综合sRNAome和RNA-Seq分析揭示了miRNA对火龙果甜菜素生物合成的影响

背景

MicroRNAs (miRNAs)及其在花青素、类胡萝卜素和叶绿素积累中的调节功能已在许多植物物种中被广泛表征。然而，miRNA在甜菜素生物合成中的调控机制仍然是未知的。

结果

在本研究中，首次分离到126个保守mirna和41个新mirnaHylocereus monacanthus，其中95个保守miRNA属于53个miRNA家族。34个与甜菜素生物合成相关的候选mirna有差异表达。采用RT-qPCR技术分析不同火龙果组织中差异表达mirna的表达模式。其中一半mirna的表达水平与相应的靶基因呈显著负相关。mirna的靶基因Hmo-miR157b-HmSPL6-likeHmo-miR160a -Hpcyt P450-like3Hmo-miR6020 -HmCYP71A8-likeHmo-novel-2 -HmCYP83B1-likeHmo-novel-15 -HmTPST-likeHmo-miR828a -HmTT2-likeHmo-miR858 -HmMYB12-likeHmo-miR858 -HmMYBC1-like和Hmo-miR858 -HmMYB2-like用5'RACE和烟草瞬时表达系统进行验证。

结论

Hmo-miR157b, Hmo-miR160a, Hmo-miR6020 Hmo-novel-2, Hmo-novel-15, Hmo-miR828a和Hmo-miR858在火龙果果实着色和甜菜蛋白酶积累中起重要作用。我们的发现为mirna及其靶基因在火龙果甜菜素合成调控功能中的作用提供了新的见解。

成熟microRNAs (Mature microRNAs, miRNAs)是一种内源性的非编码小rna，长度为20-24个核苷酸(nt)。miRNAs在转录后水平通过rna诱导沉默复合体(RISC)调控靶基因，与Argonaute (AGO)蛋白结合，切割靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 1" title="1" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e858">1］．miRNAs在植物生长发育中起着至关重要的作用，(a)生物应激反应、转录后调控和色素调控[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="2" href="#ref-CR2" id="ref-link-section-d3130527e861">2，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="3." href="#ref-CR3" id="ref-link-section-d3130527e861_1">3.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 4" title="4" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e864">4］．

miRNAs参与叶绿素、类胡萝卜素和花青素的生物合成。miRNAs可调节着色和叶绿素积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 3" title="3." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e870">3.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="5" href="#ref-CR5" id="ref-link-section-d3130527e873">5，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="6" href="#ref-CR6" id="ref-link-section-d3130527e873_1">6，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e876">7］．人工miRNA过表达osa-miR171b可促进水稻叶片叶绿素积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 7" title="7" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e879">7］．基于严重干旱胁迫下叶绿素浓度的降低，构建了一个由2个上调miRNA和19个下调miRNA组成的miRNA调控网络茶树［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 3" title="3." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e886">3.］．miRNAs参与调节类胡萝卜素途径[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="8" href="#ref-CR8" id="ref-link-section-d3130527e889">8，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="9" href="#ref-CR9" id="ref-link-section-d3130527e889_1">9，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="10" href="#ref-CR10" id="ref-link-section-d3130527e889_2">10，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="11" href="#ref-CR11" id="ref-link-section-d3130527e889_3">11，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 12" title="12" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e892">12］．miR1857影响甜橙红肉突变体及其野生型胡萝卜素的发生[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e895">8］．根据5种miRNAs的表达分析，在不同的玫瑰品种中，miRNAs可能负调控靶基因以防止类胡萝卜素积累导致白花[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 9" title="9" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e898">9］．miRNAs也可以通过其靶基因调控花青素的积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="13" href="#ref-CR13" id="ref-link-section-d3130527e901">13，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="14" href="#ref-CR14" id="ref-link-section-d3130527e901_1">14，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="15" href="#ref-CR15" id="ref-link-section-d3130527e901_2">15，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="16" href="#ref-CR16" id="ref-link-section-d3130527e901_3">16，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="17" href="#ref-CR17" id="ref-link-section-d3130527e901_4">17，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="18" href="#ref-CR18" id="ref-link-section-d3130527e901_5">18，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="19" href="#ref-CR19" id="ref-link-section-d3130527e901_6">19，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="20." href="#ref-CR20" id="ref-link-section-d3130527e901_7">20.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="21" href="#ref-CR21" id="ref-link-section-d3130527e901_8">21，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="22" href="#ref-CR22" id="ref-link-section-d3130527e901_9">22，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="23" href="#ref-CR23" id="ref-link-section-d3130527e901_10">23，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="24" href="#ref-CR24" id="ref-link-section-d3130527e901_11">24，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 25" title="25" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e905">25］．随着miR156丰度的增加，花青素的积累得到促进拟南芥［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e911">13]和荔枝[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e914">20.］．然而，miR156丰度的降低会导致黄酮醇的积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e917">13］．miR156正调控花青素积累通过靶向SPL转录因子[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e924">23］．miR828通过抑制花青素的表达负调控花青素的积累MYB75，MYB90,MYB113在拟南芥［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e939">14］．此外，miR858及其参与花青素积累的靶点已从苹果、棉花和番茄中鉴定出来[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e943">15，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 17" title="17" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e946">17，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 18" title="18" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e949">18］．

火龙果，也被称为火龙果或火龙果，是属于属的多年生攀缘水果作物Hylocereus(仙人掌科)石竹目。作为仙人掌科的一种，火龙果表现出一系列对干旱土地的特殊适应，包括多肉的茎和刺而不是叶子，以及果苏酸代谢(CAM)途径[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="26" href="#ref-CR26" id="ref-link-section-d3130527e958">26，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="27" href="#ref-CR27" id="ref-link-section-d3130527e958_1">27，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 28" title="28" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e961">28］．是基础生物学和应用生物学研究的优良植物材料。火龙果的潜在经济影响在于它的多种用途，不仅可以作为农产品和加工食品，还可以用于工业和医药产品。火龙果是一种快速回产的水果作物，种植后第二年即可生产，3-4年即可完全生产。火龙果开花后28-50天成熟(夏季28-35天，秋季35-50天)，由于华南气候或营养限制，每年有7-12个独立的结果期。因此，火龙果已经成为东南亚、中国、美国、以色列、澳大利亚、塞浦路斯和加那利群岛许多农民和家庭园丁最喜欢的水果。

火龙果的颜色归因于甜菜碱的存在[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="29" href="#ref-CR29" id="ref-link-section-d3130527e967">29，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="30." href="#ref-CR30" id="ref-link-section-d3130527e967_1">30.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="31" href="#ref-CR31" id="ref-link-section-d3130527e967_2">31，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 32" title="32" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e970">32］．甜菜素是红色和黄色的生物碱色素，存在于石竹科所有科中，但石竹科和石竹科除外，它们产生花青素[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 33" title="33" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e973">33］．火龙果中的甜菜素不仅对人体健康有益，还能帮助消费者区分火龙果品种[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 29" title="29" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e976">29，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 34" title="34" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e979">34，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 35" title="35" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e983">35］．甜菜素在抵御干旱、紫外线辐射、高盐碱度土壤和疾病方面也发挥着重要作用[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="35" href="#ref-CR35" id="ref-link-section-d3130527e986">35，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="36" href="#ref-CR36" id="ref-link-section-d3130527e986_1">36，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="37" href="#ref-CR37" id="ref-link-section-d3130527e986_2">37，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="38" href="#ref-CR38" id="ref-link-section-d3130527e986_3">38，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 39" title="39" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e989">39］．火龙果是唯一一种大规模商业种植的水果，含有丰富的甜菜素。以往的研究主要集中在甜菜蛋白酶生物合成的关键基因和转录因子的鉴定。关键基因如酪氨酸酶（酪氨酸)，细胞色素P450（Cyt P450)，4, 5-dihydroxy-phenylalanine（二羟基苯丙氨酸）加双氧酶（国防部),葡糖基转移酶（GTs) [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 40" title="40" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e1024">40]和诸如WRKY而且MYB参与甜菜素生物合成的研究已得到详细研究[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="41" href="#ref-CR41" id="ref-link-section-d3130527e1033">41，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="42" href="#ref-CR42" id="ref-link-section-d3130527e1033_1">42，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 43" title="43" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e1036">43］．然而，mirna在甜菜蛋白酶生物合成中的作用尚未见报道。本研究基于火龙果不同发育阶段果肉的小RNA和转录组数据库，鉴定了与甜菜蛋白酶生物合成相关的候选miRNAs及其靶基因。本研究的目的是探索miRNA在火龙果甜菜碱生物合成中的作用，这可能有助于更好地理解火龙果甜菜碱生物合成Hylocereus．

sRNAs和转录组的测序

利用19日“关华红”火龙果果肉生成6个sRNA文库，鉴定mirna^th开花后(DAF)(白浆期，Hp19d_1和Hp19d_2)， 25^thDAF(纸浆着色阶段，Hp25d_1和Hp25d_2)和29^thDAF(成熟期，Hp29d_1, Hp29d_2)。Illumina测序的数据来自19个sRNAs^th, 25^th和29^thDAF显示24个nt sRNAs数量最多，其次是21个nt sRNAs(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S1)．从sRNA数据集中共获得82,318,241个reads。取下适配器后，插入polyA和短rna<共获得62,729,725(76.20%)条有效reads，包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和部分其他Rfam RNA(表2 - 4)<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S1)．

利用19日“观花红”火龙果果肉构建了3个转录组文库，鉴定mirna的靶基因^thDAF(白浆期，Hp19d)， 25^thDAF(纸浆着色阶段，Hp25d)和29^thDAF(成熟期，Hp29d)。所有筛选的reads从头组装成68505个N50为1700 bp的转录本。然后，这些转录本被组装成39737个独特的序列，平均长度为879 bp。这些转录本和unigenes的长度分布如图所示<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2．图中总结了转录组数据集中不同GC含量的转录本和基因的分布情况<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S3．大多数转录本和基因GC含量在35-50%之间。

mirna的鉴定

通过BLAST搜索和序列分析，与miRBase中已知成熟植物mirna的序列进行比较，共鉴定出126个保守的mirna<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2)．其中95个已知mirna来自53个科。每个家族的miRNA成员数量从1 (MIR535)到7 (MIR482)不等(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S4)．基于结构和表达标准，使用sRNA有效读取来预测新的mirna [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 44" title="44" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e1106">44］．41个新的候选miRNAs具有明确的前体，包括茎环二级结构(表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2)．新miRNAs的长度在20 ~ 25nt之间。最多的序列为21 nt-length(49%)，其次为24 nt-length(29%)，这与成熟miRNAs的典型长度分布一致。miRNA表达水平越高，测序的miRNA拷贝数越多。除了Hmo-novel-2、Hmo-novel-6、Hmo-novel-21和Hmo-novel-22拥有超过100个标准化reads外，已知mirna的丰度高于假定的新mirna(表2)<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2)．

差异表达mirna的分析

采用高通量测序(HTS)技术，研究了“观花红”火龙果中甜菜素生物合成相关mirna的表达变化。只有表达值为的mirnap< 0.05为显著调控。在Hp29d/Hp25d/Hp19d中，发现33个已知mirna和5个新mirna存在差异表达(表2)<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">1)．

火龙果果实发育过程中mirna表达水平的变化可能反映了其潜在的功能差异。在“观花红”火龙果不同浆色期，Hmo-miR396b、Hmo-miR535、Hmo-novel-7和Hmo-novel-12在红浆期的表达量(25^th和29^thDAP)显著高于白浆期(19^thDAP)(表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="table anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">1)．Hmo-miR156、Hmo-miR157b、Hmo-miR164a、Hmo-miR164b和Hmo-miR399a的表达水平从19^thDAF到29^th“关华红”火龙果中的DAF。这些结果与甜菜蛋白酶的积累模式一致[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e2512">45，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 46" title="46" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e2515">46］．而Hmo-miR171c、Hmo-miR408、Hmo-miR393、Hmo-miR398c、Hmo-miR8175、Hmo-miR398a、Hmo-miR168a、Hmo-miR529b、Hmo-miR398b、Hmo-miR172a、Hmo-miR159a、Hmo-miR397b的表达水平逐渐下降^thDAF到29^th观花红火龙果成熟过程中的DAF。12种差异表达的mirna，即Hmo-miR390a, Hmo-miR6149a, Hmo-miR159b, Hmo-miR530, Hmo-miR6300, Hmo-miR390b, Hmo-miR6020, Hmo-miR394, Hmo-miR5072, Hmo-novel-15, Hmo-miR171d和Hmo-miR482f，在红浆期表达水平较低(25^th和29^th与相对较高的白髓期表达量(19^thDAP)。这些结果与甜菜蛋白酶的积累模式相反，表明这些mirna在甜菜蛋白酶积累过程中负向调控其靶基因。

转录组分析的生物信息学

39737条唯一序列均采用BLAST (cut-off - E-value≤10⁻⁵) Nr、Swiss-Prot Protein、Pfam、Gene Ontology (GO)、euKaryotic Ortholog Groups (KOG)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库(表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S3)．

利用GO、KEGG和KOG数据库对预测unigenes的功能进行分类。GO数据库将12000 559个unigenes分为三个主要类别:“生物过程”、“细胞成分”和“分子功能”(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">1)．在“分子功能”类别中，“ATP结合”中聚集的unigenes最多，而“细胞成分”类别的主要基团是“膜整体”(2878个unigenes, 23%)，“细胞核”(2211个unigenes, 18%)和“质膜”(1646个unigenes, 13%)。在“生物过程”类别中，“dna依赖的转录调控”(729个unigenes, 5.8%)和“dna依赖的转录”(706个unigenes, 5.6%)是两个最丰富的亚类别。

7822个unigenes被映射到KEGG通路上。unigenes数量最多的是碳水化合物代谢(796个)，其次是能量代谢(596个)、氨基酸代谢(595个)和翻译(510个)(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">2)．分析Hp25d-VS-Hp19d、Hp29d-VS-Hp19d和Hp29d-VS-Hp25d的差异表达基因(DEGs)。在hp25d - vshp19d中，24、20、16和13个DEGs参与苯丙类、二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素生物合成、DNA复制和类黄酮生物合成途径(p< 0.0001)(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">3.),分别。在Hp29d-VS-Hp19d中，有140个基因表达差异显著(p < 0.0001)，包括苯丙类、黄酮、二苯乙烯类、二芳基庚烷类和姜辣素的生物合成，苯丙氨酸、α-亚麻酸、淀粉和蔗糖的代谢，Cyt P450对异种生物的代谢，以及药物代谢-Cyt P450(图)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">3.b).同一通路中不同组间DEGs表达水平变化幅度不同。在Hp25d-VS-Hp19d和Hp29d-VS-Hp19d中分别从类黄酮生物合成途径中检测到13个DEGs。然而，在Hp29d-VS-Hp25d中未发现与类黄酮生物合成相关的DEGs(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">3.c).上述结果表明，黄酮类化合物的生物合成是火龙果甜菜素生物合成的重要途径。

KOG数据库用于研究同源蛋白的分类和进化速率。如图所示。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">4在火龙果数据集中，R组(仅用于一般功能预测)、O组(翻译后修饰、蛋白质转换、陪伴物)和T组(信号转导机制)是数量最多的3个组，说明在火龙果果实发育过程中涉及大量基因表达和功能的转录和翻译后调控。

通过表达折叠(|log)两两比较评估来自三个发育阶段(Hp25d-VS-Hp19d、Hp29d-VS-Hp19d和Hp29d-VS-Hp25d)的deg₂折叠变化|≥1)和p值< 0.05为阈值(图;<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">5)．在任意两个阶段的两两比较中，发现有3988个基因表达显著差异。在Hp19d和Hp29d库中获得的DEGs数量最多，其中下调的有1486个，上调的有733个。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">5a).在Hp25d和Hp29d库中检测到的DEGs最少，为1835个(下调987个，上调848个)，其次是Hp19d和Hp25d库(1961个，下调1274个，上调687个)。其中124个基因在“观花红”火龙果的三个果实发育阶段均有显著差异表达。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">5b)。

验证sRNAome和RNA-Seq数据的准确性

为了验证sRNAome和RNA-Seq结果的可靠性，通过RT-qPCR分析了15个与甜菜蛋白酶生物合成相关的mirna和15个基因的表达。表中显示了30个转录本的id、外显子模型每百万映射读(RPKM)值的Reads Per Kilobase和引物<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2，<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S5，<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S6,<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S8,分别。线性回归分析[(Q-PCR值)= a (sRNAome或RNA-Seq值)+ b]，得到0.717**和0.719**的总相关系数(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">6)，表明sRNAome和转录组的结果与RT-qPCR的结果一致。这些结果表明sRNAome和RNA-Seq的数据可以用于后续的实验。

预测差异表达mirna的靶点

为了研究mirna在火龙果甜菜蛋白酶生物合成中的作用，预测其靶基因是至关重要的。通过Target Finder软件预测差异表达mirna的靶基因。转录组转录本被认为是大多数miRNAs的可能靶基因。共获得124个靶标mrna, 25个保守miRNAs的22个靶标mrna和5个新miRNAs的靶标mrna<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S9)．对大多数miRNAs预测有一个以上的靶基因。miRNAs具有调节属于具有不同生物学功能的特定基因家族的靶标的潜力。例如，Hmo-miR529b预测的靶基因涉及鳞状突起启动子结合样蛋白6 (SPL6)、组蛋白赖氨酸n-甲基转移酶和泛素蛋白连接酶。基于转录组注释，筛选出6个参与甜菜素生物合成的靶点[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e2797">23，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="40" href="#ref-CR40" id="ref-link-section-d3130527e2800">40，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="41" href="#ref-CR41" id="ref-link-section-d3130527e2800_1">41，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 42" title="42" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e2803">42］．其中,HmCYP83B1-like，HmCYP71A8-like，HmTPST-like，HmWDTC1-like而且HmSPL16-like分别被Hmo-novel-2、Hmo-miR6020、Hmo-novel-15、Hmo-miR164a和Hmo-miR156靶向HmSPL6-likeHmo-miR156、Hmo-miR157b和Hmo-miR529b共同靶向。

差异表达miRNAs的组织特异性分析

在特定组织中优先表达的miRNA可以为其生理功能提供线索。采用RT-qPCR方法分析了30个差异表达的mirna的功能，分别来自“关花白”和“关花红”火龙果的10个不同组织。如图所示。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">7， 30个差异表达的mirna在火龙果组织中表达水平不同。Hmo-miR172a、Hmo-miR394、Hmo-miR530、Hmo-miR6020、Hmo-miR397b、Hmo-miR160b和Hmo-miR398b表达模式相似。Hmo-miR156在火龙果根和果实中优先表达。Hmo-miR398a在火龙果雄蕊中表达较强，在其他组织中表达较弱。Hmo-novel-7和Hmo-miR171d在花瓣中表达量较高，在其他组织中表达量中等或弱。Hmo-miR164a和Hmo-miR164b呈本构性表达，在火龙果中表达量最高。Hmo-miR396b和Hmo-miR5072在“观花白”火龙果花瓣中的表达高于“观花红”火龙果花瓣中Hmo-miR171c和Hmo-novel-2的表达。Hmo-novel-12、Hmo-novel-21、Hmo-novel-15、Hmo-miR393、Hmo-miR390b、Hmo-miR159a和Hmo-miR408在“观花红”火龙果的花瓣和花托中优先表达。Hmo-miR157b和Hmo-miR6300分别在“观花红”和“观花白”火龙果中高表达。RT-qPCR结果表明，火龙果中30个miRNAs的表达具有组织和/或品种特征。

与甜菜蛋白酶生物合成相关的mirna和靶基因的验证

根据注释转录本和先前有关色素合成的报道，筛选参与火龙果甜菜素生物合成的mirna。RT-qPCR检测了11个mirna预测的14个靶基因。“观花红”和“观花白”火龙果的靶基因序列相同(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S5)．随着miRNA表达的增加或减少，有16个靶标的表达呈减少或增加趋势，提示它们可能被miRNA积极裂解(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8)．例如,Hpcyt P450-like3(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A9和B9)和Hpcyt P450-like2(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8Hmo-miR160a靶向A10和B10)，HmMYB12-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A5),HmMYBC1-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A6)和HmMYB2-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A7) Hmo-miR858靶向HmCYP71A8-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8Hmo-miR6020靶向的A2)在火龙果浆着色各阶段均表现出先升高后降低的表达趋势，而Hmo-miR160a、Hmo-miR858和Hmo-miR6020在火龙果浆着色各阶段均表现出相反的表达趋势。HmSPL6-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8Hmo-miR156靶向的A15)在火龙果浆色各阶段均呈下降趋势，而Hmo-miR156靶向的A15呈上升趋势。然而，一些靶向基因及其miRNAs如HmTPST-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8B11) Hmo-novel-15在“观花红”火龙果和HmSPL6-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8Hmo-miR529b靶向的A13基因在“观花白”火龙果各果肉期的表达模式相似。

5’race分析进一步验证了14个候选靶点。的HmSPL6-like，HmTT2-like，HmMYB12-like，HmMYBC1-like，Hpcyt P450-like3，HmCYP83B1-like而且HmTPST-like被其相应的mirna所证实(图;<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9)．Hmo-novel-2的裂解位点HmCYP83B1-like和Hmo-novel-15HmTPST-like都发生在10点吗^th结合区mirna的5 '端核苷酸。Hmo-novel-2的解理频率HmCYP83B1-like和Hmo-novel-15HmTPST-like在“关花白”火龙果和“关花红”火龙果中分别达到10/10。这些结果证实了Hmo-novel-2和Hmo-novel-15可以引导mRNA的裂解HmCYP83B1-like而且HmTPST-like,分别。乳裂主要发生在10处^th5 '端结合位点上的核苷酸。然而,HmMYBC1-like发生在9点^th这可能是由于siRNA干扰导致miRNA切割mRNA范围广泛所致。此外，“观花红”火龙果的同一基因与“观花白”火龙果不同(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9)，这可能是两种火龙果果肉颜色不同的原因。

mirna与其靶基因的关系

建立瞬时表达系统，以证实miRNAs在体内降解其靶基因。靶基因中mirna的靶位点和修饰的靶位点(失活靶位点)被插入到含有增强绿色荧光蛋白的过表达载体(eGFP)基因。共有5个mirna和7个相应的靶基因，即Hmo-miR160a-Hpcyt P450-like2Hmo-miR6020 -HmCYP71A8-likeHmo-novel-2 -HmCYP83B1-likeHmo-novel-15 -HmTPST-likeHmo-miR858 -HmMYB12-likeHmo-miR858 -HmMYBC1-like和Hmo-miR858 -HmMYB2-like使用烟草瞬时表达系统验证了它们之间的相互作用(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S6)．Hmo-miR160a-的共表达Hpcyt P450-like2Hmo-miR6020 -HmCYP71A8-likeHmo-novel-2 -HmCYP83B1-likeHmo-novel-15 -HmTPST-likeHmo-miR858 -HmMYB12-likeHmo-miR858 -HmMYBC1-like和Hmo-miR858 -HmMYB2-like抑制了eGFP，表明miRNAs在体内降解其靶基因(图;<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10B2 4 6 8 10 12 14)结果与阳性对照一致(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S6B10, 18, 28, 32, 40和48)。miRNA与靶基因之间的相互作用可以影响miRNA的加工，导致火龙果中前体积累增加，成熟miRNA减少，并进一步调节火龙果中甜菜素的生物合成(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10)．

火龙果甜菜素的物理和化学性质研究已取得很大进展[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 47" title="47" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3333">47，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 48" title="48" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3336">48]、纯化鉴定[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="49" href="#ref-CR49" id="ref-link-section-d3130527e3339">49，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="50" href="#ref-CR50" id="ref-link-section-d3130527e3339_1">50，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="51" href="#ref-CR51" id="ref-link-section-d3130527e3339_2">51，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="52" href="#ref-CR52" id="ref-link-section-d3130527e3339_3">52，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="53" href="#ref-CR53" id="ref-link-section-d3130527e3339_4">53，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 54" title="54" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3342">54]、抗氧化及自由基清除能力[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="55" href="#ref-CR55" id="ref-link-section-d3130527e3345">55，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="56" href="#ref-CR56" id="ref-link-section-d3130527e3345_1">56，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 57" title="57" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3349">57]以及代谢和转录分析[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3352">45，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 46" title="46" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3355">46］．然而，目前还没有关于火龙果甜菜素生物合成过程中涉及的mirna的信息。因此，鉴定火龙果与其靶基因相关的miRNAs将有助于我们理解火龙果甜菜素生物合成的分子调控机制。在本研究中，通过转录组和sRNAome研究mirna在火龙果不同发育阶段着色机制中的作用。火龙果果肉中24 nt sRNAs的百分比(平均为58.03%)远高于21 nt sRNAs的百分比(平均为12.16%)(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S1)．这一结果与苹果和荔枝中sRNAs的长度分布一致[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3361">15，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3364">20.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 58" title="58" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3368">58]，但与草莓、橙子、芸苔属植物juncea，和apple [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 21" title="21" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3374">21，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="59" href="#ref-CR59" id="ref-link-section-d3130527e3377">59，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="60" href="#ref-CR60" id="ref-link-section-d3130527e3377_1">60，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 61" title="61" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3380">61]表明不同的植物种类有不同长度的sRNA分布。从“观花红”火龙果中鉴定出53个miRNA科的95个已知miRNA, 41个新miRNA (h . monacanthus)(表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2)．mirna在火龙果果实发育过程中表现出不同的表达水平，说明mirna在火龙果果实发育过程中起着重要作用。这些结果表明miRNAs通过在火龙果不同组织中的不同表达参与了火龙果的生长发育。

一般来说，保守的miRNAs与其他植物种类具有相同或同源的靶点，且大多数具有相似的功能。MIR156在次生代谢产物的生物合成中起着关键作用。MIR156通过SPL TFs正向调控花青素的合成，SPL TFs负向调控花青素的积累拟南芥，苹果，荔枝，和Pyrus pyrifolia［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 13" title="13" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3399">13，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3402">20.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 21" title="21" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3405">21，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 23" title="23" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3409">23］．Bgy-mir156调控靶基因八氢番茄红素合成酶（小组)，并影响胡萝卜中类胡萝卜素的累积(胡萝卜胡萝卜) [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 12" title="12" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3421">12］．甜菜素是次生代谢产物，但不能在一种植物中同时自然共存[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 62" title="62" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3424">62］．火龙果是一种高价值的功能性水果，含有丰富的甜菜素。在我们的研究中，Hmo-miR157b在23日的表达量最高^{理查德·道金斯}这表明Hmo-miR157b可能在甜菜蛋白酶积累过程中发挥重要作用。5'RACE的结果表明HmSPL6-like被Hmo-miR157b靶向(图;<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">7)．这些结果表明，Hmo-miR157b可能正调控甜菜素的生物合成SPLTFs,而SPLtf负向调控火龙果中甜菜蛋白酶的积累。

MiR828通过抑制花青素的表达参与花青素的生物合成MYBTFs的拟南芥、苹果和土豆[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3451">14，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3454">15，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 21" title="21" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3457">21，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 24" title="24" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3461">24］．在本研究中，表达水平HmTT2-like在23日^{理查德·道金斯}“观花红”火龙果的DAF低于“观花白”火龙果(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A1和B1)。HmTT2-like与火龙果中甜菜蛋白酶的积累呈负相关[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3475">45］．Hmo-miR828a在23号染色体上高度活跃^{理查德·道金斯}“观花红”火龙果的DAF(颜色转换)。Hmo-miR828a可以靶向HmTT2-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9B2),MYB表明Hmo-miR828a正向调控火龙果中甜菜素的积累。miR858可以直接或间接地控制花青素的生物合成拟南芥对花青素积累有负向调控作用MYB特遣部队(<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 14" title="14" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3497">14，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 15" title="15" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3500">15，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 17" title="17" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3503">17，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 18" title="18" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3506">18］．在本研究中，四个靶基因分别为HmMYB315-like，HmMYB12-like，HmMYBC1-like而且HmMYB2-like与Hmo-miR858在“关花白”火龙果中的阴性表达模式相同(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">8A5-A8和B5-B8)。5'RACE和瞬时表达分析表明Hmo-miR858具有靶向性HmMYB12-like，HmMYBC1-like,HmMYB2-like“观花红”火龙果(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9B3-B4和图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10A3-A8, B3-B8和C3-C8)。这些结果表明，Hmo-miR858可以通过促进火龙果甜菜素的积累MYB基因。

Hpcyt P450-like3甜菜素的生物合成在h . monacanthus［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 45" title="45" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3552">45］．在这项研究中，Hpcyt P450-like3被Hmo-miR160a靶向，这表明Hmo-miR160a参与了甜菜素的生物合成(图。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9B5)。新的miRNAs参与叶绿素、类胡萝卜素和花青素的积累。tu-novel-48可调节硬粒小麦叶片叶绿素的积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 6" title="6" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3561">6］．Csi-novel-03通过AP2TFs的柑橘类［<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 8" title="8" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3571">8］．在草莓花托果实成熟过程中，aba诱导的Fa_novel23导致果实花青素快速积累[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 25" title="25" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3574">25］．在我们的研究中，我们获得了两个新的mirna: Hmo-novel-2和Hmo-novel-15。Hmo-novel-2通过调控β -甜菜素的积累HmCYP83B1-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9A6-B6和图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10A11-C11和A12-C12)。Hmo-novel-15被确定为甜菜素生物合成的调节因子，调节甜菜素的表达HmTPST-like(无花果。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">9B7和<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10A13-C13和A14-C14)。Hmo-miR6020 -HmCYP71A8-like在5'RACE中未得到验证，但在烟草瞬态表达系统中得到验证(图2)。<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="figure anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">10A1-C1和A2-C2)表明转译抑制了miRNAs对其靶标的调控方式，而不是对mrna的降解。其余在HTS中差异表达的miRNAs及其靶基因在5’race和烟草瞬时表达系统中均未被证实，说明这些基因可能不是这些miRNAs的靶基因。需要进一步的工作来阐明它们在火龙果甜菜素生物合成中的作用。

在本研究中，sRNAome和RNA-Seq首次用于鉴定参与甜菜蛋白酶生物合成的差异表达mirna及其靶基因。综合sRNAome分析发现126个保守的mirna, 41个新mirna来自“观花红”火龙果(h . monacanthus)，其中95个保守miRNA属于53个miRNA家族。生成26.79 Gb RNA-Seq原始数据，重新组装成68505个转录本，其中39737个被注释。比较了火龙果不同发育阶段甜菜蛋白酶积累的mirna及其靶基因。通过5’race和烟草瞬时表达系统验证了7个目的基因。这些Hmo-miRNAs通过引导相应的靶mRNA切割或抑制翻译，负向调控其靶mRNA的表达。Hmo-miR157b -HmSPL6-likeHmo-miR160a -Hpcyt P450-like3Hmo-miR6020 -HmCYP71A8-likeHmo-novel-2 -HmCYP83B1-likeHmo-novel-15 -HmTPST-likeHmo-miR828a -HmTT2-likeHmo-miR858 -HmMYB12-likeHmo-miR858 -HmMYBC1-like和Hmo-miR858 -HmMYB2-like可能参与了火龙果中甜菜素的生物合成。本研究提供了miRNAs通过调控上游转录因子积极参与火龙果甜菜碱积累的新信息，这可能有助于进一步了解miRNAs在火龙果甜菜碱生物合成中的作用。

植物材料

两个火龙果品种，即“关华红”(红皮红瓤，h . monacanthus)和“冠花白”(红皮白浆，h . undatus),烟草benthamiana用作植物材料。“观花红”和“观花白”火龙果，经胡桂兵教授和秦永华教授(华南农业大学园艺学院)鉴定，从860株“红水景”(h . monacanthus) [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="63" href="#ref-CR63" id="ref-link-section-d3130527e3665">63，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" title="64" href="#ref-CR64" id="ref-link-section-d3130527e3665_1">64，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 65" title="65" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3669">65］．烟草benthamiana在25℃、昼夜条件为16 h/8 h的温室中生长，用于体内mirna与其靶基因的相互作用。华南农业大学提供了本研究中使用的所有植物材料，根据机构、国家和国际准则，为研究目的收集这些样本不需要特定的许可。以大岭山森林公园同一果园的“观花红”和“观花白”火龙果为研究对象，在13^th、16^th, 19岁^th, 23岁^{理查德·道金斯}, 25^th, 27岁^th和29^thDAF)(图<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S7)用于关键mirna及其靶标的表达分析。19日，“观花红”火龙果的果肉^thDAF(白髓期，Hp19d, Hp19d_1, Hp19d_2)， 25^thDAF(纸浆着色阶段，Hp25d, Hp25d_1, Hp25d_2)和29^thRNA-Seq和sRNAome采用DAF(成熟期，Hp29d, Hp29d_1, Hp29d_2)。所有样品立即在液氮中冷冻，并在−80°C保存，直到使用。

SRNAome和RNA-Seq

根据制造商说明，使用TruSeq小RNA样品准备试剂盒(Illumina, San Diego, USA)提取总RNA。RNA-Seq文库和sRNAome文库分别按照Han et al.(2016)和Liu et al.(2016)的程序进行[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3708">20.，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 66" title="66" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3711">66］．从两个生物重复中构建了6个小RNA文库(Hp19d_1、Hp19d_2、Hp25d_1、Hp25d_2、Hp29d_1和Hp29d_2)和3个RNA- seq文库(Hp19d、Hp25d和Hp29d) (<一个href="https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA588519?%20reviewer=ko91rr55muepqo1d25plnp0kv4">https://dataview.ncbi.nlm.nih.gov/object/PRJNA588519?评论家= ko91rr55muepqo1d25plnp0kv4)．所有HTS均由LC-BIO(杭州，中国)完成。

生物信息学分析

通过去除适配器、低质量标签和污染物，从sRNAome原始数据(原始读取)中获得干净的sRNA序列。将干净的sRNA序列与Rfam数据库(<一个href="http://rfam.sanger.ac.uk/">http://rfam.sanger.ac.uk/)，去除rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA。为了筛选已知的mirna, Bowtie将干净的数据映射到miRBase21.0中的参考序列[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 67" title="67" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3736">67］．miRNA前体被提交到RNAfold软件(<一个href="http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi">http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)来鉴定新的miRNA [<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 44" title="44" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3746">44］．

转录组原始数据的分析与sRNAome原始数据相同。干净的转录组数据用Trinity (<一个href="http://trinityrnaseq.github.io/">http://trinityrnaseq.github.io/)．Unigenes是基于与数据库中已知序列的最佳匹配进行初步鉴定的。

目的基因的预测和功能注释

通过Target Finder软件预测差异表达mirna的靶基因。用GO、KOG和KEGG分析目标基因的功能。E值≤10⁻⁵被认为是重大富集。

序列比对分析

使用DNAMAN软件(版本8)对多个序列进行比对。通过序列比对和人工分析确定miRNA靶点。

RT-qPCR分析mirna和靶基因

由于茎环RT-qPCR是一种高度敏感的miRNAs检测方法，因此采用茎环RT-qPCR来确认miRNAs的表达[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 68" title="68" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3789">68］．分别使用mmlv -逆转录酶(Invitrogen)和miRNA特异性茎环(stem-loop)和寡核苷酸(dT)引物从1.0 μg总RNA样本中制备cdna。特异性引物和PCR反应按照我们之前的方法进行[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 20" title="20." href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3792">20.］．RT-qPCR在ABI 7500 real-time PCR系统(Applied Biosystems, CA, USA)中使用SYBR qPCR Mix (Vazyme)进行。20微升反应液中含有2.0 μL稀释cdna (~ 15 ng/μL)， 10.0 μL 2 × SYBR qPCR Mix (Vazyme)，每个引物0.5 μL (10 μM)， 7.0 μL ddH₂所有实验均重复三次。U6而且肌动蛋白基因作为内参基因[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 69" title="69" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3804">69，<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 70" title="70" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3807">70］．mirna和靶基因序列见表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S2而且<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S10,分别。所有用于RT-qPCR分析的引物均列于表中<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S4，<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S5而且<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S6．2计算miRNAs和靶基因的表达量^-△△C_T方法(<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 71" title="71" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3829">71］．

5 'race分析

为了验证mirna介导的裂解事件，根据制造商手册，使用SMARTer®RACE 5 ' / 3'Kit用户手册(012615)(TaKaRa，大连，中国)进行RNA连接酶介导的5 ' RACE (rcm -RACE)。从29个果肉中提取1.0 μg总RNA^th分别用5'RNA接头连接DAF“关花红”和“关花白”火龙果。连接的mRNA被oligo (dT)引物反转录。使用5 '适配器引物和3 '基因特异性引物获得5 '最终产物。PCR产物插入pMD18-T载体(TaKaRa)。嵌套PCR的具体引物见表<一个data-track="click" data-track-label="link" data-track-action="supplementary material anchor" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x">S7．

瞬时表情分析

利用瞬时表达系统在体内证实了mirna与其靶基因之间的相互作用。表达载体的构建参照Liu等的方法进行[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 69" title="69" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3853">69］．分别构建甜菜蛋白酶生物合成相关miRNA和对照miRNA的过表达载体。miRNAs及其靶标的共表达n benthamiana叶子使用根癌土壤杆菌GV3101渗透。中的瞬态表达式n benthamiana如Sparkes等人所述(2006)[<一个data-track="click" data-track-action="reference anchor" data-track-label="link" data-test="citation-ref" aria-label="Reference 72" title="72" href="//www.cinefiend.com/articles/10.1186/s12870-020-02622-x" id="ref-link-section-d3130527e3865">72］．入渗3天后，用激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM800)观察叶片，激光波长为488 nm(激光强度为0.2%)，主增益值为550 ~ 700 V, ESID增益值为3，数字增益值为1.0。瞬时表达测定至少重复三次。

支持本研究结果的转录组清洁原始reads数据已提交给NCBI序列读取档案(SRA)，编号为SAMN13253272- SAMN13253280, Bioproject: PRJNA588519。在本研究过程中产生或分析的所有数据都包含在本文及其补充信息文件中。作者很乐意根据要求与大家分享这些数据。

5 'race:

5’cDNA末端快速扩增

前:

Argonaute

凸轮:

车尾菜酸代谢

互补脱氧核糖核酸:

互补脱氧核糖核酸

CYP:

细胞色素P450

Cyt P450酶:

细胞色素P450

DAF):

开花后翌日

度:

差异表达基因

国防部:

加双氧酶

二羟基苯丙氨酸:

4, 5-dihydroxy-phenylalanine

eGFP:

增强型绿色荧光蛋白

走:

基因本体论

GTs:

葡糖基转移酶

高温超导:

高通量测序

KEGG:

京都基因与基因组百科全书

KOG:

真核同源群

microrna的:

微

MYB:

Myb原癌基因蛋白

nt:

核苷酸

小组:

八氢番茄红素合成酶

RISC:

rna诱导沉默复合体

RNA-Seq:

RNA序列

RPKM:

每千碱基的外显子模型每百万映射读取

RT-qPCR:

逆转录定量实时聚合酶链反应

SPL:

Squamosa promoter-binding-like

TFs:

转录因子

TPST:

酪氨酸蛋白sulfotransferase

酪氨酸:

酪氨酸酶

WDTC1:

WD和四肽重复蛋白1

作者也要感谢大岭山森林公园果园同仁对实验材料的管理。

广东省重点领域研发计划项目(2018B020202011)、国家自然科学基金项目(31972367)、广州市科技计划项目(201904020015)、广州市科技计划项目(202002020060、201704020003、2014Y2-00164)、杨帆创新创业研究团队项目(2014YT02H013)资助。资助机构为这项研究支付了实验费用和出版费用，但在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有发挥任何作用。

从属关系

1. 华南农业大学园艺学院，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室/广东省果蔬采后科学重点实验室/园艺作物生物学与遗传改良(华南)重点实验室，广东广州510642

   陈灿斌，谢芳芳，华青竹，张露露，张志科，张荣，赵杰堂，胡桂兵，秦永华

2. 法国旱地农业和生物技术联合研究所，J.布劳斯坦沙漠研究所，内盖夫本-古里安大学，Sede Boqer校区，84990，贝尔谢巴，以色列

   Noemi Tel Zur

贡献

YHQ和CBC构想了这项研究，并设计了实验。CBC、FFX和QZH进行实验。LLZ, ZKZ, RZ, JTZ和GBH分析数据。CBC, NTZ和YHQ撰写了手稿。所有作者阅读并批准了手稿。

相应的作者

对应到<一个id="corresp-c1" href="mailto:qinyh@scau.edu.cn">陈会昌秦．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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