壳聚糖调节代谢平衡、多胺积累和Na⁺运输对匍匐草耐盐性的影响

背景

壳聚糖(CTS)是一种天然多糖，在植物中具有多种逆境适应调节功能。然而，CTS对减轻盐胁迫损害的作用和机制尚不完全清楚。本研究的目的是研究CTS在改善盐耐受性方面的功能，这些功能与代谢平衡、多胺(PAs)积累和Na有关⁺匍匐草的运输(Agrostis多茎目）.

结果

CTS处理显著缓解了盐胁迫下叶片相对含水量、光合作用、光化学效率和水分利用效率的下降。外源CTS通过激活蔗糖合酶和丙酮酸激酶活性，抑制转化酶活性，增加内源PAs积累、抗氧化酶(SOD、POD和CAT)活性以及蔗糖积累和代谢。CTS还改善了总氨基酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的积累。此外，经cts预处理的植株Na含量显著升高⁺根系和低钠含量⁺在叶片中积累，然后未经处理的植物对盐胁迫的反应。而CTS对K无显著影响⁺/ Na⁺比率。重要的是，CTS增强了盐过度敏感(SOS)通路，也上调了AsHKT1基因(AsNHX4, AsNHX5,AsNHX6)编码Na⁺/小时⁺盐胁迫下的交换器。

结论

施用CTS可提高抗氧化酶活性，从而减轻根和叶的氧化损伤。cts诱导的蔗糖和GABA积累和代谢的增加在盐胁迫下的渗透调节和能量代谢中起重要作用。CTS还增强了与Na相关的SOS通路⁺细胞质向根际的排泄量增加AsHKT1抑制表达Na⁺转运到光合组织，同时也上调表达AsNHX4，AsNHX5,AsNHX6提高Na的容量⁺盐胁迫下根和叶的区隔化。此外，cts诱导的PAs积累可能是促进耐盐性增强的重要调控机制。这些发现揭示了CTS调控Na的新功能⁺在盐胁迫下，匍匐弯草转运，促进糖和氨基酸代谢，促进渗透调节和能量供应，增加PAs积累。

盐胁迫严重影响了世界各地作物的生长和生产力。植物吸收大量钠离子(Na)⁺)导致盐胁迫下的离子不平衡[1]。钠的过度积累⁺由于抑制蛋白质合成、酶反应和光合作用，导致叶片组织坏死和过早老化[2，3.，4]。植物介导Na⁺盐过度敏感(SOS)通路，Na⁺/小时⁺反转运蛋白(NHX)和高亲和力Na⁺/ K⁺空泡和质膜中的-渗透性转运蛋白[5，6，7]。SOS1编码质膜Na⁺/小时⁺挤压Na的反向搬运工⁺从细胞质溶胶进入根际，也参与钠的长途运输⁺［8，9]。SOS3和SOS2是合成的必要条件吗SOS1mRNA和蛋白在盐胁迫下共同参与调控SOS1磷酸化(10]。此外，SOS2和SOS3也可能调节H⁺腺苷三磷酸酶,H⁺-PPase和液泡膜中的NHX [11]。NHX介导Na的交换⁺/小时⁺和K⁺/小时⁺，从而影响耐盐性和钾离子(K⁺)营养[12，13]。据报道，NHXs过表达可促进过量钠的外排⁺从细胞质中分离多余的Na⁺形成液泡，导致不同植物物种的耐盐性增强[14，15，16]。HKT1在Na检索中起着重要的作用⁺从木质部汁液中提取，从而抑制Na⁺运输到光合组织[7]。H⁺- atp酶或H⁺-PPase水解细胞质中的ATP或PPi以泵送H⁺进入液泡，产生电化学梯度和质子动力，用于Na的排出和分离⁺在细胞中[16，17，18]。编码H⁺-PPase可能与转基因基因耐盐性增强有关Lotus corniculatus紫花苜蓿(紫花苜蓿） [19，20.]。

糖代谢被认为是不同非生物胁迫下的共同反应[21]。先前的研究表明，蔗糖代谢是赋予对非生物胁迫(如干旱、高温和盐胁迫)耐受性的关键调控系统之一[22，23，24]。壳聚糖(CTS)是由几丁质去乙酰化得到的一种聚阳离子多糖，广泛存在于植物中。近年来，CTS作为一种安全、廉价的外源性添加剂在农业生产中得到了广泛的应用。CTS对植物生长和对非生物和生物胁迫的耐受性有积极的影响[25，26]。Zhang等人的研究[j]。27]发现CTS调节了小麦的一系列代谢途径，包括碳和氮代谢(小麦)叶片，从而促进植物生长。外源施用CTS能有效缓解白三叶草(三叶草被)通过促进蔗糖、甘露糖和果糖在叶子中的积累[28]。CTS在调节植物耐盐性方面也发挥着积极作用。例如，CTS提高了玉米的耐盐性(玉米)与光合作用、糖酵解和氮同化增强有关的幼苗[29]。随着盐胁迫的增加，红花(Carthamus tinctorius)和向日葵(向日葵CTS对种子萌发及过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性有显著的促进作用，以减轻幼苗的氧化损伤[j]。30.]。虽然这些研究表明，CTS缓解盐胁迫与抗氧化能力、光合作用和氮同化等生理效应有关，但CTS诱导的盐耐受性与糖和氨基酸代谢、多胺(PAs)积累和Na有关⁺植物的转运机制仍未完全阐明。

体育产业中使用的草坪草比其他领域使用的草坪草需要更高的维护和管理频率。长期使用化学药品、化肥、农药和再生水加速了土壤盐碱化，导致草坪质量下降，管理难度和维护成本增加[31，32，33]。弯草(Agrostis多茎目)是最重要的草坪草之一，因其草皮品质优良及匍匐生长的特点，广泛应用于体育产业，包括高尔夫球场及网球草坪。然而，匍匐型弯草的耐盐性已被列为中等敏感[34]。本研究的目的是研究CTS在调节水分平衡、抗氧化能力和盐胁迫下的光合作用。本研究进一步假设cts诱导的耐盐性可能与代谢物积累、内源性PAs和Na的变化有关⁺在叶和根中运输。本研究为cts调控植物耐盐性的复杂机制提供了新的全面的认识。

CTS对叶片水分状态和光合作用的影响

为了避免盐休克和适应盐胁迫，本试验采用了连续增加盐浓度(100 mmol/L NaCl溶液4 d, 150 mmol/L NaCl溶液4 d, 200 mmol/L NaCl溶液16 d)的方法。盐胁迫下植物生长受到抑制，但在盐胁迫下，cts处理的植株比未处理的植株保持了更好的生长(图2)。1a).盐胁迫显著降低了CTS含量，而在正常条件和盐胁迫下，外源CTS施用提高了CTS在叶片中的积累(图2)。1b).盐胁迫导致12 d时叶片相对含水量(RWC)、渗透势(OP)和水分利用效率(WUE)分别下降30.70%、16.81%和67.06%(图2)。1一部)。盐胁迫24 d时，cts处理植株的RWC比未处理植株高15.65%，WUE比未处理植株高4倍(图2)。1c和e)。OP表示细胞中与水势相关的两个区域之间的水运动电位。盐胁迫24 d时，cts处理和未处理植株的OP有显著差异(图2)。1d).施用CTS有效缓解了盐诱导的叶片叶绿素(Chl)、Chl a和Chl b含量下降(图2)。2a).盐胁迫12或24 d时，cts处理植株的净光合速率(Pn)显著高于未处理植株(图2)。2b).吸收性能指数(PIABS)是反映叶片健康状况的综合光合指标。对于光化学效率(Fv/Fm)和PIABS的变化，外源CTS在正常条件下0、12和24 d对这两个参数没有影响，但在盐胁迫下12和24 d显著提高了叶片的Fv/Fm和PIABS(图2)。2C和d)。

CTS对叶片抗氧化能力的影响

丙二醛(MDA)是影响脂质过氧化水平的关键参数，电解质渗漏(EL)反映细胞膜的稳定程度。盐胁迫下叶片丙二醛含量显著升高。在正常情况下，CTS预处理没有引起MDA含量的显著变化，但在盐胁迫24 d时，CTS预处理的植株MDA含量比未处理的植株降低了31.37%(图2)。3.a).盐胁迫过程中EL逐渐升高。盐胁迫12和24 d时，cts处理植株的EL水平显著低于未处理植株(图2)。3.b).在抗氧化酶活性方面，盐胁迫显著提高了匍匐弯草叶片超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和CAT活性，但降低了POD活性。3.c).在盐胁迫下，cts预处理植株的SOD、POD和CAT活性分别比未处理植株高17.24%、18.80%和18.62%。在正常和胁迫条件下，外源CTS对POD活性无显著影响(图2)。3.c)。

CTS对叶片糖、氨基酸和能量代谢的影响

盐胁迫显著提高了蔗糖、葡萄糖和果糖在植物体内的积累(表1)1）.与S处理相比，S + CTS处理的蔗糖含量提高了75.98%1）.在盐胁迫下，cts预处理植株的葡萄糖和果糖含量明显低于未处理植株(表2)1）.盐胁迫激活蔗糖合成酶(SS)和蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性，但显著抑制转化酶活性，见表1。在盐胁迫下，经cts预处理的植株的转化酶和SPS活性分别比未处理的植株提高了33.04%，降低了16.79%和47.04%(表2)1）.盐胁迫下叶片总氨基酸(TAA)、游离脯氨酸(游离脯氨酸)和谷氨酸(Glu)含量显著升高，γ-氨基丁酸(GABA)含量显著降低(表1)1）.盐胁迫下，经cts处理的植株TAA、谷氨酸和GABA含量分别比未处理的植株增加19.84%、6.79%和29.48%(表2)1）.外源CTS显著降低了盐胁迫下叶片游离脯氨酸含量(表2)1）.丙酮酸(PA)含量在盐胁迫下升高，但在正常和盐胁迫条件下，cts处理与未处理植株之间PA含量无显著差异(表1)1）.CTS预处理在正常情况下未引起丙酮酸激酶(PK)活性的显著变化，但在盐胁迫下显著增加了PK活性(表2)1）.

CTS对根系生理变化的影响

正常情况下，外源CTS对根系活力、EL、OP和MDA含量影响不显著(图2)。4模拟)。根的活力反映了根的健康状况。连续增加盐浓度会降低根系活力，但施用CTS显著缓解了根系活力的下降(图2)。4a).盐胁迫也显著降低了根系OP，增加了EL和MDA含量(图2)。4罪犯)。cts预处理植株根系EL和MDA含量分别比未处理植株降低13.15%和31.07%(图2)。4b和d)。对于根系OP，盐胁迫下cts预处理植株的OP低于未处理植株(图2)。4c)。

CTS对内源PAs、Na变化的影响⁺内容,K⁺Na基因的含量和转录水平⁺叶和根的运输

正常条件下，叶片中内源腐胺(Put)、亚精胺(Spd)和精胺(Spm)含量水平相对较低，而盐胁迫显著增加了叶片中Put、Spd和Spm的积累(图2)。5a).盐胁迫下，cts预处理植株叶片Put、Spd和Spm含量较未处理植株分别增加20.32%、23.39%和62.78%(图2)。5a).对于根系PAs的变化，盐胁迫下，cts预处理植株根系Put含量显著高于未处理植株(图2)。5b).正常或盐胁迫下，cts预处理与未处理植株根系Spd含量无显著差异。盐胁迫下，cts处理植株根系中Spd含量显著增加。盐胁迫显著诱导根中Spm的积累，在盐胁迫下，cts预处理植株根中Spm含量比未处理植株增加100%(图2)。5b)。

正常情况下，Na⁺叶片和根中Na含量维持在极低水平，CTS预处理对Na含量无影响⁺内容(无花果。6a).盐胁迫显著增加Na⁺根和叶中的物质。经cts预处理的植株Na积累量显著增加⁺在根，但较低的钠⁺在盐胁迫下，叶片比未处理植物的叶片(图2)6a)⁺含量和K⁺/ Na⁺在正常条件下，cts处理植株叶片和根系的比例显著高于cts预处理植株(图2)。6b和c)。外源CTS预处理对K⁺盐胁迫对叶片钾含量的影响不显著⁺根和K的含量⁺/ Na⁺盐胁迫下根与叶的比值(图2)。6b和c). Na相关基因表达的变化⁺在叶片中，外源CTS对基因编码无显著影响AsATPaB2，AsATPa2，AsPPa2，AsNHX8,AsHKT1，但显著上调AsATPa6，AsNHX4，AsNHX5,AsSOS2正常情况下(图2)7a).盐胁迫下，cts预处理的植株表达量显著升高AsATPa6，AsNHX4，AsNHX5，AsNHX6，AsNHX8，AsSOS1,AsSOS3比未处理植物的叶片要好(图2)。7a).盐胁迫显著上调AsATPa6，AsATPa2，AsPPa2，AsNHX5，AsSOS1，AsSOS3,AsHKT1根(图2)7b).在正常条件下，外源CTS处理诱导AsATPaB2，AsATPa6，AsATPa2，AsNHX4，AsNHX5，AsNHX6，AsSOS1，AsSOS2，AsSOS3,AsHKT1在根。在盐胁迫下，AsATPaB2，AsATPa6，AsATPa2，AsNHX4，AsNHX5，AsNHX6，AsSOS1，AsSOS2，AsSOS3,AsHKT1在根中被外源CTS显著上调(图2)。7b)。8揭示了多年生匍匐弯草对盐胁迫的内在和cts调控的适应性反应的关键途径。

土壤高盐分严重减少水分吸收，导致生理性干旱，从而抑制植物生长[35]。已有文献表明，维持较高的渗透调节(OA)能力和水分利用效率有助于改善盐胁迫下植物的水分状况[j]。36]。在本研究中，盐胁迫显著降低了叶片的OP(图2)。1d)和根(图2)。4C)这可能是匍匐的弯草适应盐损害的积极反应。经cts预处理的匍匐曲草叶片保持了较高的WUE和较低的OP(图2)。1D-e)，这可能与盐胁迫下植物更好的水分状况有关。我们最近的研究还发现，外源GABA通过提高匍匐弯草的OA和WUE，有效缓解了盐致损伤[37]。当植物受到盐胁迫时，加速氧化损伤和水分亏缺会引起光抑制[38]。连续增加盐浓度显著降低匍匐弯草叶片Chl含量、Pn、Fv/Fm和PIABS(图2)。2）.但经cts预处理的匍匐弯草Chl含量、Pn、PIABS和Fv/Fm均显著高于未处理的植物，说明本研究中经cts预处理的植物在盐胁迫下具有更好的光合能力。此外，在正常条件下，施用CTS还能改善植株生长和Chl含量。据报道，CTS可作为外源植物生长调节剂，改善作物的生长和品质[27]。因此，CTS在正常条件下调节生长和抗逆性方面的双重积极作用凸显了其在农业种植和生产中的重要性。

盐胁迫增加活性氧(ROS)的积累，如超氧自由基和过氧化氢(H₂O₂)导致氧化损伤并最终导致细胞死亡[5]。提高或维持较高的抗氧化酶活性，如SOD、CAT、POD和APX，对于减少盐胁迫下不同植物物种的氧化损伤具有重要意义[j]。39，40，41]。目前的研究结果发现，外源CTS在盐胁迫下匍匐弯草的脂质过氧化作用中发挥了重要作用，并显著增加了抗氧化酶(SOD, CAT和POD)的活性(图2)。3.)，这与前人关于CTS通过提高CAT和POD活性来提高向日葵幼苗耐盐性的研究结果一致。根系作为植物吸收水分和营养的主要器官，极易受到土壤高钠的破坏⁺［42]。盐浓度的持续增加严重降低了根系活力(图2)。4a)施用CTS可有效缓解匍匐草的负面影响。这些根系和叶片的表型和生理变化表明，CTS对缓解匍匐草的盐胁迫伤害有积极作用。

糖代谢调控在植物适应环境胁迫中起着重要作用[j]。43]。外源施用CTS显著提高匍匐曲草叶片内源CTS含量(图2)。1b).根据代谢途径，CTS可以直接转化为其他糖和丙酮酸，参与三羧酸循环和谷氨酸等氨基酸的生物合成(图2)。8）.当植物受到非生物胁迫时，果糖、葡萄糖、蔗糖等可溶性糖作为胁迫信号转导的重要信号分子、OA的渗透物和能量供应的能量物质在细胞内积累[44，45]。蔗糖是一种主要的光同化物，可以从源叶转移到根。转化酶催化蔗糖降解为葡萄糖和果糖，用于细胞的生物合成和代谢[46]。蔗糖的合成可以由果糖-6-磷酸通过SPS催化，也可以由葡萄糖和果糖通过SS转化。在本研究中，盐胁迫通过激活SPS和SS活性，降低转化酶活性，显著提高蔗糖的合成(表1)1）.有趣的是，外源施用CTS进一步增加了盐诱导的蔗糖积累，这可能与匍匐弯曲草叶片中更高的SS活性和更低的转化酶有关。在较早的研究中发现，蔗糖积累有利于盐胁迫下植物PSII的保护[47]。Schwender等人的研究[j]48]证明90%的葡萄糖可以通过糖酵解转化为丙酮酸芸苔属植物显著。PK是产能糖酵解过程中主要的限速酶之一[49，50]。CTS改善的PK活性可能会促进匍匐弯草将CTS、葡萄糖和果糖转化为丙酮酸进行能量代谢(表2)1)，但盐胁迫下糖和代谢酶变化的机制仍需进一步研究。

氨基酸的积累和代谢对植物应对胁迫损伤具有重要意义[j]。51]。脯氨酸作为一种应激响应氨基酸已被广泛研究，其功能参与植物在非生物胁迫下的OA和氧化还原平衡[qh]52，53]。谷氨酸是植物氮代谢的主要代谢物，与植物正常生长和逆境反应中碳氮平衡的维持、其他氨基酸代谢、Chl生物合成等有关[54]。越来越多的证据表明，GABA通过增强植物的OA、抗氧化防御和代谢平衡，参与调节对非生物胁迫的耐受性[j]。55]。前期研究表明，大麦(大麦芽)叶片在盐胁迫下，Glu和GABA等氨基酸是参与盐胁迫反应的关键代谢产物[56]。外源性GABA诱导的耐盐性与匍匐草叶片中糖(葡萄糖、果糖、麦芽糖和海藻糖)和氨基酸(谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、苏氨酸和半胱氨酸)含量的增加有关[37]。在本研究中，经cts预处理的匍匐曲草在盐胁迫下的TAA、Glu和GABA含量明显高于未处理的植物(表1)1)，这可以解释为什么与未经处理的植物相比，cts预处理的植物具有更好的OA能力、水分状况和代谢稳态。然而，外源CTS的施用减轻了盐胁迫引起的叶片脯氨酸积累的增加(表2)1）.脯氨酸积累也常被认为是应力损伤的一个指标。在盐或其他非生物胁迫下，植物受到的胁迫损害更严重，脯氨酸积累更多。37，57，58]。

许多研究报道，当植物受到盐胁迫时，PAs水平的增加是一种重要的适应性反应[59，60，61]。pas调控的耐盐性可能与盐胁迫下植物激活SOS信号通路、氮代谢和抗氧化防御系统来维持离子和代谢平衡有关[j]。62]。先前的一项研究发现，耐盐大麦品种“J4”在连续增加盐浓度的情况下，积累的内源Spd和Spm显著高于盐敏感品种“KP7”[60]。CTS可以转化为丙酮酸，参与三羧酸循环生产谷氨酸，谷氨酸可代谢为精氨酸合成PAs(图2)。8）.外源CTS显著提高了内源Put、Spd和Spm的积累，从而提高了白三叶草的耐旱性(三叶草被） [28，63]。在本研究中，盐胁迫下匍匐弯草叶片中Put、Spd和Spm显著积累，根系中Spm显著增加(图2)。5）.外源CTS进一步促进了盐诱导的匍匐曲草叶片和根系PAs积累。这些结果表明，cts调控的盐耐受性可能参与了匍匐草PAs的合成。

高钠⁺盐的含量通常被认为是植物中盐毒性的主要因素[64]。在盐水环境中，植物可能的生存策略是有效地隔离过量的钠⁺并抑制Na的转移⁺从根到芽[65]。结果表明，施用CTS后匍匐草的Na含量显著提高⁺但钠含量较低⁺与未进行CTS预处理的植株相比，叶片中的积累量(图2)。6）.基因表达分析也发现，盐胁迫显著上调了AsHKT1表现在叶子和根上。更重要的是，外源CTS可以进一步增强AsHKT1结果表明，CTS可以调控该基因在匍匐曲草根中的表达AsHKT1分离Na⁺并抑制钠离子⁺在长时间的盐胁迫下转运到叶片。CTS预处理也显著激活了盐胁迫下根系的SOS通路(图2)。7）.Wang et al.(2014)的研究发现AtSOS1是挤出娜⁺从细胞质进入根际拟南芥正常K下⁺加上盐胁迫。然而,AtSOS1调节了Na的长途运输⁺从根到叶拟南芥在低K以下⁺加上盐胁迫[66]。在目前的研究中，cts激活的SOS通路可能与Na有关⁺由于匍匐弯草受到足够K的盐胁迫，导致其排泄⁺供应霍格兰的解决方案。此外，分离Na⁺被认为是避免钠毒性作用的关键机制⁺在细胞质中。Na⁺区隔化还可以为盐胁迫下的水分维持提供额外的渗透调节[17，67]。经CTS处理的匍匐曲草(S + CTS)表达量显著升高AsNHX4，AsNHX5,AsNHX6在盐胁迫下根系和叶片的变化比未处理植物(S)明显(图2)。7)，表明CTS可以提高Na的容量⁺细胞区隔化。有趣的是，CTS显著上调AsATPaB2和AsATPa2在根和AsATPa6在叶片中，这可能与盐胁迫下匍匐草的质子动力增强有关。先前的研究证明，抑制Spd和Spm的生物合成可降低张力质体H⁺-ATPase活性导致大麦幼苗耐盐性显著降低[60]。PAs是否参与cts调控的Na，值得进一步研究⁺盐胁迫下植物的运输。

外源CTS的添加是缓解盐胁迫对匍匐草生长抑制和胁迫损伤的一种经济有效的措施。在盐胁迫下，外源CTS增加了抗氧化酶活性，从而减少了根和叶的氧化损伤。cts诱导的蔗糖和GABA积累和代谢的增加在应激过程中对OA和能量代谢起重要作用。CTS也调节Na⁺交通量增加AsHKT1Na抑制表达⁺转运到光合组织，增强与Na相关的SOS通路⁺细胞质向根际分泌，上调AsNHX4，AsNHX5,AsNHX6参与Na⁺盐胁迫下根和叶细胞质向液泡的区隔化。此外，cts诱导的PAs积累可能是匍匐弯草耐盐性增强的重要调控机制。这些发现揭示了CTS调控Na的重要功能⁺转运，促进糖和氨基酸代谢，增加PAs积累，有助于缓解多年生匍匐弯草的盐胁迫。为了进一步了解cts诱导的植物耐盐性，未来的研究将集中在基于代谢组学的研究全球代谢物的变化，并分析gaba调节PAs积累、抗氧化防御和Na的可能信号转导途径⁺盐胁迫下的运输。

植物材料和处理

匍匐弯草的种子。PA-1)购自Tee-2-Green公司(美国俄勒冈州)，用作植物材料。种子(3.8 g/m²在植物生长室内(光周期为10/14 h，光/暗，21/18°C昼夜，65%相对湿度，700 μmol m)进行萌发⁻²·年代⁻¹PAR) 8天。然后将幼苗在霍格兰溶液中培养20天[68]。28日龄植株分别加或不加0.5 g/L CTS预处理4天。将CTS或NaCl溶解在霍格兰溶液中。在初步试验的基础上选择CTS的有效剂量，在浓度范围(0.1、0.2、0.5、1和2 g/L)内选择对表型变化最有效的剂量。经cts预处理和未处理的植株经受nacl诱导的盐胁迫24 d。在盐胁迫条件下，分别在100 mmol/L NaCl溶液中生长4 d、150 mmol/L NaCl溶液中生长4 d、200 mmol/L NaCl溶液中生长16 d。所有的解决方案每天都被刷新。每个处理设置4个生物重复。分别在盐胁迫0、12和24 d取样，采用4个生物重复估算所有参数。

生理测量

对于EL的估计，采用Blum和Ebercon方法[69]。RWC是根据Barrs和Weatherley [70]。对于叶片和根的OP，新鲜叶片或根立即在4°C蒸馏水中浸泡12 h。将叶或根吸干后，在液氮中冷冻10分钟，然后在4℃下解冻30分钟。叶片或根被挤压以获得细胞液。细胞液的渗透压采用蒸汽压渗透计(Wescor, Logan, UT, USA)测量，OP换算为-c × 2.58 × 10⁻³［71]。根活力采用McMichael和Burke法[72]。Chl含量的测定参照Arnon等人的方法。73]。用Chl荧光系统(Pocket PEA, Hansatech，英国)记录Fv/Fm和PIABS。在分析之前，用叶片夹将叶片置于黑暗中30分钟。利用400 μl L的便携式光合系统(CIRAS-3, PP Systems, USA)测定Pn和WUE⁻¹有限公司₂800 μmol光子m⁻²红光和蓝光。

测定总抗氧化能力和抗氧化酶活性

新鲜叶片(0.2 g)与1.5 mL 50 mM冷磷酸盐缓冲液(pH 7.8)在冰上研磨，在4°C下离心12000 g 30 min。用上清液测定抗氧化酶活性和丙二醛含量。通过记录分别在560,240,470和290 mm处吸光度的变化来测定SOD, CAT, POD和APX的活性[74，75，76]。蛋白质含量按Bradford方法测定[77]。MDA含量取0.5 mL上清与1 mL含20%三氯乙酸和0.5%硫代巴比妥酸(TBA)的反应溶液混合。将混合物在95°C水浴中加热15分钟，然后在冰浴中快速冷却。在4℃下，8000 g离心10 min。记录上清液在532、600和450 nm处的吸光度[28]。

糖、氨基酸和与糖和能量代谢有关的酶活性的测量

CTS内容(第2条)不。ml020132)采用检测试剂盒(mlbio Good elisa试剂盒生产商，中国上海)根据生产商说明进行检测。丙酮酸激酶(PK)活性。不。PK-2-Y)，丙酮酸含量(第2条)。不。PA-1-Y)，蔗糖合酶(SS)活性(第2条)。不。sisi -1- y)，蔗糖磷酸合成酶(SPS)活性(第2条)。 No. SPS-1-Y), hexokinase activity (Art. No. HK-2-Y), invertase activity (Art. No. ZTM-1-Y), sucrose content (Art. No. ZHT-2-Y), glucose content (Art. No. PT-2-Y), and fructose content (Art. No. GT-2-Y)were determined by using Test Kits (Suzhou Comin Biotechnology, Suzhou, China) according to manufacturer’s instructions. For free proline content, fresh leaves (0.2 g) were ground with 3% aqueous sulfosalicylic acid and then centrifuged at 10000 g for 10 min to obtain supernatant. The reaction mixture (1 mL of the supernatant, 1.5 mL of acid ninhydrin, and 1.5 mL of glacial acetic acid) was boiled for 30 min. After being cooled at room temperature, the reaction mixture was extracted with five mL of benzene and the absorbance was recorded at 520 nm [78]。

内源性多胺和钠的测定⁺/ K⁺内容

对于内源性PAs含量的测定，Duan [79]和李[80]被使用。Na⁺或者K⁺使用火焰原子吸收分光光度计(Analytik Jena AG，德国耶拿)检测，测定方法在我们之前的研究中有记录[37]。

基因表达分析

为了确定CTS对选定基因转录物水平变化的影响，采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)。Rneasy Mini试剂盒(Qiagen, Duesseldorf, Germany)用于提取新鲜叶片或根中的总RNA。使用revert Aid First Stand cDNA合成试剂盒(Fermentas，立陶宛)将RNA反转录为cDNA。钠-氢逆向转运基因引物(AsNHX4, AsNHX5, AsNHX6，和AsNHX8), H⁺转运基因(AsATPaB6，AsATPa6，AsATPa2,AsPPa2)、盐敏感基因(AsSOS1，AsSOS2,AsSOS3)，高亲和力Na⁺/ K⁺渗透性转运体(AsHKT1)，及参考基因(β肌动蛋白)列于表中S1。所有基因的PCR条件(美国Bio-Rad公司SYBR Green Supermix公司的icycle iQ qRT-PCR检测系统)为:94°C下5 min, 95°C下30 s(变性45次)，62°C下退火延伸45 s, 60 - 95°C扩增得到熔解曲线。根据公式2计算所有基因的转录本水平^−∆∆Ct由利瓦克和施密特根描述[81]。

统计

使用SPSS 23 (IBM, Armonk, NY, USA)对所有数据进行分析。C、C + NaCl、CTS和CTS + NaCl处理间差异显著(LSD)p≤0.05。

本研究中使用和/或分析的数据可根据通讯作者的合理要求提供。

CTS:

壳聚糖

Na⁺：

钠离子

ROS:

活性氧

H₂O₂：

过氧化氢

紧急求救信号:

盐过度敏感通路

NHX:

Na⁺/小时⁺逆向转运

K⁺：

钾离子

不是:

聚胺类

RWC:

相对含水量

弗兰克-威廉姆斯:

鲜重

西南:

饱和重量

DW:

干重

WUE:

水利用效率

人事处:

渗透势

排名:

总叶绿素

阵线/ Fm:

光化学效率

piab:

以吸收为基础的性能指标

Pn:

净光合速率

MDA:

丙二醛

埃尔:

电解液泄漏

SOD:

超氧化物歧化酶

猫:

过氧化氢酶

圆荚体:

过氧化物酶

APX型:

抗坏血酸盐过氧化物酶

SS:

蔗糖合酶

SPS:

蔗糖磷酸合酶

TAA:

总氨基酸

正方观点:

游离脯氨酸

Glu:

谷氨酸

ROS:

活性氧

GABA:

γ氨基丁酸酸

PA:

丙酮酸

PK:

丙酮酸激酶

把:

腐胺

社民党:

亚精胺

Spm:

精胺

办公自动化:

渗透调节

不适用。

本研究得到国家自然科学基金(31702182)资助。资助机构没有参与研究的设计、数据的收集、分析和解释，也没有参与撰写论文。

从属关系

1. 四川农业大学动物科技学院草地科学系，成都611130

   万庚，周丽，Muhammad Jawad Hassan，闫鹏

贡献

ZL构思研究并设计实验;WG进行了实验并分析了数据;WG和ZL写了手稿;ZL, MJH, YP审阅了稿件。所有作者都认可了手稿的最终版本。

相应的作者

对应到周丽。

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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