多半乳糖醛酸酶基因家族成员的时空表达揭示了单子叶油棕肉质果实成熟和脱落过程中的不同调控

背景

在肉质水果脱落和干果脱落期间发生的细胞分离有助于种子分散，植物生殖发育的最后阶段。虽然我们对细胞分离的进化背景的理解主要是销售模型系统番茄和拟南芥在美国，人们对作物，尤其是单子叶植物的果实脱落机制知之甚少。聚半乳糖醛酸酶(PG)多基因家族编码参与原代细胞壁和中层内果胶同半乳糖醛酸解聚的酶。PG活性普遍存在于器官剥离和分裂的分离层中，但单子叶和双子叶分离后该基因家族如何分化以及这种分化在剥离过程中的后果尚不清楚。

结果

本研究的目的是鉴定在热带单子叶油棕脱落过程中脱落带(AZ)中高活性的PG基因，并分析油棕果实成熟和脱落过程中PG基因的表达。我们鉴定了14个编码PGs的转录本，它们都在油棕果的底部表达。在乙烯诱导细胞分离的过程中，5个PG转录本的积累增加，4个减少，5个不改变。一份PG转录本(EgPG4)在果基中诱导程度最高，乙烯处理增加700 ~ 5000倍。原位杂交实验表明EgPG4在细胞分离之前，乙烯对果实基部的AZ细胞层的反应，转录本优先增加。

结论

的表达模式EgPG4与油棕果脱落过程中细胞分离的时间和空间要求一致。PGs在油棕果实组织中的序列多样性及其表达的复杂性与番茄的差异表明，这两种果实在成熟和脱落过程中发生了功能上的差异。此外，EgPG4与其他物种的PGs的系统发育分析表明，单子叶植物和双子叶植物之间存在一定的保守性，但也发生了多样化，特别是在干果和肉果物种之间。

植物器官的脱落是一个高度协调的发展受监管事件，可以在整个植物生命周期的不同背景下发生[1- - - - - -4］．器官脱落对植物的营养和生殖发育都很重要，包括叶、枝、花、花部分、种子和未成熟流产或成熟果实的脱落。特别是，在肉质果实脱落和干果开裂过程中发生的细胞分离有利于种子扩散，这是生殖发育的最后阶段，因此控制着许多作物的重要性状。对于要脱落的果实，细胞分离必须发生在一个精确的时间位置，以在最有利的条件下优化分散。对于作物品种来说，如果果实脱落得太早或太晚，经济后果可能很严重。然而，我们对这一现象的进化背景的理解主要局限于模型系统，如西红柿和拟南芥，较少是关于非典型作物物种的果实脱落的机制，特别是单焦种类。

油棕榈是槟榔科的一种热带多年生单子叶植物，具有极其富含油脂的肉质中果皮，是世界上食用植物油的头号来源。此外，棕榈油作为生物燃料的潜在用途预计将限制全球可食用棕榈油的供应，并增加提高产量和扩大耕地面积的压力。虽然传统的育种方案可以使棕榈油产量每年增加1%，但未同步成熟和成熟果实在收获前脱落限制了产量增加[5.，6.］．此外，由于水果脱落不同步，很难安排定期收获，导致劳动密集型物流，增加了整体生产成本。此外，油棕果实脱落的几个原始特征值得进一步深入研究。特别是,包括小学和相邻两个过程离层区(az),加上非凡的低甲基化果胶和高水平的聚半乳糖醛酸酶(PG)活动,共同表明,发散机制可能构成细胞分离过程导致果实脱落在这单子叶植物的物种7.- - - - - -9.］．最后，观察到这种棕榈物种的唯一器官是成熟的水果。来自许多物种的鲜花和未成影的果实自然被器官脱落，以应对营养状况，以优化的生殖成功，而这种现象在油棕中无论如何都没有观察到。实际上，油棕在一堆上保持所有果实，直到发生成熟相关的信号传导以诱导成熟的果实脱落。

虽然植物器官脱落的例子多种多样，但提出的共同模型主要是基于对真双子叶植物的研究[2，3.］．首先，脱落带的发育发生在待脱落器官的基部。其次，随着AZ的发展，它必须能够胜任器官脱落所需的细胞分离事件。事实上，一旦AZ发展起来，它对诱导细胞分离的信号的反应就不同于邻近组织[10.］．当AZ具备分离被诱导的能力后，细胞活性，特别是高尔基囊泡的扩张和内膜系统的激活，以及向质外体释放的水解酶，导致中层板层的降解和细胞的分离[11.，12.］．该模型的一个重要特征是诱导编码细胞壁水解酶的基因靶向修饰和降解细胞壁组分，从而发生分离。这些基因的表达通常是由乙烯诱导和生长素抑制的，这些特征分别与这些激素在脱落过程中的积极和消极作用相关[1- - - - - -3.］．尽管允许相邻细胞黏附变化以如此精确的时间和空间发生的机制具有核心重要性，我们对这些事件的理解即使在模式生物中也是有限的。

PG基因的表达和活性是器官脱落的共同特征Sambucus nigra.[13.- - - - - -16.］．PG活性解聚果胶的同半乳糖醛酸主干，而在不同物种的PG转录本和活性在脱落过程中增加，它们也可以被乙烯诱导或被生长素抑制[14.，15.，17.- - - - - -22.］．在番茄中，有一个PG转录本(pTOM6,也被称为TFPG)，而多达四种其他PGs (TAPG1，TAPG2，TAPG4和TAPG5）用脱落相关的花/水果Pedicel Az表达[20.，21.，23.- - - - - -27.］．有趣的是，下调或淘汰TFPG结果减少了果胶解聚，但令人惊讶的是水果软化没有变化，这表明其他成分也参与了[25.，27.- - - - - -29.］．此外，果实的下调TFPG对叶片脱落的时间或速率没有影响，表明该酶在果实成熟过程中的特定功能，而不是器官脱落[22.］．相反，沉默的脱落TAPG1表达延迟脱落并增加AZ的断裂强度[30.］．总的来说，这些实验表明，虽然PGS在成熟和脱落过程中对过程很重要，但相同的基因可能不负责任，并且脱落有其他因素。实际上，高达69和59 pg基因拟南芥和水稻，许多具有重叠表达域[31.，32.］．至少有四个拟南芥基因具有在花器官脱落期间与细胞壁松动和细胞壁溶解事件相关的表达曲线[32.］．此外，ADPG1，ADPG2和QRT2已被证明在不同的细胞分离过程中具有重叠功能。ADPG1和ADPG2是角钢开裂所必需的，而ADPG2和QRT2这表明，在这些不同过程的细胞分离过程中，PG活性的精确组合可能是必要的[33.］．

先前的研究表明，在果实脱落的细胞分离事件中，水果碱中的油棕榈αz中的PG活性大幅增加[7.］．我们本研究的主要目的是鉴定可能对在果实脱落期间观察到这种活动的PG基因。我们已经对14个基因进行了详细的表达分析，其在油棕榈果底部编码PG。PG序列在水果组织中的多样性及其表达在果实成熟过程中的表达谱和在番茄中观察到的脱盐症造影期间，表明这种单圈果实物种中这些方法的一些功能性偏差。EGPG4的系统发育分析与来自各种物种的已知功能和/或表达谱的PGS的结果也将有关销售和单子叶片之间可能发生的分歧，特别是肉质和干果物种之间可能发生的偏差。

乙烯诱导油棕果实脱落试验系统

之前发表的关于油棕果脱落的研究是用空运的材料从马来西亚的种植园运输到英国的一个实验室，在那里进行实验[7.- - - - - -9.］．为了确定精确的时间事件发生在离层,我们的第一个目标是建立一个实验系统,该系统可用于本地字段设置消除问题,可能出现由于所需的时间和条件下贮存和长途运输的水果。根据早期对油棕的研究结果，乙烯被认为是诱导油棕果实初级AZ细胞分离的主要信号[9.］．因此，为了同步脱落果实，我们将小穗外植体用乙烯处理在密封盒中(详情见材料和方法;数字1A).第一个实验研究了乙烯剂量对成熟果实(授粉后150天，DAP)处理12 h初生AZ细胞分离的诱导作用(图1B). 0.1 μl l处理的小穗果实脱落数增加了13%^－1乙烯，而在10 μl l^－1， 100%的果实在初级AZ中进行了细胞分离^－1作为我们研究的有效浓度，如以前使用的[9.］．此外，实验还确认了在预定的主AZ内首先发生分离的两阶段分离过程（未示出），然后通过相邻AZ中的分离事件进行分离[8.，9.］．浓度为10 μl l^－1用于进一步的实验中，以比较不同阶段的果实分离（图1C).对30、120和180 DAP的果实小穗进行处理，处理后每隔24 h定量测定脱落量。30 DAP果实仅在处理24 h后脱落，120 DAP果实和180 DAP果实分别在处理12 h和9 h后开始脱落。在空气对照中，只有180个DAP果实在12 h(1%)和24 h(100%)脱落。这些实验确定了油棕果脱落必须发生细胞分离的时间框架，并提出了影响乙烯反应的发育因素的重要性。

多半乳糖醛酸酶基因家族在油棕果组织中的表达及在脱落前AZ中诱导的EgPG4转录本的鉴定

据报道，在脱落果期间，阿斯兰多半乳糖醛酸酶(PG)活性增加了35倍[7.］．此外，PGS涉及许多物种中的细胞分离。在这种情况下，我们的下一个目的是鉴定负责在AZ细胞分离事件中观察到这种大PG活性的PG候选基因。简而言之，我们的方法涉及与已知PG的可用数据库的搜索，包括局部衍生的454焦磷酸转录组数据，然后设计针对鉴定为测试的每种序列的特定引物，以及衍生的CDNA的混合物扩增从用乙烯处理或未用乙烯处理的水果组织，或从基因组DNA（有关细节的材料和方法）。总体而言，我们的搜索导致鉴定35推定的非冗余PG序列，其中28例含有部分或完全糖苷水解酶系列28（GH28）PG签名结构域，并保留进一步研究（参见附加文件1核苷酸序列)。RT-PCR分析结果显示，油棕果AZ中有14个非冗余PG转录本表达，并详细分析了乙烯诱导脱落过程中它们在果实组织中的表达情况。这14份文本是EgPG1，EgPG3，EgPG4，EgPG7，EgPG8，EgPG9，EgPG10，EgPG11，EgPG16，EgPG17，EgPG18，EgPG19，EgPG22和EgPG26．

为了分析表达，用来自上述乙烯实验的组织样品进行QPCR分析（图1C）。结果证实了RT-PCR分析，即14引物对中的每一个从油棕水果AZ中成功扩增了PG序列，而且从乙烯处理之前和之后的相邻的PECICEL或Mesocarp组织（图2一个n)。AZ内转录本丰度积累的分布可以分为以下三大类:I) 5种转录本显著增加(2倍以上;数字2A-E），II）四个转录物显着降低（超过0.5倍;图2F-I)和，III)五种转录本在乙烯处理期间在AZ中的丰度没有显著变化(图3)2分别J-N)。到目前为止，在AZ中检测到数量最多、丰度增加最剧烈的PG转录本是EgPG4（数字2B)。EgPG4乙烯处理3、6、9和12 h后，AZ的转录量分别增加约700、2000、4000和5000倍。相比之下,EgPG4乙烯处理3、6、9和12 h后，中果皮中表达量分别增加了10、5、36和13倍(图2B)。最后,EgPG4在乙烯处理前，花梗组织中可以微弱检测到，在乙烯处理期间，与在AZ中观察到的相比，增加的幅度较小。

PG基因表达概述表明，三个相邻的果实组织对乙烯处理的反应不同(图)3.和图1和额外的文件2）.在低于180个Dap水果的顶点的Mesocarp中，EgPG4在乙烯处理前，PG转录本占总转录本的95%，乙烯处理6 h后，转录本占总转录本的99%(图)3.）.相比之下，在乙烯处理前的水果中，EgPG11是最丰富的（43％），然后是EgPG10（15％）和EgPG8（10％）和EgPG18(10%),而EgPG4，仅占检测到的全部PG转录本的4%。相比之下,EgPG4乙烯处理6 h后，AZ中PG转录产物的含量占99%。花梗,EgPG10（62％）和EgPG11(19%)是6 h乙烯处理后最丰富的PG转录本，而EgPG4在未处理和乙烯处理的果实中，转录本仅占总转录本的7%和4%。我们的发现表明EgPG4，是检测到的最丰富的PG转录本，在三个邻近的果实组织中受到时空差异的调控。的确,EgPG4在中果皮中检测到的大部分PG转录本中，更值得注意的是，乙烯处理9小时后分离开始前，在AZ中优先大量增加(图)1C）。

在乙烯实验中，我们观察到30和120个DAP果实在没有乙烯处理的情况下不能分离(在空气中有乙烯吸收材料的对照处理)，而在有乙烯的情况下分别在12和24 h后首次分离。乙烯处理24 h后，果棚的大部分果皮均已脱落(图2)1C).相比之下，在乙烯吸收材料存在的情况下，空气处理180个DAP果实(对照处理)在12 h后开始细胞分离，24 h后完全分离(图)1C).确定是否EgPG4转录本积累与这些观察结果一致，我们检测了表达EgPG4在30、120和180 DAP果实中，乙烯存在或不存在(图)4a - c和图1C).结果揭示了一个密切相关的积累EgPG4结果表明:30、120、180果果的mRNA表达随脱落时间的变化而变化。的确,EgPG4在未处理的30和120个Dap水果中具有非常低的相对表达与180个DAP相比，并在3小时后进行乙烯处理后，在180个DAP果实中增加2,400倍，而30倍和17倍，在30和120倍下折叠17倍分别（图4a - c)。6小时后,EgPG4乙烯处理9 h后，在30、120和180果中转录量分别增加了0.70、260和6,803倍EgPG4在30、120和180果中转录量分别增加了143、350和14200倍。

原位乙烯诱导果岭期间EGPG4的空间和时间表达分析

而qPCR分析EgPG4记录积累与时间相关的细胞分离的事件发生在底部的油棕果实,AZ样品,用于表达分析包括所有三个组织的混合物包括阿兹和相邻边缘的花梗和中果皮组织(图5.）.来检验在时间和空间上的表达是否EgPG4与导致脱落的细胞分离事件相关，原位进行杂交分析。首先，我们使用了明亮场，偏振光和离荧光显微镜的组合，以清楚地区分地区EgPG4与相邻的中果皮和花梗组织相比(图5.j)。在偏振光下，除了木质化的血管系统外，所有组织中的AZ细胞层都很清晰(图)5.eg)。相比之下，表面荧光显微镜主要检测木质化的脉管系统，主要在花梗和中果皮(图)5.H-J)。在成熟果实的基部进行乙烯处理前EgPG4在AZ、中果皮下缘和花梗组织上缘均未检测到转录本(图)5.A、E、H)。乙烯处理6 h后EgPG4转录物优先在AZ细胞层中优先增加，包括副血细胞和血管束的未分化的木质细胞（图5.b，f，i）。相比之下，没有EgPG4转录产物在邻近的花梗和中果皮组织中被检测到或仅以相对较低的数量存在。在花梗和AZ之间的边界区域的较高放大倍数，EgPG4转录产物在AZ细胞中明显积累，而在邻近的花梗细胞中转录产物的含量很低或无法检测(图)5.C、G J)。与此相反，核糖体RNA (rRNA)义子和反义探针的对照杂交显示，rRNA在花梗、AZ和中果皮组织中的分布更为均匀EgPG4（数字5.B和D;附加文件3.）.此外，感觉链控制EgPG4也具有比反义更不强烈的信号（附加文件3.）.作为对比,原位还进行杂交实验EgPG10和EgPG8其中，qPCR分析显示，乙烯处理过程中，前者在三种组织中均增加到相似的数量，而后者减少(图)2e和f）。为了EgPG10，结果表明乙烯处理后三种组织中存在的转录物的均匀分布，同时EgPG8未检测到(数据未显示)。总之，这些结果证实了空间和时间表达剖面之间的相关性EgPG4结果表明，该转录本在果实脱落过程中具有重要作用。

EGPG4与具有已知功能或表达型谱的PGS相关的系统发育分析

为了研究EgPG4与其他植物PGs的关系，本文对其氨基酸序列与从DNA/RNA序列预测的系统发育进行了比较拟南芥和米饭进行。首先，PG疏水板内的EGPG4组与来自两种水稻的成员形成拟南芥之前定义的(32.)(附加文件4）.值得注意的是，EgPG4并不与来自拟南芥在花器官脱落期间，在花式器官脱落期间的思工A15中，在包括AT2G41850（PGAZAT / ADPG2），AT3G07970（Quartet2）和AT3G57510（PGDZAT / ADPG1）中，包括AT2G41850（PGAZAT / ADPG2）的功能31.- - - - - -33.］．然而，EgPG4与另外两个分枝属于A3分枝拟南芥在花器官脱落期间表达的PGS（AT2G43880和AT2G43890）[32.］．

来检查可能的结构-功能关系EgPG4氨基酸序列与已知的各种品种的PGs，包括生产肉质水果(苹果、李子、桃子、番茄、猕猴桃、葡萄、木瓜)和干果(大豆、B. Napus.，拟南芥），用选定的植物PGS进行系统发育分析，其表达与萌发，根部或花粉发育，果实成熟，器官脱落和花药和荚裂解的表达相关或显示在发挥作用。19.- - - - - -21.，23.，25.- - - - - -27.，31.，33.- - - - - -55］．首先，重建的树和bootstrap值证实了之前的分析，PGs可以分为三个主要的亚枝，两个亚枝包括参与果实成熟和脱落的PGs和参与花粉发育的PGs [18.，19.] （数字6.）.包含大豆(GmPG6_DQ382356)和葡萄(VvPG2_EU078975) PGs的第四个分支的存在支持了最近的研究，这些研究表明该基因家族包含三个以上的亚分支[36.，56］．此外，bootstrap分析证实EgPG4与两者之间存在密切的系统发育关系拟南芥PGS在花器官脱落期间表达[32.］．值得注意的是，在同一亚枝中还存在4个与脱落相关的番茄PGs (TAPG1、TAPG2、TAPG4和TAPG5) [20.，21.，38[除了在甜瓜（CMPG1和CMPG2）的成熟和脱落期间表达的两种PGS [19.]，以及木瓜成熟过程中表达的PGs (CpPG) [37.]，梨[53，54]和桃子(PpPRF5) [42］．一个额外的拟南芥PG (At2g43860)，在胚根萌发时胚乳细胞之间的细胞分离中起作用[31.在这个亚枝中也发现了。分析还表明拟南芥参与脱落或开裂的PGs包括PGDZAT、PGAZAT和QTR2，与其他在果实成熟、花器官脱落和荚开裂过程中起作用的PGs一起归为一个截然不同的亚分支[31.，33.，35.］．值得注意的是，在该思工中发现了没有参与肉质果实的脱落的PG，只有来自诸如的干果种类的物种拟南芥，B. Napus.和大豆。

EgPG4的序列和表达分析表明，单子叶和双子叶之间存在功能保守和分化

PGs被认为在细胞分离和细胞伸长过程中，在中层或初级细胞壁果胶的分解中起着核心作用[18.］．特别地，PGS在果实成熟，器官脱落和花粉发育过程中被广泛研究，但在物种之间发生了差异，以满足这些各种组织中的不同作用仍然没有完全理解。特别是，从单码器种类获得非常少的数据，以将成熟和脱落过程与申销者进行比较。

我们的系统发育和bootstrap分析证实了之前的一些系统发育研究，这些研究表明，参与器官脱落和果实成熟的PGs主要存在于两个不同的亚枝，而第三个亚枝只包含与花粉相关的PGs [18.，19.，31.，32.］．还观察到含有从成熟葡萄皮肤的第四个次要亚亚的亚亚，如前所述[36.］．虽然目前的系统发育分析是用完整的GH28结构域进行的，不包括一些PGs的序列特征，但结果支持了之前的结论，即序列的存在或缺乏并不是这些序列分化为不同分支的基础[18.］．第一个值得注意的观察是，所有已知的番茄脱落PGs组紧密地在一个亚枝内，也包含两个密切相关的拟南芥花器官脱落相关的pgs（AT2G43890和AT2G43880），除了一个拟南芥PG（AT2G43860）涉及胚胎出现[31.，32.］．At2g43860是在胚乳细胞分离时表达的一种PG，它的存在表明PG除了果实成熟和器官脱落外，还具有其他功能。有趣的是，EgPG4组与这些最接近拟南芥这些序列来源于在单子叶和双子叶分离之前存在的一个共同祖先的PG。第二个值得注意的观察是，番茄果实PG (TFPG)与参与器官脱落和干果开裂的PG更密切相关，而不是与参与器官脱落的番茄PG相关。这与来自与番茄脱落PGs属于同一亚分支的甜瓜的序列形成了对比，它们的表达谱与果实成熟和脱落都相关[19.］．同样，EgPG4转录物不仅与脱落有关的AZ增加，而且在成熟的Mesocarp的一部分中也高度表达。在一起，似乎一些PGS可以在成熟的水果组织中起作用，除了在AZ中的细胞分离期间导致单焦和拒仅在单子叶和申逊中的水果器官脱落中。

EgPG4基因的序列和表达表明干果和肉质果在功能上存在差异

另一个值得注意的观察是，在包含特征明确的脱落和/或开裂相关的PGs(包括QRT2, PGAZAT, PGDZAT, BnRDPG1和PGAZBRAN)的分支中没有发现与肉质果实脱落相关的PGs [33.，34.］．相比之下，在该分支内还发现了诸如番茄（TFPG），葡萄（VVPG1），苹果（MDPG1），KIWI（CKPGA3）和梨（PCPG1）中的PGS也参与肉质果实成熟（如番茄（TFPG），葡萄（VVPG1），苹果（MDPG1）和梨（PCPG1）23.，25.- - - - - -27.，36.，43，44，48，50，51］．另外，仅在与干果脱落和脱落PG的同一亚亚的同一亚亚亚的同一亚亚亚亚亚的甜瓜pg（cmpg3）中仅发现与枯萎有关的表达谱系，而与器官脱落和成熟相关的其他两个甜瓜pgs（cmpg1和cmpg2）在与EGPG4相同的四分之一19.］．虽然目前还没有数据表明该亚分支内的肉质果实PGs参与了果实或其他器官的脱落，但可能在器官脱落过程中它们参与细胞分离的研究还不够充分。事实上，这里讨论的分析和结果是基于两个最具特征的器官脱落模型系统，即番茄和拟南芥需要强调的是，目前对植物PGs功能多样性的认识还存在许多空白。然而，研究结果表明，干果物种可能至少有两个不同亚枝的PGs参与细胞分裂，而肉质水果可能有专门用于成熟或脱落的PGs，或者可能在两种情况下都起作用。总的来说，研究结果表明参与干果开裂和肉质果脱落的PGs之间可能发生了分歧，值得进一步研究。

EgPG4在乙烯诱导下的高表达表明EgPG4在果实成熟和脱落过程中发挥作用

这项研究最显著的结果是高积累EgPG4在细胞分离之前，含有AZ的果实的底部的转录本。重要的是,EgPG4转录本在细胞分离发生前积累，也积累较少，并与果实早期发育阶段分离较慢的时间相关。然而,EgPG4转录物在果实附近的Mesocarp组织中也高度表达，该组织附近表达在该组织的成熟中的作用。我们的数据也表明该规定EgPG4与细胞对乙烯的反应能力密切相关。这反过来又与成熟的发育阶段有关，可能是一个重要的因素，控制的空间和时间功能EgPG4事实上，在果实成熟过程中，中果皮产生的乙烯数量越来越多，乙烯的产生从果尖一直到果基，这可能是开启中果皮内乙烯分离事件的信号[9.，57］．对番茄果实成熟和花梗脱落的研究提供了实例，说明该基因家族的个体成员如何在肉质果实中进行细胞分离过程的邻近组织中具有不同的功能。并强调了在这些发育过程中PGs的组织特异性转录调控的中心重要性。的确，西红柿水果TFPG是成熟果实组织中唯一表达PG基因，其转录由乙烯正调控，编码蛋白负责PG活性，在成熟过程中发生果胶解聚[23.- - - - - -27.］．值得注意的是,TFPG在番茄果实成熟过程中，mRNA占总RNA的比例高达2.3%TFPG对叶片脱落的时间或速率没有影响，表明该酶在果实成熟过程中的特定功能，而不是器官脱落[22.，58］．相比之下，在AZ位于番茄花器官的底部的花梗中，存在至少四种脱落相关的PG基因（TAPG1，TAPG2，TAPG4和TAPG5）表达，其中三种由乙烯诱导并与花和叶AZ中发生的细胞分离吻合良好[20.，21.，38］．此外，在番茄脱落相关的PGs沉默使用TAPG1乙烯处理后叶柄AZs的断片、脱落延迟和断裂强度增加。这些研究表明，在果实成熟和器官脱落过程中，组织特异性转录调控和/或细胞对乙烯反应的局部差异是决定其功能作用的时空特异性的重要因素。

油棕果实脱落与番茄有一些相似之处，但也有显著的不同。首先，在油棕中乙烯诱导的分离时间与番茄相当。在乙烯存在的情况下，细胞在9h开始分离，而80-100%的成熟果实在12h脱落，而番茄在6h开始脱落，12h完全脱落[59］．这一结果克服了施主油棕榈的表面积，高达10毫米（图3.)，直径约为番茄花梗AZ的20倍，可达0.55 mm [59］．第二，我们观察到更多的多样性动力在成熟或脱落过程中，油棕果实组织中表达量高于番茄。值得注意的是，在含有AZ的果实的基部表达的14个转录本中，有5个转录本对乙烯的反应为正调控，另外4个转录本则为负调控。5种PG mrna在乙烯处理过程中丰度无显著变化。此前一项对香蕉果实的研究表明，在香蕉成熟过程中至少有4个PG基因表达[60］．然而，该研究中没有鉴定的PGS含有全长GH28结构域，因此我们无法与图中呈现的油棕PGS和其他PG的系统发育关系进行比较6.．香蕉PG基因的表达也在手指落地过程中进行了分析，这一过程也涉及到果胶分解[60，61］．结果表明，四种香蕉PGs也在细胞分离发生的指滴区表达，而MaPG4是最高度表达的，累积的剖面与观察到的花梗断裂力的减少相关。与目前的结果一起，香蕉和油棕榈果实成熟期间果胶拆卸机制可能涉及比目表所检查的销售物种的较大的PG。目前的研究允许在单子叶果中与乙烯相关的pg表达，鉴于香蕉早期的研究包括较少和更短的pg序列[60，61］．此外，虽然这两者都是单码，香蕉是一个占疗法型果实果实，而占淀粉的大量淀粉，而油棕是一种具有高油含量的芽孢杆菌，也可以在这两个物种之间决定不同的成熟调节机制。除了以令人满面的逃避番茄模型外，未来的工作将需要新的分子资源，以便在这两个不同的单焦度下的果实成熟和脱落中的更完整的比较研究。

与番茄相比，油棕果实组织中PG表达的多样性和复杂性远远大于AZs或成熟过程中观察到的表达。在油棕榈，全部14EGPG.在成熟的中果皮组织中可以检测到不同程度的转录本TFPG在番茄果实成熟期间表达。值得注意的是，没有一个EgPGs经鉴定的mrna似乎是完全组织特异性的，正如观察到的参与脱落和成熟的番茄PGs。然而，在这里提出的数据表明，不同的组织和发育阶段依赖于乙烯的反应可能是重要的空间和时间控制。最值得注意的例子是EgPG4，它不仅是未经处理的成熟果实中果皮中丰富的PG转录本，而且在乙烯响应下，含有AZ的果实基部中丰富度的增加也最为剧烈。丰富的EgPG4在中果皮中大量增加对乙烯的反应与番茄PG的表达相似;然而,EgPG4在乙烯处理后的成熟中果皮和AZ中均有高表达。此外,我们原位杂交实验表明EgPG4与邻近的中果皮和花梗组织相比，果实基部的转录丰富度优先发生在AZ中。重要的是，延迟的和不太显著的增长EgPG4在未处理的果实的AZ中，以及在乙烯处理的30和120的DAP果实中也观察到转录本，这与在这些成熟阶段观察到的脱落延迟相对应。

总之，这些结果提供了证据EgPG4在中果皮成熟和脱落过程中，参与细胞壁果胶的修饰，这与细胞对乙烯反应的敏感性或能力的发育调节密切相关。未来的工作将致力于识别调控成熟和脱落相关表达的调控因子EgPG4为单子叶植物和双子叶植物，特别是肉质和干果植物的这些过程的比较提供了依据。最后，油棕果实脱落相关基因的鉴定也将有助于油棕改良选择策略的制定。

植物材料，乙烯处理和RNA提取

棕榈油(Elaeis Guineensis.水果是在甲米金色Tenera种植园收获的tenera克隆(C)产自泰国。在研究的每个发育阶段，从相同基因型的不同个体中收集独立的束。取每一簇中心的小穗，随机取6个小穗，单独放入50 l密封的体积盒中。授粉后150 d结果的小穗用不同浓度的乙烯(0、0.001、0.01、0.1、1、10 μl l)处理^－1）.在没有乙烯处理的情况下，乙烯吸收器(ETHYL-GONE，http://www.biosafer.com/ethyl-gone.php)被添加到盒子里。所有盒子均置于环境温度(约30℃)下保存，处理24 h后计算从小穗上分离的果实数。采用乙烯浓度(10 μl l .^－1以30、120和180 DAP的果实为对照，进行时间历程分析。乙烯处理或不处理小穗，每3 h收集处理或不处理的小穗，定量测定每个发育阶段的脱落量。在每个时间点，将包含初生和相邻AZs的果实的中果皮、花梗和基部立即分离并在液氮中冷冻。两项独立实验的样本在收获后立即采集。

从富含AZs的中果皮、果梗和果基中提取总RNA，无论是否经乙烯处理[62］．使用第一链cDNA合成试剂盒(impromi™Reverse Transcription System, Promega)，用总RNA (1 μg)合成cDNA。

油棕果实非冗余PG核苷酸序列的鉴定

为了鉴定油棕pg cDNA序列，使用了许多分子资源。首先，TBLASTN程序用于搜索包含的可用数据库Elaeis Guineensis.序列，包括NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、本地454焦磷酸测序衍生的油棕中果皮contigs [57]和从富含AZ (Jantasuriyarat)的组织中提取的contigs等等。，未发表)的序列与PGs高度相似拟南芥以及之前描述的大米[32.］．Arondel博士也好心地提供了额外的序列[63］．互补方法利用退化引物[34.以扩增不同发育阶段经乙烯处理或不经乙烯处理的AZ组织和油棕基因组DNA的cdna。利用油棕PEST643 (accession number N°AY291341)的引物对PG基因的最保守区域进行了设计，并用于从果实组织中扩增PG cdna。对于缺少3’区域的序列，进行RACE (Clontech)扩增，根据获得的序列设计序列特异性引物对，用于扩增油棕果实组织中的非冗余PGs。从这些互补方法中共鉴定出35个推定的非冗余PG序列，并进行了比较，以确定与植物PG序列的相似性，特别是部分或完全糖苷水解酶28 (GH28)结构域的存在，该结构域覆盖了每个PG编码序列的约75% [35.］．的加入号EgPG1和EgPG4是JX233615和JX233616，而其他PG序列来自以前的数据集[57，63］．

实时定量rt - pcr

在96个孔板中在96个孔板中的含量为10μl的1/100，1.5μl底漆（2μm），1.5μl反向引物（2μm）和1/100的CDNA的30μLcDNA的体积为QPCR在96个孔板中进行。5μlsybr®GreenMasterMix（Roche）。附加文件5.列出所使用的引物。PCR开始于95°C变性10 min，然后95°C变性15 s, 60°C变性15 s，最后在70°C延伸1 min, 45个循环。所有表达归一化EgEfα1（登录号：AY550990）mRNAElaeis Guineensis.，相对mRNA丰度的计算公式如前所述[64］．没有变化的EgEfα1在处理或未用乙烯处理的水果组织中发现转录物积累。还进行了使用RNA基质的控制以验证每个样品中的DNA的不存在。每次从2个独立的生物样品复制三次，并且所有扩增的cDNA片段通过Beckman-eCogers测序，以检查扩增产物的特异性。基因丰度表示为平均值，标准误差条根据其中一个生物重复的技术复制计算。

系统发育分析

在NCBI服务器提供的蛋白序列数据库中，使用默认参数的BLASTp程序进行相似性搜索，构建系统发育树。http://www.ncbi.nlm.nih.gov）.系统发育分析在系统发育平台(http://www.phylogeny.fr）[65］．GH28结构域的氨基酸序列与ClustalW (v2.0.3) [66］．对齐后，使用gblock (v0.91b)删除模糊区域(即包含间隙和/或对齐不良)。系统发育树使用邻居连接方法构建，该方法实现在Neighbor from The PHYLIP包(v3.66)中[67］．使用ProtDist计算距离。选择Jones-Taylor-Thornton替代模型进行分析[68］．通过从100复制计算的引导比例分析评估节点的稳健性[69］．用TreeDyn (v198.3)和Inkskape分别对系统发生树进行图形表示和编辑。

核糖核酸原位杂交

为了获得用于RNA探针合成的DNA模板，采用带有T7 RNA聚合酶结合位点的基因特异性反义引物进行PCR扩增。引物分别为EgPG4qS1-EgPG4qAS1T7和EgPGq4S1T7-EgPG4qAS1, EgRiboS-EgRiboAST7和egriboasEgPG4,EgRibo- 分别特异性探测器（附加文件6.）.将得到的DNA片段直接作为模板合成反义探针，并使用MAXIscript®T7 Kit (Ambion)加入utp -地高辛(Roche)作为标签。对每个扩增产物进行测序，以检测扩增产物的特异性．原位杂交实验如前所述[70经过一些修改。未处理果实和10 μl l .^－1一夜之间,乙烯6 h被固定在黑暗中在4°C固定缓冲区(4%多聚甲醛,0.1米磷酸缓冲pH值7)。16 h后,他们洗两次0.1磷酸缓冲2%甘氨酸,然后两次在0.1磷酸盐缓冲剂通过越来越系列的乙醇和丁醇脱水浓度。在丁醇中浸泡15天使组织软化后，将样品包埋在Paraplast plus (Paraplast X-Tra, Oxford Labware)中，并用切片机切片至12 μm。组织切片用Safesol (LaboNord, France)脱链，通过一系列降低浓度的乙醇复水，然后用蛋白酶K (100 U μl)预处理^－1用Tris-HCl (100 mM, pH 7.5)、EDTA (50 mM)在37℃下浸泡35分钟。用Tris-HCl (20 mM, pH 7.5, CaCl)洗涤两次，每次5分钟，停止消化₂（2mm）和mgcl₂（50毫米），磷酸盐缓冲盐水（0.1M PBS），甘氨酸0.2％甘氨酸2分钟，然后用0.1M PBS两次。在乙醇浴后，在100μl杂交溶液中，在45℃下在45℃下进行杂交过夜，在100μl杂交溶液中（50μl甲酰胺，10μL20xSSC，1μLDenhardt100x，20μl葡聚糖硫酸盐50％，100mg ml的1μltrna^－1）.杂交后，载片在2X SSC中25°C洗涤5分钟，在2X SSC中50°C洗涤45分钟，在1X NTE (Tris-HCl 10 mM, NaCl 0.5 M, EDTA 1 mM, pH 7.5)中25°C和37°C分别洗涤5分钟。RNase A酶切(20 μg ml^－1）在37℃下在37℃下进行30分钟，并通过在37℃下用1x NTE洗涤终止。在1×SSC中在55℃下每次在1×SSC中进行最终洗涤。使用载体蓝碱性磷酸酶底物套件III（载体实验室）进行检测。没有进行无需探针的控制，以有效地没有内源性碱性磷酸盐活性。将样品孵育在阻断试剂中[罗氏;在PBS中的10％（w / v）]在37℃下，在37℃下含有45分钟的含有在封闭试剂的1：500稀释的抗霉菌蛋白碱性磷酸酶 - 缀合的Fab片段抗体（Roche）。在0.1M PBS中进行三次洗涤10分钟后，在检测缓冲液（100mM Tris-HCl pH8.2）中平衡组织，然后在37℃下用蓝色载体进行几批3小时。最后，通过乙醇蒸气扩增检测20分钟，并使用MOWIOL安装样品在用MOWIOL的载玻片上，并使用40x / 0.75数值孔径用明场显微镜（Leica DM6000）观察。为了可视化脱落区，在偏振光下也观察到组织切片，并通过TXR过滤器观察到偏振片。用Retiga 2000R摄像头（Qimaging）拍摄照片。原位杂交和显微镜分析在“plate - formme d’histocytologie et Imagerie Cellulaire Végétale”(PHIV平台;http://phiv.cirad.fr/）.

答:

聚半乳糖醛酸酶

阿兹:

脱落区

GH28：

糖苷水解酶家庭28

衣冠楚楚的:

授粉后的天。

该项目还得到了PHC Thaïlande项目2007-2010(代码16589YK和16589YK)对TJT和ST的资助，以及PalmElit SAS/IRD/CIRAD对FM和TJT的资助。我们感谢Jerry Roberts对这个项目的有益讨论和建议。我们特别感谢Anek Limsrivilai和泰国GoldenTenera油棕种植园的工作人员在研究中使用了优秀的植物材料。我们也感谢Marc Lebrun在乙烯实验设置方面的出色技术支持。

从属关系

1. Institut de Recherche Pourledelopecement，Ird Center de Montpellier，IRD / Cirad Palm开发集团，Dide 911 Adropoplis BP 64501，Montpellier Cedex 5,34394，法国

   Peerapat Roongsattham，Maxime Pizot，Myriam Collin，James W Treagear和Timothy J Tranbarger

2. Center de Compulageration Internationale en Recherche Agronicique Pour LeDévelopementCirad，Umr Dide，Montpellier，F-34398，法国

   Fabienne Morcillo和Steven Moussu

3. 泰国查图加克Phahonyothin路50号Bangkhen校区ekasetsart大学科学系遗传学

   Chatchawan Jantasuriyarat

4. 诺丁汉大学萨顿伯宁顿校区生物科学学院植物科学，莱斯特郡，LE12 5RD，英国

   Dasuni Jayaweera＆Zinnia H Gonzalez-Carranza

5. PalmElit SAS, Montferrier-sur-Lez, F-34980，法国

   Philippe Amblard.

6. 国家基因工程和生物技术中心基因组研究所，BIOTEC, 113 Thailand Science Park, Phahonyothin Road, Klong 1, Klong Luang, Pathumthani, 12120, Thailand

   Somvong Tragoonrung

7. Coopération国际农业研究中心Développement CIRAD, UMR AGAP, MRI-PHIV，蒙彼利埃，F-34398，法国

   Jean-Luc Verdeil

相应的作者

对应到Timothy J Tranbarger.．

相互竞争的利益

没有竞争利益才能宣布。

作者的贡献

TJT和FM设计并参与了该研究的各个方面。TJT和St协调了学习的物流。TJT，FM，PR，CJ和MP进行乙烯实验和收集的RNA分离样品和原位杂交研究。PR提取总RNA，分离聚半乳糖醛酸酶cdna，进行克隆，设计基因特异性引物，进行初步RT-PCR表达研究。ZHGC参与了推测的聚半乳糖醛酸酶cdna的鉴定。MP和FM进行qPCR分析。ST和PA参与了数据分析，并对手稿进行了批判性阅读。SM和FM进行系统发育分析。JLV、SM、DJ、MC准备标本进行组织学分析原位杂交过程。TJT, JLV, FM, ZHGC, JWT和PR参与了文章的撰写。所有作者阅读并批准了最终提交的稿件。

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