生产工程长寿命和雄性不育gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba植物gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

天竺葵是世界上最受欢迎的园林植物之一。此外，它在观赏植物市场上具有相当大的经济意义。传统的杂交育种策略产生了一系列具有优良性状的品种。然而，基因转移通过gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba是否可以通过引入新的基因/性状来进一步改善天竺葵gydF4y2Ba。gydF4y2Ba我们报告了一种简单可靠的遗传转化方案gydF4y2Ba天竺葵属植物。gydF4y2Ba并生产工程长寿命和不育雄性gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba植物，使用gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba和gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba嵌合基因。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

的gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba与对照植株相比，转基因植株表现出叶片衰老延迟、分枝增加和节间长度缩短的现象。叶子和花的gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物缩小了尺寸，呈现出更强烈的颜色。在携带gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba改良的花药结构中未发现花粉粒，而不是正常的花药。不育花药的小室在花前3-4天塌陷，在大多数情况下，未发育的花药组织发生坏死。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

嵌合结构gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba都是有用的gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba延缓衰老过程和改变植物结构。此外，利用工程雄性不育植物，通过防止转基因观赏植物和相关植物物种之间的基因流动，将特别有助于生产具有新性状的环境友好型转基因植物。从商业角度来看，天竺葵生产者和消费者都可能对这些特性感兴趣。gydF4y2Ba

天竺葵属(天竺葵科)有200多种，是世界上最受欢迎的园林植物之一，在观赏植物市场上具有相当大的经济意义。两组无性繁殖的垫层植物gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba(syn。gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2BaxgydF4y2BahortorumgydF4y2Ba),gydF4y2Ba天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba杂交植物是栽培最多的盆栽植物。此外，天竺葵在香水工业中也很重要，因为它们的香味而被栽培和蒸馏。gydF4y2Ba

天竺葵属植物。gydF4y2Ba在温带气候下一年生生长。叶通常互生，掌状浅裂或羽状，通常在长柄上，有时有浅色或深色的图案。直立的茎在伞形簇(假伞形花序)中生出五瓣左右对称的花。这些植物已经培育出各种各样的花朵形状，从星形到漏斗形，以及颜色，如白色，粉红色，红色，橙红色，紫红色或深紫色。天竺葵育种程序已产生新的花色和形状，开花早，连续，良好的采后和市场品质和抗病虫害。gydF4y2Ba

基因转移的手段gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba使新的基因从不相关的物种引入，将是一个有用的工具，在天竺葵育种的进一步进展。应用基因转化的第一步是gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba是要发展高效gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba目标植物的再生系统。此外，开发从经农艺性能测试的基因型成体植株中繁殖外植体的方法也是有益的。gydF4y2Ba

无性繁殖的天竺葵是高度杂合的，导致变异的后代[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。为gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba，以及……gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba关于混血儿，已经发表了一些报告gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba从成年植株的外植体中再生，使用器官发生[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]或体细胞胚胎发生[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba一些作者利用不同的标记基因和报告基因报道了不同天竺葵基因型的介导转化[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]，但没有关于使用的报告gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba（gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba)基因gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba可选择的标记已经发布。GgydF4y2Ba《外交政策》gydF4y2Ba转化细胞中的表达应该有助于在早期阶段识别转化事件，因此可能不需要选择标记基因(抗生素或除草剂抗性)。gydF4y2Ba

细胞分裂素涉及植物发育的几个方面，包括植物衰老[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]，被认为主要在根中合成，并通过木质部运输到芽中。植物组织中内源性细胞分裂素的浓度随着衰老的进展而下降。向日葵木质部汁液的细胞分裂素含量(gydF4y2Ba向日葵gydF4y2Ba)及大豆(gydF4y2Ba大豆gydF4y2Ba)也随着衰老的开始而迅速减少，这表明细胞分裂素从根到芽的运输减少使衰老得以进行[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。此外，外源应用细胞分裂素已被用于商业上，以延长新鲜收获的蔬菜和切花的保质期[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

转基因编码细胞分裂素的生物合成最初是在gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba的组成或诱导的过度表达gydF4y2Baisopentenyl磷酸转移酶gydF4y2Ba（gydF4y2BaiptgydF4y2Ba)基因gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba。这种酶催化限速步骤gydF4y2Ba新创gydF4y2Ba植物细胞分裂素的生物合成[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。异戊烯基AMP是所有其他细胞分裂素的前体，其中三种最常检测到的生理活性形式是异戊烯基腺嘌呤(IPA)，玉米蛋白(Z)和二氢玉米蛋白(DHZ) [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。过度表达gydF4y2BaiptgydF4y2Ba基因在转基因植物中导致叶片细胞分裂素浓度升高，延缓叶片衰老，但高水平的细胞分裂素已被报道对生长和生育力有害[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。为了避免这些影响，Gan和Amasino [gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]设计了一种策略，基于自动调节细胞分裂素的产生，在不改变其他植物表型的情况下延缓转基因烟草的叶片衰老。该策略利用了衰老特异性基因启动子(gydF4y2BapSAG12gydF4y2Ba) from angydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba，融合到gydF4y2BaiptgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba咯gydF4y2Ba的Ti质粒的基因gydF4y2Ba农gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。的gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba据报道，嵌合基因仅在烟草较低成熟叶开始衰老时被激活。这种方法使细胞分裂素的合成限制在叶片内，抑制了叶片的衰老，防止了细胞分裂素的过量产生。延缓叶片衰老的能力对作物改良具有潜力。的影响gydF4y2BapSAG12gydF4y2Ba：:gydF4y2BaiptgydF4y2Ba已在几种茄类作物中对转基因植物中的表达进行了评估[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)和米饭(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2Ba) [gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]、花椰菜(gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba) [gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]和生菜(gydF4y2Ba摘要以gydF4y2Bal .简历。Evola) [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。在像天竺葵这样的盆栽观赏植物中，延缓衰老过程对消费者和生产者都有好处。gydF4y2Ba

观赏植物雄性不育工程在杂交制种、消除花粉过敏原、减少死抽穗延长花期、将资源从种子转向营养生长和延长花的寿命等方面具有广泛的应用前景。利用这项技术培育具有新性状的环境友好型转基因观赏植物尤其有用，因为这种改良可防止基因改良植物与相关物种之间的基因流动[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。的表达式gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba受花药特异基因控制的基因gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]可以用来有效地创造现有天竺葵品种的雄性不育版本，而不会对各自的表型产生不利影响。的gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子在许多植物花药结构相关组织中具有特异性表达。gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba是豌豆花药特异性基因，在花药原基细胞中很早就表现出来。后来,gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba表达局限于表皮、结缔组织、内膜和中间层，但在花药花丝、绒毡层细胞或小孢子细胞中从未观察到。该基因的表达模式一直持续到花期。此外，的表达gydF4y2BabarstargydF4y2Ba是一种核糖核酸酶藤壶酶的抑制剂，已被用于恢复藤壶酶诱导的不育植物的肥力[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba并防止异位可能产生的影响gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba在工程雌雄不育植物中的表达[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

这项工作的主要目的是开发一种简单可靠的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba-介导的基因转化方案gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba和gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba使用gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba基因是gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba标记，用来测试效果gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba表达对叶片衰老和植株形态的影响，并通过消融花药发育和花粉生长所必需的组织来改造这种观赏作物的雄性不育性gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba荒唐的基因。本文还讨论了转基因编码的自调节细胞分裂素生物合成在这种观赏植物中的潜在商业应用(延长货架期，减少植株结构)以及雄性不育系的生产，以防止转基因植物和相关物种之间的不良基因流动。gydF4y2Ba

植物材料和组织培养gydF4y2Ba

天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba简历。Aranjuez(图gydF4y2Ba1gydF4y2Baa - b)和gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba(syn。gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2BaxgydF4y2BahortorumgydF4y2Ba)的简历。370(图gydF4y2Ba1gydF4y2Bac - d)gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba以繁殖植株为外植体来源。幼叶外植体(从顶端开始的第1到第5片叶)是从30-40天龄的无性系植株中获得的。通过对温室栽培植物腋芽2 cm的茎段进行表面灭菌，建立了无性系植株。首先用水彻底清洗这些结屑，然后在2.5%次氯酸钠和0.1% 7X-O-matic洗涤剂(Flow Laboratories)的溶液中浸泡20分钟，并用无菌蒸馏水冲洗三次，对其进行表面消毒。节理扦插灭菌后，在由Murashige和Skoog (MS)基础培养基组成的生根培养基(RM)上培养[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]， 20毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}蔗糖，1毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}硫胺素-盐酸，100毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}肌醇，8 g / lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}琼脂和0.1 mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}IAA。从芽节中获得的无性系植株每两个月在580 ml的培养皿中繁殖，培养皿中添加60 ml的RM，并保持为gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba股票的植物。所有培养物在25℃、60 μmol m荧光光周期下培养16 hgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba年代gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}强度)。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2Ba采用MS基液和沙欣(Shahin)组成的形态发生诱导培养基(MIM)进行植株再生。gydF4y2Ba46gydF4y2Ba每天补充30克维生素gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}蔗糖，100毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}肌醇，8 g / lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}琼脂，IAA (0.01 mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})， TDZ (0.5 mg / lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})和1毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}Cu-sulphate。高压灭菌前将pH调至5.7。将无性系叶片叶柄近端切成1cmgydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在MIM上培养，使背面与培养基接触。再生gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba是通过直接器官发生和gydF4y2Ba天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba通过体细胞胚胎发生。gydF4y2Ba

农gydF4y2Ba菌株和嵌合基因构建gydF4y2Ba

农杆菌属gydF4y2Ba所有转化实验均采用菌株LBA4404。LBA4404细胞被电穿孔以携带不同的质粒:i) pBIN19二进制载体，从右到左边界，包含gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba在标记基因的控制下gydF4y2Ba号gydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba终结者和gydF4y2Bagfp-S65TgydF4y2Ba(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba报告基因在2X的控制下gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba本构启动子和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba《终结者》;ii)从pBI101衍生的质粒，从右到左边界为gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba在标记基因的控制下gydF4y2Ba号gydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba终结者和gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba在基因的控制下gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba《终结者》(pBI101 -gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba：:gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba构造)[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]， iii)一个质粒(pVDH393)携带gydF4y2BaiptgydF4y2Ba基因在控制下诱导衰老gydF4y2BapSAG12gydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba终结者，报告基因gydF4y2BauidAgydF4y2Ba(gus内含子)在gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba《终结者》gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba在标记基因的控制下gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba《终结者》(pVDH393 -gydF4y2BapSAG12gydF4y2Ba：:gydF4y2BaiptgydF4y2Ba构造;由Van der Have, ND公司提供)。细菌在添加40 mg l的LB固体板上28°C培养gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}利福平和100mggydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}卡那霉素。用单个菌落接种25 ml LB液体培养基，接种相同的抗生素。在28°C, 200 rpm的温度下保持24 h，然后接种添加20 g l的MS液体培养基gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}蔗糖，100毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}肌醇，1毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}硫胺素-盐酸，100毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}2 - (gydF4y2BaNgydF4y2Ba-morpholino)乙烷磺酸(MES)和0.2 mM乙酰丁香酮溶解于70%乙醇中(过滤灭菌)，28℃下培养12 h。当细菌培养达到OD (600 nm) 0.06时，进行外植体接种。gydF4y2Ba

的启动子区域gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba基因(GenBank登录号:AY324651)先前被克隆到二进制载体pBI101中，其中−2736/-6启动子片段融合到β-葡萄糖醛酸酶的编码序列(gydF4y2BauidAgydF4y2Ba)报告基因[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba] PsEND1gydF4y2Ba:: barnase-barstargydF4y2Ba嵌合基因:引物Ribo1 (5 ' -gydF4y2Ba助教gydF4y2BaGGATCCCgydF4y2BaGACCATGGCACAGGTTATC-3 ')和Inhi2 (5 ' -)gydF4y2BaGCgydF4y2BaGAGCTCgydF4y2BaTTAAGAAAGTTGATGGTGATG-3´)是根据已公布的序列设计的gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba和gydF4y2BabarstargydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]放大gydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba片段和介绍gydF4y2BaBamgydF4y2Ba你好,gydF4y2Ba囊gydF4y2BaI限制位点。巴纳酶是一种非常活跃的核糖核酸酶。即使是低水平的表达从异常启动子序列或径流表达从邻近基因在操作gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba会阻止细菌的存活。因此,gydF4y2BabarstargydF4y2Ba该结构中包含编码一种藤蔓酶抑制剂的基因。PCR得到的片段被克隆到pGEM-T Easy (Promega)中，随后与gydF4y2BaBam的gydF4y2Ba你好,gydF4y2Ba囊gydF4y2Ba我的酶。的gydF4y2BaBamgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba囊gydF4y2BaI片段是通过替换gydF4y2BauidAgydF4y2Ba将序列编码成二进制向量pBI101，生成pBI101-gydF4y2BaPsEND1: barnase-barstargydF4y2Ba构造。的gydF4y2Ba号::ntpIIgydF4y2Ba在T-DNA中引入了植物选择标记基因，该基因使转基因植物对卡那霉素具有抗性。gydF4y2Ba

转基因植物的转化与再生gydF4y2Ba

用这两种方法进行了转化实验gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba和gydF4y2Ba天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba叶片外植体作为起始材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba以上述两个月龄的无性系植株为材料制备叶片外植体。用50 ml菌悬液接种25个外植体，每组接种5分钟，然后转移到由MIM和0.2 mM乙酰丁香酮组成的共培养培养基中。外植体在25°C黑暗中共培养2-3天，然后转移到无菌玻璃罐中，罐中装有液体洗涤培养基(MS基础培养基，20 mg l)gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}蔗糖，1毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}硫胺素-盐酸，100毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}肌醇，100毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}MES和600毫克一升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}头孢噻肟)，浸泡5分钟。然后用无菌滤纸吸干外植体，继代到添加300 mg l的选择性MIM上gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}Timentin和50mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}卡那霉素的gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba转基因事件的根除和选择。所有抗生素经过过滤灭菌，加入冷却培养基(45℃)，然后倒入直径为9 cm的培养皿中，每皿25 ml培养基。对照外植体除接种了gydF4y2Ba农杆菌属gydF4y2Ba。对照组分别在加卡那霉素和不加卡那霉素的培养基上培养。所有外植体每2周在同一新鲜培养基上继代培养，直到芽长到足以与愈伤组织分离。培养2.5 ~ 3个月后，愈伤组织呈现出发育良好的形态发生结构gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba体细胞胚胎gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba)转移到选择性延伸培养基(EM: MS基础培养基和沙欣维生素，添加30 g lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}蔗糖，100毫克gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}肌醇，8 g / lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}琼脂，0.01 mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}NAA, 0.1 mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}6 BA, 1 mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}硫酸铜300毫克/升gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}Timentin和50mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}卡那霉素)。EM培养1 ~ 1.5个月后，扦插在生根培养基(生根培养基)中培养。将根系发育良好的再生植株移栽到含有泥炭苔藓和珍珠岩(3:1)作为基质的塑料盆中，并在最初覆盖透明塑料以保持湿度的生长室内进行驯化。植物在长白天条件下(16小时光照/8小时黑暗光周期)培养，然后转移到温室直到开花。转化效率估计为独立转化事件的数量(每个外植体一个转基因植株)与接种外植体总数的关系。gydF4y2Ba

倍性水平分析gydF4y2Ba

天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba和gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba有2n = 18条染色体。现代栽培品种是通过种内和种间杂交获得的，与野生品种相比，它们通常具有较高的倍性。如前所述，用流式细胞术评估倍性水平[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。叶组织gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba利用植株进行细胞核分离。组织片(1厘米)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)，在200 μl的核分离缓冲液(Partec)中，用锋利的刀片在玻璃板上切碎。然后将样品通过50 μm尼龙过滤器和800 μl含1 mg l的染色溶液(Partec)gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}加入DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)用于DNA荧光。用配备水银灯的Partec PAS-II型流式细胞仪测定离体细胞核的DNA含量。DAPI的荧光团激发峰在420 nm以下，荧光发射峰在435 ~ 500 nm之间。数据绘制在直方图上，其中横轴显示DNA含量(与荧光成正比)，纵轴显示细胞核数。每个样品大约测量了5000到10000个原子核。用原品种成体和转基因植株的幼叶进行了分析。gydF4y2Ba

PCR分析gydF4y2Ba

采用Rogers和Bendich的方法从嫩叶中提取用于PCR分析的植物DNA [gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。采用以下引物对所有转基因进行PCR分析gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba基因，正向引物KAN-1:(5 ' -AAG ATG GAT TGC ACG CAG GTT C-3 ')和反向引物KAN-2:(5 ' -GAA GAA CTC GTC AAG AAG GCG A-3 ');为gydF4y2BauidAgydF4y2Ba基因，正向引物GUS-1:(5 ' -ATC AGG AAG TGA TGG AGC ATC A-3 ')和反向引物GUS-2:(5 ' ggt GAT CGG ACG CGT CGG GTC G-3 ');为gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba基因，正向引物GFP-D:(5′-ATG GTG AGC CAA GGG CGA GGA-3′)，反向引物GFP-R:(5′-GGA CCA TGT GAT CGC GCT TC-3)′;为gydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba基因，正向引物Ribo3(5′-ACG GAC CAT TAT CAG ACC TTT AC-3′)和反向引物Inhi3(5′-CGC AGC CTT CCG CTT TCG C-3′);为gydF4y2BaiptgydF4y2Ba基因，正向引物IPTDIR (5 ' -GGT CCA ACT TGC ACA GGA AAG-3 ')和反向引物IPTREV (5 ' -CCC TCC AAA GTT GAA CCA ACT C-3 ')。PCR反应在20 μl中进行，其中基因组DNA 0.1 ~ 0.2 μg，每个dNTPs 0.2 mM, MgCl 1.5 mMgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba0.6 μM 5 '和3 '引物，0.5 U Taq DNA聚合酶。为gydF4y2BanptIIgydF4y2BaDNA在94°C下变性5分钟，然后30个循环(94°C 30秒，56°C 45秒，72°C 1分钟)，最后在72°C下变性10分钟。为gydF4y2BauidAgydF4y2BaDNA在94°C下变性5分钟，然后进行30个循环(94°C 30秒，60°C 45秒，72°C 1分钟)，最后在72°C下变性10分钟。为gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2BaDNA在94°C下变性5 min，然后进行35个循环(94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 1 min)，最后在72°C下变性10 min。为gydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba和gydF4y2BaiptgydF4y2BaDNA在94°C下变性5分钟，然后进行35个循环(94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟)，最后在72°C下变性10分钟。预期产物大小为781 bpgydF4y2BanptIIgydF4y2Ba， 1021 bpgydF4y2BauidAgydF4y2Ba， 661 bpgydF4y2Ba防毒气的gydF4y2Ba， 544 bpgydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba460 bpgydF4y2BaiptgydF4y2Ba基因。PCR产物在1% w/v琼脂糖溴化乙啶凝胶上进行紫外电泳检测。gydF4y2Ba

实时RT-PCR分析gydF4y2Ba

从离体叶片中分离总RNAgydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba使用Plant RNA纯化试剂协议(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)从WT对照植株的叶片中提取转基因株系3.4、3.9、4.3和4.12。根据制造商的说明书，使用Turbo DNA-Free试剂盒(Ambion, Austin, TX)对RNA制剂进行实时逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)的dna酶处理。采用分光光度法(NanoDropTechnologies, Inc.， Wilmington, DE)测定每个样品的RNA浓度，并通过甲醛-琼脂糖凝胶电泳目视评估质量。为了合成第一链，使用PrimerScript 1在20 μl反应混合物中逆转录总RNA (1 μg)gydF4y2Ba^圣gydF4y2Ba链cDNA合成试剂盒;http. / /gydF4y2Bahttp://www.takara-bio.co.jpgydF4y2Ba）.使用两微升RT反应进行实时RT-PCR分析，每个引物300 nM与Power SYBR®Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)混合，按照制造商的说明进行。使用ABI PRISM 7500序列检测系统和专用软件(Applied Biosystems)在96个孔光学反应板上进行反应。数据归一化使用gydF4y2Ba天竺葵x hortorum PhACTIN7gydF4y2Ba(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba相对表达式值根据最大表达式值进行归一化后计算。使用PRIMER EXPRESS 2.0版本(Applied Biosystems)设计所有基因的引物，使用默认参数。使用的引物如下:gydF4y2BaiptgydF4y2Ba(异戊烯基转移酶):ipt-qRT-DIR: 5 ' -GCTACCCAGAACCAGATCACG-3 '和Ipt-qRT-REV: 5 ' -ATCTGCGTCGAGCTGCAATA-3 '和gydF4y2BaPhACTIN7gydF4y2Ba: phact7 - qrt - dir: 5 ' -TCCAGCAGATGTGGATTTCAAA-3 '和PhACT7-qRT-REV: 5 ' -TTGATGGGCCAGACTCATCAT-3 '。gydF4y2Ba

每个样品的基因表达分析都用实时RT-PCR在三个实验重复中进行gydF4y2BaiptgydF4y2Ba和gydF4y2BaPhACTIN7gydF4y2Ba。每对的实际值(gydF4y2Baipt - PhACTIN7gydF4y2Ba)等于2gydF4y2Ba^{——ΔΔCtgydF4y2Ba}。每个样本的表达水平相对于gydF4y2BaPhACTIN7gydF4y2Ba是三次生物重复的平均值。将表达水平最高的样本的相对表达水平设为1，并将所有其他样本值归一化为该值以生成折叠。gydF4y2Ba

光学显微镜gydF4y2Ba

转化外植体定期检查gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在配备徕卡荧光模块GFP3(由470-440 nm激发滤光片和525-550 nm阻挡滤光片组成)的荧光立体显微镜(徕卡MZ FLIII)下表达。一盏汞灯提供了光源。叶绿素的红色自身荧光不被任何滤光片阻挡。转基因植株和野生型植株的花蕾和雄蕊都是新鲜收获的，用镊子和手术刀解剖。用体视显微镜(MZ8，徕卡)获得解剖花和雄蕊的光照片。gydF4y2Ba

β-葡萄糖醛酸酶活性根据Jefferson等的方法进行组织化学测定。[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。将推定转基因植株的根、茎和叶段在37℃下染色24 h，用70%乙醇清除，在MZ8 Leica立体显微镜下观察。gydF4y2Ba

形态学测量gydF4y2Ba

对营养生长进行了形态学测量，以确定是否gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba和gydF4y2BaiptgydF4y2Ba其表达可影响植物的不同生长参数。在温室内对T1半合子转基因植株和WT对照植株进行了测定。评价了开花植物株高(从土壤线到最高生长点顶端的距离)、叶长和叶宽(5片完全展开的叶片的平均值)、叶柄长、节间长和每株花序数。形态学测量是在每棵植物的前五朵花到达花期的几天内进行的。使用学生检验在5%概率水平上比较显著差异的平均值。数据变异性表示为平均值±SE。gydF4y2Ba

叶绿素定量gydF4y2Ba

通过提取离体叶片的叶绿素来分析叶片的衰老情况gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物分别。使用用液氮冷却的陶瓷砂浆，将样品粉碎成细粉末。在10ml离心管中，将样品与100mg MgCO混合gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba5ml 100% (v/v)丙酮。离心(5min)去除漂白的叶料;2000年gydF4y2BaggydF4y2Ba)和1ml等分上清液转移到新管中。分光光度法测定提取物叶绿素(a + b)含量[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在体外gydF4y2Ba无性系叶片外植体的再生gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba和gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba植物与卡那霉素的选择gydF4y2Ba

诱导gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba植株再生，从无害化繁殖植株中提取叶片外植体，在形态发生诱导培养基(Morphogenesis Induction Medium, MIM)中培养。通过使用axenicgydF4y2Ba天竺葵属植物peltatumgydF4y2Ba和gydF4y2Ba天竺葵属植物zonalegydF4y2Ba以植物为外植体来源，外植体再生率达90%gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba80%gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba。植株通过体细胞胚发生进行再生gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2BaE-h)和通过器官发生gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba我)。gydF4y2Ba

由于用于转化实验的质粒携带gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba基因作为选择标记，有必要确定合适的卡那霉素浓度进行转基因事件的选择。用不同浓度卡那霉素(0、25、50和100 mg / l)的选择性MIM培养基培养无性系植物叶片外植体gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}）.浓度为50mg lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}足以抑制两个品种叶片外植体中非转化细胞的生长。再生芽在不同卡那霉素浓度(0、25、50和100 mg l)的选择性伸长培养基(EM)中培养gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}）.根据我们的结果(数据未显示)，卡那霉素浓度为50mg / lgydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}在EM中筛选两个品种的转基因植株。gydF4y2Ba

基因转化实验gydF4y2Ba

的遗传转化实验gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba和gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba以无性系植物叶片外植体为试验材料。在最初的转化实验中，来自两者的外植体gydF4y2Ba天竺葵属植物sppgydF4y2Ba。都接种了gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba菌株LBA4404携带pBIN19二进制载体窝藏，在左右边界之间gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba在标记基因的控制下gydF4y2Ba号gydF4y2Ba发起人和gydF4y2Ba号gydF4y2Ba《终结者》gydF4y2Bagfp-S65TgydF4y2Ba报告基因受2x35SCaMV组成启动子控制gydF4y2Ba号gydF4y2Ba终结者。外植体在50 mg / l的选择性MIM中培养gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}卡那霉素。培养1个月后，外植体在叶片外植体切面上开始形成愈伤组织。未转化的愈伤组织在选择性培养基中培养30-50天后发生坏死。选择性MIM处理2.5 ~ 3个月后，愈伤组织分化为不定芽gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba体细胞胚胎gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba在某些情况下，在同一外植体中发现了几个独立的转化事件(同一外植体相对两侧的不定芽)，但每个外植体只恢复了一个植株，以确保所有选择的植株都来自独立的转化事件。在选择性EM培养基中培养1-1.5个月后，将芽切除并在生根培养基(生根培养基)中培养。最后，独立生根植株6株gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba6 / 6gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba被选中并转移到锅中。转基因植物在生长室中适应环境，然后转移到温室，在那里它们随后在长时间的白天条件下正常开花。转化效率，估计为独立转化事件的数量(每个外植体一个转基因植株)与接种外植体总数的关系，在两个品种中范围在2-3%之间。gydF4y2Ba

为了获得长寿和雄性不育的天竺葵植株，我们采用了上述相同的转化方案，并使用了gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba作为起始材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba与叶片外植体共培养gydF4y2Ba农gydF4y2Ba携带嵌合构建体pVDH393-的菌株LBA4404gydF4y2BapSAG12gydF4y2Ba：:gydF4y2BaiptgydF4y2Ba和pBI101 -gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba：:gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba分别。gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba可选择的标记gydF4y2Ba

而gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba基因被用于转基因植物的选择gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在转化过程中还检测了基因表达，以评价其转化能力gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba作为gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba可选的标记。的表达式gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在接种后40-50天(当不定芽或体细胞胚胎开始出现时)的叶片外植体和获得的转基因植株中观察到基因。的gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba转化细胞中的表达应该有助于在早期阶段选择转化事件，因此抗生素选择标记基因可能不需要。然而，在的情况下gydF4y2Ba天竺葵属植物。gydF4y2Ba，如果选择只基于gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在表达过程中，由于绿色组织中存在叶绿素，大量转基因植株无法被检测到。这个问题与叶绿素含量高的组织(如叶片)的荧光可视化有关。叶绿素显示出强烈的红色自身荧光，可以掩盖少数细胞的绿色荧光。在这两个gydF4y2Ba天竺葵属植物sppgydF4y2Ba，绿色荧光在最初的白色愈伤组织中清晰可见，生长混乱(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bam-n)，而在随后的有机愈伤组织和不定芽中越来越难以识别(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bao-p)。所有抗卡那霉素植物在不同器官和组织中均显示绿色荧光。在再生芽和植株中观察到绿色荧光(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Baq-r)，在叶子的边界上(图1)gydF4y2Ba1gydF4y2Bas-t)，尤其是在没有叶绿素的根部(图2)gydF4y2Ba1gydF4y2Bauv)。一般来说，在同一个器官内，gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba根据叶绿素含量的不同，不同组织或细胞类型的检测结果也不同。gydF4y2Ba

倍性水平分析gydF4y2Ba

分析了再生植株在选择培养基上的倍性水平，并与原始材料进行了比较。用原品种成株对照叶和转基因植株幼叶进行分析(图2)gydF4y2Ba2gydF4y2Baa - b)。只选择与原植株具有相同倍性的二倍体植株。gydF4y2Ba

转基因基因的PCR分析及转基因品系的选择gydF4y2Ba

的存在gydF4y2BanptIIgydF4y2Ba，gydF4y2BauidgydF4y2Ba一个,gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba，gydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba和gydF4y2BaiptgydF4y2Ba两种选择的转基因系的转基因gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba和gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba经PCR证实。数字gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的PCR检测结果为gydF4y2Babarnase-barstargydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Bac)和gydF4y2BaiptgydF4y2Ba转基因(图gydF4y2Ba2gydF4y2BaD)不同的转基因植物gydF4y2Bap . zonale。gydF4y2Ba

基于PCR分析，我们选择了12个独立的gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba6携带pVDH393-gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba构建和6与pBI101-gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba嵌合基因用于进一步的表型和分子分析。gydF4y2Ba

所选转基因系gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba带着gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba构造也被评价为GUS的生产，因为它们都携带gydF4y2BauidAgydF4y2Ba在报告基因的控制下gydF4y2Ba35 scamvgydF4y2Ba启动子。在图gydF4y2Ba3.gydF4y2Baa-b，在茎、叶和根中均可观察到GUS的本构表达gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba与对照植物(WT)比较。gydF4y2Ba

转基因株系的形态测定gydF4y2Ba

为了确定转基因表达是否会影响不同的生长参数，在每株植物的前五朵花到达花期的几天内，对其营养生长进行形态学测量。测量参数包括开花株高、叶宽、叶长、叶柄长、节数、节间长和单株花序数。结果表明，转基因植株的营养生长和开花没有明显的改变gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba花药中的表达(未显示)。因此，似乎不存在异位效应gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba基因存在于营养或生殖植物组织中，而不是花药中，证实了该基因的组织特异性gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子。相比之下，转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植株叶片衰老延迟，在基生叶中更为明显(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Bac-d)，分枝增加，节间比WT短，产生的表型显示整个植物的结构更紧凑(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2Bae-f)。gydF4y2Ba

延缓衰老gydF4y2Bap . zonalegydF4y2BapVDH393 -gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植物gydF4y2Ba

生根后，gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba对转基因植株进行驯化和温室栽培，评价其延缓衰老的可能性。与未转化的WT对照植株相比，转基因植株表现出叶片衰老延迟、分枝增加和节间长度缩短的现象。数字gydF4y2Ba3.gydF4y2Bag显示了6个WT植株和6个转基因品系在节间长度上的重要差异。转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植株表现出比WT表型更紧凑的结构。gydF4y2Ba

野生型与转基因植株的另一个表型差异是叶片尺寸较小gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物(图gydF4y2Ba4gydF4y2Baa - b)。在花序中，花的表型非常相似，尽管不同的花有不同的表型gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba与WT花相比，花的大小也减小了(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Bac).转基因植株的叶片和花朵的颜色比未转基因植株的颜色更鲜艳，这可能是因为它们的尺寸减小了。在一些转基因成体植株中，当我们将转基因植株与WT植株进行比较时，我们偶尔会观察到花序发育的变化(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Bad e)。在一些gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba花序，花与新的营养结构共存，这些营养结构与花或新的花序同时产生(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Baf-g-h)。这种偶然出现的现象可能是由于拷贝量大或插入位置不正确所致gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物基因组中的转基因。为了阐明表型与外源基因在这些植物中的表达水平之间是否存在相关性，我们选择了4个延迟衰老的转基因株系(3.4、3.9、4.3和4.12)进行了实时RT-PCR实验。转基因系3.4表现出花序逆转表型。我们的结果表明，与其他基因相比，转基因在第3.4行表达量更高(图2)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba然而，从商业角度来看，这种表型可能被认为是一种不良的附带效应，因此，偶尔出现花序逆转的转基因品系被丢弃。gydF4y2Ba

所有的gydF4y2BaP. zonale pSAG12::iptgydF4y2Ba与WT对照植株相比，在温室栽培的转基因植株表现出延缓衰老的现象，尤其是在基叶上。在图gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， 5个月以上的成虫基生叶的比较gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植物(图gydF4y2Ba3.gydF4y2Bad)和年龄相近的未转化植物的基叶(图2)gydF4y2Ba3.gydF4y2BaC)被展示。对照植株的大量成体叶片表现出明显的衰老表型，而转基因植株相同位置的相似叶片保持绿色且完全张开。gydF4y2Ba

为了更好地表征和确定转基因植株的衰老延迟，我们分离了转基因植株和对照植株年龄相近的健康幼叶，将叶柄置于装有水的玻璃管中，28°C，暗处处理。随着时间的推移对这些叶子的分析表明gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植物保持绿色的时间比对照组长。在图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，我们展示了从控制(左)和gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba(右)在黑暗中孵育0 (a)、6 (b)、8 (c)、17 (d)、22 (e)、24 (f)、27 (g)和34 (h)天的植物。WT叶片在黑暗中孵育6天后出现明显的叶绿素降解症状，转基因叶片在孵育22天后出现类似症状，表明衰老过程延迟。同样，WT叶片(~ 8天)出现坏死症状的时间也比转基因叶片(~ 20天)早。离体叶片在第0、6和8天的叶绿素定量分析证实了这些观察结果(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Bai).例如，在WT和WT的黑暗中孵育8天后叶绿素(a + b)含量下降gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba叶片的衰老率分别为63.0%和25.2%，证实了转基因植株衰老过程的延迟。此外，转基因植株叶片在时间过程中的水分流失量低于WT植株(图2)gydF4y2Ba5gydF4y2Baj).在黑暗中孵育6天后，差异开始显现。15天后，WT叶片的鲜重下降了65%，而转基因叶片的鲜重下降了32%。22天后，WT叶片的鲜重损失率达到初始重量的80%，而转基因叶片的水分损失率为初始重量的65%。30 d后，WT和转基因叶片的值相近。这些数据强化了嵌合结构的观点gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba可能会有用gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba延缓衰老过程，生产长寿的植物。gydF4y2Ba

在带状假单胞草转基因植物中，早期花药消融导致有效的雄性不育gydF4y2Ba

转基因gydF4y2BaP. zonale pend1::barnasegydF4y2Ba植株营养发育正常，开花正常。然而，来自转基因系的花药携带嵌合物gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba与未转化的WT花药相比，基因结构表现出显著的发育差异。光镜下观察不同发育阶段的花药。在WT中，花在开花前一天的花药(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Baa)，小室发育完全，呈正常形态(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Bac)和含有在花期可见的活花粉粒(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Bad)，而转基因花在正常四裂花药的位置显示出短花丝末端的塌陷结构(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2BaB)完全膨胀的灯丝。gydF4y2Ba

在携带雄性不育结构系的花药结构中，未观察到与正常花药结构相反发育的变异花药结构中的花粉粒。花前3 ~ 4天不育花药的花房狭窄且未展开。在大多数情况下，未发育的花药变成坏死结构，由消融的花药组织组成，永不开裂(图2)gydF4y2Ba6gydF4y2Bae).雄性不育植物与野生型植物的花粉异花授粉通常产生正常的果实和种子，说明雌性的育性不受影响。在一些转基因品系中，我们发现种子产量有小幅下降(数据未显示)，这些品系被丢弃。gydF4y2Ba

传统育种计划用于培育花卉新品种或改良品种，结果产生了一系列具有优良性状的品种，如颜色，形状，香味，切花品种的花瓶寿命，生根潜力或整体植物形态。然而，其中一些目标尚未在许多观赏物种中实现。基因转移的手段gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba可以从不相关的物种中引入新的基因/性状，并将成为天竺葵育种的有用工具。gydF4y2Ba

可适用于广泛的不同基因型的高效再生方案是为植物物种或基因型开发转化系统的先决条件[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。我们开发了一种简单可靠的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba再生方案的遗传转化gydF4y2Ba天竺葵属植物。gydF4y2Ba这两个gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba本研究使用的基因型表现出不同的再生能力。在相同的培养基中，通过体细胞胚发生进行再生gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba通过器官发生gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba。有趣的是，从两种基因型获得的再生外植体的百分比相似(90%)gydF4y2Bap . peltatumgydF4y2Ba80%gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba)和转化效率(2-3%)。gydF4y2Ba

我们也评估了gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba基因是gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba天竺葵中的可选标记。据报道，ggydF4y2Ba《外交政策》gydF4y2Ba转化细胞中的表达有助于在早期阶段选择转化事件，因此不需要选择抗生素[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba54gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。在…的情况下gydF4y2Ba天竺葵属植物sppgydF4y2Ba的用法gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba作为可选项gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba标记基因仅限于识别转化事件，因为在发育后期，由于绿色组织(叶片)中叶绿素的存在，它变得无法检测。在成年植物中，gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba仅在根、花瓣或花药花丝等非绿色组织中可检测到表达。gydF4y2Ba

利用该转换协议，我们引入了两个新的特性gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba简历。通过诱导植物生长出长寿命的植物gydF4y2BaiptgydF4y2Ba在植物衰老过程中，另一个基因产生雄性不育植物，没有花粉。在最初的转换分析中，我们使用gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba报告基因gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba识别再生植株的转化事件并评估转化效率。的gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba基因已被成功地用于改造甘蔗、烟草、玉米、生菜。gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]，核桃[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]，柑桔[gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]，桃[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]，土豆[gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]，梨[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba]，胡萝卜[gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]及其他物种[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。在gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba，我们观察到gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba在再生过程中表达，但在接种后超过三周的时间内，我们无法将再生转基因植株的外植体与绿色荧光联系起来。低水平的gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba荧光与叶绿素含量的增加在时间上重合，而叶绿素的红色自身荧光与叶绿素含量的增加相干扰gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba绿色荧光[gydF4y2Ba62gydF4y2Ba]。这种干扰也可能是由对紫外线或蓝光不透明的颜料引起的[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba]。一些作者指出，基于对选择性标记的抗性的转化效率可能低估了转基因植物再生的实际速度[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。因此，除了使用选择性或目视筛选标记外，还提出了PCR分析来鉴定转基因植物[gydF4y2Ba63gydF4y2Ba]。在目前的工作中gydF4y2Ba绿色荧光蛋白gydF4y2Ba基因可用于确认遗传转化gydF4y2Ba体内带状疟原虫。gydF4y2Ba所有转基因植株几乎在分析的所有组织中都显示出绿色荧光，但器官和组织之间的绿色荧光差异很大，这取决于每个器官和组织的叶绿素含量。PCR分析证实再生植株中存在转基因。gydF4y2Ba

在遗传转化实验中，分析一般集中在转基因植株的分子特性上，而检测转基因材料的倍性水平的案例相对较少。转基因材料倍性水平的确定在转基因品系的选择中尤为重要。我们的研究结果表明gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba这里使用的品种具有二倍体染色体数量，这些外植体的再生导致植株具有与原品种成体材料相同的倍性水平。gydF4y2Ba

转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba叶片衰老延迟，以基叶明显。与未转化的植物相比，它们也表现出分枝增加和节间长度减少。此外，转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物的结构比野生植物更紧凑。野生型和转基因之间的其他有趣的表型差异gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植株叶片大小减小。转基因植株的植株结构紧凑，花序和花紧密。在一些gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba花序、花与新的营养结构共存，这些营养结构与花或新花序同时产生。这种偶然的现象可能是由于花分生组织的决定发生了变化，导致花序逆转，新的营养器官取代了花序上的花。gydF4y2Ba

当花信号的水平不足以完成花的发育和抑制不确定性时，可能会发生花序或花的逆转[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba]。花和花序的逆转涉及到从花发育到营养发育的转换，从而使开花成为持续生长模式中的一个阶段，而不是分生组织的最终行为。虽然它可以被认为是一种不寻常的事件，但它与环境条件有关，并且通常是对与诱导开花条件相反的条件的反应。一个明确的恢复叶片生产已描述在gydF4y2Ba凤仙花gydF4y2Ba(gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]。在gydF4y2Ba即balsaminagydF4y2Ba在我们的研究中，叶片衍生的信号对于开花的完成至关重要，并且可以被认为是在没有分生组织自主的情况下实现整个植物开花承诺的基础。有人提出细胞分裂素可以作为叶片产生的信号参与开花诱导过程，使开花过程不可逆[gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba]。这些细胞分裂素通量在LD植物成花诱导过程中可能会发生改变gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba由于细胞分裂素的持续产生，转基因植物在衰老过程中可能会影响一些花序的逆转过程。为了阐明这些植物的花序逆转表型与外源基因的表达水平是否存在相关性，我们进行了实时RT-PCR实验。结果表明，在花序逆转的转基因品系中，该基因的表达量较高。然而，从商业角度来看，这种表型可能被认为是一种不良的附带效应，因此偶尔出现花序逆转的转基因品系被丢弃。gydF4y2Ba

所有的gydF4y2BapSAG12::ipt P. zonalegydF4y2Ba温室栽培植株与对照植株相比，衰老延迟，尤其是基叶。对照植株的大量成年叶片表现出明显的衰老表型，而转基因植株相同位置的相似叶片保持绿色且完全张开。为了更好地表征和确定转基因植株的衰老延迟，我们分离了转基因植株和对照植株年龄相近的健康幼叶，将叶柄置于装有水的玻璃管中，28°C，暗处处理。随着时间的推移对这些叶子的分析表明gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植物保持绿色的时间比对照组长。WT叶片在黑暗中孵育6天后出现明显的叶绿素降解症状，转基因叶片在孵育22天后出现类似症状，表明衰老过程延迟。同样，野生型植株的叶片出现坏死症状的时间也比转基因植株早。离体WT和叶绿素含量的定量分析gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba结果表明，与转基因叶片相比，WT叶片的叶绿素下降幅度更大。此外，在分析的时间过程中，转基因植物叶片的水分损失很小。这些数据强化了嵌合的观点gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba构造可以在gydF4y2Ba天竺葵属植物gydF4y2Ba延缓衰老过程，生产长寿的植物。gydF4y2Ba

我们获得了工程雄性不育植株gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba防止引入的转基因向亲缘种的横向基因流动。的gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子的特异性定向表达gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba基因转移到花药不同组织参与花药结构(表皮、花药内膜、中间层、结缔组织)。的表达式gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba受该启动子控制的基因在转基因植物花药发育的早期阶段引起这些组织的特异性消融。我们很容易观察到转基因花在第三轮花药中出现了代替正常花药发育的小结构，表现为花粉囊、小孢子和绒毡层的过早衰老和塌陷，以及花期花粉缺乏。结构花药组织的消融也会导致绒毡层组织的不正确形成，随后小孢子的退化伴随着花药壁厚度的变化、大小的减小和表皮细胞类型的变化[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。由于这种表型不太可能是由于结构组织中藤蔓酶的表达，它很可能是绒毡层和小孢子细胞丢失的间接影响。gydF4y2Ba

在雄性不育植株的烧蚀花药的任何切片中均未观察到花粉粒，这表明麻秆酶有效地烧蚀了形成花药结构组织的特定细胞系，从而阻止了花粉的发育。转基因花药在每个检测阶段都表现出对藤壶酶表达的影响。这可能是由于发育较早地表达gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子。转基因植株的花药花丝比野生型短。短纤维的形成通常与男性不育或生育力下降有关[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba68gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]。这些观察结果加强了我们之前在其他作物物种中使用相同嵌合结构的结果[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

由于藤本酶的剧毒性质，其他研究人员报告说，在携带这种病毒的转基因植物中，普遍缺乏活力，植物生长下降gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba71gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba73gydF4y2Ba]。当考虑在园林绿化植物中使用藤本酶进行雄性不育时，对生长特性缺乏显著影响是重要的。防止宫外孕可能产生的影响gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba表达，Gardner等。[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba建议引入男性和/或女性不育基因与防止不适当的基因相结合gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba表达式(增强gydF4y2Ba35 s:: barstargydF4y2Ba）.在所有的转基因品种中gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba植物表达gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba在…的控制下gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子，我们没有观察到野生型植物在营养生长、开花时间和花序数方面的差异。对转基因植株的形态分析表明，在温室条件下，转基因植株表达的gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba构造不显著影响营养和花的发育，从而证实了花药的特异性gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba先前通过不同双子叶和单子叶的GUS表达研究观察到的启动子区域[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。潜在的生物技术应用gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子在很大程度上取决于其空间和时间表达模式，因为细胞毒性因子的异位表达会损害植物的其他组织和器官，降低杂交植物的农艺价值。gydF4y2Ba

的表达式gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba观赏植物花药特异性调控下的基因gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子可用于现有流行品种的高效雄性不育版本，而不会对其各自的表型产生不利影响。因此，该技术通过防止转基因观赏植物之间的基因流动，将特别有助于生产具有新性状的环境友好型转基因植物。gydF4y2Ba

我们开发了一种简单可靠的gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba再生方案的遗传转化gydF4y2Ba天竺葵属植物sppgydF4y2Ba。通过这种方法，我们引入了两个新的特征gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba简历。370、一种产生长寿植物，另一种产生雄性不育。由此产生的表型对消费者和生产者都是有益的。gydF4y2Ba

的荒唐的gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba构造可能在gydF4y2Ba天竺葵属植物。gydF4y2Ba延缓衰老过程，生产长寿植物，这可能具有商业利益。转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba与未转化植株相比，叶片衰老延迟，分枝增加，节间长度缩短。此外，转基因gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba植物的结构比野生型更为紧凑gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba花序、花与新的营养结构共存，这些营养结构与花或新的花序同时产生。这种偶然的现象可能是由于在一些转基因系中，由于转基因基因表达水平的增加，导致花分生组织的决定发生了变化，从而导致了花序的逆转。显示花序逆转的线条被丢弃，因为从商业角度来看，这种效果是不可取的。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaPsEND1gydF4y2Ba启动子的特异性定向表达gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba基因转移到不同的花药组织参与花药结构。的表达式gydF4y2BabarnasegydF4y2Ba该启动子控制的基因引起这些组织的特异性消融，这些组织在转基因天竺葵植物花药发育的早期阶段坏死。在雄性不育植株的烧蚀花药中未观察到花粉粒，说明麻秆酶有效地破坏了形成花药结构组织的特定细胞系，从而阻止了花粉的发育。工程雄性不育的使用将特别有助于消除花粉过敏原，并通过防止基因在转基因观赏植物和相关植物物种之间的基因流动，生产具有新特性的环境友好型转基因植物。gydF4y2Ba

为:gydF4y2Ba

AcetosyringonegydF4y2Ba

芭:gydF4y2Ba

6-benzylaminopurinegydF4y2Ba

欧共体语言教学大纲:gydF4y2Ba

头孢噻肟gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白基因gydF4y2Ba

IptgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

异戊烯基磷酸转移酶基因gydF4y2Ba

国际宇航科学院:gydF4y2Ba

Indole-3-acetic酸gydF4y2Ba

菅直人:gydF4y2Ba

硫酸卡那霉素gydF4y2Ba

亲人:gydF4y2Ba

激动素gydF4y2Ba

磅:gydF4y2Ba

Luria Bertani中号gydF4y2Ba

市场经济地位:gydF4y2Ba

2 - (gydF4y2BaNgydF4y2Ba-morpholino)乙烷磺酸gydF4y2Ba

女士:gydF4y2Ba

Murashige和Skoog培养基gydF4y2Ba

乙酰天冬氨酸:gydF4y2Ba

α-萘乙酸gydF4y2Ba

nptIIgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

新霉素磷酸转移酶基因gydF4y2Ba

聚合酶链反应:gydF4y2Ba

聚合酶链反应gydF4y2Ba

TDZ:gydF4y2Ba

的物质gydF4y2Ba

蒂姆:gydF4y2Ba

丁entin(替卡西林/克拉维酸)gydF4y2Ba

uidAgydF4y2Ba：gydF4y2Ba

β葡萄糖醛酸酶基因。gydF4y2Ba

本研究由西班牙科学与创新部(MICINN)的AGL2009-13388-C03-01和BIO2009-08134基金资助。我们感谢CSIC开放获取出版支持计划通过其研究信息资源单位(URICI)提供的出版费用支持。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. Biología植物分子细胞研究所(CSIC-UPV)， politicnicica de la Innovación, Edf 8E。C/工程师Fausto Elio s/n，瓦伦西亚，E-46011，西班牙gydF4y2Ba

   Begoña García-Sogo，贝尼托·皮内达，Edelín罗克，特蕾莎Antón，亚历杭德罗·阿塔姆斯，约瑟·Pío Beltrán，维森特·莫雷诺和路易斯·安东尼奥CañasgydF4y2Ba

2. BIOMIVA S.L, Carretera M-511 Km. 2, Villaviciosa de Odón，马德里，E-28670，西班牙gydF4y2Ba

   Marise博尔哈gydF4y2Ba

3. Plant Response Biotech s.l.， Parque Científico-Tecnológico Montegancedo, Pozuelo de Alarcón, Madrid, E-28223, SpaingydF4y2Ba

   Marise博尔哈gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2Ba路易斯·安东尼奥CañasgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

在过去的五年里，我们得到了西班牙科学与创新部(MICINN)的资助，文章处理费将由两个获批项目的资金支付。作者的薪水来自两个不同的机构:瓦伦西亚理工大学(UPV)或西班牙高等科学研究委员会(CSIC)。我们目前没有申请与这份手稿内容相关的专利。无论是现在还是将来，所有提到的生物/机构都不会从这份手稿的出版中获得或失去经济上的损失。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

BG-S和BP进行了转化实验gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba，叶绿素定量和水分损失实验，两位作者对本文的贡献相同。TA对…的制作做出了贡献gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba再生和温室gydF4y2Bap . zonalegydF4y2Ba植物。AA对转基因系进行倍性水平分析。MB和VM设计了与制作相关的实验gydF4y2BapSAG12: iptgydF4y2Ba转基因植物。ER对转基因植株进行了分子分析(PCR和实时RT-PCR)。JPB和LAC设计了与雄性不育生产相关的实验gydF4y2BaPsEND1: barnasegydF4y2Ba转基因植物。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd.授权发表。这是一篇开放获取的文章，在知识共享署名许可(gydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0gydF4y2Ba)，允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是正确引用原创作品。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba