防御相关基因的EST测序和基因表达谱分析鳄梨美洲感染了疫霉、肉桂

背景

鳄梨 （鳄梨美洲）属于樟科家族，并在50多个国家一个重要的商业水果作物。影响鳄梨生产最严重的病原体是疫霉、肉桂这引起致病疫霉根腐病（PRR）。根病原体如p、肉桂它们与宿主的相互作用尚不清楚，尽管鳄梨作物及其影响都很重要Phytophthora.在它的培养上，还缺乏分子知识来支持我们对病原体的防御策略的理解。为了更好地了解宿主特异性防御，我们使用454焦磷酸测序生成了EST数据，并从pc感染的鳄梨根中分析了9个防御相关基因。

结果

在GS FLX平台的单个车道上，大约有1万次读取，生成了2.0 Mb的数据。用Newbler汇编器组装了371个contigs，其中367个是新颖的鳄梨美洲．根据基因本体论术语对基因进行分类。除了识别根特异性ESTs外，我们还能够识别和量化9个防御相关基因的表达，它们在响应中受到不同的调控p、肉桂．基因如Metallothionein，Thaumatin和发病机制与PsemI、mlo相关和profilin的被发现是有差异的。

结论

这是在阐明鳄梨树转录以及查明鳄梨根的防御反应到根病原体的第一项研究p、肉桂．我们的数据是目前为鳄梨砧木产生的唯一EST数据，本研究中识别的EST在识别与抗辩相关基因以及为其他研究提供诸如ROS规则的过程提供基因信息以及鲕梨根中的缺氧。我们的EST数据将有助于阐明鳄梨转录组，并鉴定可改善砧木育种和筛选的标志物。此外，鳄梨转录组的表征将为基础高血管植物的功能基因组学提供基础。

鳄梨 （鳄梨美洲玉米)是全球50多个国家的重要农业作物，原产于墨西哥和中美洲[1］．它属于-属鳄梨，子属 -鳄梨， 家庭-樟科属于木兰类枝，木兰类枝是双二科和单二科枝的姐妹枝。美洲大蠊一个二倍体被子植物由24条染色体组成，约为8.83 × 10^8.(883 Mb)碱基对(bp)。迄今为止，牛油果的基因组尚未获得，仅从水果和花卉中生成的有限数量(16558个)的表达序列标签(ESTs)已被测序、注释并发布到NCBI数据库。

疫霉根腐病（PRR），致疫霉、肉桂，被认为是对牛油果行业最具破坏性的病原体引起的疾病[2-4 gydF4y2Ba生产严重依赖于使用亚磷酸树干针剂和耐受性砧木，如杜莎^®[4 gydF4y2Ba那5.以种植高有机质土壤和覆盖促进拮抗微生物生长为支撑p、肉桂．甲霜灵也显示出令人鼓舞的结果连同20世纪80年代的宽容砧木公爵7加州[使用时6.］．然而，在南非，据报道，在成功应用了两年之后，甲霜甲酯在控制疾病方面变得无效[7.］．最近p、肉桂在长时间使用后显示对亚磷酸盐处理的敏感性降低[8.］．作者证明了p、肉桂在澳大利亚州南西南部的亚磷酸盐治疗中暴露于长时间的分离物在评估鳄梨，羽扇豆和桉树时对杀菌剂的敏感性降低。人口p、肉桂从亚磷酸处理过的地方分离的菌株比以前未接触过杀菌剂的菌株更容易定殖亚磷酸处理过的植物材料。对亚硫酸盐敏感性的降低可能表明对该杀菌剂开始产生抗性。

早在1926年的鳄梨研究人员认为，鳄梨产业的成功奠定了砧木改善[9.］．自1957年以来，世界上最大的砧木种质一直保存在加州，希望找到更耐栽培的砧木[6.那10.］．到目前为止，少数砧木已被鉴定为部分抗性p、肉桂如托马斯，马丁格兰德，巴尔迪克，公爵7和D9 [11.］．在南非，造成的毁灭p、肉桂20世纪70年代促进了无性系砧木的引进，并在80年代发展了大规模的选择方案。多年来杜克7一直是行业标准在南非，直到2002年与发布的杜萨^®威斯特法利亚技术服务公司的砧木。Dusa^®给牛油果种植者提供了比杜克7号更好的替代品，表现出了更好的耐受性p、肉桂以及良好的果实产量。在威斯特法伦鳄梨繁殖计划是一个持续的过程和用途先前确定的宽容砧木为家长进行开放授粉。近日，田间试验上进行选择在澳大利亚昆士兰州的砧木一些选择，如“SHSR-02”进行的，“SHSR-04”，未接枝“哈斯”和DUSA^®显示对PRR的容忍[12.］．

尽管鳄梨很重要，我们花了60年时间试图解开宿主病原体的相互作用，但我们的知识是基于;根系分泌物分析[13.]、根的化学分析[12.]，即使用化学物质来帮助抑制病原体[14.和生化研究[15.］．对感染根组织学研究p、肉桂试图了解植物病原体的相互作用[16.］．观察到核心胰岛和蠕虫细胞壁分裂发生，这限制了病原体的进展，但不影响病原体的活力或降低其感染宿主植物的能力。p、肉桂感染植物根部通过游动孢子存在于土壤中。游动孢子的吸引力是由博塔和Kotze在1989年研究并且发现由14种氨基酸中鳄梨根分泌物的组合物[影响13.］．Sánchez-Pérez和同事们测试了粗根分泌物p、肉桂菌丝抑制和随后使该化合物被称为豆甾3,5二烯鉴定为抑制性化合物[12.］．Garcia-Pineda等．(2010)研究了活性氧(ROS)的形成和一氧化氮(NO)的作用p、肉桂[15.］．作者观察到ROS的增加，没有水平，推断出观察到的RO的增加可能有助于早期感染患者组织疲软，急剧增加可能导致水杨酸（SA）积累。这种积累可能导致SA介导的H.₂O.₂通过H的抑制突发₂O.₂退化。作者假设(胞质烟草过氧化氢酶)CAT与SA结合，抑制CAT H₂O.₂有辱人格的行为。此外，还研究了外用SA对根定植的影响，表明SA的施用与根定植的减少有关。SA参与调节细胞死亡、诱导抗性反应和激活各种防御基因，如致病相关(PR)基因[17.但行动方式尚未阐明。NO和ROS的产生已经被证明可以激活细胞死亡。这些早期研究鳄梨和p、肉桂已经说明了防御反应的复​​杂性，突出了对防御基因的分子阐明的需要。

鳄梨的分子研究包括遗传关系研究和水果和花的分子表征。鳄梨果实成熟基因有一些基因表征[18.-22］．由于标记显影中的不断努力，在持续努力方面存在较少的分子细节，以协助阐明裂殖关系中的遗传关系[23-28，或接穗改良[29-32］．目前已有基于微卫星、随机扩增多态性DNA (RAPD)标记和DNA指纹(DFP)标记的初步遗传图谱[33］．近年来，从8000多个est中鉴定出70个微卫星标记，以期为分子标记辅助育种提供帮助。然而，这些ESTs来自于为基础被子植物比较基因组学研究而生成的花基因数据库。它们的有效性还有待测试，以用于鉴定耐受砧木，但众所周知，它们可以在所有鳄梨品种中扩增，并可用于研究遗传关系[34那35］．加州大学河滨分校(UCR)最近使用61个多态AFLP标记来表征83个来自不同地区的砧木的PRR耐受性，包括南非和以色列，其中大部分砧木来自UCR收集[36］．结果表明，抗性机制在耐药品种间存在差异，聚类分析未发现趋势。

鳄梨/p、肉桂相互作用以前没有在分子水平上阐明。目前的知识是基于对非宿主植物的研究，拟南芥．一项关于拟南芥感染了p、肉桂结果表明，感染后活性氧诱导、HR激活、木质素合成和胼胝质生成开始。非宿主显示了乙烯和茉莉酸途径的激活，而只有少量的SA途径参与[37与García-Pineda所做的研究相反等（2010），其上表明，SA是定植病原体的主要抑制剂鳄梨。如胼胝质的生产也被过程中观察到肉眼可见的变化，例如p、肉桂玉米感染[38虽然模型植物喜欢拟南芥非宿主防御反应和宿主特异性防御反应是有区别的。为了全面了解鳄梨的耐受性，在分子水平上研究鳄梨与寄主之间的特异性相互作用具有重要意义美洲大蠊和p、肉桂．

由于没有鳄梨的基因组数据，基因的鉴定和特征是困难的。EST的产生通过提供转录本的特定信息和排除基因组的非编码区域来补充基因组数据的缺乏。高通量测序非常适合大规模EST发现，为非模式作物的基因发现提供了一种工具，以评估基因表达对非生物或生物胁迫的变化[39-41］．焦磷酸测序的成本也低于传统的EST测序，小转录物不会丢失，并从组织分离在序列生成的时间大大缩短[39］．更具体而言，有利的是，缺乏实质性的分子数据库，并在他们的非常规有助于提高经济作物[40］．鳄梨就是这样一种商业作物，需要开发分子工具来改良这种作物。鳄梨作为一种农业作物的重要性为分子研究和现代分子工具的应用提供了理由[26那27那31那33那42那43］．高通量测序技术在鳄梨育种上的应用是提高鳄梨育种水平的下一步。

本研究对一个耐受性强的牛油果砧木进行了est检测疫霉、肉桂是生成的。利用454 GS-FLX平台生成多个时间点的序列数据，包括感染后未感染、6、12、24、48和72小时，并识别与防御反应相关的转录本。我们从鳄梨中鉴定了371个转录本，并研究了这些ESTs的基因表达，从而为鳄梨提供了第一个分子数据p、肉桂交互。

454焦点正和大会

三个cDNA文库未感染的（0小时），库1（6和12小时）和库2（24，48及72小时）进行测序的GS FLX平台上的单个车道和一个总的数据的2 MB（产生修整和质量控制）组成的9953后读出，并导致在组件371点的重叠群（表1）.这些由1407重叠群从未感染库读取，3584从感染库1读取和4962从感染库读取2.文库的平均读取长度为216.4 bp的未感染，217.5碱基对库1和215.9个碱基对库2（数字1）.焦点正常运行基于可获得的最大数据量为2.5 MB，最大读取长度为250bp。

EST识别和分类

通过dCAS软件分析，共鉴定出367条新的est序列美洲大蠊．该程序使用BLASTX氨基酸比较来筛选contigs与NCBI非冗余(NR)数据库的同源性。所生成的序列大部分与假设的蛋白质具有同源性，371个contigs中有45个序列与之前注释的序列不具有相似性2）.鉴定的371个重叠群，只有两个序列显示同源性的先前鉴定醛缩酶和金属硫蛋白II型蛋白从鳄梨，与在NR数据库不具有任何鳄梨序列同源物的剩余369。手册BLAST注释不影响成绩单识别。

根据GO (Gene Ontology)和KOG (Eukaryotic Orthologous Groups)数据库对Contigs进行功能分类。9%的contigs被归类到KOG数据库中的未知函数类中，而GO分类中44.5%的contigs由未知函数表示(图)2和表3.）.翻译后修改的类别;翻译，核糖体结构和生物发生;信号转导机制和一般函数预测包含所有Contig的总和34.8％。根据Go Database相关的细胞壁的功能分类;蛋白质结合;压力反应;核糖体结构成分;细胞质生物过程;细胞成分和其他类别包含40.8％的含有3％（12/371）的Contig，直接与压力反应连接。 Over 20 putative defence related genes were identified ranging from general defence-related genes (金属硫蛋白，索马甜和普遍胁迫基因），以更具体的卵菌防卫相关基因（病程相关蛋白PR10和氧固醇结合基因）（表4 gydF4y2Ba＆5.）.

鳄梨和其他植物之间的物种相似性

我们观察到显著的序列同源性葡萄（葡萄）和鳄梨当序列相似性的物种来源进行了研究。三甲根据在NCBI的氨基酸同源性为代表种为拟南芥和栽培稻，有欧洲葡萄在这三个图书馆都有大量的点击率。22%的序列与欧洲葡萄用7.5％属于序列答:芥7.8%的序列o .漂白亚麻纤维卷．同源性,美洲大蠊在只有1％的序列被发现（371分之4）（图3.）.只有两个基因以1%为代表，其中金属硫蛋白转录本出现3次，果糖二磷酸醛缩酶出现1次。葡萄藤在每一个被注释的contig的前10个同源点击中占有一席之地。在被注释的contigs中，有37%是由不同的植物种类所代表，如李古兰亚美尼亚卡那茄属植物tuberosum那橡胶树取代巴西橡胶树随着各种植物物种，没有偏向任何特定的家庭或订单。大多数物种的相似之处涉及多种植物，这些植物被集体分类为其他。

定量基因表达分析

在感染后0、3、6、12、24和48小时对9个基因进行表达分析，以验证焦磷酸测序数据是否反映了它们的基因表达。将其与18S和肌动蛋白内参基因进行归一化，以获得相对基因表达。然后将表达数据与焦磷酸测序数据进行比较，发现9个基因中有6个在两种方法之间有相似之处，在转录本来源的文库的时间点表达量最高(表)6.）.

在48 hpi(1.1)以及3和6 hpi时，Thaumatin的表达显著高于未感染(0.4)(图4）.的表达模式表明，索马甜，响应于仅调节p、肉桂在36小时内增加12 HPI并增加了近三倍。与较早的时间点相比，后来的感染时间点的硫胺素水平显着较高 - 因此与焦塞数据数据相关。

发病机制相关（PR-10）psemI基因在6和24 hpi表达显著增加。现病史在24psemI与所有时间点相比，表达水平最高达到1.54 b）.48 HPI.psemI表达有显著降低至0.1，达到相当于3 HPI水平。

细胞色素P450-like真沸点(TATA盒结合蛋白)显示一个重要的早期反应在感染后3小时p、肉桂随着反应的十倍。在6 HPI该基因显著下调，随后在12大幅增加hpi-相似水平发现在3 HPI。该基因然后显著下调到1.0，在24 HPI和在48 HPI保持不变（图4摄氏度）.细胞色素p450样TBP水平持续升高和下调，随时间点变化显著。数据与该转录本的焦磷酸测序数据一致。

金属硫蛋白样蛋白的编码基因在0.6组成表达，在前6个hpi中表达无显著变化。然而，与其他时间点相比，在12 hpi时表达显著增加，达到3.2水平，然后在24 hpi时表达下降到0.5，在48 hpi时保持不变(图)4 d）.数据显示相似的这份成绩单的焦磷酸测序数据。

这profilin-like基因是在1.9到感染前组成型表达。感染后3小时的转录物显著下调至0.6（3倍的降低），并且在6 HPI保持不变。有6至12 HPI HPI一个显著上调与表达峰值在2.6，随后显著降低至0.9在24 HPI，并保持在48 HPI不变，而不是12 HPI（图4 e）.

与未感染时间点相比，MLO跨膜蛋白编码基因在2.2组成表达，随后在6 hpi显著降低。在12 hpi时，抗性砧木响应显著增加至5.7 hpi。与12 hpi相比，24 hpi的表达显著下调，并在48 hpi达到1.5的水平(图)4 f）.这MLO表达数据与该转录本的焦磷酸测序数据一致。

万向应力蛋白显示出最高表达在12 HPI但相比于0和6 HPI时没有表现出显著增加。在表达的总体增加在48 HPI被看过直到12 HPI，接着显著下调至0.4相比，12 HPI（图4 g）.

分别用于编码两个基因的甜蛋白样蛋白和富含亮氨酸重复（LRR）抗性蛋白质样蛋白质在0.8进行组成型表达。这两个基因显示出调控在48小时过程中没有统计学显著变化，但类似的大多数在这个实验中的基因，这两个基因显示出在12 HPI表达的最高涨幅。上调的实现的最高水平为1.1和1.47分别（图4 h＆4I.）.

我们已经对鳄梨根的第一组转录组数据进行了测序p、肉桂交互。GS FLX平台上的单通道焦糖测序产生了2.0 Mb(潜在2.5 Mb)的数据，包含9953个reads，组装成371个contigs，其中367个est是新的美洲大蠊和以前没有被发现。此外，我们还能够识别和量化是调节响应九防御相关的基因的表达p、肉桂．主要目的本研究是产生感染病原体根宽容的鳄梨砧木的EST数据p、肉桂．该数据确定参与细胞的过程和防御机制，从而为研究中的重要的农业主持人之一的根源根本容忍的分子机制的第一平台的基因p、肉桂．

371个重叠群分组为分别基于使用DCAS程序KOG和GO数据库38和21的功能类别。正如预期的那样，大多数序列的有未知的功能。由于测序的高灵敏度，转录组研究确定许多成绩单还没有被定性，许多使用数据库注释，即使有未知的功能，如基因本体论[44］．通常，鳄梨的缺乏和基因组序列数据一般，特别是砧木，也占了未知功能的高频。根据GO分类的前十个功能分组透露，44.5％的组装成簇由未知的函数表示，其次是“其他”，“细胞组分”，“生物过程”，“压力反应”，“核糖体结构”'，'细胞壁相关'，'蛋白质结合'，'线粒体和'ATP结合'。根据Kog数据库的大部分序列数据匹配类别的“一般函数预测”，这意味着这些转录物显示对根据NCBI表现不佳的转录物的同源性。Kog数据库透露前十个课程首先进行分组的葡萄节;“一般函数预测”之后是“信号转导”，“未知函数”，“翻译和核糖体结构”，“伴侣”，“碳水化合物代谢”，“细胞内贩运”，“转录”，“细胞骨架”和“无机离子运输”和新陈代谢'。此外，本研究中未识别的读数的存在不是鳄梨的独特，其他研究也产生了与NCBI数据集中存在的任何序列不对齐的序列[39］．

我们研究了鳄梨序列数据与我们的数据显示同源的植物物种之间的序列同源性。只有1%(4/371)的序列显示同源性美洲大蠊，而20-30％的Contigs产生与葡萄曲线相似（欧洲葡萄）.在我们的研究中观察到的鳄梨序列数据缺乏相似性，这强调了NCBI缺乏遗传数据。通过对鳄梨砧木的est序列进行测序，我们获得的知识可能会对其他木兰类植物或系统发育相关植物提供一些见解。本研究产生的序列和表达数据可以形成基生被子植物功能基因组学的基础，基生被子植物是一个没有其他模型的类群[27］．

正如预期的那样，我们也分离出若干个EST的同源性先前在植物的防御反应对病原体和在某些情况下相关的基因，对卵菌。有趣的防御无害环境技术包括奇甜蛋白，金属硫蛋白，一个PR10病程相关蛋白，MLO跨膜蛋白和profilin的。9个基因与定量RT-PCR定量阐明感染了宽容鳄梨砧木的早期基因响应p、肉桂以及验证焦磷酸测序数据。

索马甜，与SA通路相关的蛋白质PR5 [45那46，在48 h时显著上调p、肉桂感染。该基因在接种菌丝悬浮液后的前6小时内无明显调控变化。在12和24时，hpi表达对感染的反应不显著但稳定增加。PR5是由生物胁迫诱导的，并进一步与提高病原体抗性有关[47］．Garcia-Pineda等（2010）显示了根系殖民的降低Arabidopsis-P。、肉桂系统连接到SA。索马甜中的显著上调P. cinammomi耐受性牛油果砧木表明SA途径在半生物营养的早期抑制中的重要性p、肉桂．半生物营养体在成为坏死营养体之前有一个初始生物营养阶段，sa依赖途径中的PR5基因活性已被证明对生物营养体有效[48］．

PsemI在感染宽容鳄梨根24 HPI呈高表达p、肉桂．在Douglas的响应中鉴定了PR10基因 - 感染了Phellinus weirii[49］．作者指出，高浓度的销米III（PsemI基因同源物）负责抗生锈病原体柱锈菌属ribicola．这PR-10.基因也被用作标记在筛选P. Weirii.对牛油果PRR抗性的筛选具有重要意义。

的编码细胞色素P450基因样TBP是要由显著诱导唯一转录p、肉桂早于3 hpi。这种酶的特点是氧化代谢和ROS的产生。这种快速反应可以归因于蛋白质在细胞代谢和生长中的普遍特性。此外，据报道它参与生物和非生物环境反应以及HR对感染的反应[44那50-52］．

我们的数据在12 HPI时揭示了一个明显的宿主响应，其中四个转录物的上调金属硫基因，通用的应激蛋白，profilin的＆枣疯病．Metallothioneins抑制编程细胞死亡（PCD）和Fumonisin B1诱导的番茄根死亡感染根出杆菌根草杆菌通过干扰ROS途径。金属硫蛋白过表达显著降低了ROS的积累，验证了其清除ROS的功能[53］．显著的归纳法Metallothionein在高耐受性的牛油果砧木中，12 hpi提示该蛋白可能在授予抗病能力中起作用p、肉桂清除活性氧。活性氧的产生表明了超敏反应(HR)的活性，它会导致细胞死亡，并对生物营养有机体有效[54］．

通用应激蛋白在12 HPI上调表示植物的感染的由应激反应p、肉桂．普遍胁迫蛋白通过介导的乙烯[55，因此我们的结果可能涉及乙烯途径的响应p、肉桂，这一途径显示了拟南芥/ P。、肉桂互动(37］．

这两个profilin的＆枣疯病在肌动蛋白丝极化中起作用[56那57]和肌动蛋白的重排已结合成功病原体感染导致重排[的抑制植物真菌相互作用观察58那59］．profilin的已知定位于细胞壁下方的部位，由该oomycetous附着胞渗透[60.]，并促进或阻止肌动蛋白细胞骨架中的肌动蛋白聚合[56］．真菌攻击过程中的细胞壁增厚也涉及到作为防御反应的肌动蛋白丝的重新定位，以防止病原体侵入[61.］．的上调profilin的在鳄梨的根表明profilin的是响应于所生产p、肉桂渗透。MLO是一种跨膜蛋白，可调节抗性大麦中肌动蛋白细胞骨架极化以响应一种生物营养真菌Blumeria茎F。sp。大麦[62.］．对病原体的成功防御导致细胞壁强化，并与尝试渗透的部位的actin积累增加相关[57］．

的奇甜蛋白样基因的表达表现出对卵菌感染无显著响应。这可能是由以下事实来解释，它通常是由病毒，细菌和真菌感染引起的[46，并被认为利用各种酶的活动破坏真菌细胞壁[63.］．LRR (leucine rich repeat)抗性蛋白样基因也未表现出明显的反应p、肉桂．虽然已经发现耐药相关LRR蛋白与其他特异性相互作用Phytophthora.物种， （马铃薯，马铃薯晚疫病互动）[64.]，没有这样的相互作用，为被描述我们的知识p、肉桂以及它的宿主，特别是鳄梨。然而，aLISK基因p、肉桂受感染的耐受性鳄梨根需要进一步调查。

这项研究发现了一组受半生物营养体感染调节的有趣的基因p、肉桂通过454焦磷酸测序。防御基因包括一般防御相关转录本(通用应激蛋白，Metallothionein和奇异果甜蛋白- 样基因以及细胞色素p450）和Phytophthora.特异性应答基因，例如（Thaumatin，PR-10和远程雷达抗蛋白质像基因）[44-47那49-52那55那64.］．

我们用菌丝悬浮液接种鳄梨根，根据植物的遗传反应，我们假设植物的反应延迟是因为菌丝侵染率较慢，而游动孢子能够在孢子囊释放后2小时内发芽和包结。尽管有这种延迟，9个防御相关转录本中的5个在3到12 hpi之间对病原体表现出显著的早期反应。基于这第一组转录组数据，我们假设本研究中砧木的耐受性最有可能是多基因的，基于早期检测p、肉桂随后的反应包括活性氧和细胞壁增强。我们实验室正在进行的研究产生了第二组转录组数据，包括了各种不同水平的PRR耐受性和敏感性以及额外的时间点的砧木。

我们已经成功地获得了牛油果的第一个分子数据疫霉、肉桂互动，相信这一数据将有助于打击这种破坏性的病原体，从而在宽容鳄梨砧木的选择帮助宿主防御的理解。

植物材料接种

九个月大，有耐性的杜莎^®克隆鳄梨苗被伐里亚技术服务（察嫩，南非）提供并与接种疫霉、肉桂含有菌丝体和动物孢子的菌丝体悬浮液。在65升蒸馏水中总共均化了33克菌丝菌塞，其终浓度为0.5g / l。然后将其混合到迷雾中的112千克蛭石中。小植物在蛭石中随机接地，并在六周内持续灌溉。使用扫描电子显微镜和共聚焦显微镜确认p、肉桂感染，发芽和根定殖，然后用来确定根系收获的时间点。根据获得的结果，游动孢子在1小时内萌发，菌丝在6小时可见，我们选择了相应的时间点。根材料在感染后0小时(未感染)、3、6、12、24、48和72小时(hpi)收获，在液氮中快速冷冻，保存在干冰(-78°C)上，直到根材料可以运输回-80°C冰箱。将一组植物放在臭气床上6周，作为疾病的阳性对照。

用于焦磷酸测序的cDNA文库的生成

使用CTAB法进行RNA分离[24］．将根在液氮中研磨，每次提取2-3 g根材料。氯仿:异戊醇洗涤步骤重复6次，乙醇洗涤3次。总RNA浓度使用Nanodrop ND-100分光光度计(Nanodrop Technologies, Inc.， Montchanin, USA)进行定量，并在2%非变性TAE凝胶上进行验证。3个生物复制(每个时间点)的总RNA在mRNA纯化前合并。每个生物重复3个技术重复进行RNA分离。

在mRNA分离之前，将不同的时间点合并成三个文库进行焦磷酸测序，分别命名为未感染库、库1和库2。将0小时时间点视为未感染库，其中库1包含6和12小时感染时间点，库2包含24、48和72小时感染时间点。根据制造商说明书使用Oligotex (Oligotex™mRNA kit, Qiagen, Valencia, California, USA)纯化mRNA。每个样品进行两次mRNA纯化，以确保去除任何DNA污染，同时减少样品中可用的rRNA的数量。

利用内含子侧翼引物检测DNA污染。F3H向前:

(5'- tctgattttcggagatgactcgc -3')和F3H反转:

(5'-TGTAGACTTGGGCCACCTCTTT-3')从RNA中扩增出300 bp的黄酮-3-羟化酶基因片段，而不是从DNA中扩增出1200 bp的片段。

根据制造商说明书，用罗氏cDNA合成系统(罗氏诊断公司，曼海姆，德国)合成cDNA文库，并在测序前使用Qiagen MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen, Valencia, California, USA)进行纯化。如前所述，在cDNA中评估DNA污染。

焦磷酸测序和生物信息学

Inqaba Biotec (Sunnyside, South Africa)在GS-FLX平台上对文库进行测序。每个文库提供约3 μg的cDNA。每个文库的三分之一用不同的10个核苷酸标签(Uninfected tag- 5'CGTGTCTCTA'3, library 1 infection tag- 5'CTCGCGTGTC'3, library 2 infection tag- 5'TAGTATCAGC'3)进行测序。

使用Newbler汇编程序版本1.1.02.15 (Roche)，共将9950个reads组装成371个contigs。在拼接组装前对读取进行了修剪。不包括低质量的reads，使用dCAS (Desktop cDNA Annotation System) Version 1.4.1 Build 3791和CLC Free Workbench软件(CLC bio, Cambridge, MA)对组装进行分析和注释。使用BLASTX工具(使用PAM 30矩阵)来生成短的和几乎精确的匹配。本研究生成的序列数据可在NCBI转录组Shotgun组装序列数据库BioProjectID: PRJNA72155上查询。已量化基因的基因序列可通过登录号TSA JO840460-JO840468获得。

定量基因表达分析

选择9个基因用于基因表达分析，其中包括：索马甜，索马甜-就像那金属硫蛋白类，富含亮氨酸重复性蛋白样，病程相关蛋白PsemI那推定的普遍应力，皮肤素，跨膜蛋白枣疯病和细胞色素P450-like真沸点(TATA盒结合蛋白)。为本研究选择的内参基因为肌动蛋白和18岁核糖体rna基因。用于分析基因表达的时间点为感染前0小时和感染后3、6、12、24和48小时。

对于qRT-PCR的起始用1-2微克每一个时间点的总RNA的材料进行cDNA合成。所述ImProm-II™自Promega（Promega公司，麦迪逊，威斯康星州，美国）的单链cDNA系统，其与自Invitrogen（Invitrogen生命技术，米西索加，ON，加拿大）的随机六聚体引物一起使用。逆转录在下述条件下进行：25℃5分钟，42℃60分钟和70℃10分钟。

定量聚合酶链反应

引物使用Primer Designer 4 for Windows, version 4.2设计^©，(科学和教育软件，Durham, NC)基于序列同源性。设计引物以扩增不超过150个碱基对的产品，然后使用更积极的标准自动调整选择，并在58-61°C范围内选择引物。引物由South Cross Biotechnology(开普敦，南非)合成(见表)1）.

采用Bio-Rad CFX96 real-time PCR检测系统(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)进行定量PCR。反应在20 μl试管中进行，试管中包含每个cDNA样品5 μl、iQ SYBR Green supermix (Bio-Rad) 10 μl、每组片段特异性正、反引物1 μl和3 μl SABAX水。

热循环在95℃下进行10分钟，然后在95℃的55℃下进行10秒的片段特定退火温度（表7.）持续15秒和72℃延伸15秒。三个生物学重复用各自的三个技术重复使用。每个引物对的特异性彻底通过标准PCR研究了定量PCR进行的，然后通过单个熔融温度峰的存在证实之前。对于定量PCR，循环阈值（CT）的值被自动使用伴随的Bio-Rad公司CFX管理器（Bio-Rad公司CFX管理器™版本1.5）来测定。

统计分析

采用学生t检验确定基因表达水平之间的显著差异，用于定量基因表达分析。使用JMP进行统计分析^®程序版本9.0.0 (SAS Institute, Inc.， Cary, NC)， 95%置信区间。

我们是提供试管苗的支持伐里亚技术服务（WTS）的感激。该工作得到了国家研究基金会（NRF）和汉斯·梅伦斯基基金会的支持。

隶属关系

1. 林业和农业生物技术研究所（FABI），比勒陀利亚大学，比勒陀利亚，0002，南非

   瓦希德·穆罕默德＆Noëlani范登贝尔赫

2. 遗传学，比勒陀利亚大学，比勒陀利亚，0002，南非系

   瓦希德·穆罕默德＆Noëlani范登贝尔赫

通讯作者

对应到Noëlani van den Berg．

作者的贡献

WM和NVdB设计了实验，工作由WM进行。两位作者准备并批准了最终的手稿。

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再版和权限