硫化氢对黄瓜中的CD诱导的细胞死亡产生负面调节（gydF4y2BaCucumis巨大成功gydF4y2BaL)根尖细胞gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

硫化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bas）是涉及调节对重金属应激的耐受性的气体信号分子。在这项研究中，我们调查了H的作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS中的镉（CD-）诱导黄瓜幼苗根尖的细胞死亡。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

结果表明，200μMCD引起的细胞死亡，增加了活性氧物质（ROS），染色质缩合的含量，从线粒体和活化的Caspase-3样蛋白酶释放细胞色素C（Cyt C）。用100μM硫化钠（NaHS，H）进行幼苗的预处理gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba小号供体）有效地缓和生长抑制和降低由镉胁迫根尖的细胞死亡。此外，硫氢化钠+ Cd处理能降低ROS水平和增强的抗氧化酶活性。预处理硫氢化钠也抑制细胞色素c从线粒体的释放，线粒体通透性转换孔（MPTP）的开口部，和caspase-3样在黄瓜的镉胁迫下幼苗的根尖蛋白酶的活性。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS通过减少ROS的积累、激活抗氧化系统、抑制线粒体Cyt c的释放和减少MPTP的开放来抑制cd诱导的黄瓜根尖细胞死亡。结果表明，HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS是cd诱导黄瓜幼苗根尖细胞死亡的负调控因子。gydF4y2Ba

环境作为人类活动的结果，镉（Cd）的污染已经引起了全世界的关注[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．Cd毒性可引起植物ROS升高、氧化损伤、脂质过氧化、细胞死亡和生长抑制[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．在Cd胁迫下，植物表现出叶片卷曲和褪绿等症状[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．根和小麦光合色素合成的伸长率镉胁迫下抑制作用[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．此外，Cd胁迫下菠菜植株的光合作用、氨基酸和蛋白质合成以及植株生长均降低[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．植物已经形成了应对复杂和恶劣环境的生理生化机制，其中一种自卫机制就是硫化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bas）。gydF4y2Ba

硫化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2Bas），这是反应性硫种类的重要组成部分[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]，最近被列为第三种气体传送器，仅次于一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO) [gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．在人类中,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS参与血液流动、神经传递、免疫反应、激素分泌和肌肉收缩系统[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba］．在植物中，低浓度的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS导致了一个气体信号分子的特性，植物可以合成内源性的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS在生物和非生物胁迫条件下[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba］．HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS可通过d-半胱氨酸脱巯基和β-氰基丙氨酸合酶来制造gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS参与调节植物生长发育，如诱导不定根形成和调节气孔关闭[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．它还与植物对环境刺激的反应有关，如盐、重金属(HMs)、干旱、热和冷胁迫以及病原体感染，这可能会提高植物的耐受性[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

编程的细胞死亡（PCD）是由细胞本身激活和驱动的过程，并且在遗传和生化水平下是一个有组织的现象。PCD是植物对环境变化的重要过程。PCD涉及几个过程，包括生长和发展，以及对各种不利环境条件的植物适应[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba］．许多研究表明，PCD可以限制发育和生殖，也与衰老有关[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba[其他过程，如生长[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba“非生物胁迫[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．高浓度的镉可诱导番茄、烟草和烟草的PCD或坏死gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．线粒体在细胞代谢中起着关键作用，在PCD的调控中起着关键作用。线粒体是ros介导的PCD事件的参与者，而线粒体跨膜电位(MTP)也被报道在PCD中必不可少[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba］．线粒体在ROS介导的PCD过程中发挥着重要作用[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．动物细胞中线粒体介导的PCD通过释放凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)和Cyt c激活caspase蛋白酶，因为MPTP的开放[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba］．在许多植物PCD体外应激模型中，线粒体释放Cyt c已被报道[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．许多研究表明，在植物中也有类似的现象[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．此外，细胞色素c和caspase-3样蛋白酶的激活的释放在热应激诱导PCD的烟草细胞中的过程[中也观察到gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]但没有研究表明，任何植物中单个蛋白质的水解级联与PCD相关过程有关[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba］．这些研究表明，植物中可能存在类似于动物细胞凋亡的细胞死亡机制。gydF4y2Ba

目前，关于H的应力缓解作用已有多篇研究gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba但对H的作用的研究很少gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在植物细胞死亡的过程中。此外，HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在植物细胞死亡S分别还不清楚。这项研究的目的是探索H的作用gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS参与Cd胁迫下黄瓜幼苗细胞死亡的信号事件。gydF4y2Ba

cd胁迫下黄瓜幼苗根长和鲜重的变化gydF4y2Ba

为了研究CD对根长和新鲜重量的黄瓜幼苗的影响，将不同浓度的CD施加48小时。如图所示。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba随着Cd浓度的增加，根长和鲜重量显着下降。与对照的控制相比，50μmCD引起的33.0和根长减少了7.6％和鲜重。100μMCD剂量导致根部长度的降低44.0％，鲜重的20.5％。200μm剂量减少了根长度49.2％，重量半重量为27.1％。300μm的Cd引起53.1和根长度和鲜重的28.9％。当浓度为200μm时，根长度约为对照的一半。因此，200μmcdclgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba被选作进一步实验之用。gydF4y2Ba

cd胁迫下根尖细胞死亡gydF4y2Ba

因为伊文思蓝可以染色死亡细胞，所以它可以指示死亡细胞的水平。如图所示。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba与增加,治疗持续时间(0,12、24、36和48 h),根尖染色逐渐加深,表明死亡的根尖细胞的数量逐渐增加的影响下Cd。伊文思蓝的含量在根提示治疗12 h显著高于控制(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab)， Cd处理48 h后，其含量是对照的2.8倍。这些结果表明，镉通过引起根细胞的死亡来抑制根的伸长。gydF4y2Ba

H的影响gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS对根生长和根尖细胞死亡的影响gydF4y2Ba

为了选择适当的NaH浓度以缓解Cd应激，观察到NaHs预处理在CD胁迫下对不同浓度（1,10,100或200μm）的根长和新鲜重量的黄瓜幼苗的影响。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa和b，作为硫氢化钠浓度的增加，黄瓜根长和鲜重增加在第一和然后下降。Compared with the 200 μM Cd treatment, the 1 μM NaHS caused a 2.7 and 0.1% increase in root length and fresh weight of seedlings, respectively. The 10 μM NaHS treatment increased root length and fresh weight by 8.1, and 1.5% compared with that of Cd alone respectively. Both indices reached the highest values when pretreated with 100 μM NaHS under Cd stress, which resulted in 42.9 and 10.3% greater root length and fresh weight, respectively, than that of Cd treatment. However, seedlings treated with the highest concentration of NaHS (200 μM) exhibited a decrease in effects compared with that of 100 μM NaHS treatment. Figure3.gydF4y2Bac表明，在无Cd胁迫条件下，1 ~ 100 μM NaHS浓度对根长有促进作用，而200 μM NaHS处理的根长显著低于其他浓度(1、10和100 μM)。上述结果表明，适宜浓度的NaHS (100 μM)可促进Cd胁迫下黄瓜幼苗的根系伸长。因此，在接下来的实验中使用了100 μM的NaHS。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad，观察不同处理下Evans蓝染色情况。Cd胁迫表现出更深的染色，而对照组、单独的NaHS和NaHS + Cd处理表现出更淡的染色。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae表明，Cd胁迫引起的细胞死亡是对照的3.77倍，而NaHS预处理比Cd单独处理减少了29.2%的细胞死亡。对照组和单独NaHS处理的值之间没有差异。gydF4y2Ba

内源性HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba■在黄瓜幼苗根系gydF4y2Ba

探讨内生HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS含量(内生HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS加上根吸收外源HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以黄瓜幼苗根系为材料，测定了根系内源HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在不同的治疗后24和48小时的S含量。如图所示。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba在处理24 h后，Cd胁迫、NaHS和NaHS + Cd处理均可引起内源hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS含量显著高于对照(分别为119.1、50.7和170.6%)和内生HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNaHS + Cd处理S含量显著高于Cd处理(24.2%)。内源HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba黄瓜幼苗根系中S含量在48 h后较24 h下降，而内源hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaNaHS + Cd处理的S含量仍比Con、Cd和NaHS处理分别高107.9、28.8和78.5%。这些结果表明，黄瓜幼苗根系吸收外源HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内源性HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba并有助于缓解Cd压力。gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS降低了cd诱导的ROS积累、丙二醛(MDA)和电解质渗漏率(ELP)gydF4y2Ba

确定h是否gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS可以调节ROS水平，降低cd诱导的细胞死亡gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}Cd胁迫48 h后，黄瓜幼苗根尖含量的变化(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Baa, b).暴露在200 μM CdCl中gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba提高了HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba这是比对照的高66.7％，而硫氢化钠+镉显著降低ħgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容(17.8%)。在Cd处理下，OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}是对照组的3.89倍。而NaHS预处理降低了O水平gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}了36.4%。因此，NaHS预处理可有效降低Cd胁迫下ROS的积累，从而保护膜的完整性。gydF4y2Ba

如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaC，MDA含量的最高值记录在CD应激下，而MDA含量的最低值是用对照和NaHs获得的。此外，与NAH的预处理与CD应激处理相比，NAH的预处理将MDA含量显着降低20.6％。类似地，NaHS + Cd处理将ELP降低23.7％（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bad）。结果表明hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS抑制细胞膜脂质过氧化，保证细胞结构的完整性，提高植物对Cd胁迫的耐受性。gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS激活抗氧化酶，减少氧化损伤gydF4y2Ba

探讨HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS, we measured SOD, CAT, POD and APX activity in the root tips of cucumber seedlings after 48 h of Cd treatment. As shown in Fig.6gydF4y2Ba，镉胁迫，SOD，CAT下，POD和APX活性显着增加了119.7％，63.5，分别130.3和194.9％，与对照相比，而对照和硫氢化钠处理单独不表现出显著差异。与CD处理相比，硫氢化钠+镉改善SOD，CAT，POD和APX活性20.5，20.0，10.3和0.6％。这些结果表明，ROS积累的由H减少gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS依赖于抗氧化酶系统的激活。gydF4y2Ba

NaHS对DAPI染色及荧光定量分析的影响gydF4y2Ba

为探讨NaHS对黄瓜幼苗根尖细胞死亡的影响，采用DAPI染色作为细胞死亡的诊断标记。如图所示。gydF4y2Ba7gydF4y2Baa，对照和NaHS预处理均观察到弱荧光。Cd胁迫48 h后，黄瓜幼苗根尖荧光增强;然而，NaHS + Cd处理降低了荧光。荧光定量分析还表明，NaHS + Cd处理较Cd处理显著降低了25.2%的荧光(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bab)，表明NaHS预处理降低了DAPI染色测定的cd诱导的根尖细胞死亡。gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS在Cd胁迫下抑制来自线粒体和Caspase-3样活性的Cyt C释放gydF4y2Ba

调查H是否gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS影响Cd胁迫下线粒体Cyt c的释放，测定Cyt c/a和MPTP的含量。Cyt c与线粒体内膜磷脂结合松散，不能自由穿过线粒体外膜，而Cyt a与线粒体内膜结合紧密。因此，Cyt c/a可以反映线粒体内膜中Cyt c的含量。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa，与对照组相比，Cd处理显著降低了Cyt c/a的43.8%。NaHS + Cd处理的Cyt c/a值较Cd处理显著提高22.6%，但与H处理无显著差异gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba预处理。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2BaB，Cd应激显着降低线粒体膜吸收，而对照，并且NaHs和NaHs + Cd处理均分别高于75.3,74.5和30.2％的CD处理。gydF4y2Ba

Caspase-3在动物细胞凋亡中起着重要作用，并且在植物中存在类似的研究。调查H是否gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS影响caspase-3样活性，在处理48 h后测定酶活性。如图所示。gydF4y2Ba8gydF4y2BaC、caspase-3-like活性明显升高，较对照升高77.8%。NaHS预处理24 h显著降低caspase-3-like活性，较Cd处理降低22.1%。gydF4y2Ba

总的来说,结果表明,Cd的压力可能导致Cyt c释放到细胞质中,增加注射的开放程度MPTP药物,并激活caspase-3-like活动,而硫氢化钠预处理可以抑制这些影响和减少从线粒体释放Cyt c和caspase-3-like活动。gydF4y2Ba

一些研究表明，镉干扰植物的代谢和生理过程，如缩短根的长度[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]及叶面积[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]和导致细胞死亡[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba］．Cd胁迫严重影响大白菜的根系发育和鲜重[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在大麦植株中，高浓度Cd处理9 h后，与低浓度Cd处理相比，细胞死亡和生长迟缓[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．在该实验中，Cd抑制了根伸长率和降低了黄瓜幼苗的新鲜重量。随着CD浓度的增加，抑制效果显着增强（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.一些研究表明CD胁迫会导致植物细胞死亡。淹没的血管植物的叶细胞死亡gydF4y2BaRuppia maritimagydF4y2Ba3或5 d曝光后观察到镉[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．10 μM和100 μM Cd处理分别导致玉米细胞在24 ~ 48 h和12 ~ 24 h出现死亡[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．我们的研究结果表明，暴露于200μMCD的持续时间越长，死的细胞数量越大（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.类似地，Zhang等人[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，found that 5 mM Cd treatment led to cell death in Chinese cabbage roots.

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS是动植物中第三个具有多种功能的生理气体信号分子，在缓解重金属胁迫中发挥着重要作用。在铝(Al)胁迫下，大麦幼苗根系伸长受到抑制，而NaHS预处理可有效缓解Al对幼苗根系伸长的抑制[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba龙葵gydF4y2Bal .幼苗HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS调节锌（Zn）在根中的分布和吸收，从而减轻Zn引起的根部发育引起的应力[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS是应对重金属胁迫时产生的一种常见气体分子，Cd是重金属胁迫中毒性很强的气体分子之一，对植物造成严重的胁迫[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba］．在无花果。gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa, b, 100 μM NaHS预处理显著降低了Cd胁迫对黄瓜幼苗根长和鲜重的抑制作用。这与其他报告显示HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS提高植物对Cd胁迫的耐受性，如谷子[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]，gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba［gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),而gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba54gydF4y2Ba］．同时，在Cd胁迫下，用100 μM NaHS预处理黄瓜，细胞死亡明显减少(图2)。gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC，D）。同样，郑艾特。据报道，与外源NaH的预处理显着缓解了豌豆幼苗的缺氧诱导的根尖死亡，并增强了对缺氧应激的耐受性[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba］．此外，Zhang等也报道NaHS预处理可降低Cd胁迫下小白菜根细胞死亡，促进根伸长[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．我们的结果表明HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba小号保护黄瓜根系从镉诱导根系细胞死亡。gydF4y2Ba

ROS是植物有氧呼吸的副产物，其稳定水平取决于ROS产生机制和ROS清除机制之间的相互作用。过量的ROS会对植物造成损害，包括膜过氧化、蛋白质变性、酶失活和DNA损伤，这些都会导致细胞死亡[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba镉可活性在ROS的MPK3 / MPK6信号通路剂量依赖性方式[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba］．高浓度的Cd使H增加gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}氧化损伤，根生长抑制，细胞死亡。此外内生HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS通过上调的表达参与了ROS水平的降低gydF4y2BaBr_UPB1sgydF4y2Ba在…的根尖gydF4y2Ba芸苔属植物拉伯gydF4y2Ba［gydF4y2Ba58gydF4y2Ba］．在本研究中，我们还发现HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba阿,gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}，黄瓜幼苗根系MDA和ELP显著增加gydF4y2Ba_2gydF4y2BaCd处理48 h后，S通过激活抗氧化酶系统抑制氧化损伤和膜过氧化作用(fig .;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.Kaya等人也报道HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS能提高小麦和草莓抗氧化酶活性，降低氧化应激，减轻Cd的毒性[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba］．金属盐如Al，Iron（Fe）和Cd可以在植物中诱导细胞死亡。当水稻的两种基因型（耐铅）和IR64（铁敏感）暴露于Fe时gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}(400 mM)胁迫，诱导IR64品种根尖细胞死亡[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba］．89毫米以下CdClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba3-d黄羽扇豆根(gydF4y2Ba卢比斯花丁gydF4y2BaL.)幼苗在24 h后遭受PCD, tunel阳性反应观察到[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba］．同样，我们也通过DAPI染色和荧光定量分析观察了细胞死亡的发生(图)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）.活性氧，如OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}和HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，诱导植物和动物细胞死亡[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba］．ROS平爆是植物[参与了镉诱导的细胞死亡的最重要的信号gydF4y2Ba63gydF4y2Ba，gydF4y2Ba64gydF4y2Ba］．有报道称cd诱导的悬浮细胞死亡gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba伴随着h增加gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba内容(gydF4y2Ba65gydF4y2Ba］．我们发现，硫氢化钠预处理减少ROS（图积聚。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)和抑制细胞死亡的发生(图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba）gydF4y2Ba通过增加抗氧化酶活性(图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.我们的结果与Zhang等人的研究结果一致，他们报道NaHS处理延迟了赤霉酸- (GA-)处理糊粉层的细胞死亡过程，降低了ROS水平，增加了抗氧化酶活性[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba］．HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS降低了H的积累gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，从而抑制cd诱导的DNA片段和染色质凝聚[gydF4y2Ba67gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

Cyt c位于线粒体内膜，参与正常细胞呼吸链的电子传递，但不能穿透线粒体外膜。不同凋亡诱导因子可诱导Cyt c的释放并激活细胞死亡，如热休克[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba［gydF4y2Ba68gydF4y2Ba]和铝应力[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．我们的实验也证实了Cd导致Cyt c从线粒体脱离进入细胞质和MPTP开口(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baa，b）。此外，用100μmnah的预处理削弱了促进Cyt C和MPTP的开口的Cd应激的负效应。这与前面的报告一致，表明HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS通过抑制Cyt c的释放来抑制细胞凋亡，如SH-SY5Y细胞[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]、RGC-5细胞[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]和老鼠细胞[gydF4y2Ba72gydF4y2Ba］．半胱氨酸蛋白酶是一种生物和细胞因子成熟和凋亡的蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶家族的一类。半胱氨酸蛋白酶家族是细胞死亡机制的主要调控因子。当caspase蛋白酶体被刺激和激活时，细胞死亡过程开始，导致细胞死亡调控的执行[gydF4y2Ba73gydF4y2Ba］．植物半胱氨酸蛋白酶是在动物细胞中的细胞凋亡过程类似于半胱天冬蛋白酶。它还参与了细胞死亡的植物细胞中调节。聚（ADP核糖）聚合酶（PARP）参加了由H诱导植物细胞死亡gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，而植物PARP的降解依赖于Cyt c释放到细胞质中，而Cyt c可被特定的caspase-3抑制剂抑制[gydF4y2Ba74gydF4y2Ba］．Ye等报道100 μM Cd导致caspase-3-like活性增加gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba悬浮细胞(gydF4y2Ba75gydF4y2Ba］．我们的结果还表明，在黄瓜幼苗根尖的胱天蛋白酶-3样活性（在CD-诱导增加图。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac）。此外，外源NaHS预处理降低了CD胁迫诱导的Caspase-3样活性的增加。同样，H.gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS改善皮质神经元线粒体功能障碍，抑制ros介导的caspase-3通路[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba］．HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过降低Caspase-3活性，S可以抑制大鼠腹膜间皮细胞中高葡萄糖毒性诱导的凋亡[gydF4y2Ba77gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

综上所述，我们的数据显示HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaS抑制黄瓜幼苗根尖中的CD诱导的细胞死亡。CD的应用抑制了根伸长率生长，引起了细胞死亡，并伴随着线粒体Cyt C的释放，MPTP的开口和钙酶-3样活性增加。用外源h预处理gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS供体NaHS通过减少ROS积累、Cyt c释放和caspase-3样活性来抑制cd诱导的细胞死亡的发生。本研究提示了HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba镉胁迫对黄瓜幼苗根系细胞死亡的保护作用，虽然还需要进一步的实验来确定这种保护作用如何在黄瓜生产中应用。gydF4y2Ba

植物材料及处理gydF4y2Ba

黄瓜(gydF4y2BaCucumis巨大成功gydF4y2Ba‘新春4号’种子来源于甘肃省农业科学院，中国兰州。实验1将种子置于铺有滤纸的培养皿中，在28°C黑暗条件下发芽48 h。然后，用不同浓度的氯化镉(50、100、200和300 μM)处理2龄幼苗gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba）和transferred to an illuminating incubation climate box (25 ± 1 °C, 12 h photoperiod, photo- synthetically active radiation = 200 μmol m^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}) 48小时。实验2用不同浓度(1、10、100和200 μM)的氢氧化钠(NaHS, a h .)对萌发24 h的种子进行预处理gydF4y2Ba_2gydF4y2BaS供体）24小时的溶液，然后将幼苗暴露于200μmcdclgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba48 h。然后测定黄瓜幼苗的根长和鲜重。gydF4y2Ba

检测细胞死亡gydF4y2Ba

伊文思蓝染色已被广泛用于细胞死亡的指示。根据张的方法[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]，处理48 h后，用0.25% (w/v)伊文氏蓝染色15 min，水洗3次。在显微镜下观察并拍照(Revolve RVL-100-G, ECHO, USA)。染色后，用1 mL 80%乙醇均质，50℃孵育15分钟，10000离心gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟，然后在600nm下测量吸光度。gydF4y2Ba

内源性H测定gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba■内容gydF4y2Ba

根据方的方法[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba[将0.2g根尖样物加入到5ml 50mM磷酸盐缓冲溶液中（0.2M抗坏血酸（ASA），0.1M EDTA和0.5mL 1M HCl，pH 6.8），将其加入均质中．释放的H.gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba以1% (w/v)醋酸锌捕收硫。30分钟后，0.3 mL 5 mM二甲基对苯二胺溶于3.5 mM HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba所以gydF4y2Ba_4gydF4y2Ba加入0.3 mL 50 mM硫酸铁铵。反应15 min后，检测在667 nm处的吸收值。gydF4y2Ba

过氧化氢(HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba)和超氧阴离子自由基(OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba})分析gydF4y2Ba

为了确定^ hgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2BaCd胁迫48 h后，我们取0.2 g根尖样品，用预冷的丙酮研磨。然后转移到离心管中，在4°C下3000 rpm离心10分钟。提取液(1 mL)加入0.1 mL 5%硫酸钛和0.2 mL浓氨水中;沉淀于4℃，3000 rpm离心10 min，然后用丙酮洗涤3 - 5次。最后，2mol LgydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}在沉淀物中加入大欣酸，在415 nm处进行比色分析[gydF4y2Ba79gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

为了确定将OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}含量，根样品(0.2 g)用1 mL磷酸盐缓冲液(pH 7.8)均质，并在4°C下12,000 rpm离心15分钟。上清液中加入盐酸羟胺(1ml)反应1h，再加入对氨基苯磺酸1ml和α-萘胺1ml。溶液在25°C保存20分钟。检测530 nm处的吸收值[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

丙二醛和ELP的测量gydF4y2Ba

在硫代巴比妥酸反应中加入根样0.2 g，反应液在95℃水浴中浸泡20 min，冷却至室温。最后，分别在450、532和600 nm处测量吸光度值[gydF4y2Ba80gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

取根样0.2 g加入10 mL蒸馏水，25℃孵育2 h。然后，通过电导率(EC1)读取溶液。最后，样品在95℃水浴中处理30分钟，然后读取EC2，其中ELP = EC1/EC2 × 100% [gydF4y2Ba81.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

抗氧化酶活性测定gydF4y2Ba

抗氧化酶活性的测定方法由Bu等人描述[gydF4y2Ba82.gydF4y2Ba］．根(2 cm长)加入1.5 mL 50 mM PBS缓冲液(1 mM EDTA和1%聚乙烯吡咯烷酮)并均质。匀浆在10,000离心gydF4y2BaggydF4y2Bafor 10 min at 4 °C and the extract was used to detect the activity of antioxidant enzymes.

以抑制硝基蓝四唑(NBT)的光化学还原为基础，在560nm处测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。通过微量修饰测定过氧化物酶(POD)活性;酶提取液(0.1 mL)加入2.6 mL愈伤愈醇(0.3%加入50 mM磷酸盐缓冲液，pH 6.5)和0.3 mL 0.6% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba，然后在470 nm处检测吸光度变化2 min。过氧化氢酶(CAT)在290 nm下检测3分钟，使用2% HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba， 50 μL酶液和50 mM PBS缓冲液。用50 mM PBS缓冲液、15 mM抗坏血酸、50 μL酶提取物、30 mM H在290 nm下检测抗坏血酸过氧化物酶(APX)gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

4,6 -二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色gydF4y2Ba

用前面描述的方法测量DAPI染色[gydF4y2Ba83.gydF4y2Ba经过一些修改。2 cm长的根用4%戊二醛溶液固定24 h后，用蒸馏水冲洗3次。将根浸泡在1 μg mL中gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}(w/v) DAPI在室温下浸泡10分钟，然后用蒸馏水洗涤数次。DAPI染色图像用荧光显微镜(Revolve RVL-100-G, ECHO, USA)观察。通过ImageJ软件测量荧光强度。gydF4y2Ba

线粒体Cyt c/a与线粒体通透性过渡孔(MPTP)比值的检测gydF4y2Ba

如先前研究所述[gydF4y2Ba84.gydF4y2Ba]线粒体，在制造商的指示之后，使用套件（Bestbio，BB-3611-1）的套件（Bestbio，BB-3611-1），从4 d岁黄瓜幼苗的根尖中分离出来。加入0.2％BSA的悬浮的线粒体以达到0.5mg mL的终浓度gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}，用紫外分光光度计在550 nm和630 nm处测定悬浮液的吸光度。Cyt c/a的比值= A550 / A630。gydF4y2Ba

将分离的线粒体用缓冲液II (5 mM琥珀酸钠、70 mM蔗糖、5 mM HEPES、220 mM甘露醇，pH 7.2)悬浮，调整蛋白浓度为0.3 mg/mL, 20℃孵育2 min。在540 nm处记录吸光度[gydF4y2Ba69gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

caspase-3-like的活性gydF4y2Ba

caspase-3样检测试剂盒(Solarbio, BC3830)按照厂家说明书使用。为测定caspase-3样蛋白的活性，采用35 μL提取液+ 65 μL反应缓冲液[5 μL caspase-3底物(DEVD-)]在96孔微量滴定板中进行测定gydF4y2BapgydF4y2Bana），2 mm]。将裂解物在37℃下孵育4小时。用ELISA读取器（CMAX加，分子器件，USA）在405nm中测量混合物。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

本研究中所有值均重复三次，结果为三次独立实验的均值±标准误差(SE)。采用数据分析进行邓肯多极差检验(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05)，使用SPSS 19.0软件(IBM SPSS，芝加哥，美国)。gydF4y2Ba

在当前的研究中生成的数据集可从第一作者在合理的要求。gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba史:gydF4y2Ba

硫化氢gydF4y2Ba

纤毛运动:gydF4y2Ba

编程细胞死亡gydF4y2Ba

ROS:gydF4y2Ba

活性氧gydF4y2Ba

HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

过氧化氢gydF4y2Ba

OgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba^{·−gydF4y2Ba}：gydF4y2Ba

超氧化物阴离子自由基gydF4y2Ba

MDA:gydF4y2Ba

丙二醛gydF4y2Ba

ELP:gydF4y2Ba

电解液泄漏比例gydF4y2Ba

SOD:gydF4y2Ba

超氧化物歧化酶gydF4y2Ba

圆荚体:gydF4y2Ba

过氧化物酶gydF4y2Ba

猫:gydF4y2Ba

催化剂gydF4y2Ba

APX型:gydF4y2Ba

抗坏血酸过氧化物酶gydF4y2Ba

Cyt c:gydF4y2Ba

细胞色素cgydF4y2Ba

MPTP:gydF4y2Ba

线粒体通透性过渡孔gydF4y2Ba

GA：gydF4y2Ba

赤霉酸gydF4y2Ba

DAPI：gydF4y2Ba

4, 6-Diamidino-2-phenylindolegydF4y2Ba

感谢程立祥博士(甘肃省旱地作物科学重点实验室，甘肃农业大学，兰州730070)提供的方法支持。gydF4y2Ba

这项工作得到了国家重点研究和开发项目(2018 yfd0201205),中国国家自然科学基金(31660584),中国农业研究系统(CARS-23-C-07),甘肃省科技重点项目基金(No.17ZD2NA015)和甘肃引用省自然科学基金,中国(1610 rjza098)。资助方没有参与实验的设计、数据收集和分析、数据解释以及手稿的撰写。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 甘肃农业大学园艺学院，甘肃兰州730070gydF4y2Ba

   罗世雷，唐中奇，余继华，廖伟标，谢建明，吕建，冯志&穆罕默德·穆吉塔巴·达乌达gydF4y2Ba

2. FoA发展研究大学园林系，盒子TL, 1350，加纳塔马莱gydF4y2Ba

   穆罕默德Mujitaba DawudagydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

概念化，SL, ZT和WL;形式分析，SL, ZT, JL;收购资金,客户至上;调查,SL;方法论，SL, WL和ZF;项目管理，JX, JY;资源,客户至上;监督，WL, JX, JY;验证、客户至上;写作-原草案SL; Writing – review & editing, WL and MD. All authors have read and approved the manuscript.

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba华贵的余gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

竞争利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

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开放获取gydF4y2Ba本文是基于知识共享署名4.0国际许可,允许使用、共享、适应、分布和繁殖在任何媒介或格式,只要你给予适当的信贷原始作者(年代)和来源,提供一个链接到创作共用许可证,并指出如果变化。本文中的图像或其他第三方材料都包含在本文的知识共享许可中，除非在该材料的信用额度中另有说明。如果资料不包括在文章的知识共享许可协议中，并且你的预期用途没有被法律规定允许或超过允许用途，你将需要直接从版权所有者获得许可。如欲查阅本许可证副本，请浏览gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba．创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本文提供的数据，除非在数据的信贷额度中另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba