Na的组织特异性表达分析⁺和Cl⁻与水稻叶鞘脱盐能力相关的转运基因

背景

水稻耐盐的一个重要机制是去除钠的能力⁺和Cl⁻在叶鞘中，这限制了这些有毒离子进入叶片。叶鞘去除钠⁺主要在基底部，Cl⁻主要在顶端部分。这些离子从周围部分的木质部导管中释放出来，并被隔离到叶鞘中心部分的基本薄壁细胞中。

结果

本研究旨在鉴定相关钠⁺和Cl⁻在水稻品种FL 478的叶鞘中发现了具有这种除盐能力的转运蛋白基因。从21个已知的候选人Na⁺和Cl⁻我们测定了这些基因在水稻基部和根尖的表达对盐的响应性⁺或氯⁻在盐度条件下，离子大量积累。我们还比较了这些转运蛋白基因在叶鞘外围和中心部位的表达水平。8 Na⁺转运蛋白基因和3cl⁻盐胁迫下，叶鞘基部和叶鞘顶端的转运蛋白基因均上调。在这些基因中，OsHKT1; 5而且OsSLAH1外周部分高表达，表明这些基因参与了Na⁺和Cl⁻从木质部容器中卸载。OsNHX2, OsNHX3, OsNPF2.4高表达，提示这些基因可能在Na⁺和Cl⁻在盐度作用下叶鞘中部的基本薄壁细胞中。此外，4个候选基因在盐度条件下的高表达与叶鞘脱盐能力的基因型变异有关。

结论

这些结果表明，水稻叶鞘的除盐能力可能是通过表达不同的Na来调控的⁺或氯⁻转运基因在组织中——特别是在外围和中心部位。此外，一些候选基因的表达水平与叶鞘脱盐能力的基因型变异相关。这些发现将有助于进一步认识水稻叶鞘除盐能力的分子机制，为耐盐水稻品种的选育提供依据。

水稻叶鞘在降低钠等有毒离子方面起着重要作用⁺和Cl⁻在水稻植物的主要光合组织——叶片中的浓度[1，2，3.］．叶鞘的除盐能力包括从木质部卸载盐和将盐隔离到叶鞘细胞，这是由两个不同的内部部分，边缘部分和中心部分相互协调完成的。叶鞘释放钠⁺和Cl⁻来自周边脉管系统木质部血管的离子，然后优先将这些离子从周边运输到中心部位，并将这些离子隔离到中心部位的基本薄壁细胞[3.］．此外,钠⁺和Cl⁻在叶鞘的不同部位积累，Na⁺在基部和氯⁻在水稻叶鞘的顶端部分，这表明这些离子运输的响应基因可能在水稻叶鞘的每个位置上调[3.］．因此，为了阐明叶鞘脱盐能力的分子机制，确定哪些已知的候选Na是很重要的⁺和Cl⁻转运蛋白基因与钠的去除有关⁺在基底部和Cl⁻在盐胁迫下，叶鞘顶端和叶鞘外围的盐卸载和叶鞘中心的基本薄壁细胞的盐固存。

此前,Na⁺据报道，木质部血管的卸载是由几个1族高亲和K介导的⁺转运蛋白(HKT1)蛋白[4，5，6］．AtHKT1; 1拟南芥［7，8，9]和OsHKT1;1 [10Na的功能⁺从根的木质部导管中卸载，有助于耐盐。许多研究表明OsHKT1; 4基因在水稻中介导钠⁺在叶鞘中排除，以防止钠的过度积累⁺在叶片中，尤指在繁殖阶段[2，11，12］．此外，另一组HKT运输车，OsHKT1; 5已知其在靠近木质部血管的根薄壁细胞中优先表达，具有提取Na的生理功能⁺从木质部的汁液，导致较少的Na⁺K的浓度和增加⁺盐胁迫下地上部含量[13，14，15］．在叶鞘水平上OsHKT1; 5基因也负责钠的卸载⁺从木质部血管进入木质部薄壁细胞[16］．HKT2基因编码2类高亲和K⁺转运蛋白也介导钠的向内摄取⁺以及K⁺［17，18，19］．

其他重要Na⁺-选择性转运蛋白基因被称为腺膜定位钠⁺/小时⁺换热器(NHX)，负责钠的隔离⁺进入液泡，导致毒性钠的减少⁺在盐胁迫下几种植物的细胞质中[20.，21，22，23，24，25］．过度的AtNHX1在拟南芥通过分隔钠来增加耐盐性⁺进入液泡对盐胁迫的反应[20.，21］．在大米、OsNHX1, OsNHX2, OsNHX3而且OsNHX5在穗、旗叶鞘和叶片、幼苗芽和根等不同部位表达，有效地发挥Na的作用⁺在液泡中隔离以维持低钠⁺在盐胁迫下的细胞质中，这对水稻的耐盐性至关重要[22，24］．

此外，质膜型Na⁺/小时⁺交换蛋白盐超敏1 (SOS1)是重要的钠元素之一⁺转运蛋白减少Na的转移⁺从根到芽拟南芥、米及面包小麦[26，27，28，29，30.］．据报道，SOS1在两种Na中都起作用⁺从根表皮挤出[5，31]和Na⁺载入根和嫩枝的木质部[26，32，33，34］．吴等。[29揭示了娜⁺挤压由根的伸长区所介导TaSOS1是小麦耐盐性所必需的。在水稻方面，Mahi等人最近的一项研究。[34报告说OsSOS1在提高水稻耐盐性方面发挥着重要作用⁺排除和装载钠⁺进入水稻植物的木质部。

先前的一些研究已经阐明了一些与Cl机制相关的转运蛋白基因⁻盐胁迫下植物的转运与解毒。在拟南芥，硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白2.4 (NPF2.4)和慢型阴离子通道相关同源物1 (SLAH1)蛋白，定位于根中柱细胞的质膜，介导Cl⁻装载到木质部血管中，控制Cl的长距离运输⁻从根到芽[35，36］．此外，阳离子-氯离子共转运体1 (CCC1)也参与Cl的表达，它也位于根中柱细胞和叶片的质膜上⁻从木质部血管向周围薄壁细胞卸载，影响长距离Cl⁻运输在拟南芥盐胁迫下的水稻[37，38］．此外，Nakamura等人。[39]表明，液泡体定位的OsCLC1和OsCLC2蛋白属于氯通道(CLC)家族，在分隔Cl中起作用⁻以避免Cl的毒性⁻在盐水条件下水稻细胞质中。

在本研究中，我们的目标是确定哪个已知的Na⁺或氯⁻通过一般和局部表达分析，转运蛋白基因与水稻叶鞘脱盐能力相关。首先，我们测定了Na候选人的转录水平⁺和Cl⁻转运蛋白基因在基底(Na⁺)和顶端(Cl⁻)在FL 478基因型水稻的叶鞘部分，其中Na⁺和Cl⁻均累积至最高水平[3.]以确定在盐胁迫下表达水平增加的基因。其次，我们比较了候选人Na的转录水平⁺和Cl⁻在盐渍条件下生长的FL 478植株叶鞘边缘和中心区域之间的转运蛋白基因。外周部分包括血管、表皮和外周基本薄壁细胞[3.］．我们假设Na⁺或氯⁻外周部分高表达的转运蛋白基因可能参与了这些离子在脉管系统中的卸载，或在外周组织中的积累。另一方面，由于中心部分多为基本薄壁细胞，盐在此高度积聚[3.),钠⁺或氯⁻在中心部分高度表达的转运蛋白基因被推测参与了这些离子在基本薄壁细胞中的隔离。为了实现这些目标，我们选择了关键Na⁺和Cl⁻转运蛋白基因(表1)，之前被描述为与增强水稻的耐盐性有关。然后，将所有候选基因分别在正常和nacl处理下的水稻叶鞘基部、根尖部分和内部组织中进行表达分析。接下来，为了确定哪些基因表达谱与叶鞘除盐能力的基因型差异相关，我们选择了两对表现出优势或劣势钠的水稻基因型⁺或氯⁻叶鞘内的去除能力[40]，比较候选Na的表达水平⁺或氯⁻盐胁迫下叶鞘组织中的转运蛋白基因。最后，我们讨论了水稻叶鞘脱盐能力的潜在候选转运基因。

钠的分布⁺和Cl⁻在米叶中

Na的分布⁺和Cl⁻以耐盐水稻品种FL 478为试材，在对照和nacl处理条件下，测定了第5叶纵轴上的含量。NaCl处理72 h, Na⁺在叶鞘基部(Sheath1)积累较多，向叶片顶端减少(图1)。1a).在控制条件下，Na⁺叶鞘顶部浓度较高，但各部位间无显著差异(图2)。1a). Cl⁻在对照和NaCl处理下，叶鞘顶端浓度均高于其他部位(图2)。1b)。

Na的表达谱⁺和Cl⁻叶鞘基部和叶鞘顶端的转运基因

进行转录表达分析，确定各Na的表达谱⁺和Cl⁻叶鞘基部和叶鞘顶端的转运蛋白基因，其中Na⁺或氯⁻在控制或nacl处理条件下，都是高度积累的。在所有已知的Na族中⁺本研究中使用的转运基因(共13个)，OsHKT1; 1，OsHKT1; 5，OsSOS1，OsNHX1，OsNHX2，OsNHX3，OsNHX4而且OsNHX5在NaCl处理下，叶鞘基部表达量显著增加(图2)。2)．

在已知氯内⁻转运基因(共8个)，OsNPF2; 4，OsCLC1而且OsSLAH1在盐水条件下叶鞘顶端显著上调(图2)。3.)．的表达式OsCCC1, OsCLC5而且OsCLC6在NaCl处理下，叶鞘顶端部分的盐含量降低(图;3.)．

钠的表达分析⁺在叶鞘中部和顶端部分也进行了转运蛋白基因的检测(附加文件)1)．在叶鞘的中部，仅有OsNHX2,在所有纳族中⁺在盐胁迫下，转运蛋白基因的表达水平显著增加(附加文件)1)．叶鞘顶端部分，仅限OsHKT1; 4在盐胁迫下表达水平显著增加(附加文件)1)．所有Cl的表达量⁻在叶鞘基部和叶鞘中部也检测到了转运蛋白基因(附加文件)2)．在叶鞘基部，表达量为OsNPF2; 4，OsCCC1，OsCLC1，OsCLC2，OsSLAH1而且OsSLAH7在盐度下显著增加(附加文件2)．叶鞘中部:OsCLC1而且OsSLAH1对盐胁迫的反应显著增加(附加文件)2)．

Na的表达谱⁺叶鞘内部组织中的转运基因

Na的表达分析⁺叶鞘内部组织中的转运蛋白基因在叶鞘外围部分表达量较高OsHKT1; 3，OsHKT1; 5，OsHKT2; 3，OsHKT2; 4，OsNHX4而且OsNHX5与nacl处理条件下的中心部位相比(图;4)．另一方面，和OsNHX3在盐胁迫下，中心部位的表达量高于周围部位(图2)。4)．

对照条件下，外周部位表达量较高OsHKT1; 3，OsHKT1; 5，OsHKT2; 3，OsHKT12;4和OsNHX5比中心部分(附加文件3.)．相比之下,OsHKT1; 4，OsHKT2; 1而且OsNHX2中心部位的表达水平高于外围部位(附加文件)3.)．

Cl的表达谱⁻叶鞘内部组织中的转运基因

用于Cl的表达分析⁻转运体基因,OsCCC1, OsSLAH1而且OsSLAH7在nacl处理条件下，外周部位的表达量明显高于中心部位(图2)。5)．表达水平OsNPF2; 4，OsCLC2而且OsCLC6在nacl处理条件下，中心部位高于外围部位(图2)。5)．

在控制条件下，OsSLAH1而且OsSLAH7与中心部位相比，外周部位表达水平较高(附加文件4)．另一方面，在对照条件下，没有基因在中心部分表现出更高的表达水平(附加文件)4)．

候选Na的验证⁺和Cl⁻使用RNA-seq的转运蛋白基因

RNA-seq分析验证Real-Time PCR分析Na表达水平的结果⁺和Cl⁻正常和生理盐水条件下叶鞘中部和外围部位的转运蛋白基因。在nacl处理条件下，RNA-seq(附加文件5，6)对所有Na的Real-Time PCR结果显示，外周和中心部位的表达量差异具有可比性⁺和Cl⁻转运基因除外OsCLC1(无花果。4，5)．关于OsCLC1的资料OsCLC1是在RNA-seq中获得的，因为没有用于RNA-seq分析的RAP ID，为该基因注册。RNA-seq结果显示，细胞外周部分Na的表达量较高⁺转运基因等OsHKT1; 3，OsHKT1; 5，OsHKT2; 3而且OsHKT2; 4和一个氯⁻转运体基因,OsSLAH1，与nacl处理条件下的中心部位相比(附加文件5，6)．中心部位Na表达量较高⁺转运基因等OsHKT1; 4，OsHKT2; 1而且OsNHX3和一个氯⁻转运体基因,OsCLC2，与盐度下的外围部分相比(附加文件5，6)．

在正常情况下，所有Na的RNA-seq和Real-Time PCR分析结果在外周和中心部位的表达水平差异趋势具有可比性⁺和Cl⁻转运基因除外OsNHX2(附加文件3.，4，7，8)．在RNA-seq分析中，外周部分的表达水平相对较高OsHKT1; 3，OsHKT2; 3，OsHKT12;4和OsNHX2对Na⁺转运蛋白基因OsSLAH1对氯⁻在对照条件下，转运蛋白基因比中心部位要高(附加文件)7，8)．此外，在纳⁺和Cl⁻转运基因，只有OsHKT2; 1正常情况下，中心部位表达水平高于外围部位(附加文件7，8)．

Na的基因型比较⁺和Cl⁻转运蛋白基因表达

比较Na的基因表达水平⁺和Cl⁻在IR-44595和318盐度下，Na在叶鞘中的转运蛋白基因⁺氯为Okshitmayin和WC 4419⁻表现出Na的对比能力⁺或氯⁻叶鞘的去除能力[40］．如先前报道[40]， IR-44595中Na的鞘刃比较高⁺浓度大于318(图;6a). Okshitmayin也表现出较高的Cl的鞘刃比⁻与WC 4419相比的浓度(图;6b)。

IR-44595和318积累的Na最高⁺盐胁迫下基叶鞘中钠的含量次之⁺浓度向叶片方向降低(图;6c).另一方面，Okshitmayin和WC 4419表现出相当的Cl⁻叶鞘基部、中部和顶端部分的浓度(图2)。6d).因此，在活性脱盐部位进行基因表达分析时，IR-44595和318使用叶鞘基部，Okshitmayin和WC 4419使用叶鞘顶端。

表格2示Na的相对表达量比较⁺盐胁迫下IR-44595和318基叶鞘中的转运蛋白基因。在确定的基因内，相对表达水平OsHKT1; 3，OsHKT1; 5而且OsNHX1IR-44595显著高于318。另一方面，与Cl的相对表达量相比⁻盐胁迫下转运蛋白基因的相对表达量OsCLC2与WC 4419相比，Okshitmayin显著升高(表3.)．OsNHX4，OsSLAH1而且OsSLAH7基因不包括在表中2而且3.因为实时PCR结果在一些样本中是不确定的，可能是由于这些基因型的低表达水平。

本研究旨在鉴定Na⁺或氯⁻水稻叶鞘中与脱盐能力相关的转运蛋白基因及其在脱盐机制中的作用因此，我们确定了21个已知候选Na的转录水平的盐响应性⁺或氯⁻转运型水稻基因分别在基部或根尖部位，其中Na⁺或氯⁻堆积水平较高(图;1)．我们还确定了已知的Na候选人。⁺或氯⁻转运蛋白基因在叶鞘外周或中心部位特异性表达，从而推断哪些基因与叶鞘外周部位卸盐或叶鞘中心部位盐固入基本薄壁细胞有关。

Na⁺与钠相关的转运蛋白基因⁺叶鞘去除

Na的去除⁺提示叶鞘中钠的卸载对叶鞘中钠含量的调节作用⁺从木质部血管和Na的隔离⁺叶鞘中央基本薄壁细胞[3.］．在本研究中使用的HKT转运蛋白编码基因中，OsHKT1; 1而且OsHKT1; 5在叶鞘基部响应盐胁迫时，它们的表达量显著增加(图2)。2a-g)，表明它们在Na中具有潜在的活性⁺盐胁迫下叶鞘基部的转运。此外，基因OsHKT1; 3，OsHKT1; 5，OsHKT2; 3而且OsHKT2; 4在由血管和基本薄壁细胞组成的外周部分高表达(图。4a-g，附加文件5)．这些结果表明OsHKT1; 5可能对娜负责⁺在盐度下从叶鞘的木质部血管中卸载，作为一种高选择性的钠⁺运输车辆。OsHKT1; 5在水稻中，该基因定位于质膜上，并在盐胁迫下水稻的节、基茎和叶鞘的脉管中高度表达[16］．这与Kobayashi等人的发现相吻合。16显示T-DNA插入OsHKT1; 5降低Na⁺叶鞘的去除能力。此外,OsHKT1; 5在对照条件下，叶鞘外围部分也有高表达(附加文件3.的具体作用OsHKT1; 5在叶鞘的外围区域。另一方面，在叶鞘中，OsHKT1; 1在对照组和生理盐水条件下，外周和中心部位均有表达(图2)。4a、附加文件3.，5，7)，可作为Na⁺转运蛋白在非特异性部位渗透Na⁺在盐度条件下，从细胞外体间隙到细胞内部。OsHKT1; 1，定位于质膜上，在水稻根和叶片的维管组织中均有表达，并在盐胁迫下表达增加[10］．

这五种基因的表达水平OsNHX盐胁迫下叶鞘基部基因也有上调(图2)。2h l)。在这些OsNHX的基因,OsNHX2而且OsNHX3在盐度条件下，叶鞘中部高度表达(图2)。4h-l，附加文件5)．这意味着OsNHX2而且OsNHX3哪些基因负责吸收钠⁺盐胁迫下，离子进入叶鞘中部基本薄壁细胞内的液泡。钠的过度积累⁺叶鞘中央的基本薄壁细胞是影响叶鞘除盐能力的重要过程[3.］．因此,OsNHX2而且OsNHX3是决定Na⁺叶鞘中盐的去除在一定程度上受叶鞘中基本薄壁细胞向液泡的隔离作用的影响。此外,OsNHX2在叶鞘中部高表达，与盐处理无关(图2)。4i，附加文件3.)．OsNHX蛋白不仅渗透Na⁺而且K⁺［24］．据报道，中央叶鞘的基本薄壁细胞积累了高浓度的钾⁺在正常情况下[3.］．因此，可以认为OsNHX2可能涉及K⁺在正常情况下，在叶鞘基本薄壁细胞的液泡中积累，并介导Na⁺固溶时过量Na⁺离子被输送到叶鞘。另一方面，OsNHX4而且OsNHX5在盐度条件下叶鞘周围高度表达(图2)。4k, l)，表明这两个基因具有固纳功能⁺在叶鞘的周围部分(脉管系统、表皮或周围薄壁细胞)分化为液泡，但在中央的基本薄壁细胞中不分化。

Cl⁻与Cl相关的转运蛋白基因⁻叶鞘去除

实验结果表明，该工艺对氯的去除能力较好⁻在盐胁迫条件下，叶鞘中的叶绿素含量受多重Cl的调控⁻缺乏机制的转运基因。叶鞘顶端部分的磷含量显著增加OsNPF2; 4，OsCLC1而且OsSLAH1(图;3.)．这说明这三个Cl⁻转运蛋白基因与Cl的去除能力有关⁻在盐度下的叶鞘中。此外,OsNPF2; 4在盐水条件下，叶鞘中部表达高于叶鞘外围(图2)。5)．NPF2; 4，定位于质膜，已报道在负载Cl⁻进入木质部导管的根中拟南芥［35］．在大米、OsNPF2; 4据报道，它是一种低亲和力的硝酸盐转运体，参与了硝酸盐从根到芽的长距离运输[41的生理功能OsNPF2; 4作为一种氯离子在水稻中的转运体，目前尚未有研究。有人建议OsNPF2; 4可能在Cl中起作用⁻尽管需要进一步的研究来证实NPF2;4参与了Cl的去除，但在盐度下，NPF2;4被加载到叶鞘中部的基本薄壁细胞中⁻在水稻的叶鞘中。另一方面，OsSLAH1，质膜型Cl⁻转运体(36]在正常和盐处理条件下，细胞外周部位表达高于中心部位(图2)。5g、附加文件4)，表明…的特定功能OsSLAH1在叶鞘的外围部分。在拟南芥，同源基因AtSLAH1而且AtSLAH3在根中柱细胞中共表达，并在Cl中发挥作用⁻以氯的形式进入木质部⁻射流转运器[42］．有人怀疑OsSLAH1可能在Cl中起作用⁻通过Cl的作用从外围部位向中心部位运输⁻外排，虽然它必须是必要的，以研究生理功能OsSLAH1叶鞘的除盐能力。

OsCLC1主要定位于液泡体，被称为rice氯通道基因，介导氯的区室化⁻在盐胁迫下进入液泡[39］．OsCLC1在中心部较周围部表达较高(图;5)，表明OsCLC1可能在隔离氯⁻进入叶鞘中部基本薄壁细胞的液泡中。OsCLC2而且OsCLC6在中部也有较高的表达(图;5，附加文件6)，而这些基因可能不参与Cl⁻盐度降低了这些基因对叶鞘的去除能力。

Na表达水平的基因型比较⁺和Cl⁻盐度下的转运基因

我们确定了Na基因型差异的原因基因⁺或氯⁻叶鞘的去除能力。在盐度条件下，IR-44595具有较高的Na⁺叶鞘的去除能力表现出较高的表达水平OsHKT1; 3，OsHKT1; 5而且OsNHX1与能力较弱的品种318相比(表2)2)．这一结果表明，这些基因的高表达水平可能与较高的Na有关⁺叶鞘的去除能力。这也与之前的发现相一致，即敲除的地方OsHKT1; 5基因降低钠的能力⁺叶鞘的去除能力[16］．到目前为止，还没有关于介入的报道OsNHX1在那⁺叶鞘的去除能力。OsNHX1在叶鞘中央薄壁细胞中表达较高(图2)。4)，表明该基因参与了Na⁺细胞内的隔离。这些结果可能指示Na⁺叶鞘中部的基本薄壁细胞的隔离也会定量地影响其吸收钠的能力⁺叶鞘中钠的去除能力较弱⁺卸料活动由外围部分调节OsHKT1; 5．需要进一步的研究来证实这一假设，以确定改变表达水平的影响OsNHX1Na基因⁺叶鞘内的去除能力。王萨旺等。[43]报道，在耐盐粳稻品种oukan 383中，高度诱导表达OsHKT1; 4可能与高钠相对应⁺在叶鞘中积累。这意味着基因型变异的原因基因可能依赖于基因型。

相比之下，关于Cl的基因型差异⁻去除能力在叶鞘中表达水平较高OsCLC2与较高的Cl⁻与WC 4419相比，Okshitmayin的去除能力(表3.)．OsCLC2可能与Cl⁻通过在叶鞘中心的基本薄壁细胞中优先表达来隔离。5)，表示Cl⁻固溶活性可能影响Cl⁻叶鞘内的去除能力。OsCLC2基因编码水稻液泡电压门控氯通道，优先表达于叶鞘而非叶片[39]，尽管有直接证据表明OsCLC2耐盐性，尤其是氯⁻在叶鞘中脱除，至今未见报道。在拟南芥中，AtCLC基因与耐盐性有关[44，45］．此外，在野生大豆BB52中GsCLC -_C2基因在根中表达，并在Cl中发挥作用⁻在根系中隔离，有助于降低Cl⁻从根到芽的运输[46］．需要进一步的研究来确定的生理作用OsCLC2在叶鞘中OsCLC2-敲除或过表达水稻突变体，验证是否存在差异OsCLC2表达水平引起Cl基因型变异⁻水稻叶鞘的去除能力。

目前的研究表明，一些已知的候选Na⁺或氯⁻转运蛋白基因对叶鞘中的盐度有反应。此外，部分Na在组织中有特异性表达⁺或氯⁻转运蛋白基因表明不同基因参与了叶鞘外围的盐卸载和叶鞘中部的盐固存。关于Na的去除⁺在叶鞘中，OsHKT1; 5可能在Na中起作用⁺盐胁迫下木质部容器的卸载。Na⁺叶鞘中部的基本薄壁细胞的隔离可能与此有关OsNHX2而且OsNHX3在盐水条件下。Cl的去除率⁻在叶鞘中可能受到几种氯的调控⁻运输者，比如OsNPF2; 4，OsCLC1而且OsSLAH1在盐胁迫条件下。此外,OsCLC1强烈建议在Cl⁻在生理盐水条件下，内叶鞘中心区域的基本薄壁细胞。此外，一些基因的表达水平与叶鞘脱盐能力的基因型变异相关。利用基因敲除或基因过表达技术，进一步验证各基因在叶鞘脱盐机制中的生理功能。此外，有必要研究耐盐性状与候选基因表达水平之间的相关性，以探讨这些基因在育种中应用的可能性，从而培育出耐盐新品种。

植物材料和生长条件

本研究采用耐盐水稻基因型FL 478。FL 478种子由菲律宾国际水稻研究所(IRRI)的Genebank提供，并在日本名古屋大学繁殖。Neang等描述了水稻幼苗的生长条件。[3.］．植物在Yoshida溶液中水培生长2周[47]，然后在水培溶液中加入50 mM NaCl，静置2天，再加入100 mM NaCl，静置1天(共3天)。

样品制备

第五片叶子被切成4个部分;鞘被切成等长的3部分，第4部分为叶片(鞘1、鞘2、鞘3、刃)。Sheath1、Sheath2和Sheath3是指叶鞘基部、中部和上部，Blade是指整片叶片。这四个部分用于测定钠⁺和Cl⁻浓度。采用基叶鞘Sheath1和根尖叶鞘Sheath3进行基因表达分析。另外，用第五叶鞘的中间部分做横截面。每个横截面首先分为上下两部分，上部分在立体显微镜下使用剃须刀片分为中心和外围部分(Olympus SZ61)(附加文件)9)．截面的下部没有被使用，因为它很难分成中心和外围部分。横切面叶鞘的中心部分主要由基本薄壁细胞组成，外围部分由基本薄壁细胞、表皮和脉管组成。收获后，立即将样品放入N液中进行RNA提取₂，然后在-80°C保存，如有必要。Na样品⁺和Cl⁻在70°C下干燥72小时以上。

娜的Measurement⁺和Cl⁻浓度

Na⁺和Cl⁻浓度的测量方法如Neang等所述。[3.］．

基因表达分析

使用RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN, Hilden, Germany)从叶鞘的基部、中部和顶端部分、横切面叶鞘的中部和外围部分分离总RNA。每个样品提取的RNA用寡核苷酸(dT)进行cDNA合成。¹⁵引物(Takara Bio，志贺，日本)使用Takara PrimeScript逆转录酶(Takara Bio，志贺，日本)。然后，采用SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio，志贺，日本)，使用LightCycler 96 (Roche Diagnostics,Risch-Rotkreuz，瑞士)仪器进行实时PCR分析。基因特异性引物集在附加文件中列出10．各基因的相对转录水平用2^−∆∆CT方法(48)使用OsActin1作为对照基因。

RNA-seq分析

上述从FL 478叶鞘中心和外围提取的RNA样品也用于RNA-seq分析，验证Real-Time PCR分析数据。RNA和RNA-seq分析的质量检查如Neang等所述。[40］．数据已存入DDBJ序列读取存档(存取号为。DRA009377)。每个基因的相对转录水平由每个基因的reads per kilobase per million reads (RPKM)除以的RPKM计算OsActin1作为对照基因。

Na的基因型比较⁺和Cl⁻转运蛋白基因表达

比较Na的表达水平⁺和Cl⁻Na表达能力高和低的基因型之间的转运蛋白基因⁺或氯⁻4种水稻基因型IR-44595 (籼稻，高Na⁺叶鞘去除，IRGC注册编号117755)，318 (热带粳稻，低钠⁺叶鞘去除，IRGC注册编号117629)，Okshitmayin (混合，高氯⁻去除叶鞘，IRGC注册编号117827)和WC 4419 (热带粳稻，低氯⁻从296个水稻基因型[40]，被使用。这些种子是由IRRI的Genebank提供的。如上所述，它们被种植和盐碱化。收获第五叶，切成基部、中部、叶尖和叶片四部分。Na⁺和Cl⁻测定了各部位的浓度，并对Na浓度最高的部位进行了测定⁺或氯⁻用于RNA提取。提取的RNA用于测定Na的表达量⁺或氯⁻通过Real-Time PCR分析转运蛋白基因。

统计分析

每个处理设3个重复。数据采用方差分析(ANOVA)进行统计分析，t-test与Tukey的多重对比测试在R软件上运行。差异有统计学意义p < 0.05而且0.01．

在这项研究中分析或分析的所有数据都包含在这篇发表的文章及其附加文件中。在当前研究中生成和/或分析的序列数据可通过登录号为DRA009377的DDBJ序列读取存档库(ftp://ftp.ddbj.nig.ac.jp/ddbj_database/dra/fastq/DRA009/DRA009377/)．在这项工作中使用的植物材料可从菲律宾国际水稻研究所的基因库获得。

方差分析:

方差分析

CCC1:

阳离子-氯离子转运体1

CLC:

氯离子通道

HKT1:

第一组高亲和力K⁺转运体

国际水稻研究所:

国际水稻研究所

NHX:

Na⁺/小时⁺换热器

NPF2.4:

硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白2.4

RPKM:

每千碱基每百万次读取

SOS1:

Salt-overly-sensitive 1

我们感谢Masahide Seki博士和Yutaka Suzuki教授(日本东京大学)在RNA-seq分析方面的技术支持。我们感谢IRRI的Genebank为我们提供本研究中使用的所有水稻品种的种子。

这项工作得到了JSPS KAKENHI授权号19H02942, 16 K14836和16H06279 (PAGS)的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、数据解释或手稿写作中没有任何作用。

作者指出

1. Sarin Neang和Itsuki Goto对这项工作做出了同样的贡献。

从属关系

1. 名古屋大学生物农业科学研究生院，千古萨，名古屋，464-8601，日本

   Sarin Neang, Itsuki Goto, Joyce A. Cartagena, Akira Yamauchi & Shiro Mitsuya

2. 名古屋大学理学院，千古萨，名古屋，464-8601，日本

   尼古拉·斯蒂芬妮·斯科尔丁

3. 名古屋大学国际农业研究与教育中心，千古萨，名古屋，464-8601，日本

   法力Kano-Nakata

贡献

SN, IG和SM设计了实验。SN和IG进行了大部分实验并分析了数据。NSS、JAC、MKN和AY辅助实验，并对实验结果进行了讨论。SN和SM撰写了手稿。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Shiro迁址．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们之间没有利益冲突。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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