PACBIO SMRT-和Illumina RNA-SEQ的整合分析显示了候选基因和途径涉及硒代谢的溶解剂Cardamine violifolia

背景

Cardamine violifolia是硒(Se)的超富集物之一。硒的代谢和耐受机制尚不清楚，目前仅有有限的遗传信息。因此，我们将PacBio单分子实时(SMRT)转录组库和Illumina硒酸钠(Na₂SEO.₄)治疗c . violifolia以进一步揭示硒代谢的分子机制。

结果

总硒、无机硒和有机硒的浓度c . violifolia苗期显著增加₂SEO.₄治疗浓度增加。来自SMRT全长转录组c . violifolia，共获得26,745个注释的非冗余转录本，14,269个简单序列重复，283个可变剪接和3407个转录因子。从134份转录本中鉴定出51个基因参与硒代谢，包括转运体、同化酶和一些特定基因。Illumina RNA-Seq数据分析显示，4组Na共过滤出948个差异表达基因(DEGs)₂SEO.₄其中11个DEGs与硒代谢有关。对所有DEGs的KEGG通路进行富集分析，发现它们在激素信号转导和植物-病原互作通路等5个通路中均显著富集。四个与硒代谢相关的基因，三磷酸硫腺苷酶，腺苷5 ' -磷酸硫酸盐还原酶3，半胱氨酸（Cys）脱硫酶1， 和丝氨酸乙酰转移2，受lncrna调控。20个潜在的中心基因(例如，硫酸盐转运蛋白1; 1，半胱氨酸合酶，蛋氨酸gamma-lyase,和Se-binding蛋白1）进行筛选，确定了硒的积累和宽容中发挥重要作用c . violifolia通过加权基因相关网络分析得出结论。结合基因的表达谱和注释分析以及硒的形成和浓度c . violifolia在不同NA的治疗₂SEO.₄浓度，推测的硒代谢和同化途径c . violifolia提出了。

结论

我们的数据提供了丰富的信息，推测基因转录和途径参与硒代谢c . violifolia．这一发现为硒的超积累机制提供了新的遗传资源c . violifolia．

Cardamine violifolia是属于芸苔科家族的物种，主要分布在中国的恩施和Huping山脉，并据报道是硒的一个超沉积植物之一​​[1]．到目前为止，三种不同的硒积累cardamine.来自中国的物种进行了研究。积累硒的主要形式是有机硒化合物，但Se构成的形态从一个不同到另一：硒代胱氨酸（SeCys2），用于C. Hupingshanensis.［2]，硒半胱氨酸(SeCys)和甲基SeCys (MeSeCys)C. enshiensis.［3.和硒代蒽醌c . violifolia［1]， 分别。随后的研究表明，在它们之间的耐受性，积累，位置和形态的显着差异c . violifolia其非积累的妹妹种c . pratensis［4]．迄今为止，这些研究主要集中在硒在不同组织中的形态、转运和分布cardamine.物种，然而，近几种研究已经解决了SE代谢和耐受性的分子机制c . violifolia．最近，Zhou等(2018)的转录组分析表明硒酸盐(SeO₄²⁻）是代谢的初始硒化合物C. Hupingshanensis.，并且可以通过含有几种含Se的化合物的崩解和降解来缓解SE毒性[5]．但硒代谢和耐受性的分子信息仍有待进一步研究c . violifolia仍然稀缺。

自然界中最常见的硒是亚硒酸盐和硒酸盐[6]．在厌氧环境中，亚硒酸盐是硒的主要形式，通过磷酸盐转运体被植物吸收[7，8]．不幸的是，到目前为止，这种现象还没有得到很好的解释。硒酸盐是好氧土壤中主要的硒形式，包括大多数耕作土壤[8]．与亚硒酸盐不同，硒酸盐在植物中通过硫酸盐转运体(Sultr)被吸收[6]．硒酸盐的吸收和代谢过程比使用硒酸盐的吸收和代谢过程更清楚拟南芥和Se超累加器基础pinnata作为模范植物[8，9]．四组Sultrs的负责硒的吸收和运输，包括Sultr1，Sultr2，Sultr3和Sultr4植物，在植物中发现，每组包含若干亚型[10.，11.，12.]．硒酸盐进入植物后，可被一系列主要用于硫酸盐代谢的酶同化(如腺苷三磷酸硫酶[APS]、腺苷5 ' -磷酸硫酸盐还原酶[APR]、亚硒酸盐还原酶[SIR]) [13.]．与硫酸盐转化为氨基酸(aa)类似，硒酸盐被同化为硒-aa，包括SeCys和硒蛋氨酸(SeMet) [14.]．然而，SeCys和蛋氨酸可以替代非特异性Cys和Met的蛋白质，并导致蛋白功能障碍，从而toxifying植物[15.]．Se超累加器，例如美国pinnata［16.),黄芪bisulcatus［17.，已经进化到能够从它们的组织中去除硒。将SeCys甲基化为MeSeCys并进一步挥发为二甲基二硒化物(DMDSe)是硒解毒的最有效途径。这些反应是由Cys甲基转移酶(SMT)和Cys亚砜裂解酶(CSL)催化的[9]．与SeCys类似，SeMet也可以通过s -腺苷- l- met: met -s -甲基转移酶(MMT)的介导转化为甲基-SeMet (MeSeMet)，然后转化为挥发性化合物二甲基硒(DMSe) [8]．此外挥发，植物保持另一种策略，以消除硒，即，经由SeCys的裂合酶（SL）的催化SeCys分解成元素硒和丙氨酸[18.]．

在…的情况下c . violifolia作为一种高贵的硒超积累体，目前对硒超积累的分子代谢和基因组信息了解有限c . violifolia关于硒代谢缺乏。对分子信息c . violifolia将有助于在植物修复和食品工业中开发和利用富硒食物源。近年来，单分子实时测序技术已被广泛应用于转录组全长测序。FL转录组数据中转录结构的序列长度和信息优于Illumina RNA-seq第二代数据[19.]．因此，为了阐明Se代谢的分子机制，PACBIO FL转录组和Illumina RNA-SEQ的整合分析c . violifolia用不同浓度的硒酸盐处理下，分别进行。这项研究确定候选关键基因参与硒代谢并建立了硒代谢的假定途径c . violifolia．本研究的结果将为SE同化的分子过程提供新的见解c . violifolia是一种超富集硒的植物。

SE浓度和生理指标的变化c . violifolia在不同的硒浓度下成长

se集中c . violifolia硒酸钠(Na₂SEO.₄)治疗。总硒、无机硒和有机硒的浓度随Na处理的增加而显著增加₂SEO.₄浓度增加(图。1）.值得注意的是，总硒、无机硒和有机硒的浓度c . violifolia达到9955 mg kg^{- 1}DW, 1338 mg kg^{- 1}DW, and 8617 mg kg^{- 1}DW低于16.0 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄分别是0.25 mg L以下患者的83、54和90倍^{- 1}Na₂SEO.₄分别处理。有机硒占总硒浓度的80%以上c . violifolia用不同浓度的Na处理₂SEO.₄．这一结果表明，大部分硒酸盐在c . violifolia代谢为有机形式。

的增长c . violifolia也受到Na₂SEO.₄治疗方法。如表格所示1，0.25 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄治疗刺激了生长c . violifolia鲜重显著高于0 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄治疗。4.0 mg L之间无显著差异^{- 1}组和0 mg l^{- 1}在鲜重，叶绿素，游离氨基酸和维生素C含量的组c . violifolia．Whereas for the 16.0 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄治疗，新鲜的重量和叶绿素含量显着降低，游离氨基酸和维生素C含量明显高，而不是0 mg L中的含量^{- 1}组。结果表明，0.25和4.0 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄治疗没有压力c . violifolia植物，而16.0 mg l^{- 1}Na₂SEO.₄治疗对抗强烈的压力c . violifolia植物。

测序的c . violifoliaFL转录组

为了保证PacBio FL文库的质量，我们从四组中提取了高质量的RNAc . violifolia用不同浓度的硒酸盐治疗并证实了RNA质量达到了图书馆建设的要求（附加档案1：图。S1）。在PACBIO RSII平台上测序具有1-6 k的cDNA尺寸的一个SMRT细胞。获得总共591,350个循环共分序列（CCSS）。转录长度分布在0至6000个核苷酸（NT）（附加文件2:图S2)，平均长度为1807新台币。在获得的ccs中，有508,026个(85.9%)reads为FL非嵌合(FLNC) reads。对FLNC reads进行聚类，共获得51,182个一致亚型，平均长度为1734 nt，其中50,900个是高质量亚型(表)2）.然后利用Illumina RNA-seq数据对低质量亚型进行校正，以提高序列的准确性。最终获得27,034份非冗余转录本，并指定为F01_transcript/xxx。来自12个样本的非冗余转录本的整体表达模式显示在附加文件中3.:图S3。由BUSCO评估转录组的完整性[20.]．在1440个预期胚胎发育基因中，有974个是整合基因，包括600个单拷贝和374个重复基因。在这些转录本中，其他418个和48个基因分别缺失和片段化(图。2一个)。

编码序列预测和转录本注释

通过TransDecoder软件分析，共识别出26707个开放阅读帧(orf)，其中22,388个是完整的。完整orf编码蛋白的长度范围为0 ~ 100 ~ 1500 ~ 1600 aa(附加文件)4图S4)， 79.1%的预测蛋白的长度在100-200、200-300、300-400、400-500和500-600 aa范围内。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)的非冗余蛋白序列(Nr)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)、蛋白质家族(Pfam)、真核生物Orthology Groups (KOG)、Orthologous Groups Clusters (COG)、基因的进化谱系:无监督的同源组(egg-NOG)， Swiss-Prot和基因本体论(GO)。如表所示3.其中Nr 26689份，GO 25719份，COG 12030份，KEGG 11864份，KOG 16982份，Swiss-Prot 23,444份，eggNOG 26,378份(附加文件)5：表S1）。NR同源物种分布分析显示c . violifolia是密切相关的其他Brassicaceae.植物，如拟南芥lyrata(24.0%),拟南芥蒂利亚纳（20.6％），和亚麻荠（17.2％）（图。2b).特别是，共有25791份成绩单c . violifolia用53个GO术语进行注释(图。2C）。在蜂窝部件中最丰富的词条细胞部分（92.4％），细胞（92.4％），细胞器（75.9％），膜（37.9％），和细胞器部分（27.7％）。当中分子功能，前五条款结合（52.4％），催化活性（44.3％），转运蛋白活性（7.2％），核酸结合转录因子（TF）的活性（6.2％），和结构分子活性（3.2％）.生物过程的五大词条细胞过程（69.5％），代谢过程（67.8％），单生物体过程（63.7％），响应于刺激（42.0％），和生物调节（36.6％）。在COG数据库注释的转录物也被归类（附加文件6:图S5a)。总共有3505个(19.4%)、1779个(9.9%)、1729个(9.6%)、1663个(9.2%)和1193个(6.6%)转录本分别在一般功能预测、转录、信号转导机制、复制、重组和修复、翻译后修饰、蛋白质翻转和伴侣中被注释。eggNOG功能分类中最丰富的术语是功能未知，包含11723个转录本(附加文件)6：图。S5B）。还获得了其他术语，例如翻译后修饰，蛋白质转换，伴侣（8.5％）和信号转导机制（6.8％）。

硒代谢相关转录本的特性

第五十一个基因与涉及硒134个转录物/硫（S）代谢物从八个注解数据库筛选（附加文件7:表S2)。这些基因被分为三类，即转运基因、同化酶基因和特异性基因。八个成员Sultrs,包括SULTR1; 1，Sultr1; 2，SULTR2; 1，SULTR2; 2，Sultr3; 2，Sultr3; 3，Sultr3; 5， 和SULTR4; 1在硒酸盐的摄取和转运中，硒/S代谢被注释c . violifolia．同化酶基因包含31个成员，如APS1-4，APR1-5和APR7，先生，Cys合成酶（CS），蛋氨酸合酶，同型半胱氨酸S-甲基转移酶（HMT),S-adenosyl-L-methionine-dependent甲基转移酶（MMT）.这些基因参与了植物的S同化过程，提示它们可能在植物的Se同化过程中发挥作用c . violifolia也(8，9]．另有12个基因被鉴定为与硒代谢相关的特异性基因c . violifolia，属于Cys Desulfurase1-2，Met-gamma-lyase（球型),Se-binding蛋白质（SBP1.） 家庭。这些特定基因可能在Se代谢和耐受中发挥作用c . violifolia．对来自4个处理组的134个转录本的表达谱分析表明，大多数筛选到的硒相关转录本在Na的响应下表达增强₂SEO.₄尤其是在16.0 mg L的情况下^{- 1}Na₂SEO.₄治疗组(无花果。3.）.该结果进一步表明，这些硒相关基因可以以硒摄取和代谢的作用c . violifolia通过调节表达水平。

差异表达基因(DEGs)分析c . violifolia用不同浓度的Na处理₂SEO.₄

deg在六组样本中进行过滤:0 vs 0.25、0 vs 4.0、0 vs 16.0、0.25 vs 4.0、0.25 vs 16.0、4.0 vs 16.0。共获得948个DEGs。各对照组的统计结果显示Fig中转录本上调、下调和不变的数量。4．上调和下调的转录本分别为76和431(图。4a)、36和282(图。4b），70和586（图。4c)、11和22(图。4d），34和82（图。4e）和23和50（图。4f）在0对0.25，0对4.0，0对16.0，0.25 VS 4.0，0.25 VS 16.0和4.0 VS 16.0对照组，分别。从每个比较组中的DEGS的8个数据库带注释数字进行计数（表4）.注释的DEG的总数和总含量中的注释含量的百分比为500％和98.6％，313和98.4％，649和98.9％，33和100％，114和98.3％，73和1000 VS 0.25,0 VS 4.0，0 VS 16.0，0.25 Vs 4.0,0.25 Vs 16.0和4.0与16.0比较组。此外，涉及Se-代谢的11个转录物被鉴定为DEGS，包括F01_TRANSCRIPR / 7937（SULTR1; 1），f01_transcript / 8686（Sultr1; 2），f01_transcript / 7028（SULTR2; 1），f01_transcript / 17050（SULTR2; 1），f01_transcript / 19508（APS2），f01_transcript / 21387（APR1), F01_transcript / 25148 (APR1），f01_transcript / 26665（APR3），f01_transcript / 27008（APR3），f01_transcript / 28221（SBP1.)和F01_transcript/41258 (SDI2)的表达明显增强₂SEO.₄与对照组比较(图。3.）.

来自kegg的注释DEG的数量为167,120,218,13,42和38，在0 vs 0.25,0vs 4.0，0 vs 16.0，0.25 Vs 4.0，0.25 Vs 16.0和4.0 Vs 16.0比较组中，分别。共丰富了77 kegg途径从六个比较组中富集（附加文件8：图。S6）。图2中显示了15个最重要的Kegg路径。5．α-亚麻酸代谢（KO00592），氨基糖和核苷酸糖代谢（KO00520），亚油酸代谢（KO00591），植物激素信号转导（KO04075）和植物 - 病原体相互作用（KO04626）途径在0 VS中显着富集0.25,0 vs 4.0和0与16.0组，表明这些重要活动与SE代谢有关c . violifolia．

单核苷酸多态性(SNP)、简单序列重复(SSR)和可变剪接(AS)事件的鉴定

对每个样本的转录本进行分析，以确定SNP。检测了纯合子(HomoSNP)和杂合子(HeteSNP) SNP，发现每个样本中SNP总数约为180,000个(附加文件9：表S3）。SNP密度的分析表明，所有SNP都分布在转录物的0-1Kb中（图。6一个)。

我们使用微卫星（MISA）识别工具检查了26,631个非冗余序列，总尺寸为47,220,014bp。这里获得了14,269个SSR。SSR类型的分析表明，化合物，单核苷酸，二核苷酸，三核苷酸，四核苷酸，戊核苷酸和己核苷酸SSR的数量分别为1319,6764,2522,4589,94,93和207（附加文件10.:表S4)。单核苷酸SSR的密度最高，其次是三核苷酸SSR和二核苷酸SSR(图2)。6b）。

作为事件c . violifolia用BLAST软件对非冗余转录本进行预测。我们的数据显示，283个AS事件被发现c . violifolia．为了确认所述预测AS事件的真实性，我们随机选择的被确定为AS事件（这六个基因的注解如下六个候选基因：F01_transcript / 15968，未表征的Rho GTP酶激活蛋白At5g61530; F01_transcript / 13543，热shock 70 kDa protein 3; F01_transcript/18692, catalase-3; F01_transcript/2169, probable disease resistance protein At4g33300; F01_transcript/33954, phosphatidate cytidylyltransferase; F01_transcript/35375, transcription factor UNE12) for validation through reverse transcription PCR (RT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the AS events of these six genes (Additional file11.:图S7a-c)。F01_transcript/15968、F01_transcript/33954、F01_transcript/35375这6个基因的3个剪接亚型在4个处理组中均有显著差异表达。Na₂SEO.₄治疗似乎增强了亚型的表达。例如，这三个基因的FPKM值在16mg L以下^{- 1}Na₂SEO.₄治疗为2.98,1.64，和1.58倍的0 mg l^{- 1}Na₂SEO.₄说明AS事件在硒的积累中起作用c . violifolia．

此外，我们注意到，确定为硒代谢相关基因的一种转录物是可变剪接。RT-PCR验证证实了该基因的AS事件（附加文件12.:图S7d)。即F01_transcript/19477，注释为MMT已证明在Semet新陈代谢中发挥作用[8]，表示硒在代谢c . violifolia可能受AS调控。

TFs的预测

从非还原成绩单预测总共分为197个TF系列的3407个TF系列。分析了最多成绩单数量的Top 20 TF系列（附加文件12.：图。S8）。在前20个TF家庭中，BHLH包含最多数量的转录物，其次是C3H和CAMK_CDPK。几个常见的TFS，如MYB，WRKY和C2H2，也包含在前20名TF家庭中。

长链非编码rna (lncrna)的鉴定

在植物中，lncrna在基因表达调控和对外界环境刺激的响应中发挥重要作用[21.，22.]．本研究采用编码势计算器(CPC)、编码非编码指数(CNCI)、编码势评估工具(CPAT)和Pfam四种方法，通过分析转录本的编码势预测lncrna。以上四个数据库共预测了4543个lncrna，并进一步分析了这四个数据库的重叠(53个)lncrna(图)。7一个)。在53个lncRNAs的表达水平的变化c . violifolia用硒酸盐处理的结果如图所示。7湾在53℃，在不同浓度的NA下18种增强的表达₂SEO.₄与0 mg L相比^{- 1}Na₂SEO.₄治疗。对53个lncrna的靶基因进行预测，共获得797个靶基因。GO富集分析显示，这些lncRNA靶向基因在核糖体的结构组成、胞质大核糖体亚基和翻译中显著富集(图)。7C）。靶向基因含有四种硒的代谢相关基因，其由三个LNCRNA调节（图。7d）。详细地说，F01_transcript / 23255（APS1)及F01_transcript/26665 (APR3)被lncRNA F01_transcript/2477靶向;F01_transcript / 20597 (半胱氨酸desulfurase 1）通过LNCRNA F01_TRANSCRIPR / 32219靶向;和f01_transcript / 35589（丝氨酸乙酰转移2［SAT2])被lncRNA F01_transcript/38950靶向。这些结果表明硒在c . violifolia可能受到lncrna的调控。

代谢相关基因与lncrna的基因共表达分析

根据134个与硒代谢相关的转录本和53个不同样本的lncrna的表达谱，采用加权基因相关网络分析(WGCNA)构建基因共表达模块，研究硒超积累的基因调控网络c . violifolia和筛选参与其硒积累和耐受性的关键基因c . violifolia．聚类树状图显示，树枝可以分为两个模块，分别用灰色和绿松石表示(图。8一个)。模块特征关系分析表明，绿松石模块与16.0 mg l有关^{- 1}Na₂SEO.₄治疗组(r= 0.99,p< 0.05)(图8b).绘制加权网络图，显示绿松石模块相关基因的共表达关系和相关性(图2)。8c).在加权网络图中，基因之间的连通性程度用节点的颜色表示。红色代表高连通性，绿色代表低连通性。连通性越高，基因在调控网络中心的潜力就越重要。如图所示。8C，参与绿松石模块中的26个转录物用于构建调节网络，并在14个基因中注释的20转录物被鉴定为模块的候选轮毂基因，包括四个sul成员，二APS.成员，三4月成员，每人一个先生，满足合成酶2.，球型，SBP1.，以及一个编码蛋白质缺硫诱导的基因2 (SDI2）.除F01_transcript/20373 (APS2），这意味着APS2在监管网络中作用相对较弱。Na增强了14个基因的表达水平₂SEO.₄这些基因的表达水平在16.0 mg L^{- 1}Na₂SEO.₄组显著高于其他处理样品(图。8d），从而表明这些轮毂基因在SE积累和耐受中担任正调节剂c . violifolia．具体来说，就是四个转运基因Sultr1; 1;Sultr1; 2，SULTR2; 1， 和SULTR4; 1已知参与硒酸盐摄取和转运的6个同化基因，即APS1，APS2，APR1，APR2，APR3， 和先生在硒酸盐还原转化过程中，四个特定的基因，即满足合成酶2.，球型，SBP1.， 和SDI2在硒的解毒和耐受性方面，可能在硒的代谢中起重要作用C. violifolia。

硒代谢相关关键基因与硒浓度的相关性分析

之间的相关分析在植物硒浓度和20个hub基因执行(表5）.结果表明，除f01_transcript / 20373外，所有集线器基因APS2），F01_transcript / 5636（先生），和f01_transcript / 28221（SBP1.)，与总硒、无机硒和有机硒浓度显著相关，尤其是F01_transcript/7937 (SULTR1; 1), F01_transcript / 23255 (APS1），f01_transcript / 26665（APR3)和F01_transcript/27008 (APR3），构成了它们的表达与总，无机和有机SE浓度之间的最高相关性，从而再次表明这些基因在SE积累和耐受中起关键作用c . violifolia．

RNA-SEQ数据的可靠性分析

为了验证RNA-seq数据的可靠性，我们选择了51个与硒代谢相关基因相关的转录本进行实时定量PCR (qRT-PCR)。这51个转录本的表达水平被归一化为表达β肌动蛋白，GAPB， 和18 s rRNA．结果表明，RNA-SEQ数据（FPKM）和QRT-PCR结果（2^——ΔΔCt)显著相关(R²= 0.7837,p< 0.01;额外的文件13.:图S9)，说明RNA-seq数据可靠、准确。

PacBio FL转录组提供了全面的基因信息c . violifolia

在硒超积累的分子机理目前，一些研究c . violifolia是可用的。特别是，没有参考基因组c . violifolia尚未发表，导致缺乏这种植物的遗传信息。这些问题阻碍了硒超积累的生理和分子机制的阐明。在这里，我们构建了一个PacBio FL转录组数据库c . violifolia用硒化物处理并将Illumina RNA-SEQ数据组合到涉及SE积累和耐受的矿山基因c . violifolia第一次。本研究共获得27,034个非冗余转录本，其中26,745个被成功注释。Illumina RNA-seq显示，4种Na处理下有948个转录本的差异表达₂SEO.₄．Kegg途径的富集分析表明，α-亚麻酸代谢（KO00592），氨基糖和核苷酸代谢（KO00520），亚油酸代谢（KO00591），植物激素信号转导（KO04075）和植物 -病原体相互作用（KO04626）途径。此外，使用PACBIO SMRT-SEQ技术预测了总共283个作为事件和14,269个SSR。具体而言，51个候选基因和53个LNCRNA以及我们筛选的预测靶基因涉及SE代谢。加权基因相关网络分析（WGCNA）显示20个枢纽基因可能在SE代谢和耐受中发挥重要作用c . violifolia．因此，本研究的结果为美国提供了综合信息进入参与SE代谢的基因c . violifolia．

候选基因在硒代谢和耐受性中发挥重要作用c . violifolia

在本研究中，共鉴定出51个与硒积累和耐受相关的基因，134个转录本c . violifolia．根据基因注释，我们将这些基因分成三类，即转运蛋白，同化酶和特定基因。鉴于SE和S的化学相似性，通过植物中的S同化途径代谢了[8]．八个Sultrs基因,包括SULTR1; 1，Sultr1; 2，SULTR2; 1，SULTR2; 2，Sultr3; 2；Sultr3; 3，Sultr3; 5， 和SULTR4; 1，发现于c . violifolia(附加文件7:表S2)。在这些基因中,Sultr1负责植物中的硫酸盐或硒化物摄取[23.，24.];Sultr2硫酸根转运进入血管系统的功能[25.];Sultr3在植物的再分配中起重要作用，特别是在进入叶绿体中，有助于调节Sultr2的表达[11.，26.];和Sultr4是硫酸盐液泡流出的原因[27.]．比较转录组结果显示，所有的表达水平Sultrs在na下增加₂SEO.₄与对照组比较(图。3.)，表明这些基因可能在硒处理的硒摄取和转运中起作用c . violifolia．

从FL转录组中筛选编码同化酶的三十一基因（附加文件7:表S2)。在这些基因中,APSs有四种亚型(APS1，APS2，APS3， 和APS4）被确定。APS通过偶联ATP催化硒酸盐或硫酸盐，形成腺苷5'-磷酸烯醇酯（APSE）或腺苷5'-磷硫酸盐[6，28.，29.]．在APR的催化作用下，APSe可以进一步还原为亚硒酸盐[30.]在本研究中还发现了六种同种型（四月1，四月2，四月3，四月4，四月5，和APR7）.我们还确定了两个亚苯基 - 硫酸盐激酶（运力)基因,即, ASK1和ASK2和一个phosphoadenosine phosphosulfate(PAPS)还原酶家族的蛋白质．在硫酸盐同化过程中，腺苷5 ' -磷酸硫酸盐可被ASK催化形成pps [31.]，在PAPS还原酶的作用下进一步转化为亚硒酸盐[32.，33.]．然而，pps也可以被植物中的其他次级硫酸盐化合物同化，如硫代葡萄糖苷[34.]．植物中硫酸盐的命运表明，硒酸盐可能被ASK和PAPS还原酶激活，形成亚硒酸盐或含硒S类似物，如含硒硫代葡萄糖苷[31.，32.，33.，34.]．RNA-seq结果显示，这些基因的表达水平除APR7Na₂SEO.₄治疗比对照的，这表明这些基因可能参与硒酸盐中的同化c . violifolia．综上所述，我们通过综合转录组分析获得的这些与硒同化相关的基因为研究硒在体内的吸收和代谢提供了必要的基因组资源c . violifolia．然而，这些基因的催化功能c . violifolia需要生化研究来证实。

亚硫酸盐可在SIR的作用下还原为硫化物[35.]．硫化物可以被施加到形成半胱氨酸（CYS），其被Cys合酶（CS）的作用下合成和丝氨酸乙酰转移（SAT）[36.]．考虑到假定非活性CS 2和双官能L-3-氰基碱合成酶/ CS C1具有合成Cys的功能[37.，38.，39.]，他们也可能在SECES合成中发挥作用。因此，两种CS同种型的活动可能会补充CS的。作为SMT的同源物，HMT在植物中将同型半胱氨酸转化为相遇[40]．然而，HMT与SMT具有较高的序列同源性，从而表明其具有类似的Cys和同型半胱氨酸甲基化功能[6]．在本研究中，负责SeCys向SeMet转化的基因包括胱硫胺γ-合成酶（研究生院理事会）[41.),蛋氨酸合酶［8在(附加档案7:表S2)。表达水平研究生院理事会和蛋氨酸合酶在Na作用下增强₂SEO.₄治疗(图。3.）.因此，可以推测，SeCys可以通过编码酶的作用被转化为MeSeCys或蛋氨酸HMT，研究生院理事会， 和蛋氨酸合酶在c . violifolia．这个过程可能是由S-adenosylmethionine合成酶（山姆)c . violifolia因为山姆负调节器是什么研究生院理事会［42.]．此外，蛋氨酸可以进一步甲基化以硒甲基蛋氨酸的调解下MMT在c . violifolia根据以往报告的综合资料[9，43.]．

几个可能参与硒代谢的特殊基因c . violifolia被确定（附加文件7：基于研究硒或S代谢相关基因的结果。[表S2，编号40-51）8，9]．Cys脱硫酶降解Cys并在植物中产生免费s [44.]．使用自由S用于形成FE-S簇[45.]．这里，若干Fe-S蛋白质基因从转录数据识别（例如，NADH脱氢酶[泛素]铁- s蛋白1和铁- s组装蛋白IscA）.然而，Cys脱硫酶具有一种称为SL的类似酶，可以将塞塞分解为元素SE [18.]．这一结果意味着c . violifolia在Cys脱硫酶的活性下也可以降解到元素Se中。遇到的另一个含S的AA可以通过MGL的催化来降解，以产生甲硫醇和2-酮丁酸酯[46.，表明SeMet可分解为非蛋白硒硫醇。这一推测间接得到了Both等人的研究的支持[1元素硒占总硒的16%，而SeMet仅在微量中被检测到C. violifolia。此外，Met的含量是由遇到过蓄电池［47.[是否难以评估：何处是否通过该基因呈正常或负面调节。．

在SE超读数器中，由于这两个元素的竞争作用，SE的高吸收会模仿缺乏症[48.]．SDI2是氨基葡萄糖合成的关键负调节剂拟南芥在缺s的情况下[49.]．增强SDI2S的表达会导致富S硫代葡萄糖苷的合成受到抑制，从而使S在缺S条件下的植物的初级代谢物中优先使用[49.，50.]．因此，确定植物体内的S水平是一个重要的考虑因素。组织中Se/S比值水平代表植物积累Se的能力[51.]．SBP1.与植物处于氧化应激时的解毒作用密切相关[52.]．在拟南芥中，过表达SBP1.镉积累增加及对镉的敏感性降低[53.]．证据也表明，表达SBP1.通过降低胁迫敏感性提高拟南芥对硒酸盐的耐受性[54.]．转录本表达热图分析表明SDI2和SBP1.随着NA的浓度增加明显增加₂SEO.₄治疗(图。3.和图。8d).总的来说，是SDI2和SBP1.可能有助于硒的积累和耐c . violifolia．

这里通过WGCNA寻找高度相关的基因模块，总结与样本性状相关的模块内hub基因[55.]．共鉴定了20个hub基因，发现它们构成了一个复杂的调控网络(图。8C）。生物质和生理数据显示c . violifolia植株在0.25和4.0 mg L下正常生长^{- 1}Na₂SEO.₄处理，但在16.0 mg L时受到抑制^{- 1}Na₂SEO.₄．而当浓度为4.0和16.0 mg L时，这些中心基因的表达量显著增加^{- 1}硒酸盐治疗(图。8D)，表明这些枢纽基因可以对硒酸盐作出反应。相关分析表明，除F01_transcript/20373 [APS2), F01_transcript / 5636 (先生]和f01_transcript / 28221 [SBP1.]）与硒浓度显著相关（表5）.结合这些基因从以前的研究在其他超富集硒的功能分析，我们建议这些基因在促进硒累积公差c . violifolia．

三个lncRNAs可能本身代谢功能c . violifolia

尽管Cakir等人[56.]证明几种小的非编码rna可以调节超蓄能器中硒的积累黄芪chrysochlorus在美国，有关植物中硒代谢的lncRNA的信息很少。在本研究中，从四个数据库中预测了53个lncrna(图。7a)和表达谱显示18个lncrna的表达水平随硒酸盐浓度的增加而上调，包括F01_transcript/24772、F01_transcript/32219和F01_transcript/38950。我们确定了53个预测lncrna的靶向转录本(图。7c).目标转录本在核糖体和翻译中显著富集，说明翻译过程受这些lncrna的调控。这一结果可能暗示硒的解毒作用与lncRNAs相关c . violifolia．此外，通过lncrna的表达与潜在靶基因的相关性分析，我们鉴定出3个lncrna (F01_transcript/24772、F01_transcript/32219和F01_transcript/38950)，其中有4个靶基因参与Se代谢。7d）。四个有针对性的SE相关的转录物被注释为APS1，APR3，Cys Desulfurase 1.， 和SAT2和它们的表达水平显著增强（图3.)，说明这些基因的转录受到相应lncrna的调控。自APS1和APR3在硒酸盐还原中起重要作用[28.，30.]，Cys Desulfurase 1.可以在CELCE转换为元素SE中的作用[18.),而SAT2是参与SeCys合成的关键基因[36.]，这三个lncrna可能影响硒的积累和耐c . violifolia通过调节四种基因的表达。

推定的se代谢和同化途径c . violifolia

与上一项工作的本研究和基因表征的结果一起，我们提出了一种推定的SE代谢和同化途径c . violifolia（无花果。9）.5.硒酸盐可通过Sultr1导入根细胞，并通过维管系统通过Sultr2和Sultr3转运到芽中;部分硒酸盐在Sultr4介导下可通过空泡进出;部分硒酸盐也可在Sultr3的介导下进入叶绿体;硒酸盐的同化主要发生在叶绿体和细胞质中[8]．首先，硒酸盐通过APS转化为APSe。apapse既可以被APR催化成亚硒酸盐，也可以被ASK活性转化成中间化合物PAPSe。PAPSe进一步转化为其他含硒的S类似物或被PAPS还原酶还原为亚硒酸盐。亚硒酸盐被SIR还原为硒化物，并通过SAT、OAS和CS的联合作用合成SeCys。SeCys可通过三种途径被同化，即由Cys脱硫酶介导的SeCys降解为单质Se;通过HMT酶将SeCys甲基化成MeSeCys, MeSeCys最终转化为挥发性化合物[57.];通过CGS和Met合成酶的活性将SeCys转化为Met。此外，SeMet可以降级。该过程在MGL催化下生成硒代甲硫醇。metet也可以在蒙脱土的催化下被甲基化成mesmet，然后进一步挥发。在同化过程中，一些基因受到某些lncrna的调控，如APS.和4月．考虑到球型和蛋氨酸合酶被鉴定为枢纽基因，SeMet的形成和转化可能是硒在c . violifolia．展望未来的学习，半胱氨酸desulfurase和球型将是基因功能验证的关键候选者，因为它们与硒的解毒有关c . violifolia．

FL转录组c . violifolia经硒酸盐处理的转录本进行分析，共获得26,745个注释的非冗余转录本。对AS事件、SSR和SNP的预测也扩展了我们的遗传知识c . violifolia．在51个基因中注释的134个转录本被认为参与了硒的代谢。此外，DEGs分析显示有11个硒代谢转录本在Na中有差异表达₂SEO.₄治疗方法。几个硒代谢相关基因被推测受lncrna的调控，这表明lncrna可能在硒的积累和耐受中起作用c . violifolia．WGCNA发现了几个中枢基因，如SULTR1; 1，SBP1.， 和球型．这些中心基因可能在硒的积累和耐硒方面起着关键作用c . violifolia．最后，我们提出了一个可能的硒代谢途径c . violifolia．本研究为植物硒超积累和耐硒提供了新的认识。

植物材料

的种子c . violifolia由中国恩施恩施世润健康科技发展有限公司提供，在含苗木基质(pH 5.5，纤维长度0-6 cm，丹麦品德斯特拉普公司)的孔托盘中发芽。当幼苗长出4 ~ 5片真叶后，挖出，冲洗两次，移栽到不透明的水培槽中进行水培。每个水培池长36厘米，宽24厘米，深12.5厘米，有11个孔和一个曝气器。后立即移植,¹/₄霍格兰营养液被用来使植物适应水培养。溶液被替换成¹/₂Hoagland在10天后的营养溶液，并加入Na₂SEO.₄．在正式实验前，对钠进行了初步测定₂SEO.₄治疗浓度，这将采用c . violifolia超过一个月，而不是短时间的响应。因此，Na的治疗₂SEO.₄营养液浓度分别设为0、0.25、4.0和16.0 mg L^{- 1}．每次治疗都有三种独立的生物重复，具有11个幼苗c . violifolia每个复制中的植物。的混合¹/₂霍格兰营养液和硒酸钠每10天更新一次。的生长条件c . violifoliawere controlled to a temperature of 20 ± 1 °C, relative humidity of 75%, irradiance of 200 μmol m^− 2年代^{- 1}， 14 h光周期。本研究的目的是寻找参与硒代谢和耐硒的基因C. violifolia。为了配合这一目标，避免各器官之间的误差，整苗c . violifoliafrom all replicates were harvested after 30 days of treatment, washed twice, frozen in liquid nitrogen, and stored at − 80 °C for Se concentration and transcriptome analysis.

测定硒、叶绿素、游离氨基酸、维生素C含量

整个幼苗的样本c . violifolia在60°C下干燥至恒重，然后研磨成粉末。采用氢化物发生原子荧光光谱法(HG-AFS) (AF640，北芬-瑞丽，北京，中国)测定总硒浓度，方法参照Yuan et al. (2013) [2略作修改。简单地说，称量0.5 g样品，用10ml HNO消化_3.和2 mL H₂O₂在微波消解仪（YMW40，长沙永乐康仪器，中国）。After digestion, 5 mL HCl was added into the digested solutions. The solutions were then continuously heated till cleared and transferred to 10 mL flasks, diluted with water to the set volume for determination. The HG-AFS conditions as follows: negative high voltage 340 V, lamp current 100 mA, temperature of atomization 800 °C, a flow rate of carrier gas 500 mL min^{- 1}，注射量1ml, KBH₄浓度3.5％。无机素浓度，包括SEO_3.²⁻和搜索引擎优化₄²⁻，采用液相色谱- hg - afs (LC-AFS8510，北京海光仪器，中国)测定[2，58.]．SeO的标准物质_3.²⁻和搜索引擎优化₄²⁻来自中国计量科学研究院，购得。SEO的判定条件_3.²⁻和搜索引擎优化₄²⁻在样本如下：移动阶段40 mmol l^{- 1}KH₂阿宝₄+ 20 mmol L^{- 1}KCl，pH 6.0，流量1.0毫升，色谱柱汉密尔顿PRP-X100（Hamilton Co.，USA），柱温25°C，注射体积100μL，阴极电流80 mA，载气的流速600mL min^{- 1}，negative high voltage 400 V. The organic Se concentration (including elemental Se) ofc . violifolia计算为总硒与无机硒之差。挥发性硒属植物不是研究重点，因此未进行定量研究。实验采用3个独立的生物学3个重复，每个3个重复由3个硒测定技术重复组成。

采用乙醇提取法、茚三酮比色法、2,6-二氯吲哚酚滴定法测定叶绿素、游离氨基酸和维生素C含量，方法参照《植物生理实验》[59.]．

Illumina RNA-seq和PacBio Iso-Seq测序文库的制备

构建PacBio Iso-Seq文库，总RNA的整体c . violifolia将幼苗与四种浓度的所有处理混合，其中包含12个独立生物重复的样品。通过使用Clontech Smarter PCR cDNA合成试剂盒（山景，CA，USA）合成FL cDNA，并使用Bluepippin（Sage Science Beverly，Ma，USA）过滤。在Biomarker Tech构建不同长度的单分子实时文库。公司（北京，中国）使用模板预备套件1.0（PACBIO，MENLO PARK，CA，USA）。使用具有minfullpass = 0的ISO-SEQ管道和MinprodedGedurAcy = 0.90，将原始读取被处理成错误校正的插入（ROIS）读取然后，通过搜索ROI中的PolyA尾信号和5'和3'CDNA引物来确定FLNC转录物。用于纠错（ICE）的迭代聚类用于获得共有的同种型，通过颤动抛光冰的流量序列。高质量的FL转录物分类为标准后校正精度高于99％。最后，删除了冗余以获得最终的FL转录物。

用于建造Illumina RNA-SEQ文库，整体的总RNAc . violifolia从SE浓度的四个处理基团中提取幼苗（0,0.25,4.0和16.0mg L.^{- 1}）.每个硒处理样品设置3个生物复制，使用RNAprep Pure Plant Kit(天根生物技术，北京，中国)构建12个独立的cDNA文库。Illumina测序采用中国北京生物标志物技术有限公司Illumina HiSeq 2500平台进行。干净读取是通过删除包含适配器、poly-N和低质量读取的原始读取获得的。然后将干净的读取映射到PacBio参考序列。在参考序列的基础上，只有完全匹配或只有一个错配的读码才能进一步分析和注释。基因表达水平以每千碱基的转录本每百万片段(FPKM)表示。采用12个独立样本的FPKM进行统计分析。EBSeq R包用于通过比较两个样本来筛选deg。筛选假发现率< 0.05和|log2(fold change)|≥1的转录本为DEGs。 Enrichment analysis of DEGs was analyzed using the KEGG databases to obtain the pathway enrichment of the DEGs.

硒代谢相关转录本的功能注释和鉴定

使用BLAST软件(version 2.2.26)对Nr、KEGG、Pfam、KOG、COG、egg-NOG、swiss-Prot、GO等多个数据库进行检索，对非冗余转录本进行注释。用R中的GOseq软件包分析GO富集，用KOBAS软件分析KEGG富集。通过搜索整合注释结果筛选参与硒代谢的转录本。

识别作为事件和RT-PCR验证

使用BLAST软件对所有非冗余FL转录本进行成对比对，预测AS事件。候选人是事件过滤符合下列条件:两个亚型应该的长度超过1000个基点和两个高分段对,之间的差距应该超过100个基点,遥远的作为和3 ' / 5 '末端之间应该至少100个基点,和5 bp应该允许重叠。用于RT-PCR的引物设计在Primer3Plus (http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）（附加文件14.：根据YE等人的方法验证为事件。［60.]．

lncRNA的识别和定位成绩单预测

结合四种计算方法，包括CPC、CNCI、CPAT和Pfam数据库，从转录本中推测的蛋白质编码RNA中筛选候选编码RNA。使用最小长度和外显子数目阈值筛选出推定的蛋白编码rna。选择长度大于200 nt且两个以上外显子的转录本作为候选lncRNA。进一步采用CPC、CNCI、CPAT、Pfam筛选lncrna。将这四种方法的重叠结果应用于后续分析。通过分析lncRNA与mRNA表达的相关性来靶向lncRNA的转录本[61.]．

WGCNA分析

与SE代谢相关的筛选转录物和所获得的LNCRNA用于通过R包装WGCNA（1.42版）构建共表达网络。属于四个治疗组的12个独立样品的转录物的FPKM值用于WGCNA。使用自动网络构建功能BlockWiseModules获得模块，具有默认设置。使用OMICSHARE工具绘制加权网络图，这是一个免费的网络分析的免费在线平台（http://www.omicshare.com/tools.）.

编码序列检测和TF的鉴定

TransDecoder软件(https://github.com/transdecoder/transdecoder/releases)，根据从Pfam数据库中获得的ORF长度、对数似然评分、aa序列和蛋白质结构域比对信息，识别可靠编码序列(CDS) [60.]．使用iTAK软件预测TFs [62.]．

SSR分析

Transcripts longer than 500 bp were screened for SSR analysis using MISA software (http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）[63.]．将鉴定的SSRS分为七种类型，即单核苷酸，二核苷酸，三核苷酸，四核苷酸，五核苷酸，己核苷酸和化合物SSR。

单核苷酸多态性分析

Picard-Tools（1.41版）和SAMTools（版本0.1.18）用于排序，删除重复读取，并合并每个样本的BAM对齐结果。GATK软件用于执行SNP调用[64.]．原始vcf文件使用GATK标准过滤方法和其他参数(如clusterWindowSize: 10, MQ0≥4，[MQ0/{1 × DP}] > 0.1, QUAL< 10;qa < 30或QD < 5或HRun> 5])，仅保留距离为> 5的单核苷酸多态性。根据SNP位点的等位基因数量可将SNP分为HomoSNP和HeteSNP。

qRT-PCR的基因表达

采用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix和HiScript III-RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) (Vazyme Biotech, Nanjing)进行实时PCR，扩增mRNA的每个cDNA。采用LineGene 9600 Plus荧光定量PCR系统(Bioer, Hangzhou, China)进行qRT-PCR分析。所有检测的转录本的相对表达均归一化到内参基因β-actin 3, GAPB (GAPDH家族成员)，和核糖体18s rRNA，并使用公式f = 2计算^——ΔΔCt［65.]．利用Primer3Plus设计qRT-PCR引物(附文件)15.:表S6)。

统计分析

从各处理的数据表示为代表三个生物一式三份±标准误差平均值。使用SPSS22（SPSS公司，Chicago，IL，USA）通过单向ANOVA分析数据。多次治疗组间比较采用Tukey的诚实显著差异测试在执行p≤0.05。

本文报告的原始PacBio序列数据已在大数据中心的基因组序列归档中沉积[66.[中国科学院北京基因组研究所(BIG)]， accession number: CRA002432，公开地址https://bigd.big.ac.cn/gsa.．所有的原始RNA-seq数据都可以在国家生物技术信息中心序列阅读档案(登录号:NO。PRJNA590869)。在当前研究中生成的数据库和使用的材料可从相应和第一作者在合理要求(xufeng198@126.com；raoshen1989@163.com）.

aa:

氨基酸

AFS：

氢化物产生原子荧光光谱法

4月:

腺苷5 ' -phosphosulfate还原酶

APS:

腺苷三磷酸硫酶

拱点:

腺苷5 ' -phosphoselenate

作为：

可变剪接

问：

Adenylyl-sulfate激酶

CCS技术:

圆形的共识序列

CDS：

编码序列

研究生院理事会:

胱硫醚gamma-synthase

COG：

同源组的簇

CNCI:

Coding-non-coding指数

CPAT：

编码潜在评估工具

中国共产党:

编码潜在计算器

CS：

半胱氨酸合成酶

CSL：

半胱氨酸亚砜裂合酶

cys：

半胱氨酸

DEG：

不同的基因表达

DMSe:

Dimethyl-selenide

DMDSe:

Dimethyl-diselenide

蛋酒：

基因的进化系谱

FL:

全长

FLNC：

全身non-chimeric

走：

基因本体论

HeteSNP:

杂合的SNP

HG-AFS:

氢化物产生原子荧光光谱法

HMT：

同型半胱氨酸S-methyltransferase

HomoSNP:

homozygotic snp.

KEGG:

基因和基因组京都百科全书

Kog：

真核Orthology组

lncRNA:

长期非编码RNA

MeSeCys:

甲基硒代半胱氨酸

满足:

蛋氨酸

球型:

蛋氨酸gamma-lyase

对剧中:

微卫星识别工具

mmt：

S-adenosyl-L-Met: Met-S-methyltransferase

NCBI:

国家生物技术信息中心

木栓：

非监督的直立群体

Nr:

NCBI非冗余蛋白序列

nt:

核苷酸

ORF：

开放阅读框架

PAPS:

Phosphoadenosine phosphosulfate

PAPSe:

Phosphoadenosine phosphoselenate

包含了:

蛋白家族

存在:

定量实时软

rt - pcr:

逆转录-PCR

山姆:

S-adenosylmethionine合成酶

星期六：

丝氨酸乙酰转移酶

SBP：

硒结合蛋白

SDI:

蛋白质缺硫引起的

SeCys:

硒代半胱氨酸

SeCys2:

Selenocystine

SeMet:

硒代蛋氨酸

先生：

Selenite还原酶

SL：

密塞萨斯

SMRT:

单分子实时

SMT：

SeCys甲基转移酶

SNP:

单核苷酸多态性

苏维埃社会主义共和国:

简单序列重复

Sultr:

硫酸盐转运蛋白

TF：

转录因子

WGCNA：

加权基因相关网络分析

感谢吴美如小姐和朱倩慧小姐帮助确定硒的浓度。

本研究由湖北省科技创新专项(NO。恩施市科技计划资助项目(NO. 2019ABA113);E20180005)。资助机构在研究的设计、数据的收集、分析和解释以及手稿的撰写中没有发挥任何作用。

从属关系

1. 2 .长江大学园艺学院，湖北荆州434025

   饶申，徐峰，赖晓卓，张伟伟，廖永玲

2. 武汉工业大学，富硒农产品加工技术国家研发中心，武汉，430023

   田宇，丛欣，程水源

3. 2 .恩施世润健康科技发展有限公司，湖北恩施445000

   田玉＆xin cong

4. 2 .国家富硒产品质量监督检验中心，湖北恩施445000

   水源程

贡献

SR，FX和SC设计实验并起草了手稿。SR和XL进行实验。TY和XC分析数据。WZ和YL促成人物画。全体作者都阅读并同意稿件。

通讯作者

对应到冯旭．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

利益争夺

提交人声明他们没有竞争利益。

出版商的注意事项

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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