这GydF4y2Ba烟草L.主要乳胶蛋白样蛋白423GydF4y2Ba（GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba)通过aba依赖途径正调控抗旱性GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

干旱胁迫是限制植物生长和繁殖的环境因素。一些研究已进行调查GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba烟草中的基因。这里，GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba并对其在干旱胁迫中的作用进行了研究。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过对失水效率、活性氧水平、丙二醛含量和渗透调节物质水平的生理分析，提高烟草对干旱胁迫的耐受性。过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在转基因植物中导致对吸收酸（ABA）介导的种子萌发和ABA诱导的气孔闭合的更大敏感性。GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba也是干旱胁迫的条件下增加ABA水平调控耐旱性。我们的研究表明，ABA合成基因的转录水平也有所提高。过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba减少干旱胁迫下膜损伤和ROS积累，增加胁迫相关基因的表达。我们还发现GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba调节转录GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba改善耐旱性。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们的研究结果表明：GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba- 通过ABA途径长轴增加烟草中的耐旱耐受性。GydF4y2Ba

干旱胁迫是不利于植物生长和发育的，因为它可以引起植物的形态和损坏改变细胞[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．植物已经进化出许多复杂的生理生化机制来适应干旱。植物激素脱落酸调节植物在生物和非生物胁迫下的生理过程[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

脱落酸是一个关键的倍细胞萜烯，其参与了植物生长和发育的许多重要过程，并控制许多与应激适应响应和渗透调整相关的基因[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．干旱胁迫下的ABA合成的增加可以促进气孔闭合并降低蒸腾损失[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．由于ABA响应干旱胁迫的作用，已鉴定参与ABA生物合成的基因，例如9-CIS-环氧丙酮类二氧化根酶（GydF4y2BaNCEDGydF4y2Ba），Xanthoxin脱氢酶/还原酶（GydF4y2BaABA2.GydF4y2Ba)、aba -醛氧化酶3 (GydF4y2BaAAO3GydF4y2Ba）[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．在拟南芥中，GydF4y2Banced3.GydF4y2Ba响应干旱胁迫而有助于ABA积累[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]，虽然GydF4y2BaABA2.GydF4y2Ba和GydF4y2BaAAO3GydF4y2Ba突变体在干旱胁迫下降低ABA水平[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

主要乳胶蛋白（GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba）基因首先在鸦片罂粟的乳胶中鉴定[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba]．在其他植物中也发现了类似于MLP的蛋白质[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．每一种植物可以包含多个MLP家族成员。例如，有26、14和27GydF4y2BaMLPS.GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba那GydF4y2Ba葡萄GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaSolanum lycopersicumGydF4y2Ba分别为(GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．MLP系列的特征在于序列相似低，而三维结构是相似的。有人发现了两个GydF4y2BaMLPS.GydF4y2Ba拟南芥可以通过诱导顺式肉桂酸来延迟开花[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba] 然后GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba与桃子和猕猴桃等水果中的成熟密切相关[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．过度表达GydF4y2Baghmlp.GydF4y2Ba增加的黄酮含量GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba并且增加的对盐胁迫[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]，虽然GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba野生草莓和黄瓜的表达水平因机械损伤而增加[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．表达GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba基因家族在不同的组织中显着不同;但是，几乎没有研究GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba基因和分子机制GydF4y2BaMLPS.GydF4y2Ba烟草对非生物胁迫的反应仍然是捉摸不定的。这里，我们克隆了GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba来自烟草的基因并测试了应力响应GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba-overexpressing转基因植物。GydF4y2Ba

NTMLP423的亚细胞定位GydF4y2Ba

我们构建了Pro35S::MLP423-GFP载体，并将其注射到GydF4y2Ba本氏烟草GydF4y2Ba通过农药。共聚焦显微镜结果表明NTMLP423蛋白质在细胞质和核中局部化（图SGydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

表达分析GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在烟草GydF4y2Ba

所述的组织表达分析GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过qRT-PCR显示出最高的表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在叶子中，其次是根，茎中最低表达（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba一个)的表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba甲基紫精（MV），ABA和聚乙二醇下（PEG）处理通过qPCR检测。结果三种处理（图下方所示差动上调。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba罪犯)。的感应GydF4y2BaABI5GydF4y2Ba（脱落酸不敏感5; ABA响应基因）[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]，GydF4y2BaP5CSGydF4y2Ba（吡咯啉-5-羧酸合成酶;脯氨酸生物合成键基因），和GydF4y2BaDEFLGydF4y2Ba（Defensin-like; hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba及mv反应基因)[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba]确保了治疗是有效的（图：SGydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这在D.uction rate in the PEG treatment was more than 30 times higher than that in control group over 5 h, while that in the ABA treatment for 24 h was the most significant. These results suggested thatNTMLP423.GydF4y2Ba受干旱胁迫和干旱相关的信号分子调节。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba赋予天旱宽容GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba

调查是否GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba参加干旱胁迫，我们获得了表达的转基因拟南芥GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba基因。GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在所有转基因拟南芥（图S为表示GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），以及选择了三个T3代纯合品系（OE1-1，OE4-1和OE7-1），用于后续实验。转基因和野生型（WT）种子播种于Murashige和Skoog（MS）培养基，并在甘露醇培养基中播种。结果表明，存在于在MS培养基发芽率没有差别;然而，过表达的发芽率GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在不同浓度的甘露醇培养基中，拟南芥种子的浓度均高于野生型(图SGydF4y2Ba4.GydF4y2BaA, B).过表达的平均根长GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba植物显着长于WT植物（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2BaC，D）。我们检查了效果GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba干旱胁迫在干旱胁迫下，在植物中停止灌溉2周，其次是3 d的喷壶观察恢复过程。结果表明，在浇水后，只有20.8％的WT植物存活，而转基因存活率大于80％（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa - b)。我们进一步检查了GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过用20％PEG治疗植物，在干旱胁迫下过表达。我们发现WT植物比转基因植物更严重（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。转基因植物的相对含水量被发现是比WT的以下干旱胁迫（图高得多：SGydF4y2Ba5.GydF4y2BaB).过表达叶的渗透势GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在干旱胁迫下也显着低于WT（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaC）。结果表明过表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba增加在拟南芥对干旱胁迫的阻力。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba增加ABA敏感性和拟南芥积累GydF4y2Ba

ABA激素在调节生长和对植物中的各种压力条件的反应中起着关键作用，包括气孔闭合[GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba]．我们检测ABA引起的气孔关闭（如关闭，部分打开，或开放，基于宽度与孔径的长度的比率限定的孔相）。有在所有线路之间的比率没有显著差异无ABA处理。However, after ABA treatment for 30 min, the percentage of stomatal closure in overexpressingNTMLP423.GydF4y2Ba比在WT（图高得多。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac).外源ABA处理后，WT、OE1-1、OE4-1和OE7-1转基因植株的气孔关闭率分别提高了2.56倍、22.67倍、3.52倍和6.22倍。结果表明，aba诱导的气孔关闭与抗旱性的提高有关。GydF4y2Ba

研究ABA在植物胁迫反应中的信号分子作用[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]，我们进行了ABA处理。在没有ABA的培养基，有发芽率所有植物之间没有差异。At different ABA concentrations (0.5 and 1.0 μM), plants in whichNTMLP423.GydF4y2Ba过表达表明与野生型相比，萌发率显著降低(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），表明过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba提高了ABA敏感性。在正常情况下，所有植物中的ABA含量相似，但过表达的过表达明显高GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba比在干旱胁迫，其增加了大约2.0倍下野生型植物（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）。我们进一步测量的ABA相关基因的表达水平，发现的ABA-合成基因的表达水平（GydF4y2BaABA2 AAO3,GydF4y2Ba和GydF4y2Banced3.GydF4y2Ba）在过表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba干旱条件下显著高于野生型(图2)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba罪犯)。在这里，我们还测试了参与ABA分解代谢途径（图S中的基因GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.结果表明表达了GydF4y2BaBG1.GydF4y2Ba(β-葡萄糖苷酶1)基因的过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba植物在干旱胁迫下的表达量显著高于野生型，但在干旱胁迫下表达量显著高于野生型GydF4y2BaCYP707A1GydF4y2Ba(细胞色素P450单加氧酶707A1)基因在干旱胁迫下低于野生型(图SGydF4y2Ba6.GydF4y2Ba作为GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。GydF4y2BaBG2.GydF4y2Ba（β葡糖苷酶2）和GydF4y2BaUGT71C5GydF4y2Ba(udp -葡萄糖基转移酶71C5)基因在干旱胁迫下表达无显著差异(图SGydF4y2Ba6.GydF4y2BaB，S.GydF4y2Ba6.GydF4y2BaD)。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba使烟草具有耐旱能力GydF4y2Ba

为了研究烟草的耐旱性，我们检测到的表达水平GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在转基因品系和选定的三行T2代过表达的GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba（OE-1，OE-3和OE-5）和三个反义转基因品系（反-1，抗-2和抗-4）用于随后的分析（图：SGydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.我们检查了效果GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba20% PEG处理对干旱胁迫下烟草过表达的影响我们发现WT比过表达更严重的萎蔫GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba植物(图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba一种）。与WT相比，过度表达植物的rwc率高于干旱应激和OE-1，OE-3和OE-5的rwc率分别增加1.17,111和1.14倍。过度表达的水分损失率GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba叶子在体外比WT叶片下（图GydF4y2Ba5.GydF4y2Bac)。而反义转基因烟草表现出相反的结果，降低了对干旱胁迫的抗性，如图所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Bad-F。反义植物有更严重萎蔫比WT，和RWC明显高于WT低;然而，从反义植物失水率比WT（图高。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaD-F）。此外，测量烟叶的渗透潜力，发现过表达的渗透潜力GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba低于WT的，而反义植物具有最高的渗透势（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.结果表明GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba过表达在烟草中对干旱胁迫的抗性增加。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在烟草中加强干旱胁迫下的光合作用GydF4y2Ba

干旱胁迫后，所有植物的净光合速率（PN）明显减少，反义线的最大减少，过表达线的最低减少。WT，OE-1，OE-3，OE-5，抗1，抗-2和抗-4的PN分别下降47.3,33.8,32.5,41.2,62.7,63.1和63.3％之后干旱胁迫治疗（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba一种）。所有植物的可变荧光/最大荧光（FV / FM）比干旱胁迫后下降。然而，在反义的Fv / Fm中的减少是比其它行较大，而在过表达的植物的Fv / Fm中的减少是小的（图GydF4y2Ba6.GydF4y2Bab).各品系的叶绿素含量在WT、OE-1、OE-3、OE-5、Anti-1、Anti-2和Anti-4中分别降低了41.1、37.5、29.5、33.7、54.2、52.3和54.3%(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba的缓解膜损伤和减少干旱胁迫下ROS水平在烟草GydF4y2Ba

植物的细胞膜在不良条件下受到损伤，其程度可通过丙二醛（MDA）的水平反映。在干旱胁迫下，所有群体的MDA含量增加;然而，过表达的MDA含量低于WT植物中的MDA含量，反义植物显示出最高含量（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad）。此外，过表达的相对电导率GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在干旱胁迫后，反义植物的光合速率最低，反义植物的光合速率最高。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bae）。这些结果显示，过表达植物细胞膜损伤是干旱胁迫下的最低水平。由于脯氨酸是细胞内的渗透压调节键和播放渗透胁迫抗性的重要作用[GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]测量不同植物系中的脯氨酸含量。干旱胁迫改善了所有线条中的脯氨酸含量，过表达植物中的最高含量和反义植物中最低的含量（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2BaF）。结果表明，过表达的植物可通过调节脯氨酸的含量减少干旱胁迫下渗透损伤和膜损伤。GydF4y2Ba

干旱会导致渗透压力，从而导致ROS生产[GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba]．我们测量了H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{• -GydF4y2Ba}干旱压力下的水平，发现H的积累GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{• -GydF4y2Ba}干旱胁迫诱导;H的含量GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{• -GydF4y2Ba}均反义显著高于WT和过表达的植物，具有最低含量的过表达的植物中发现（图GydF4y2Ba7.GydF4y2Bab，c）。硝基蓝四唑（NBT）和3,3'-二氨基苯甲酸（DAB）染色的结果与从H的定量分析中获得的结果一致GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{• -GydF4y2Ba}水平（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Baa).进一步检测抗氧化酶活性，发现干旱胁迫前所有植物的抗氧化酶活性均无差异。同时测定了干旱胁迫下APX、CAT、SOD和POD的抗氧化酶活性。结果表明，过表达的APX、CAT和SOD活性显著高于野生型和反义型植物;但POD活性低于野生型(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaD-G）。这些结果表明过表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba可通过提高APX、CAT和SOD活性调节ROS水平。此外，我们还测定了应激相关基因的表达GydF4y2BaNtABF1GydF4y2Ba(ABA响应元件结合因子1)GydF4y2BaNtRD20GydF4y2Ba（响应脱水20）GydF4y2BaNtERD10aGydF4y2Ba(对脱水的早期反应)和GydF4y2Bantp5cs.GydF4y2Ba在QPCR的干旱条件下发现过表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba干旱胁迫下，胁迫相关基因的表达量增加，而反义基因的表达量低于野生型(图2)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

转录GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过增强GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba

为了进一步阐明的分子调控机制GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba，生物信息学分析GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba进行启动子并筛选转录因子GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba对于潜在的绑定GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba启动子。进行萤火虫荧光素酶（LUC）互补成像测定并观察到注射后荧光强度增加GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba，在指示反式激活作用GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba启动子(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2Baa).酵母单杂交(Y1H)检测是否GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba可以结合启动子GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba．将W-box序列整合到酵母细胞中，在含有aureobasidin A (AbA)的SD/−Ura/−Leu-deficient培养基上梯度稀释，验证阳性酵母细胞。结果表明，含有诱饵载体pai - w -box的酵母在AbA浓度为250 ng/mL时能够正常生长(图2)。GydF4y2Ba9.GydF4y2Bab).此外，我们使用含有W-box序列的DNA片段作为探针进行验证GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba结合GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba启动子，在EMSA实验。结果表明，GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba直接绑定在W-box上GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba启动子(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2BaC）。GydF4y2Ba

目前，研究探索的特点GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba基因表达主要关注其在应对非生物和生物胁迫中的作用。有研究报道，三GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba氧化应激后基因显着下调[GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba在甜瓜的茎韧皮汁中被检测到与黄瓜马赛克病毒感染[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．此外,GydF4y2BaGhMLP28GydF4y2Ba基因可以对病原体作出反应[GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]和显着差异GydF4y2BaMLP.GydF4y2Ba基因家族的表达已经显示出不同的组织中发生。在我们的研究中，GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba基因在叶子和根部的最高水平上表达，并在PEG处理后显着诱导（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.结果表明GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba可能参与烟草对干旱胁迫的反应。这一点通过过表达得到了证实GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba植物;过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在干旱胁迫下显示出低于WT的衰弱和较高的存活率（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba一种，GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，SGydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.结果表明GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba积极调节的抗旱性。GydF4y2Ba

气孔关闭在适应干旱中发挥了重要作用，ABA起到了调节气孔关闭[关键作用GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．在这项研究中，我们发现，过表达的转基因植物表现出ABA超敏性，其中包括种子萌发的ABA诱导的抑制和ABA诱导促进气孔关闭（图的。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.水分损失的效率与干旱胁迫耐受性有关，因为水分迅速增加对干旱的敏感性[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba]．过表达的rwcGydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba比WT高，但水损失率和渗透势均显著更低;这种高保水能力通过提高其抗旱性（图受惠转基因植物。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB-C，SGydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.研究表明，ABA的积累可以提高抗旱性，从而减少干旱条件下气孔的张开和水分流失[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

过表达的ABA含量GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba干旱胁迫下显著增加，并且比WT（图高。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba一种）;这表明了GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba参与ABA积累。ABA是参与干旱反应的主要信号分子，并确定了许多与ABA生物合成相关的基因[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．NCED酶对ABA的生物合成非常重要，并已被证明在拟南芥的干旱胁迫响应中发挥关键作用[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba]．我们分析了ABA合成基因的表达（GydF4y2BaABA2.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAAO3GydF4y2Ba， 和GydF4y2Banced3.GydF4y2Ba），发现它们被上调（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.结果表明GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过调节ABA生物合成来积极调节ABA信号和ABA积累。GydF4y2Ba

光合作用是生物界生存的基础。干旱胁迫通过破坏光合系统反应中心来抑制植物的光合作用，导致光合效率降低。光合色素叶绿素对植物的光合作用至关重要[GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba]．我们发现，Pn和叶绿素含量干旱胁迫下下降，与记录在反义植物和在过表达的植物和相同的结果的至少最大的减少，发现了的Fv / FM比率（图GydF4y2Ba6.GydF4y2BaA-C）。结果表明，过度GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba在干旱胁迫下增加烟草的光合作用。GydF4y2Ba

膜脂质过氧化的最终分解产物是MDA，其广泛用于评估非生物胁迫下的氧化脂质损伤[GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]．以往的研究表明，植物对非生物胁迫的抗性与生理反应密切相关，主要是由于游离脯氨酸等渗透调节物质的积累[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．自由脯氨酸的积累有助于耐旱性，从而保护细胞免受损伤[GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．我们的结果表明，在过度表达的植物线中，自由脯氨酸的积累量更大积聚和MDA的大部分积累GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba比在wt中（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Bad，f）。这证明了过度表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba增强植物的渗透调节能力，并减轻对膜脂质的损伤。GydF4y2Ba

作为参与应力反应的各种基因的直接或间接诱导剂，ROS可以用作信号分子[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．干旱胁迫引发活性氧的积累，过多的活性氧会导致植物细胞膜受损。活性氧的去除对干旱胁迫下植物的生存至关重要;因此抗氧化酶的活性可以维持活性氧代谢的平衡，保护膜系统[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]．我们的实验结果表明，在干旱胁迫下，活性氧会积累;然而，过表达的ROS水平低于WT和反义植物(图。GydF4y2Ba7.GydF4y2BaA-C）。有证据表明，ABA增强的干旱胁迫耐受性与抗氧化酶[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]．干旱胁迫后SOD、CAT和APX酶活性较高GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba-overexpressing比其他实验组（图GydF4y2Ba7.GydF4y2BaD-G）。结果表明GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba参与ROS介导的干旱反应，并GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba可以消除干旱胁迫下过度ROS生产的负面影响，从而提高耐旱性。GydF4y2BaNtABF1GydF4y2Ba和GydF4y2BaNtRD20GydF4y2Ba是干旱胁迫反应的基因。GydF4y2Bantp5cs是GydF4y2Ba脯氨酸生物合成的关键基因GydF4y2BaNtERD10aGydF4y2Ba是一种编码晚期胚胎发生丰富蛋白质的基因，并参与调节干旱胁迫[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]．研究了QPCR的应激相关基因的表达水平，发现过表达线通过上调应力相关基因增加耐旱性（GydF4y2BaNtABF1GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtRD20GydF4y2Ba那GydF4y2BaNtERD10aGydF4y2Ba， 和GydF4y2Bantp5cs.GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对调节转录因子几乎没有研究GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba．在这里，我们筛选出了一种新的转录因子，GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba．y1h和EMSA测定决定测试是否GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba可以结合启动子GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba．结果表明GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba调节转录GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba并直接绑定了W-BoxGydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba启动子(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.Wrky转录因子包括大家庭转录调节因子，在生物应激反应，ABA信号和生理和生化过程中发挥关键作用[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba那GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]．的规定GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba通过GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba也是改善抗旱性的因素。GydF4y2Ba

由生理指标和干旱相关基因的表达水平确定，过表达GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba增加耐旱性拟南芥和烟草。根据我们的研究结果，GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba是一种能积极调节抗旱性的基因，也有利于提高植物对逆境的耐受性，在农业生产中具有潜在的应用价值。GydF4y2Ba

植物材料，种子萌发测定和干旱治疗GydF4y2Ba

拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba（哥伦比亚生态型）和GydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆GydF4y2Ba简历。本研究使用NC89。GydF4y2Ba拟南芥蒂利亚纳GydF4y2Ba（Columbia生态型）植物拟南芥生物资源中心（ABRC）得到的，和烟草的种子（GydF4y2Ba尼科尼亚塔哈瓦姆GydF4y2Ba简历。NC89)贮存于实验室。将植株种子播种在MS培养基上，分别在不添加ABA(0.5和1 μM)和甘露醇(150和200 mM)的条件下进行发芽试验。GydF4y2Ba

为了研究干旱胁迫对拟南芥和烟草的影响，我们利用上述程序获得的幼苗进行了模拟和自然干旱实验。对拟南芥(8周龄)和烟草(4周龄)的根进行模拟干旱处理，分别用20% PEG处理7 d。自然干旱处理停止浇水14 d，再浇水3 d观察植株表型。GydF4y2Ba

对于拟南芥，分别采用转基因(OE1-1、OE4-1和OE7-1)和WT株系各3盆，每盆4株来自同一株系。烟草则采用t2代过表达各3盆GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba（OE-1，OE-3和OE-5），反义转基因（反-1，抗-2和抗-4）行，和WT被使用，以每盆一株。每次治疗的每个锅被认为是一个生物学重复。总体而言，被用于各处理12米21的盆GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和烟草分别。GydF4y2Ba

转基因植物的产生GydF4y2Ba

CDNA末端的快速扩增（RACE）用于CDNA克隆，使用用于第一轮种族PCR反应的GSP1和NGSP1引物和嵌套的PCR反应（表S.GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba序列与NtMLP423F和NtMLP423R引物扩增（表S =GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.完整GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba编码序列在CaMV 35S启动子驱动的PBI121载体中以意义或反义方向融合。获得义义和反义表达载体并转化为GydF4y2Ba农杆菌肿瘤术GydF4y2BaGV3101和LBA4404。烟草转化物通过叶盘法进行的，而用于拟南芥的转化浸花法。GydF4y2Ba

NTMLP423蛋白的亚细胞定位GydF4y2Ba

的NtMLP423和绿色荧光蛋白（GFP）融合表达载体，并在载体导入GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]，然后将其注射成叶子GydF4y2BaN.benthamianaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]．共焦成像使用高分辨率共焦激光扫描显微镜(Zeiss LSM880，德国)。GydF4y2Ba

基因表达分析GydF4y2Ba

玫瑰花叶为8周历史的乌鸦和4周龄烟草的叶子，没有和7天的干旱治疗。表S.GydF4y2Ba1GydF4y2Ba列出了实时定量PCR实验中用到的引物。采用美国Bio-Rad CFX96-3定量PCR检测系统进行qRT-PCR研究，共3个生物重复。GydF4y2Ba

气孔孔径测量GydF4y2Ba

将八周历史的拟南芥玫瑰花叶在溶液中孵育（50mM KCl，10mM CaClGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba， 和10. mM MES-KOH) for 3 h for ABA sensitivity analysis. ABA was added into incubation solution and then stomatal aperture was observed with a fluorescence microscope (AX10, Zeiss, Germany) after treatment with ABA for 1 h [33.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

相对含水量和失水率GydF4y2Ba

在Gaxiola等人之后测量相对含水量（RWC）和水损失。[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

ABA内容测量GydF4y2Ba

为了确定ABA含量，在正常条件下生长的50毫克拟南芥玫瑰花叶，并在7天的干旱胁迫下进行采样。用70％甲醇和0.1％甲酸和ABA含量提取ABA，根据Wang等人确定。[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

脯氨酸含量和丙二醛（MDA）的内容GydF4y2Ba

按Zhang等的方法测定脯氨酸和丙二醛含量[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

ROS含量和抗氧化酶活性GydF4y2Ba

为HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和o.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{• -GydF4y2Ba}内容根据Kong等人的描述确定[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba]．抗氧化酶活性是按照Wang等人的方法测定的。[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

叶绿素含量测量GydF4y2Ba

叶绿素含量按Wang等的描述进行测定[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

净光合速率和叶绿素荧光参数GydF4y2Ba

使用便携式光合作用测量系统确定的光合作用速率（Pn）中的溶液（CIRAS-3，PP系统国际赫特福德郡，UK）。Leaf maximum photochemical-efficiency was measured after steady state attainment in the dark for 30 min at 25 °C using a portable fluorometer (FMS-2, Hansatech, UK).

双荧光素酶测定GydF4y2Ba

根据An等人的描述进行双荧光素酶测定。[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]．这GydF4y2BaNTMLP423.GydF4y2Ba将启动子插入PGREENII0800-LUC载体中，而GydF4y2BaNtWRKY71GydF4y2Ba插入pgreenii62-sk载体。所有载体都转化为GydF4y2BaA. Tumefaciens.GydF4y2BaGV3101和渗入GydF4y2BaN. Benthamiana.GydF4y2Ba叶子。通过荧光素酶互补成像(Xenogen，美国)观察荧光信号。GydF4y2Ba

酵母单杂交测定GydF4y2Ba

如Zhu等人所描述的转录因子和NtMLP423启动子之间的相互作用是由Y1H测定验证。[GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

电泳迁移率移位测定（EMSA）GydF4y2Ba

EMSA实验如由An等人所述进行。[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

数据为3个生物重复的平均值±SE，采用SPSS软件进行统计分析。*表示在GydF4y2BaP.GydF4y2Ba < 0.05, ** indicates significantly different atP.GydF4y2Ba < 0.01, relative to the WT.

本研究中的烟草基因序列从国家生物技术信息（NCBI）下载（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/GydF4y2Ba）.本研究中使用的QRT-PCR的引物在Primer5软件中设计，并且列入了QRT-PCR的特定引物GydF4y2Ba补充表GydF4y2Ba．在当前研究期间使用和/或分析的数据集可从合理的请求上从相应的作者获得。GydF4y2Ba

阿巴：GydF4y2Ba

脱落酸GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白:GydF4y2Ba

绿色荧光蛋白GydF4y2Ba

简要:GydF4y2Ba

主要乳胶蛋白GydF4y2Ba

MDA:GydF4y2Ba

丙二醛GydF4y2Ba

多发性硬化症：GydF4y2Ba

Murashige和SkoogGydF4y2Ba

PN：GydF4y2Ba

净光合速率GydF4y2Ba

电视台:GydF4y2Ba

硝基蓝色四唑唑唑GydF4y2Ba

PEG：GydF4y2Ba

聚乙二醇GydF4y2Ba

RWC：GydF4y2Ba

相对含水量GydF4y2Ba

阵线/ Fm:GydF4y2Ba

可变荧光/最大荧光GydF4y2Ba

ROS：GydF4y2Ba

反应性氧气GydF4y2Ba

WT：GydF4y2Ba

野生型GydF4y2Ba

Y1H：GydF4y2Ba

酵母单杂交GydF4y2Ba

EMSA：GydF4y2Ba

电泳迁移率移位测定GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

国家自然科学基金资助项目(no . 31370359);山东省“双优”项目资助项目(批准号:SYL2017YSTD01 to y.w)。关键词:边坡，边坡稳定性，边坡稳定性资金用于实验进行和开放获取支付。资助机构没有参与研究的设计、分析、数据解释和手稿的撰写。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 山东农业大学生命科学学院作物生物学国家重点实验室，山东省泰安，271018，P.R.中国GydF4y2Ba

   刘恒，小岑马，刘韶华，杜冰洋，王勇和张鸳蝴GydF4y2Ba

2. 临沂大学，临沂，276005，山东，P.R.中国GydF4y2Ba

   nini cheng.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

YZ是本次研究的构思和设计。HL进行了实验并撰写了手稿。HL、XM和SL对数据进行了分析。BD, NC, YW对手稿进行了修改。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaYuanhu张GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

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重印和权限GydF4y2Ba