接穗基因型对嫁接葡萄藤中砧木对低磷酸盐的转录组反应起远距离控制作用

背景

嫁接广泛应用于园艺，众所周知，砧木可以修饰接穗生长和适应土壤条件。然而，接穗基因型在调控砧木发育和功能方面的作用还有待进一步研究。本研究制备了两种葡萄基因型的互交移植物以及相应的同源移植物对照。这些植物受到低磷酸盐(LP)处理，并用RNA测序对LP处理开始27小时后收集的根系样本进行转录组分析。

结果

在所有接穗/砧木组合中鉴定出一组对LP处理有响应的转录本。通过比较两个同源移植物对LP的反应，确定了与遗传变异相关的基因表达模式。此外，研究表明，接穗以一种砧木依赖的方式修改根系对LP的转录组响应。加权基因共表达网络分析确定了相关基因的模块;通过分析这些模块与磷肥处理的相关性，以及接穗和砧木基因型，发现了潜在的轮毂基因。

结论

本研究为嫁接葡萄对磷酸盐供应的响应提供了深刻的见解，并确定了不同葡萄基因型之间可能存在的潜在的茎到根信号。

磷(P)是植物发育所必需的大量营养素，参与许多代谢和信号通路[1］．植物只有在磷的自由无机形式正磷酸盐(Pi)下才能从土壤中吸收磷，尽管土壤中存在许多植物无法吸收的磷形式[2］．当资源有限时，植物已经进化出几种机制来最大限度地获取磷;其机制从植物形态的改变到基因表达的改变。例如，许多植物能够通过向根系分配比茎部生长更多的碳，从而改变茎部/根系的生物量比，增加根系分枝和细根的产生，从而提高根系的Pi觅食能力[3.］．植物还可以通过释放质子、有机酸、酸性磷酸酶和核糖核酸酶，从难以接近的来源释放磷，从而提高土壤中磷的生物利用度[2］．这些变化伴随着茎和根的代谢变化，一般糖、有机酸、氮化物和次生代谢物的浓度增加，而磷酸化代谢物的浓度降低[4，5，6］．此外，通过亚砜脂和半乳糖脂替代细胞膜磷脂，可以节约细胞内部的Pi使用[7］．

为了应对有限的磷供应，一些参与感知、信号传递和对磷饥饿反应的基因已被确定，被称为磷饥饿诱导(PSI)基因[8］．Lan等人(2015)对拟南芥根系对磷供应的响应进行了元分析，并确定了在磷饥饿开始数小时或数天后诱导的100个PSI基因的核心，独立于生长条件、实验设计和转录组分析方法[8］．此PSI基因列表包括与脂质代谢和半乳糖生物合成相关的基因，包含SYG/PHO81/XPR1 (SPX)结构域的转录因子(tf)， Pi转运蛋白(如来自磷酸TRANSPORTER1/PHT1)、蛋白激酶和细胞内分泌的紫色酸磷酸酶[8］．多年生植物对磷有效性的转录组响应很少受到关注，尽管在拟南芥、玉米、水稻、白高粱、番茄、大豆和野生芥菜等一年生植物中，人们广泛研究了短期和长期的转录响应[9］．迄今为止，对多年生作物(枳壳三叶的，马尾松和杨树)一直仅限于研究一种基因型及其对长期(数周至数月)限制磷处理的适应性[10，11，12])。

比较不同基因型对有限磷供应的响应可以为适应性策略的遗传变异提供证据，并确定作物改良的靶点[13，14，15］．小道消息(葡萄。)，基因型对有限的Pi有效性的生长响应不同[16，17]，以及Pi的获取和利用效率[17，18］．每年约有三分之一的植物磷从葡萄园出口(在收获的浆果和冬季修剪[19])，这表明葡萄是了解Pi供给适应性反应遗传变异的分子基础的重要作物。此外，在葡萄等易于嫁接的植物中，不同接穗/砧木组合对有限的磷供应的响应可以阐明茎和根对磷供应的特定响应，并提供有关茎和/或根信号的深入了解。对拟南芥等模式植物的嫁接研究表明，根和茎都在调节植物对磷供应的响应中发挥作用;潜在的远距离信号包括离子、代谢物、蛋白质、信使rna、小rna和激素[9，20.］．一些根到梢信号已经被确认，如Pi本身(以及潜在的肌醇多磷酸酶和焦磷酸酶)和激素，如独角内酯和细胞分裂素[9，20.］．从茎到根的信号包括糖、microRNAs和钙相关信号[9，20.］．嫁接实验表明，在限制Pi的情况下，microRNA 399可以从茎部向根部移动进行抑制PHOSPHATE2/PHO2表达式[21，22］．PHOSPHATE2介导磷酸盐转运体的蛋白质降解并控制芽Pi稳态[23，24］．类似地，嫁接实验表明，两种液泡钙转运蛋白CAX1和CAX3触发了梢到根信号，增加了Pi的吸收，但确切的机制仍不清楚[25］．

嫁接植株适应低磷供给的分子机制尚未研究;本研究研究了接穗和砧木在调控嫁接葡萄植株对低磷供给的根系转录组反应中的作用。首先，我们的目标是确定是否可以在所有研究的接穗/砧木组合中识别出一组低Pi响应转录本核心。其次，我们研究了根系对低磷供给的转录组反应是否存在遗传变异。第三，研究了接穗基因型是否能改变砧木基因表达及其对有限磷供应的响应。加权基因共表达网络分析(WGCNA)可识别与磷供应、砧木和接穗基因型密切相关的共表达基因模块，并识别潜在的枢纽基因。

将4个葡萄接穗砧木组合(1103P/1103P、1103P/PN、PN/1103P和PN/PN)在HP上曝气水培栽培，其中一半转入LP，另一半继续接受HP。处理27 h后，利用RNA-seq比较不同接穗/砧木组合(下文详细描述)对LP的短期转录组响应。处理28 d后，采用RT-qPCR方法对4个PSI基因(2个含有SPX结构域的基因和2个含有SPX结构域的基因)的表达进行定量分析PHT1在LP和HP上生长的植物根尖中的转运蛋白);在所有接穗/砧木组合中，LP都强烈上调了这些基因的表达(图。1)．

在所有接穗/砧木组合中，一组基因对LP的响应均有上调或下调

为了表征在LP作用下基因表达的短期变化，在所有接穗/砧木组合中，RNA-Seq用于定量转移到LP后27 h根尖中mRNA的丰度。与HP处理相比，LP处理在所有接穗/砧木组合中分别导致1834和2501基因表达量的上调和下调。2一个)。

在所有接穗/砧木组合中，发现了一组对LP反应下调的301个差异表达(DE)基因1)，其富集于MapMan BINs WRKY和乙烯响应因子/ERF tf，酪氨酸激酶样(TKL)超家族成员，苯丙氨酸解氨酶/PALs和柚皮苷查尔酮合成酶(特别是二苯乙烯合成酶/STSs，表1)．在这个列表中包括WRKY tfWRKY6（Vitvi10g00063)，WRKY18（Vitvi04g00510)，WRKY33（Vitvi06g00741而且Vitvi08g00793)，WRKY40（Vitvi04g00511而且Vitvi09g01122)，WRKY51（Vitvi04g00760而且Vitvi04g01985)，WRKY53（Vitvi15g01003而且Vitvi16g01213),WRKY75（Vitvi01g01680)．在这个列表中有16个ERF转录因子以及其他与乙烯信号相关的基因，如1-AMINOCYCLOPROPANE-1-CARBOXYLATE氧化酶1/ETHYLENE-FORMING酶（Vitvi12g00445)和乙烯反应基因，在脱落的花序缺乏（Vitvi01g01924)．此外，该列表还包括与次生代谢相关的基因，如PREPHENATE脱水酶（Vitvi06g01946)，它参与苯基丙氨酸等芳香族氨基酸的生物合成CINNAMATE-4-HYDROXYLASES/C4Hs（Vitvi11g00924而且Vitvi11g01045)和两个4-COUMAROYL COA-LIGASES/4 cls（Vitvi14g01757而且Vitvi02g00717)，它们参与苯丙类代谢。

在所有接穗/砧木组合中，只有8个DE基因对LP反应上调，这些基因是:一个ABC转运蛋白(Vitvi14g01865)，一种受体激酶(FERONIA, Vitvi14g01365)，一种抗病蛋白(Vitvi18g01755)、两个转移酶(Vitvi12g02284而且Vitvi07g03041)，异黄酮2》羟化酶/CYP81D8（Vitvi07g01651)和一个假定的转录调节因子(转座酶样蛋白)Vitvi13g02203)(额外的文件1)．综上所述，受LP胁迫下调的DE基因在接穗/砧木基因型间具有很好的保守性，而受LP胁迫上调的DE基因则主要是接穗/砧木组合特异性的。

两个同源移植物对LP反应的基因调控存在差异

在HP和LP条件下，两个砧木基因型之间有许多基因为DE(图1)。2b,额外的文件2)．在对照HP条件下，两个砧木基因型之间的基因DE在MapMan bin中富集，这些bin与酶、核苷酸结合域和富含亮氨酸的重复序列(NLR)效应受体(感知病原体感染从而触发免疫机制)有关。此外，MapMan BINs PAL和查尔酮合成酶也在PN高表达的基因中富集(附加文件3.)．

比较两个同源移植物(PN/PN和1103P/1103P)对LP的转录组响应，可以清楚地看出，在PN/PN中DE基因多于在1103P/1103P中(图1)。2a).为了确定同源移植物之间对LP的转录组响应是否不同，计算了相互作用(即(PN/PN LP vs PN/PN HP)与(1103P/1103P LP vs 1103P/1103P HP)之间的基因DE，附加文件4)．在两个同源移植物之间，有310个基因的表达对LP有不同的响应4)，这310个基因在MapMan BINs NAC和WRKY tf、溶质转运(液泡铁转运蛋白/VIT和铝活化苹果酸转运蛋白家族)、生物胁迫、氧化还原酶(主要是漆酶14的同源物，参与木质素降解)和转移酶(转移含P基团)中富集(附加文件)5)．来自生物胁迫类别的bin是NLR效应受体和调控根瘤菌感染的ERN1转录因子Lotus粳稻［26])。为了表征这310个基因的表达模式，显示在同源移植物之间对LP有显著的相互作用，我们将1103P/1103P中对LP有响应的基因表达量的对数倍变化与PN/PN进行对比(图1)。3.a).从整体上看，LP对DE表达下调的基因在两个同质移植物间具有良好的质量保守性，PN/PN和1103/1103P中均有67个DE基因显著下调，但PN/PN的倍性变化更高。在PN/PN中，与1103P/1103P相比，对LP反应高度下调的DE基因包括许多tf、激酶、生物胁迫相关基因和钙信号相关基因。在只有一个基因(茉莉酸甲酯酶)的同源移植物中，对LP反应上调的DE基因保守性较差。Vitvi07g02517)对LP的响应均显著上调，但PN/PN的变化倍数更高。在PN/PN中DE基因对LP的响应高于1103P/1103PWRKY19（Vitvi18g01743)，硫酸盐转运剂(Vitvi09g00484)， Snf1蛋白激酶KIN10（Vitvi08g00935)和adp -葡萄糖焦磷酸化酶的一个大亚基(Vitvi07g00544)，它调节淀粉合成以及与茉莉酸、细胞分裂素和脱落酸(ABA)信号相关的基因。只有一个基因(Vitvi08g01380)在1103P/1103P响应LP上调，在PN/PN响应LP下调，反之只有一个基因(Vitvi18g02447)在1103P/1103P响应LP下调，在PN/PN上调。综上所述，PN/PN对LP的转录组反应比1103P/1103P更广泛，但基因表达的质变在两个同源移植物间相似，尤其是下调基因。

与非自接穗嫁接的基因差异调控

与非自接穗嫁接引发了许多基因的差异表达;然而，一个基因，一个含有BURP结构域的蛋白质rd22样亚型X2，VViBURP17（Vitvi04g00357) [27在砧木和磷处理中，DE对异嫁接的反应(图。2c,额外的文件6)．含有BURP结构域的蛋白质参与多种植物的非生物胁迫耐受性，通常对ABA的应用有响应[27］．

比较1103P/PN和PN/PN，在PN砧木的LP和HP中，只有少量DE基因对非自接穗嫁接有响应;6和24个DE基因分别上调和下调(图。2c).包括1103P/PN相对于PN/PN大量增加的6个转录本类胡萝卜素裂解双加氧酶8（Vitvi04g00298)，一种参与合成独脚内酯的酶(附加文件7)．24个数量减少的转录本在MapMan BINs减数分裂退出调控因子(参与细胞周期)、蛋白质修饰和铁摄取中富集(附加文件)7)．

当比较PN/1103P和1103P/1103P时，发现在LP和HP条件下，分别有661和505个DE基因上调和下调，对PN接穗嫁接产生了较大的转录响应(图1)。2c,额外的文件8)．与1103P/1103P相比，PN/1103P中上调的661个DE基因在MapMan BINs dna结合中富集，与一根手指、NAC、碱性螺旋-环-螺旋/bHLH和同位盒tf、TKL激酶、枯草菌素样蛋白酶(与生物应激反应相关)、参与纤维素合成的蛋白质、热休克蛋白和半乳糖醇合成酶(附加文件)8)．半乳糖醇合酶介导棉子糖的积累，棉子糖是一种促进耐受力的渗透保护剂[28］．与1103P/1103P相比，PN/1103P中下调的505个DE基因在MapMan BINs GATA tf、bHLH tf、生长调节因子、丝氨酸羧肽酶、水解酶和富半胱氨酸肽前体中富集8)．富含半胱氨酸的多肽参与调节植物的一系列发育反应，并可参与细胞间的通信，特别是在植物-细菌共生关系的建立和根系发育的响应中[29］．

总的来说，砧木的转录组对非自接穗嫁接有反应，但转录组反应的程度取决于接穗/砧木，砧木转录组似乎没有普遍的非自接穗反应。

接穗对根对LP转录组响应的影响

比较PN/PN和1103P/PN对LP的响应，可以发现接穗对砧木对LP的转录组响应有轻微的影响(图1)。2a).然而，在PN/PN和1103P/PN之间，只有5个基因对LP的响应在数量上存在差异(即(1103P/PN LP与1103P/PN HP)与(PN/PN LP与PN/PN HP)之间的基因DE9)．1103P/PN中4个基因的下调量大于PN/PN中的2个ABCG40转运体(Vitvi09g00473而且Vitvi09g00478)，一个参与酪氨酸合成的基因(Vitvi12g00272)和一个udp -糖基转移酶编码基因(Vitvi12g01724)分配给MapMan BIN ABA合成/降解。

相比之下，比较1103P/1103P和PN/1103P对LP的响应，PN接穗显著增加了1103P砧木对LP的转录组响应;在1103P/1103P中，只有59和42个转录本的丰度显著降低和增加，而在PN/1103P中，1181和1084个转录本的丰度显著降低和增加。为了确定1103P/1103P和PN/1103P相互作用之间的转录组对LP的响应是否在数量上不同，我们计算了(PN/1103P LP与PN/1103P HP)与(1103P/1103P LP与1103P/1103P HP之间的基因DE)，附加文件10)．只有364个DE基因对LP有不同的反应，这些基因在MapMan BINs ERF tf、NLR效应受体和磷酸化丝氨酸转氨酶(参与丝氨酸生物合成)中富集(表2)2)．从同源移植物对LP的转录应答的比较中可以看出，LP下调基因的应答具有保守性(图1)。3.b)，有113个DE基因在PN/1103P和1103P/1103P中显著下调，但PN/1103P的基因表达响应幅度更高。然而，在显示相互作用的基因中，没有常见的DE基因对LP的响应显著上调(图。3.b);在PN/1103P中，12个基因的DE响应LP而降低，而在1103P/1103P中响应LP而升高。

PN/1103P比1103P/1103P上调的104个DE基因包括一个周期蛋白(Vitvi15g00641)， bHLH TFFIZZY-RELATED 3（Vitvi12g02634),一个铝活化苹果酸转运蛋白（Vitvi13g02145),四个DICER-LIKE3的基因,远红受损反应1相关序列5（Vitvi08g01733)和许多参与生物应激反应的抗性蛋白和基因(附加文件10)．

PN/1103P中比1103P/1103P中下调的260个DE基因包括与氨基酸代谢、发育(包括一个VIT家族蛋白)、发酵和糖酵解(细胞质分支，如糖酵解)相关的基因。丙酮酸激酶(Vitvi10g01568)，磷酸甘油酸酯激酶（Vitvi19g01690),GLYCERALDEHYDE-3-PHOSPHATE脱氢酶（Vitvi01g01538))(附加文件10)．这个列表还包括5个ERF TF，一个锌指同源盒子TF (Vitvi12g02000),一个NADP-DEPENDENT苹果酸脱氢酶（Vitvi04g00009)， 2个EXORDIUM-like 2编码基因TREHALOSE-6-PHOSPHATE磷酸酶（Vitvi18g00384)(额外的文件10)．

综上所述，接穗可以改变砧木对LP的转录组响应，但其作用依赖于砧木。

基因共表达网络分析

采用WGCNA方法确定了26个高度相关基因模块，并对这些模块与每个实验变量(磷处理、接穗和砧木基因型)的相关性进行了分析(图1)。4)．根据kME值(附加文件)确定表达模式高度相关的基因11)相关系数最高的基因(> 0.9)可能被认为是模块内潜在的枢纽基因。模块MEgrey包含了不能分配到共表达模块的基因。

与磷供应相关的基因共表达模块

与LP最正相关的基因共表达模块为MEyellow;其中包含1704个基因(图4)。4)．高度相关的基因(> 0.8)在MapMan bin转录激活中富集，特别是C3H zing finger和FAR-RED impairment RESPONSE 1 tf3.)．144个高度相关的基因(> 0.9)包括参与RNA(特别是小RNA)处理的基因(如DICER-LIKE1而且DICER-LIKE3)、染色质重塑因子、两种组蛋白乙酰转移酶(Vitvi12g00328而且Vitvi19g00124)，得墨忒耳（Vitvi08g01515)，来自MapMan BIN染色质结构的三个基因以及其他生物和非生物应激响应转录本(附加文件12)．与HP正相关的共表达模块为MElightgreen，共有438个转录本。阳性相关转录本(> 0.8)在MapMan BINs WRKY和ERF tf和查尔酮合成酶中富集(表2)3.)．

与砧木基因型间转录组差异相关的基因共表达模块

与砧木1103P高度正相关的共表达模块为MEturquoise;该模块包含2455个基因(图。4)．高度相关的基因(> 0.8)在与NLR效应受体和各种酶相关的MapMan BINS中富集(表2)3.)．与砧木PN高度正相关的共表达模块是MEgreen，包含1590个基因，其中高度相关的基因(> 0.8)富集于与RNA处理、NLR效应受体和各种酶相关的MapMan BINs中(表2)3.)．

与接穗基因型对根转录组影响相关的基因共表达模块

与接穗基因型显著相关的基因共表达模块较少，相关系数远低于P处理或砧木基因型(图4)。4)．模块melightylow与1103P接穗(298个转录本)的相关性最高，但与砧木基因型也显著相关。而MEgreenyellow模块仅与接穗基因型显著相关，因此该基因更可能是接穗反应特异性基因。MEgreenyellow在MapMan bin信号肽(半胱氨酸丰富肽)、转录激活、蛋白质降解(丝氨酸羧肽酶)和细胞壁中富集(表2)3.)．121个高度正相关转录本(> 0.9)包括5个生长调节因子，它们可能被microRNA 396靶向[30.)(附加文件12)．MEmagenta模块是与PN接穗(736个转录本)、MapMan BINs左内酯信号、C2C2、NAC、bHLH和BEL tf高度相关的共表达模块，部分TKL受体激酶在该模块中富集(表2)3.)．

葡萄参考基因组的可用性是RNAseq分析的一个重要资源，但我们的知识仅限于该参考基因组的预测转录组(即PN40024)。文献表明，即使在克隆水平上，基因组变异也是显著的[31］．对本研究中使用的1103P克隆进行测序，将有助于纠正高复制基因/基因家族的转录物定量，但这超出了本项目的范围。然而，尽管同一属的基因组之间存在差异，泛基因组研究表明，在亲缘种之间共享的同源基因比例很高[32，33］．

许多拟南芥的PSI基因在葡萄LP处理27 h后未被诱导

在这项对葡萄的研究中，我们鉴定了一组301和8个DE基因，它们分别在所有接穗/砧木组合中下调和上调。令人惊讶的是，拟南芥中很少有PSI基因[8]，这在一定程度上是因为葡萄藤的同源物还没有被识别出来(例如。磷酸盐饥饿诱导而且IPS2)或者它们的表达水平很低(例如:丝裂原活化蛋白激酶)．然而，一些拟南芥PSI基因的同源基因不是DE。磷酸饥饿RESPONSE1-LIKE1（Vitvi07g00666而且Vitvi14g00736)和的两个正交词PHO2（Vitvi00g02237而且Vitvi10g01764， DE不显著，但LP下略有上调，尤其是PN/PN和PN/1103P)。Orthologues的WRKY6，WRKY18，WRKY40而且WRKY75在所有接穗/砧木组合中，对LP反应下调的301个基因中存在tf，尽管这些基因在拟南芥中是PSI基因，并在调节Pi饥饿反应中发挥作用[34，35，36］．然而，在LP处理28 d后，4个拟南芥PSI基因的同源基因表达相对于HP上调，表明在27 h对LP的响应代表了早期胁迫相关基因表达的变化。

在所有接穗/砧木基因型中鉴定出309个DE对LP的响应基因

在研究的4个接穗/砧木组合(301个基因)中，LP响应的基因表达下调是很保守的，而在所有接穗/砧木组合中，LP响应的基因表达上调的只有8个。信使RNA的稳定性在基因表达调控中起着重要作用。短寿命的转录本(如tf和激酶)通常与调控过程有关(而长寿命的转录本往往与蛋白质合成和能量平衡有关)[37，38］．此前已有研究表明，转录本降解在拟南芥幼苗对蔗糖的快速反应中起了很大作用[39]并参与广泛的非生物应激反应(如[40］．在所有接穗/砧木组合中，对LP反应下调的301个基因在tf和激酶中富集，表明它们的下调可能与它们的快速更替有关。在不同的接穗/砧木组合之间，对LP的响应下调基因的保存似乎很重要，这可能是因为快速的转录本周转有潜力确保对变化的土壤营养条件的快速响应。

在所有接穗/砧木组合中，对LP反应下调的301个DE基因集中存在许多参与二苯乙烯合成途径的基因:例如1个PREPHENATE脱水酶, 9朋友,两个C4Hs,两个4 cls和13STSs．已知许多代谢物在植物中对LP的反应有差异积累，这是增加次生代谢物浓度的一般反应(特别是叶片中花青素浓度对LP供应的响应[41])，但很少有人知道二苯乙烯的合成是否会因LP而改变，因为只有少数植物产生二苯乙烯。迄今为止，只有一项关于植物产生二苯乙烯的研究，该研究是在松树上进行的，经过较长时间的低磷处理，并没有突出次生代谢相关基因的差异表达[11］．已知二苯乙烯在植物防御反应中发挥作用[42]，因此，在转入LP处理27小时后，二苯乙烯合成相关基因的表达下调可能是一种早期反应，将代谢从防御反应转向适应有限的磷。在所有接穗/砧木组合中，301个DE基因中也存在许多乙烯相关基因，这些基因在LP处理中均下调;已知这些基因在生物和非生物胁迫响应中具有广泛的作用，包括调节根系生长对磷供应的响应(如[9])。在WGCNA分析中，与HP正相关最强的模块是MElightgreen;该模块中高度相关的基因在MapMan BINs WRKY和ERF tf和查尔酮(二苯乙烯)合成酶中富集。WRKY tf和乙烯都被证明可以调节STSs在小道消息43这表明这些tf可能是调节LP代谢反应的中枢基因。此外,VviMYB15（Vitvi05g01733),VViMYB14（Vitvi07g00598)，积极的监管者STSs［44]，在大多数接穗/砧木组合中被下调。表达的下调VviMYB14和许多STSs在葡萄中也观察到对缺铁的反应，这些变化伴随着类黄酮合成相关基因表达的增加[45］．同样，在所有接穗/砧木组合中对LP反应上调的8个DE基因中的1个是异黄酮2的羟化酶/ CYP81D8（Vitvi07g01651)．这表明，在转录水平上，二苯乙烯合成的下调和类黄酮合成的上调是葡萄根系缺磷缺铁的共同反应。

在所有接穗/砧木组合中，只有8个基因对LP的表达上调，这表明接穗/砧木组合中，单个接穗/砧木组合对LP的基因表达上调的变异大于下调的变异。尽管转录组反应存在差异，但WGCNA分析允许识别与LP治疗呈正相关的模块。与LP正相关最强的模块是MEyellow;该模块中的基因在包括FAR-RED impairment RESPONSE1在内的MapMan bin转录激活中富集。众所周知，FAR-RED受损的RESPONSE1参与光敏色素信号传递，但最近发现它调节PHR1在拟南芥中的表达[46］．这可能表明，FAR-RED受损的RESPONSE1转录因子调节葡萄早期LP转录组反应。许多参与染色质修饰和RNA加工的基因如DICER-LIKE1而且DICER-LIKE3与MEyellow最具正相关的基因列表中均存在。在拟南芥中，DICER-LIKE1参与了microRNAs的形成，已知这些microRNAs在响应Pi饥饿时产生差异[9］．DICER-LIKE3产生的siRNAs直接引导DNA甲基化，并已被证明被Pi饥饿抑制[47];的存在DICER-LIKE3MEyellow基因表明，sirna定向的DNA甲基化可能在葡萄对磷有效性的反应中也很重要。DNA甲基化在两种植物的Pi饥饿反应调控中都起着重要作用。48]和多年生植物[49］．拟南芥中PSI基因表达调控与染色质修饰有关[50在所有接穗/砧木组合的LP上调基因中都存在一个转座酶样蛋白，这表明这可能在葡萄中也很重要。

葡萄基因型对LP的反应不同吗?

在HP和LP条件下研究的两种不同基因型中，根系中许多基因为DE，其中MEturquoise和MEgreen模块分别与砧木1103P和PN相关。两个砧木之间的基因DE与各种酶和NLR效应受体相关，在葡萄的其他基因型特异性转录组比较中也获得了类似的结果[51，52］．两个同源移植物对磷供应的转录组反应也不同;LP处理27 h后，PN/PN的转录组反应较1103P/1103P更为广泛，但两种基因型的基因表达质性变化相似。与铁、有机酸和硫酸盐转运、碳代谢相关的基因以及与激素信号相关的基因在两个同源移植物之间为DE。两个同源移植物对LP的反应中，大量的TF是DE，这表明用于调节LP反应的TF网络的基因型不同。

接穗基因型是否改变砧木转录组及其对磷供应的响应?

关于多年生植物接穗中砧木如何改变基因表达的文献已有大量研究。53，54，55，56，57和一年生作物[58]，以及接穗对不同环境条件的反应[59，60］．然而，很少有研究反过来研究接穗如何改变砧木的转录组及其对环境的响应。在这项研究中，我们只发现了一份转录本，VViBURP17，在所有异种移植物中，其丰度均高于相应的同种移植物对照。这表明与非自接穗嫁接没有保守的根系转录组反应，每个砧木的反应不同。

在葡萄中，嫁接非自根茎会触发防御和应激反应相关基因的差异表达(如编码次生代谢物和受体激酶生物合成的基因)、染色质修饰、转录调控和激素信号传导[53，54在接穗上。在与非自接穗嫁接的反应中，根中有类似的基因DE。此外，在WGCNA中发现的一些接穗响应转录本和潜在的枢纽基因表明，本研究中使用的接穗改变了富含半胱氨酸的肽信号和microRNA的产生(特别是microRNA 396)。也有可能，一些接穗响应转录本实际上是从接穗移动到砧木的mrna，这种移动是复杂的，在烟草/番茄移植物中似乎涉及调控和非调控组分[61］．我们假设这些与防御和胁迫相关的接穗反应转录本与不亲和性问题无关，因为葡萄藤在离体培养中相对容易嫁接，且处理是在嫁接10周后进行的。

接穗对砧木对LP反应的影响取决于所研究的砧木;只有6个基因在PN/1103P和PN/PN之间存在DE, 364个基因在PN/1103P和1103P/1103P之间存在DE。这主要是因为与其他接穗/砧木组合相比，1103P/1103P对LP反应的DE基因较少。总的来说，这364个基因表达的质变在两个接穗基因型之间是相似的，尤其是对LP反应下调的基因。在PN/1103P和1103P/1103P之间的364个基因DE中MapMan bin的富集表明PN接枝对乙烯信号和氨基酸的生物合成有特殊的影响。

本研究表明，嫁接后的葡萄植株经过短时间(27 h) LP处理后，根系中许多基因发生了差异调控;在所有的接穗/根茎中都发现了一组对LP反应的核心基因DE，令人惊讶的是，它只包含少量在拟南芥中发现的PSI基因(尽管这些基因中的4个在处理28 d后被诱导)。这组DE核心基因中下调基因比上调基因多，且许多与二苯乙烯合成相关的基因出现在下调基因列表中。比较两种同种移植物对LP的反应，强调了转录反应的基因型特异性变异。在对LP转录应答的基因型特异性变异的基础上，接穗还以砧木基因型特异性的方式修饰了对LP的砧木基因表达响应。通过加权基因共表达网络分析，确定了与磷供应、砧木和接穗基因型相关的基因簇。这些数据表明，与磷供应相关的潜在韧皮部移动信号在不同的接穗/砧木基因型中受到不同的调控;这些信号包括代谢物、富含半胱氨酸的多肽、激素(如独角内酯和乙烯)和microRNAs。虽然我们知道这些信号在模式物种中从茎部传递信息到根部，但我们在这里表明，作物物种的遗传变异可能会改变嫁接植物中的这些信号事件。本研究强调了研究嫁接植株在砧木选择中的重要性，以及接穗基因型可以改变根系对环境的反应。

植物材料和生长条件

一种美国砧木基因型诉? ?x诉rupestris混合的简历。' 1103 Paulsen ' (1103P，克隆198;葡萄国际品种目录编号:9023)，采集自法国波尔多的一个葡萄园(根据机构指南)。法国蒙彼利埃瓦萨尔市资源生物中心(ampélographique de Vassal)通过简单的序列重复标记对1103P进行了鉴定。的诉酿酒用葡萄所使用的基因型来自命名为400,024 (PN)的黑皮诺自花授粉的有性生殖，由法国INRAE Colmar提供，其基因组由法国-意大利财团测序[62在离体培养中也能很好地生长和嫁接。获得这种植物材料不需要许可。两种基因型均经表面消毒后进行体外培养。四种可能的接穗/砧木组合均采用裂接系统，即1103P/1103P、1103P/PN、PN/1103P和PN/PN进行体外微接。用添加30 g L的McCown木本植物培养基(Duchefa)进行离体培养⁻¹在22℃、光周期为16 h /8 h、光子通量密度为55 μmol m的生长室中制备了蔗糖、0.27 μM 1-萘乙酸和0.4%琼脂⁻²年代⁻¹．6周龄的幼苗在26℃、光周期为16 h /8 h、光子通量密度为145 μmol m、充珍珠岩、水灌溉的生长室内驯化4周⁻²年代⁻¹在植物的水平。然后将植物转移到加气溶液的水培中;每个花盆中有2株相同的接穗/砧木组合，加入700 mL高磷溶液(HP, 0.6 mM P)。4天后，一半花盆继续接受HP溶液，另一半花盆接受低磷(LP, 0.001 mM P)处理。宏量营养成分为2.45 mM KNO_3.， 0.69 mM MgSO₄1.27 mM CaCl₂HP和LP解决方案;HP溶液中还含有0.6 mM KH₂阿宝₄和0.6 mM CaSO₄而LP溶液中K含量为0.3 mM₂所以₄0.3 mM CaSO₄．微量营养素供给为46 μmol H_3.薄_3.， 9.1 μmol MnCl₂， 2.4 μmol ZnSO₄， 0.5 μmol CuSO₄14 nmol (NH₄）₆莫₇O₂₄铁的供给为8.5 mg L⁻¹Sequestrene 138(即31.3 μmol乙二胺-N,N’-双(2-羟基苯乙酸)NaFe, Syngenta Agro S.A.S.)。每周更换一次溶液，持续28 d。

RNA提取

LP和HP处理27 h和28 d后，采收3个根尖池(每株约15 mm长)，立即在N液中速冻，分别进行RNA测序(RNA- seq)和定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)分析。样品的总RNA提取采用植物总RNA谱试剂盒(Sigma-Aldrich)，并如前所述进行了一些修改[54］．

RT-qPCR分析

使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)将总RNA (1.5 μg)反转录为cDNA。根据供应商描述的步骤，在iCycler iqqh (Bio-Rad)上使用SYBR Green进行定量反转录聚合酶链反应，每个基因使用0.2 μM的引物。基因表达量以归一化相对量计算[63有三个参考基因。引物序列列在附加文件中12．统计分析采用R [64］．数据分析采用双向方差分析(p< 0.05，经Tukey 's诚实显著性差异检验)。

RNA序列

根据制造商说明，使用TruSeq搁浅mRNA LT样品制备试剂盒(Illumina)从500 ng总RNA中生成RNA测序文库。然后使用Illumina Hiseq 4000对这些文库进行测序，根据Illumina的说明产生50 bp的对端reads。RNA-seq数据已存入ArrayExpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress［65)，注册号为E-MTAB-8678。

RNA-Seq数据预处理

适配器二聚体读取使用DimerRemover (https://sourceforge.net/projects/dimerremover/)，并使用FastQC v0.11.2评估每个样品的质量[66］．转录本丰度用三文鱼v0.13.1进行量化[67——seqBias——gcBias——fldMean 50——fldSD 1——validatemaps -rangeFactorizationBins 4。使用tximport R包将量化结果连接到计数矩阵[68］．经质量验证后，有一个样品被确定为异常值，并从后续分析中丢弃。

基因组功能注释

V3注释的基因模型[69]根据arapport11(06.17.16号版本，https://www.araport.org/)蛋白数据库，其中DIAMOND 0.9.19版本软件的blastx功能设置为默认参数，并在最高对齐评分的1%范围内报告对齐[70］．对于每个V3基因模型，保留最佳爆炸命中(1比1)，对于得分相同的多次命中(1比多)，保留第一次命中作为代表，保持其他命中可访问。从arapport11 gff文件(release 06.22.16)中获得相应的基因注释，并下载V1 id对应的(https://urgi.versailles.inra.fr/Species/Vitis/Annotations)．

加权基因共表达网络分析

利用R中WGCNA软件包(v1.63)构建共表达基因网络[71，72］．筛选低表达基因后，共使用24190个基因。β的幂值设为11。模块特征基因用于评估26个识别的基因模块与实验变量之间的相关性。然后，计算每个模块的每个基因的kME值(基于模块特征基因的连通性)。对每个模块本征基因筛选出相关系数为> 0.80、a的高相关基因p-value < 0.01，用于进行下面描述的富集分析。

差异表达分析和MapMan BIN富集。

R包73使用以下阈值检测差异表达(DE)基因:调整错误发现率(FDR)p-value < 0.01 and |log2 fold change (LFC)| > 1。MapMan BIN代码[74]被归因于每个基因的墨卡托4 (http://plabipd.de/portal/mercator-ii-alpha-version-)。富集分析采用Fisher’s检验，结果经Bonferroni’s校正p-value <= 0.05，富集> 1。

在当前研究中生成的数据集可在ArrayExpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress［65)，注册号为E-MTAB-8678。

1103 p:

葡萄? ?x诉rupestris品种1103 Paulsen

4 cl:

4-COUMAROYL COA-LIGASE;

阿坝:

脱落酸

bHLH:

基本helix-loop-helix

C4H:

CINNAMATE-4-HYDROXYLASE

德:

差异表达

小块土地:

乙烯反应的因素

惠普:

高磷

“诱导多能性”:

磷酸盐饥饿诱导1

LP:

低磷

NLR:

核苷酸结合域和富含亮氨酸的重复

病人:

磷

朋友:

苯丙氨酸AMMONIA-LYASE

PHO2:

PHOSPHATE2

PHR1:

磷酸饥饿RESPONSE1

PHT1:

磷酸TRANSPORTER1

Pi:

正磷酸盐

PN:

诉酿酒用葡萄品种黑比诺

PSI:

Phosphate-starvation-inducible

RNA-Seq:

RNA-sequencing

RT-qPCR:

定量逆转录聚合酶链反应

SPX:

SYG / PHO81 / XPR1

STS:

芪合酶

TF:

转录因子

设备:

酪氨酸KINASE-LIKE

维特:

空泡的铁转运蛋白

WGCNA:

加权基因共表达网络分析。

rna测序由法国Génomique联盟(ANR-10-INBS-0009)的成员genome east平台进行。

该研究是在法国国家研究机构(ANR)的资金支持下进行的，该资助是在对未来项目的投资框架下进行的，隶属于COTE优秀集群(ANR-10- labx -45);AG的博士生和耗材费用由该基金支付。

从属关系

1. EGFV，波尔多农业科学，INRAE，波尔多大学，ISVV, 33882，维伦纳夫德奥农，法国

   Antoine T. Gautier, Isabelle Merlin, Cyril Hevin, Virginie Lauvergeat, Philippe Vivin, Nathalie olat和Sarah J. Cookson

2. 作物生产和生物刺激实验室，Université自由布鲁塞尔，校园平原，B-1050，比利时布鲁塞尔

   安东尼·t·Gautier

3. 内华达大学生物化学与分子生物学系，美国里诺市89557

   一个Cochetel

4. ISPA，波尔多农业科学学院，INRAE, 33140，维伦纳夫德奥农，法国

   阿兰•莫里尔

贡献

AG、CH和IM进行实验和数据收集，NC分析数据，AG和SC准备数据，SC起草稿件，所有作者修改、阅读和批准稿件。

相应的作者

对应到莎拉·j·Cookson．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者们声明除了《BMC植物生物学》的副编辑Sarah Jane Cookson外，他们没有任何竞争利益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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