们概述了耐冷普通普通野生水稻和冷敏感籼稻之间的不同分子变化。RNA-SEQ数据表明,响应于冷的转录相对不同,耐受性和敏感基因型之间的差异。我们的转录组数据可用于识别CT的新型靶标。此外,本研究发现了耐冷相基LTG5从野生稻。LTG5编码的UDP葡糖基转移酶和在调节冷胁迫下的发芽率发挥了重要作用。然而,还需要进一步研究,以确定基因表达和冷反应之间的联系。因此,mRNA的下冷处理一个独特的水平,LTG5这对进一步深入分析和研究CT在水稻萌发种子中的调控机制具有重要意义。

方法

植物材料及冷处理

冷敏感的籼稻品种CE253(253),广泛种植在桂林,广西,中国,耐冷普通普通稻米(O.鲁菲蓬贡格里夫。)在本研究中使用Y12-4。所有植物材料都在广西农业科学院水稻研究所保存,y12-4是从国家种质南宁野生稻苗圃获得的。用蒸馏水洗涤三次种子,然后在70%乙醇中浸泡5分钟。然后,将种子浸泡在5%次氯酸钠中15分钟,并在玻璃盘(9cm)中发芽之前用蒸馏水洗涤三次。

所有水稻种子在温室的温度下萌发,温度为28°C±2℃,相对湿度为80-100%,光周期为12小时。制备种子,用厚度为≥5mm。在4℃下在0,3,6,12和24小时下采样的三天龄种子及其在0,3,6,12和24小时下采样的相应水稻进行总RNA提取和RNA-SEQ分析。收集三种生物复制(含有至少30种发芽种子的每一个),立即在液氮中冷冻,然后储存在-80℃直至进一步分析。

采用一种方法来评估萌发阶段的CT。将三天龄的种子在LT(4°C)下处理10天并回收5天。通过存活率评估表型。每根测量至少五个30株植物。如富吉诺等人所述进行萌发试验。[57.稍作改动。

RNA-SEQ和数据分析

按照制造商的说明,使用TRIzol R试剂(Invitrogen, Carlsbad, USA)提取每个样品的总RNA。RNA使用PrimeScript™RT reagent Kit with gDNA Eraser进行进一步分析。在Illumina HiSeq软件中确认了质量控制。将Reads映射到Nipponbare的参考基因组序列中。通过HISAT2、Tophat2(2.1.1)和IRGSP-1.0将所有通过筛选规范的基因reads映射到参考基因组上。基因可于水稻基因组注释计划(http://rice.plantbiology.msu.edu.)具有完美的匹配或一个不匹配。

具有低于0.05且折叠变化≥1.5的基因被认为是差异表达的基因/转录物。进行耐冷或冷敏的数据集中的乙型基因座以查找富集的富集,并且认为该组织被显着富集。已知和新预测的基因基于三个公共蛋白质数据库注释,以获得有关检测到的转录物的综合信息。使用材料和方法部分中列出的标准在每对样品中鉴定在每对样品中(图。3.).

具有相似表达模式的基因的聚类是一种分析策略,有助于鉴定未知基因的功能或表征已知基因的未知功能。基因表达水平被标准化为每百万碱基对序列(FPKM)的每百万kB的转录序列(FPKM)的片段,以鉴定两种水稻基因型中的次数[11.].使用治疗的FPKM值与对照来计算DEG的折叠变化。CDNA文库对Illumina Vilumina Viotechnology Co.,Ltd。(中国广州)进行测序。

矢量建筑和遗传转型

用于构建过度表达质粒,整个1.4 kB外显子和内部区域LTG5从Y12-4中扩增,用PACI和KPNI消化,并克隆到二元载体PMDC32中[58.].所有片段用KOD-FX高保真PCR酶(TOYOBO, KFX-101)进行扩增。用于载体构建的引物序列在附录中提供S1.序列确认的质粒全部导入农杆菌肿瘤术菌株EHA105并通过使用农杆菌介导的方法转移到受体材料中[59.].

qRT-PCR分析候选基因

冷敏感线253和耐冷耐野生水稻Y12-4用于鉴定推定候选基因的表达模式。使用Trizol R试剂(Invitrogen,Carlsbad,美国)提取QRT-PCR的水稻RNA,并在制造商的说明之后,并在所有RNA中使用具有GDNA橡皮擦的Primescript™RT试剂盒进行进一步分析。常规温度发芽的种子用作对照。在LT和常温下,在0,3,6,12和14小时内收集两条线的芽,用于三次重复。将样品立即置于液氮中,然后储存在-80℃,以进行总RNA分离。我们构建了每种水稻基因型的单端cDNA文库。使用具有GDNA橡皮擦(完美实时)的Primescript TM RT试剂盒合成第一链cDNA。作为内源性控制,家务基因UBQ(OS03G0234200.)被用作参考基因,并且使用ΔΔCT方法来测量相对表达值[60.].引物Premier 6软件利用引物Premier 6设计各基因的引物(附录)S1).根据制造商的协议,使用Sybr®Mifixextm(TLI RNASEH Plus,Takara,Takara,Takara,Japan)使用Sybr®Mucx96™实时系统C1000进行QRT-PCR。

亚细胞定位

质粒CaMV35S::GFP和CaMV35S::LTG5-GFP转化到稻叶原生质体用于亚细胞定位。GFP was excited with a 488 nm laser.

可用性数据和材料

相关数据的文件及其支持信息的文件中,以及序列数据被存放在国家生物技术信息中心(SRA)数据库登录号SRR11248805,SRR11248806,SRR11248807,SRR11248808,SRR11248794,SRR11248800,SRR11248801,SRR11248802,SRR11248803,SRR11248804,SRR11248797,SRR11248796,SRR11248795,SRR11248822,SRR11248798,SRR11248799,SRR11248793,SRR11248809,SRR11248810,SRR11248811,SRR11248812,SRR11248813,SRR11248814,SRR11248815,SRR11248816,SRR11248817,SRR11248821,SRR11248818,SRR11248819,SRR11248820(总共30个序列)。本研究期间生成或分析的所有其他数据都包含在此手稿中。

缩写

度:

差异表达基因

RNA-SEQ:

RNA测序

QRT-PCR:

实时定量聚合酶链反应

LTG5

低温生长5

LT:

低温

ROS:

反应性氧气

CBF:

C重复结合因子

走:

基因本体论

CT:

耐寒性

冷1

冷却耐受性分歧1

CTB4A

触发阶段的耐寒宽容

MAPK:

增殖蛋白激酶

OsCPK24:

加利福尼亚州2+端依赖kinase24

253:

CE253

罗斯福:

假发现率

FPKM:

每转录序列的KB片段每百万个碱基对序列

WGCNA:

加权基因共表达网络分析

CAMV35S:

Cobacco Cauliflower马赛克病毒

OE:

超表达

NT:

非转基因素

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

ABA:

脱盐酸

工具书类

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下载参考

致谢

我们感谢Zichao Li(中国农业大学)博士建设性建议。

资金

本研究支持的广西自然科学基金重点项目(批准号2018 gxnsfda281053, 2018 gxnsfba281022和2017 gxnsfaa198266),广西重点实验室开放项目的水稻遗传和育种和广西主要的科技创新基地(批准号2018 - 05 - 06 - kf08),基金资助:国家自然科学基金资助项目(批准号:zl201010102130441);国家自然科学基金项目(Nos. nsfc31960059),广西农业科学院基地业务项目(桂农科2018yt24),国家自然科学基金项目(Nos. NSFC31960401)。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有作用。

作者信息

隶属关系

作者

贡献

G-F D and Y-T L designed and supervised the research. G-X D, W-W C, X-H Y, W-Y Z, C-C H performed the experiments. D-J Q, H W, J G, J H analysed data. Y-H P, H-F L, and L-J G wrote the paper. All authors have read and approved the manuscript.

通讯作者

通信会长邓

道德声明

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版物

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

额外的信息

出版商的注意事项

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。

补充资料

附加文件1:

补充图1。样本处理间的相关分析

附加文件2:补充图2。

在不同基因型富集途径

附加文件3:补充图3。

模块基因表达模式在Y12-4中,红色意味着上调基因,绿色意味着下调基因

附加文件4:补充图4。

模块基因表达模式在253中,红色意味着上调基因,绿色意味着下调基因

附加文件5:补充图5。

候选基因的QRT-PCR和候选基因低温下的萌发率

附加文件6:表S1。

253例有显著差异表达。

附加文件7:表S2。

Y12-4基因表达差异显著。

附加文件8:表S3。

QRT-PCR的基因。

附加文件9:附录S1。

本研究中的引物。

附加文件10:附录S2。

Seqence的LTG5从“y12-4”。

权利和权限

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潘,Y.,梁,H.,高,L.et al。冷胁迫下萌发种子的转录组分析及耐冷基因的特性LTG5在大米。BMC植物BIOL.20,371(2020)。https://doi.org/10.1186/s12870-020-02569-z.

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关键字

  • 野生稻
  • RNA-SEQ.
  • LTG5
  • 耐寒性