亲和性的丧失可能解释了抗性拟南芥加入Te-0到Golovinomyces cichoracearum

背景

植物和病原体之间的相容性的建立需要符合各种条件，例如识别正确的宿主，抑制防御机制，以及维持一个允许病原体繁殖的环境。迄今为止，维持相容性所需的大多数植物因子仍然未知，少数最典型的是那些干扰防御反应的因子。一个适合研究主机兼容性的系统是各因素之间的相互作用拟南芥白粉病(PM)Golovinomyces cichoracearum。作为一种专性生物营养性病原体，这种真菌必须建立相容性才能永存。反过来,答:芥显示自然变异的敏感性，一些品种显示完全敏感性(Col-0)，和其他单基因显性抗性(Kas-1)。有趣的是，Te-0，在其他品种中，显示出对这种PM的隐性部分抗性。

结果

在本研究中，我们描述了的相互作用g . cichoracearum利用Te-0植株，研究该植物抗性的基础。我们发现Te-0的不相容性与宿主诱导性防御的过度激活无关。Te-0植株允许分生孢子萌发和功能吸器发育，但不支持成熟分生孢子的形成。利用抑制性消减杂交技术，我们发现在真菌分孢前阶段，抗Te-0植株和敏感Col-0植株的基因表达存在差异。

结论

Te-0抗性可能是由宿主相容性的丧失引起的，而不是由诱导性防御的刺激引起的。分生孢子的形成是Te-0植株完成真菌生命周期的主要制约因素。这里描述的系统允许鉴定作为这种PM易感性标记的基因。

植物病害在自然环境中是一种罕见的事件，因为不断改进的防御程序有效地控制了大多数微生物病原体。除了预先形成的屏障外，植物通常表现出两种可诱导的防御反应。首先，监测系统通过感知微生物相关分子模式(MAMPs)或宿主自我修饰的成分来检测病原体，以激活模式触发免疫(PTI) [1］．这种广谱免疫反应激活了一个复杂的信号级联，包括活性氧(ROS)的早期和短暂积累，β -葡聚糖胼胝质在植物细胞壁的沉积，以及大规模的转录重编程[2］．

尽管PTI有效地限制了大多数“非适应”病原体，但特定的“适应”微生物可以灭活这一途径，与植物建立兼容的相互作用。后一种情况意味着宿主和入侵者之间的亲密交流，并需要病原体衍生的效应物对其宿主分子目标的协调作用[3.- - - - - -5］．这些宿主靶点是防御信号级联、代谢途径或结构细胞成分的元素，其被效应子修饰有利于病原体的营养或生长，因此可被视为“相容性因子”[6］．

第二道防线参与控制适应性病原体。这种反应包括抗性蛋白(R)的作用，它识别效应物或其活性产物，以诱导效应物触发免疫(ETI)，提供种族特异性抗性。PTI和ETI有几个共同的成分，但只有ETI会导致被入侵细胞的崩溃，产生超敏反应(Hypersensitive Response, HR) [7］．此外，对同一属几种病原体的广谱抗性也可能表现出HR特征[8］．在过去的几十年里，这些途径的组成部分已被深入研究，包括植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)，它们的相互平衡调节对生物营养性和坏死性病原体的抗性[9］．相比之下，对于支持疾病发展的宿主相容性因子的性质或功能知之甚少。正向和反向遗传方法揭示了一些单基因隐性基因座，其功能丧失可减少疾病，因此表明它们编码相容性成分[10］．相反，交互作用方法，如酵母双杂交和免疫共沉淀试验，大多将防御相关元件确定为生物营养或半生物营养病原体效应物的靶标[11- - - - - -13］．

植物与白粉病(PMs)的相互作用为研究和鉴定支持疾病发展的植物和病原因子提供了适宜的条件。PMs是适应专性病原体票面价值卓越，完全依靠活组织生长和繁殖[10］．与这些病原体兼容需要在成功提取资源和维持宿主活力之间取得微妙的平衡[14，15］．具体而言，拟南芥的三种PM病害已得到很好的表征，涉及以下PM物种:Golovinomyces cichoracearum(原白粉菌属cichoracearum) [16),Golovinomyces orontii(原白粉菌属orontii) [17),而白粉菌属cruciferarum［18］．这些病理系统被用来克隆广谱抗病基因[8]和非宿主抗性[19- - - - - -21]，以及编码相容性因子的基因[22- - - - - -25］．此外，最近还描述了另一种PM物种，命名为粉孢子neolycopersici，能够在拟南芥中完成其生命周期[26］．有趣的是,不同的答:芥品种表现出不同程度的易感性g . cichoracearum．其中，Tenela (Te-0)没有宏观的疾病迹象，一个名为RPW3的隐性遗传位点(识别白粉病3)赋予了中等抗性，这提高了Te-0植物中病原体发育或传播所需的植物成分缺失或改变的可能性[16］．我们在这里评估了Te-0抗性是否可能源于相容性建立中的缺陷。在这种相互作用中观察到的防御和感染特征表明，Te-0植物具有功能性吸器的形成，但没有分生孢子的成熟。因此，该实验系统将适用于描述影响PM分化最后阶段的相容性条件。

Te-0植株侵染后PTI/ ti样反应g . cichoracearumUCSC1

评价Te-0抗性的基础g . cichoracearum，我们监测了这种相互作用中防御标记的激活。作为对照，我们使用了完全易感的哥伦比亚(Col-0)植物和抗性的克什米尔(Kas-1)植物。在最后的遗嘱中，RPW8，非典型的R基因通过诱导sa依赖的防御、ROS积累和细胞死亡，在类似于经典R基因激活的HR反应中，对几种PM物种具有广谱抗性[8，16，27］．通过3,3二氨基联苯胺(DAB)监测ROS的积累，初步分析了PTI/HR诱导的三个细胞学标记物[28]，植物细胞壁胼胝质随苯胺蓝的沉积[29，30.]，以及乳酸酚台盼蓝引起宿主细胞死亡[31，32］．

在受感染的Kas-1植株中检测到ROS的积累(图1)，其中约50%的相互作用部位在接种后24小时出现DAB染色(hpi)。这种反应在72 hpi到达接近分生孢子的叶肉细胞时更强1， 72 hpi;额外的文件1A)，类似于描述的反应RPW8-介导抗性[8］．相比之下，Te-0和Col-0组织在24 hpi时没有积聚ROS(图1)，近10%的相互作用位点在48 hpi处显示DAB染色(附加文件1a).在72 hpi时，在20% (Col-0)或26% (Te-0)的相互作用位点检测到微弱的DAB染色，主要是在含有旧吸器的细胞中(附加文件)1a).此外，在支持分生孢子萌发停滞的Te-0表皮/叶肉细胞中未观察到DAB沉淀(图1)．与这些结果一致的是，销售税(谷胱甘肽s -转移酶)转录积累，通常伴随氧化还原改变，直到240 hpi才在Te-0感染的组织中检测到(图2)．

在kas1感染的24和72 hpi的组织中，在真菌接触部位或未萌发的分生孢子下，观察到表皮细胞壁密密地分布着胼胝质沉积物1 b)．相反，Te-0和Col-0感染表皮细胞，相邻叶肉细胞细胞壁无胼胝质沉积。在这两种标本中，吸器周围检测到荧光(图1 b)，可能是由于真菌自身荧光和/或胼胝包膜随吸器年龄而变亮[15，29，32，33］．

正如预期的那样，在感染的Kas-1组织中也观察到死亡细胞。接近一半接触病原体的表皮细胞在24 hpi时显示台锥蓝染色(附加文件)1a).后来，到48 hpi时，这些组织中形成的少数吸器被植物染色的细胞质内容物包围(图1 c插图)。此外，在这种植物中，一些相互作用部位的叶肉细胞表现出死亡迹象1b).相反，Te-0和Col-0组织在72 hpi之前几乎不存在细胞死亡(图1 c；额外的文件1一个)。

在答:芥，对生物营养性病原体的易感性受SA-和JA-依赖防御途径之间的平衡调节[34- - - - - -36］．我们分析了Te-0植株是否对g . cichoracearum由这些通路的组成表达或过度激活引起的。为此，我们监测了sa敏感基因标记物的表达PR1(致病相关基因1)和JA-诱导基因LOX2(脂氧合酶2),VSP2(营养贮藏蛋白2)和PDF1.2(beta-glucanase 1.2)。

未侵染的Col-0、Te-0和Kas-1植株组织中，均未出现病毒积累PR1成绩单。感染后,PR1首先在Kas-1中检测到激活(24 hpi)，然后在Col-0中检测到激活(72 hpi)，随后在Te-0植株中检测到激活(240 hpi)(图)2)．关于JA标记基因，病原介导VSP2三种植物的活性都很弱且相似(图2 b；额外的文件2)．为LOX2而且PDF1.2在未侵染的Kas-1和/或Te-0植株中表达上调，Te-0植株侵染后表达变化较小。因此，这些基因标记的表达模式表明，Te-0植株既没有表现出强烈的基础刺激，也没有真菌诱导的SA和JA通路激活。为了寻找Te-0中SA和JA通路之间平衡改变的迹象，我们检测了两个基因的转录活性，这些基因对这些通路之间的相互作用敏感g . cichoracearum．基因为sa依赖和ja抑制糖苷水解酶(GH14)，以及ja依赖和sa抑制的肿瘤相关蛋白(刀) [37］．我们发现，在侵染过程中，Col-0和Te-0植物表达这两种基因的模式相似(图2摄氏度；额外的文件2)．

综上所述，我们的分析表明，Te-0植株对g . cichoracearum不伴有PTI的构成性激活或ETI通路的恶化。

发展的限制阶段g . cichoracearum对Te-0植物的影响

为了分析Te-0组织中真菌疾病的进展，我们在感染时间过程试验中评估了病原体来源结构的丰度和形态。我们用易受Col-0影响的植株和抗kas1的植株作为对照，进行了同样的分析。为g . cichoracearum，分生孢子萌发后形成初级生殖管(PGT)，表皮细胞穿透并产生吸器(HA)(图3) [16］．其次，次生芽管(SGT)和分枝菌丝(R)形成真菌菌落，最终分化出分生孢子(Cph)，结束真菌无性繁殖周期。正常情况下，一个成熟的Cph (mCph)含有一个在基底足细胞(FC)上形成的五分生孢子链。偶尔，在一些拟南芥遗传背景下表现出抗性g . cichoracearum，该真菌只形成含有FC和1-2分生孢子的未成熟Cph (iCph) [34，38］．

在最初的72 hpi中，接种分生孢子的叶片每6小时采样一次，用台潘蓝染色，用明场光学显微镜分析真菌结构(图2)3.；额外的文件3.)．与Col-0植物相比，Kas-1植物的分生孢子萌发严重降低，Te-0植物的分生孢子萌发受影响较小(图2)3, b)。这些差异一直持续到72 hpi，其中Col-0、Te-0和kas1的接种分生孢子萌发率分别为90.5±8.4%、64.2±5.3%和42.6±4.7%3 b)．发芽后，在48 hpi, Te-0组织上发育的真菌结构模式与Col-0组织中发现的非常相似，但与Kas-1组织上观察到的真菌结构有很大不同(图3 c)．此时，Te-0和Col-0植物的R菌落水平相当(分别占萌发分生孢子的29%和36%)，而Kas-1植物从未达到这一分化阶段，其真菌发育在PGT(41%)或HA(42%)阶段停止(图)3 c，附加文件3.c)。

相对于Col-0植株，Te-0植株上的真菌生长在6-12 h内被延迟3.a、b)。有趣的是，尽管Te-0植物中存在R菌落(图3 c)，这些组织中Cph的形成严重减少(图3 d)．通过计算每个菌落的Cph数(mCph和iCph)，我们发现，在接种后5天，Col-0组织的Cph为15±6 Cph/菌落，10 dpi时最高为52±10 Cph/菌落，而Te-0组织在接种后5 dpi时没有Cph, 10 dpi时仅为12±4 Cph/菌落。Cph含量的降低一直持续到感染后期，这表明这不仅仅是由于Te-0植物上真菌生长的延迟。虽然在Te-0中形成的真菌菌落比在Col-0中形成的菌落略小，分枝程度也较低(图3， 72 hpi时，两种植物的吸器数量相近(Col-0为12±4个，inter -0为10±3个)。值得注意的是，Te-0中发现的大多数Cph发育不完全，仅达到iCph阶段(图3， 72 hpi)。

综上所述，Te-0组织中萌发的分生孢子能够分化HA并形成R菌落，但未完成mCph的形成，说明mCph的形成过程是一个限制步骤g . cichoracearum这种植物的无性繁殖。

Te-0植物真菌吸器形成的结构特征

吸器的形成是与植物建立相容相互作用的关键，因为这些结构将效应物输送到宿主细胞，并为真菌增殖提供营养物质[39，40］．由于Te-0植物支持产生少量mCph的小型真菌菌落，我们决定评估这些组织中吸器的形成。利用电子显微镜，我们比较了Te-0和Col-0植物发育的吸器的超微结构特征(图4)．

在这些植物中，含有吸器的表皮细胞没有显示出细胞壁增厚或质膜改变的迹象(图4、d、c、f)。此外，在这些细胞中没有发现细胞器或细胞质破坏的迹象，这些细胞保持完整的细胞核位于吸器附近(图4f)。多叶吸器(图4 b，c,e)，大量的线粒体和多泡体聚集在吸器周围或内部(图4 b，c,f)均存在。此外，两种植物吸器外基质的光电外观相似(图4摄氏度，e,f)，在这些组织中未观察到真菌细胞壁和吸器外膜的间断或改变。

为了补充这些研究，我们比较了Te-0和Kas-1植物中形成的吸器。由于卡斯-1感染组织的超显微切片中未发现吸器，因此我们使用共聚焦显微镜进行研究。在这里，再次分析了在Col-0植株上发育的吸器作为对照。在24、48和72 hpi时切除感染叶片，固定后用磺胺-罗丹明B (SRB)和1-苯胺-8-磺酸(ANS)染色[41，42］．据我们所知，这是关于这些化合物用于植物细胞内真菌吸器可视化的第一个证据5)，因为传统上它们分别被用来染色蛋白质和脂质[41，42］．同时，DAPI染色用于识别吸器核(附加文件)4)．

在所有被检测的阶段，Te-0中产生的吸器与Col-0中产生的吸器没有区别，但与Kas-1植物中存在的吸器明显不同，后者可以积极对抗真菌感染(图2)5)．Col-0和Te-0植物含有正常的吸器，具有单个圆形核，囊状室被连续的薄结构包围，可能对应于EHM [15)(图5)．相比之下，在Kas-1上形成的60-80%的吸器此时是异常的(附加文件)1a)，表现为细胞质紊乱和DAPI染色昏厥(附加文件)4)，暗示了退化过程。在Col-0和Te-0中，这些异常仅在72 hpi的一小部分吸器中观察到(分别为18.00±8.33和12.00±9.33%)1a).通过三维重建48 hpi的图像，确定了Te-0和Col-0样品的最大吸器直径(分别为20.98±2.49和21.52±1.87 μm);T-test p < 0.05)，与Col-0样品相比，Kas-1样品吸器直径显著减小(16.67±3.96 μm，T-test p = 0.0034)。

l -精氨酸通过Te-0植株的吸器转运

专性生物营养真菌如白粉病和锈病的吸器参与吸收糖、氨基酸、S、P和真菌生长所需的其他营养物质[43- - - - - -46］．为了评估Te-0中形成的吸器的功能，我们分析了它们运输l -精氨酸C的能力¹⁴(命令行参数个数¹⁴)从植物细胞到真菌细胞。在这些实验中，叶片在感染后的不同时间被切除，并在ArgC中漂浮5小时¹⁴解决方案。然后，用胶带将存在于磁盘表面的真菌物质剥离，并将C¹⁴在磁带中被量化。平行取样手足感染盘，台潘蓝染色法测定吸器含量。此外，来自未感染的叶子的圆盘也被暴露在同样的处理中，以量化和减去由于剥离过程而转移到磁带上的残余放射性。类似的测定方法以前曾用于相同的目的[44，45］．

我们发现Kas-1样品中含有可忽略不计的ArgC水平¹⁴在整个分析期间(24-96 hpi;额外的文件5a).相比之下，te -0衍生条带显示ArgC增加¹⁴感染期间的含量，这些值几乎代表了72 hpi之前Col-0样本所对应的值的一半(附加文件5a).在这段时间内，观察到的差异可能是由于Te-0植物上真菌增殖延迟造成的(图3.b,c，附加文件3.b).考虑到这种可能性，我们将ArgC的水平归一化¹⁴吸器的数量，并发现在摄取ArgC没有差异¹⁴在菌丝安装在Te-0和Col-0植株之间的最初72 hpi(附加文件)5b).有趣的是，在96 hpi时，在Col-0样品中检测到放射性的净增加，但在Te-0样品中没有。目前尚不清楚这种变化是否也是由于真菌生物量的差异。然而，由于Cph成熟发生在敏感植物的这个时期，这一结果可能表明在这种条件下需要更高水平的营养物质。与此一致的是，即使在稍后的时间点，Te-0植物无法保持mCph(这些样品中含有近400 cpm的ArgC)，也从未达到这样的增长¹⁴在120 hpi时，每剥离的叶盘)。

总之，结果表明，Te-0植物的吸器功能与Col-0植物的吸器功能非常相似，至少在精氨酸吸收方面是如此。因此，在Te-0中观察到的分生孢子不足不会导致营养物质吸收的严重失败。

答:芥基因在Te-0植株中表达差异g . cichoracearum

为了进一步表征Te-0植物与g . cichoracearum，我们发现在感染晚期，Col-0和Te-0组织中存在差异表达的基因。为此，从72 hpi分离的组织样本中生成cDNA文库，并用于抑制性消减杂交试验(SSH)，将Col-0 72 hpi cDNA样本(测试者)与Te-0 72 hpi cDNA样本(驱动者)进行对照。克隆并测序得到的未减除的cdna，发现与Col-0样品相比，Te-0中有8个基因低表达。这些差异表达的基因编码以下蛋白质:PR1，甲基硫蛋白1a (MT1a)，热休克同源蛋白70.1 (HSP70.1)，内质蛋白(END, HSP90.7)， GRF7/GF14v 14-3-3蛋白(GRF7)，蔗糖转运蛋白4 (STP4)，叶绿素a/b结合蛋白LHCB1.2和氧化还原酶。原则上，这些基因可以被认为是无效防御激活或两者之间兼容性的标记答:芥而且g . cichoracearum．我们忽视了防御相关基因编码的研究PR1，氧化还原酶，和叶绿素a/b结合蛋白，其作用和/或行为在此病原体感染之前已被描述[36，37］．

我们选择了剩下的5个基因，并在未处理和真菌接种的Col-0, Te-0和Kas-1叶片中监测其表达(图6；额外的文件6)．所有基因在Col-0组织中均表达上调，在48 ~ 72 hpi时表达量最大，激活时间为120 hpi。与SSH试验一致，在Te-0感染的组织中，这些基因都没有被诱导，即使在120 hpi时，真菌生物量与在48 hpi时Col-0组织中发现的相似(附加文件)5c).有趣的是，在Kas-1植物中，基因保持不变(MT1a，HSP70.1结束)或者被下调(STP4, GRF7)，表明它们的激活与感染无关R-基因介导的抗性，而不是与g . cichoracearum．

pm与它们的宿主建立长期的关系，迫使它们维持兼容性条件[10］．PM基因组中编码的大量不同的效应子集合[47]可能表明这些化合物在植物中的目标分子上具有冗余功能。这也许可以解释为什么基因对基因抗性在田间对PM病害的控制作用可以忽略不计，以及为什么植物抗性被克服而病原体没有明显的适应度损失[48］．这种效应物及其靶标的鉴定将是了解PM疾病和设计新的替代品以产生持久的被动耐药性的关键。为了朝着这个方向前进，需要新的实验系统，允许通过敏感性损失来评估相容性和耐药性。对于后一种情况，我们描述了相互作用的特征答:芥Te-0植物和g . cichoracearum在这种情况下，宿主在感染的初始阶段提供兼容条件，但不是在感染的后期。在这种植物中，分生孢子的萌发部分减少，真菌的生长略有延迟。在涉及PTI或ETI/HR激活的抗性相互作用中，已经描述了这两个特征[8，20.，30.，34］．然而，Te-0感染的组织没有表现出主动防御的迹象(ROS积累，胼胝质沉积或细胞死亡)，这种反应与感染的Kas-1组织明显不同。因此，Te-0抗性似乎与RPW8在许多不同品种的白粉病中提供广谱保护答:芥通过激活hr样反应[8，27，49- - - - - -51］．在基础条件下，在Te-0真菌感染的组织中，既没有诱导sa依赖通路介导对生物营养性病原体的抗性，也没有过度刺激。此外，JA信号级联似乎没有增加抗性g . cichoracearum在Te-0植物中。的LOX2而且PDF1.2基因标记物的基础表达较轻，感染后无激活VSP2无基本表达，对病原菌的诱导较弱，表明对真菌的抗性不是由于ja依赖防御的主要增强。奇怪的是，JA途径对相互作用的影响答:芥目前尚不清楚。的JA水平瞬时增加答:芥组织感染g . cichoracearum［37］．JA处理的野生型植物对PMs的抗性增强cev1构成性激活JA途径的突变体[52］．然而,coi1-1而且jar1-1在ja通路受损的突变体对PMs不高度敏感[53］．因此，在自然感染条件下，JA/ET途径的激活可能不足以对PMs产生耐药性[36］．

Te-0植株没有表现出过早衰老、大小改变或发育诱导的胼胝质积累的迹象(http://www.arabidopsis.org/ABRC和附加文件7)．这些植物对真菌感染也没有强烈的防御功能。这些观察结果驳斥了Te-0植物的抗性可能源于编码PMR2、PMR4、EDR1、EDR2和PUX2的基因突变的可能性，这些基因以前被描述为pm易感因子，导致防御反应的过度激活[22，25，34，38，54］．

在答:芥， PMR5和果胶裂解酶PMR6已被认为是增强PMs易感性的因素。PMR5参与细胞扩张，而PMR6在细胞壁建模中起作用[23，24]，这两种蛋白都是植物细胞壁果胶的正常组成以及与PMs建立相容性所必需的。电阻的pmr5/pmr6突变体不涉及SA或JA/ET途径，类似于Te-0植物的抗性。然而，这些突变体发育不良，显示细胞大小减少，组成性散发性叶肉细胞死亡，并沿静脉沉积自动荧光化合物。这些特征在健康或g . cichoracearum-感染Te-0组织时，这些植物的抗性可能不是由于PMR5/6功能缺陷。

迄今为止，PMs发展的两个最具特征的限制阶段是表皮细胞的渗透[20.，55]和吸器的发育[56，57］．有趣的是,g . cichoracearum在Te-0植株中，未阻止其达到上述任何阶段。50%以上的接种分生孢子在Te-0组织中萌发，形成穿透性菌丝和功能性吸器。而真菌无性繁殖是该植物病原菌增殖的主要限制阶段。在此发展阶段的限制，已在以前描述的PM疾病答:芥［34，38］．在子囊菌中，产孢受多种因素的调控，包括接种量、光照、温度、湿度和养分有效性[58，59］．虽然在阐明模型真菌的这一发育程序方面已取得重大进展(神经孢子菌属，曲霉属)，其遗传基础和对寄主线索的敏感性仍然是专性真菌生物营养的未知因素。从这个意义上说，我们的结果表明g . cichoracearum在答:芥需要特定的寄主条件或信号，这些寄主条件或信号在Col-0植物中存在，而在Te-0植物中不存在。另外，Te-0可能限制了真菌的最佳发育，例如影响养分吸收，这对Cph成熟产生了负面影响，尽管我们发现放置在这些植物中的吸器显示出正常的ArgC同化¹⁴．

有趣的是，Te-0支持丰富的菌丝发育和适度的孢子形成g . cichoracearum相对白粉菌属cruciferarum［18]并且易受产卵菌的野外分离株感染角膜白斑。(E keemen, JD Jones，未发表结果)。因此，下面的证据支持Te-0在兼容性所必需的成分中被改变的可能性g . cichoracearum:(i)植物抗性的遗传性质(隐性);(ii)植物对其他生物营养性病原体的敏感性，包括近缘种;iii)在这种相互作用中缺乏主动防御(PTI、ETI、SA和JA途径的标记)。

为了描述在相容条件下发生的基因表达变化，我们寻找了Te-0-和Col-0感染组织在孢子形成前阶段的转录差异。通过SSH，我们鉴定了8个差异表达基因，包括经典的防御相关基因(PR1，氧化还原酶)，以及影响光合作用的基因(叶绿素a/b结合蛋白)，这些已在其他地方被描述[36，37］．余下5名候选人(MT1a, HSP70.1，结束，GRF7而且STP4)在敏感的Col-0植株中表达增加，但在抗性Kas-1植株中不表达，表明它们对相容性条件敏感，但对ETI激活不敏感。

先前的研究报告了其中一些基因的激活对真菌感染的反应。这已经被观察到STP4在交互过程中答:芥与g . cichoracearum［60]和forMT1a以及其水稻同源物对其他吸器形成真菌的反应[61，62］．反过来,HSP70.1是由专性生物营养菌诱导的Hyaloperonospora arabidopsidis(交货。parasitica) [63]，而结束- - -［64),而GRF7 -大麦中的同源物被PMs上调[65］．

编码宿主相容性因子的基因缺失预计会减少病原体的生长。然而，这些基因的功能冗余可能会阻碍null突变对单个基因的影响。相反，这些基因表达的增加可能会对入侵者的生长产生可控制的影响。与这个预测一致的是，答:芥植物的过度表达HSP70.1高度易受h . arabidopsidis［62]，使水稻植株活跃起来平显示对防御基因诱导和细胞死亡的负面影响[66］．此外，激活MT1a导致对细菌病原体的易感性增加，减少体内ROS的积累木麻黄glauca［67］．奇怪的是，植物过度表达结束对盐和干旱压力更敏感，尽管它们对病原体的反应还没有得到评估[68］．因此，综合这些结果，我们研究中选择的基因似乎参与了对压力的反应，其中一些基因在细胞活力途径中起作用。

本研究提供了专性生物营养病原体之间相互作用的详细描述g . cichoracearum自然变异的答:芥物种,Te-0。我们发现了真菌发展的极限阶段在足底是条件团的形成。这种限制与PTI和ETI/HR的细胞或分子标记的激活无关。考虑到Te-0植株抗性的遗传基础(隐性和单基因)[16]，我们认为这种表型可能是由于植物在感染后期无法维持相容性条件造成的。由于Te-0没有表现出在缺乏配伍因子的突变体中所描述的发育或生殖缺陷(pmr2/4/5/6)，其耐药性将来自于新的配伍因子的改变。对这些因素的初步研究允许识别未来必须鉴定的候选相容性基因标记。此外，这项工作提出了与控制有关的新问题g . cichoracearum无性生殖在足底假设存在支持这一阶段的宿主分子线索，以及这里鉴定的基因对建立与PMs的兼容性的贡献。

植物和真菌材料

答:芥种子取自ABRC (http://www.arabidopsis.org/ABRC)．表面灭菌，分层的种子在转基因板上发芽10天，转移到土壤中。在80%湿度、21-23℃、8/16 h光/暗循环、100 μE m条件下生长^－2证券交易委员会^－1辐照度，在5-7周大时使用。g . cichoracearumUCSC1由Shauna Somerville博士[16]并在Col-0和南瓜中传播(Curcubita最大值var。库塔;Park Seed, Greenwood, SC, USA)。在叶片组织上接种病原体，如前所述[37］．

组织化学分析

为评估植物细胞死亡情况，用乳酸酚台盼蓝混合染色处理病原体感染的叶片[31］．用Axioplan 135显微镜(蔡司，德国)观察样品，用Axiovision摄像系统获得图像。DAB(3,3二氨基联苯胺)染色检测ROS的积累[28］．简单地说，叶柄是在水下切开的，以避免维管系统中的气泡。叶片在200 μl DAB (1mg /ml水，pH = 3.8)中浸泡8 h，在96%乙醇中漂白24小时，再水化，装入50%甘油中，观察细胞死亡情况。用台盼蓝共染色检测和定量真菌感染结构[31，37］．为了检测胼胝质，将叶片在96%的乙醇中脱色，在水中重新水化，并浸入苯胺蓝溶液(0.01%p/v在150 mM的磷酸盐缓冲液中，pH = 9.5) 1小时。将叶片置于50%的丙三醇中，使用共聚焦激光显微镜(卡尔蔡司激光扫描系统LSM5 Pascal安装在倒置显微镜Axiovert 200，蔡司，德国)，使用488 nm氩激光和c-apochromat 40X物镜进行观察。

共焦显微镜

用磺胺-罗丹明B (SRB) + 1-苯胺-萘-8-磺酸(ANS)溶液对感染植物组织中的真菌吸器进行染色。简单地说，切除的感染叶片在2.5%戊二醛和2.5%多聚甲醛中固定1小时，并在含有2 mg SRB(分子探针，尤金，OR，美国)和1 mg ANS(分子探针，尤金，OR，美国)的溶液中孵卵20分钟，溶解于45 mL甲醇+ 45 mL MilliQ水和10 mL乙酸中。叶片在PBS中冲洗10分钟，并装入50%甘油中。用543 nm激光和100X c-apochromat油DIC物镜共聚焦显微镜观察荧光结构。

电子显微镜

将感染的叶片取样，并在2%多聚甲醛和2.5% gluter醛中固定1小时。固定样品包含在Spurr树脂中[69]，用四氧化锇染色，由IFFIVE (INTA，科尔多瓦，阿根廷)的电子显微镜实验室切片并进一步处理。

真菌氨基酸摄取

基于之前的协议[44，45]，用分生孢子(约500毫米)接种的植物^2－1)，在不同时间点切除叶片(每个基因型2个叶片和20片叶片)。将两组圆盘(每组20个)分别漂浮在水中或C溶液中¹⁴l -精氨酸100 μM (Arg C¹⁴)在潮湿的容器中放置5小时，避免菌丝与溶液接触。将叶盘沉积在薄纸上，并使用胶带(Magic tape, 3m)将菌丝体从正面剥离¹⁴用闪烁计数器在磁带上测定含量。使用相同的程序，从未受感染的植物中取出的圆盘被用来减去由于组织的机械损伤而转移到磁带上的放射性。用台盼蓝染色法测定样品上吸器的数量。类似的一组样本被用来估计真菌生物量。简单地说，取15片Col-0和Te-0叶片(3片/株，5株)，在48、72和120 hpi下用台潘蓝染色，用亮场显微镜图像确定真菌菌落覆盖的叶片面积(长x宽)(附加文件)5c)。

基因表达

总RNA是从健康的和g . cichoracearum -受感染的答:芥叶子(70]并用于北方斑点[37］．每个样本抽取10微克RNA，用dATP P随机引物生成的放射性探针进行杂交³²(NEB)从ABRC (PR1: U11550,销售税: U13302)。按照制造商的说明，从未感染(T0)或真菌感染(T72)的Col-0和Te-0叶片中提取的总RNA用于抑制性消减杂交(SSH)测定(Clontech的PCR Select cDNA Subtraction Kit)。对缺失的cdna进行克隆和测序。

一毫克答:芥总RNA用DNAse I (Invitrogene)在37°C处理1小时，然后在75°C加热。加入随机六聚体引物和MMLV逆转录酶(Invitrogen)，在20 μl中合成cDNA。1 μl分别用于半定量(sq)或实时定量(q) PCR(最终体积分别为25 μl或14 μl)。

对生物复制样本进行至少两次sqRT-PCR，结果相似。检测每个基因的周期数，以确定与cDNA输入初始量相关的PCR线性阶段。每个基因的引物集和周期数在附加文件中说明8．

qPCR检测包括图中评估的cDNA样本2而且6，使用含有热启动Taq聚合酶和SYBR绿色荧光团的Biodynamics mix B124-100进行了三次重复，并在Rotor GeneQ热循环器(Qiagen)中执行以下协议:95°C 10分钟，然后95°C 15秒，60°C 15秒，72°C 30秒，然后是融化曲线(60 - 95°C)。使用ΔΔCt方法计算基因表达UQB5作为内务管理。通过引物的效率进行校正。通过用1/10稀释的Col-0 T0 cDNA进行对照反应来确定效率。

GF和MEA是CONICET研究生涯的成员。

我们非常感谢Shauna Someville提供的帮助g . cichoracearumUCSC1, Claudia Nome (INTA, IFFIVE)为电子显微镜处理样品和Carlos Mas (ciquibicc - conicet)为共聚焦显微镜提供有价值的帮助。这项工作由国家机构Promoción Científica y Tecnológica(授予BID PICT 1542)和Secretaría de Ciencia y Tecnología -国立大学de Córdoba支持MEA。

从属关系

1. CIQUIBIC研究中心Química Biológica de Córdoba, UNC-CONICETDepartamento de Química Biológica, CIQUIBIC科学学院Químicas，国立大学Córdoba, Haya de la Torre and Medina Allende,Ciudad Universitaria, Córdoba, X5000HUA，阿根廷

   Georgina Fabro & María Elena Alvarez

相应的作者

对应到María埃琳娜·阿尔瓦雷斯．

作者的贡献

MEA设计并监督研究，GF进行实验。GF和MEA对结果进行分析并撰写稿件。所有作者均已阅读并批准稿件。

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