低聚半乳糖醛酸通过在转录和翻译后水平调节1-氨基环丙烷-1-羧酸的合成来促进番茄果实成熟GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

Oligogalacturonic酸（OG了）是从细胞壁通过的聚半乳糖醛酸水解在果实成熟和非生物/生物胁迫下发布的α-1,4-连接的galacturonosyl残基的低聚物。OG了可诱导乙烯生产和果实成熟，但是，该机构（一个或多个）这些方法背后是未知的。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

番茄品种‘Ailsa Craig’(AC)及其突变体GydF4y2BaNeverripe，成熟抑制剂，非成熟剂GydF4y2Ba,GydF4y2Ba无色non-ripeningGydF4y2Ba结果表明，OGs处理不同时期的果实。只有成熟绿期1的AC果实表现出提前成熟的现象，而所有番茄果实中都检测到瞬时乙烯生成。乙烯合成基因GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba迅速上调，和OG了处理后检测到的磷酸化LeACS2蛋白。蛋白激酶/磷酸酶抑制剂显著受OG了引起的成熟过程。作为OG了一个潜在的受体，LeWAKL2也在他们的存在上调。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

我们证明OGs通过在转录和翻译后水平调节LeACS2诱导乙烯合成，从而促进番茄果实成熟。GydF4y2Ba

肉质水果的成熟在从发育程序到成熟过程的转变过程中会引起复杂的生化变化，这是由成百上千的基因调控的[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba-GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba］．乙烯对于番茄的开始和完成至关重要（GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba(水果成熟[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba］．氨基氨基丙烷-1-羧酸合成酶（ACC合酶，ACS; EC4.4.1.14）和ACC氧化酶（ACO; EC1.3.3.6）负责乙烯生物合成，其催化S-腺苷 - 甲硫氨酸转化为ACC和Acc对乙烯分别[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．有许多天生的elicators可以在植物中诱导乙烯生产，包括脱硅酸（aba），其可以通过激活磷酸化ATACS6的C-末端GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba的钙依赖蛋白激酶GydF4y2BaAtCDPK4GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtCDPK11GydF4y2Ba[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，和生长素，其可通过促进乙烯生产[抑制ABA诱导的气孔关闭GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba］．另外，在常规果实成熟过程中释放的细胞壁降解产物还可以诱导乙烯生产，在果实成熟过程中发挥着重要作用[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

OligogalactuRonic酸（OGS）是通过多肢乳酸水解从细胞壁释放的α-1,4-连接的半乳​​糖基残基的低聚物[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba[微生物感染] [GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]机械损坏[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]，以及在果实成熟过程中[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．OGs作为植物先天激发子，可诱导一系列植物反应[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，包括乙烯合成[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]抑制植物素作用[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]，植物抗毒素的积累[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]并调用反应性氧气种类[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]及一氧化氮[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]. 先前的研究表明，在刚刚开始成熟的番茄组织中，果胶衍生低聚糖（包括OGs）的内源性积累促进了MG番茄果皮盘中乙烯生成的短暂增加[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．此外，番茄果实的果胶分解产物也可由病原菌相关酶的作用引起[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．这些研究表明，内源性果胶衍生寡糖在番茄的正常成熟和抗病过程中存在并发挥作用。早期研究表明，OGs可以促进番茄果实或圆盘和梨细胞悬浮液中的乙烯生物合成[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．小尺寸OGS的混合物引发番茄植物中的乙烯生产作为对伤害的反应[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．具有四到六个聚合（DP）的OGS通过其诱导表达的能力更有效地在乙烯促进中更有效GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba基因[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．虽然已经显示了OGS增强乙烯生产的能力，但尚未详细阐述这种能力背后的机制，以及ogs对果实成熟进展的影响尚不清楚。GydF4y2Ba

最近的研究发现，OGs可以介导细胞壁信号转导，并被壁相关激酶和激酶样蛋白(分别为WAKs和WAKLs)识别，它们包含一个胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞浆激酶结构域[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba］．在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，Atwak1在钙诱导的构象中与细胞壁果胶相互作用，是OGS受体[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba， OGs可以通过wak2依赖的方式激活有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)来影响许多植物的发育和应激反应[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．激活的MAPKs可以调节一系列植物激素，包括水杨酸、茉莉酸和乙烯，广泛地调节植物的生长、发育和胁迫/防御反应[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]. 一些ACS蛋白可以通过磷酸化和去磷酸化被MAPKs调控[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］．AtACS2和AtACS6的由MAPK6磷酸化导致ACS蛋白的积累和细胞ACS活性水平升高，促进乙烯生产[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba］．钙依赖蛋白激酶(CDPKs)也参与ACS调控[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］．在番茄中，MAPK和CDPK的磷酸化都是促进受损番茄果皮中LeACS2稳定性所必需的，LeACS2的磷酸化/去磷酸化调节其在泛素- 26s蛋白酶体降解途径上游的翻转[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

在本研究中，我们发现OGs可以通过诱导乙烯生物合成来促进番茄品种‘Ailsa Craig’(AC)果实成熟绿1 (MG 1)阶段的成熟。此外，转录水平GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba在OGS存在下令人上调。OGS还诱导磷酸化GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba在ser - 460。这些结果表明，OGs在转录和翻译后水平诱导乙烯生物合成，进而促进番茄果实成熟。另外，LeWAKL2作为一种候选OGs受体，受OGs影响，有待进一步研究。GydF4y2Ba

OGS制备和分离不同DPGydF4y2Ba

以聚半乳糖醛酸（PGA，Sigma 81325）为原料制备了不同聚合度的OGs混合物，纯度为 > 根据先前的研究，这一比例为95%[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba与调整)。1 g PGA溶解在100毫升0.1 M pH值4.4醋酸钠,PGA与100年第一次被孵化μL果胶methylesterase (EC 3.1.1.11中外,从成熟番茄果实中提取)在37°C 2 h用颤抖的把甲基残留物,溶液被加热到100°C 5分钟失活中外,5 U聚半乳糖醛酸酶(PG、EC 3.2.1.15σ17389,从GydF4y2BaAspergillus尼日尔GydF4y2Ba然后加入酶活性> 1U / mg）并在37℃下孵育1小时，最后在100℃下孵育10分钟。GydF4y2Ba

我们在QAE-Sephadex a -25基质(Pharmacia, 2.5 × 160 cm)上使用阴离子交换色谱分离不同DP的OGs，然后用0.125 M咪唑HCL缓冲液pH 7.0平衡200 mL [GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]，pH 7.0咪唑HCl为0.2μm，0.35m，0.5m，0.65m，0.8m，0.9m，1.0m，为每种浓度的500ml洗脱ogs。收集9ml为每个池收集洗脱，用M-苯基苯酚法检测薄层色谱（TLC）和总氧化酸含量[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]（附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba），用Sephadex G-25基质（Pharmacia，2.5×160cm）合并具有相同DP的游泳池。通过基质辅助激光解吸电离 - 质谱（MALDI-MS）进一步分析分离结果，如附加文件所示GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba根据辛普森等人[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

我们在实验中使用的OGS是根据我们预先实验的所有OG个体的混合，其中所有不同DP的混合OG对ogs的混合DP≥9具有类似的功能（参见附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba)．混合OG的大小在附加文件中显示GydF4y2Ba4.GydF4y2BaA，并使用具有PGA的相同程序制备对照溶液。GydF4y2Ba

植物材料，生长条件和治疗方法GydF4y2Ba

番茄(GydF4y2Ba茄属植物lycopersicumGydF4y2Ba）野生型植物AC，突变体GydF4y2BaNrGydF4y2Ba那GydF4y2BarinGydF4y2Ba那GydF4y2Ba也不GydF4y2Ba和GydF4y2Ba中国北车GydF4y2Ba在标准条件(25/20°C)下，在北京小汤山蔬菜种植基地大棚中种植。AC和突变体种子由Jim Giovannoni博士好心提供(博伊斯·汤普森植物研究所，伊萨卡，NY 14853, USA)。根据前人对授粉后天数(DAP)的描述，选取不同时期的果实[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]携带叉霉。mg1是39个dap。所有的水果都用DDH洗涤GydF4y2Ba_2GydF4y2Bao并通过播出干燥，在测量乙烯生产之前将温度平衡至25℃过夜。然后检测乙烯生产以进一步分类AC Mg果实，如先前的研究所述[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]， mg1阶段的乙烯产量为0-0.1 nL·gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯·hGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba，Mg 2为0.1-0.4 nl·gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯·hGydF4y2Ba^-1GydF4y2BaMG 3为0.4–0.7 nL · GGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯·hGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

处理前果柄被丢弃，共10 μL·gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在切割点加入10 μM K252a在0.2%二甲基亚砜(DMSO)中的FW或1 μM OA在0.2%二甲基亚砜(DMSO)中的FW，在−0.02 MPa下真空渗透吸收K252a或OA 2 min，然后平衡10 min，进一步同化。1小时后，在相同条件下，用1g /L的OGs或对照溶液处理果实，除非将果实浸泡在容器中吸收OGs。将表面剩余溶液用纸吸干，在处理后1、2、3、5、8、12和24 h将赤道果皮用液氮冷冻，进行短期变异检测。处理后每天将样品冷冻至11天，以检测乙烯和颜色变化。所有样品保存在−80°C直到使用。GydF4y2Ba

利用果皮圆盘检测AC和突变体果实的短期乙烯产量。将直径为1cm的果皮圆盘置于湿滤纸上，置于100%湿度、25°C的通风气候箱中过夜。将果皮圆盘与1 g/L的OGs或对照溶液在25℃下孵育2 h，表面多余的OGs用滤纸吸干，然后选择几个圆盘测定乙烯产量。保留的果皮圆盘放置在气候箱中，直到进行乙烯检测。我们检测处理后0 h、1 h、3 h和6 h的乙烯产量，每个时间点重复4次。GydF4y2Ba

乙烯测量GydF4y2Ba

果乙烯检测，每个水果放入气密300mL的容器中，在25℃进行1个小时，并使用配备有火焰离子化检测器（日本岛津气相色谱仪（GC）进行分析1个毫升的气体样品，GydF4y2Bahttp://www.shimadzu.com/GydF4y2Ba)以检测乙烯的生产情况，如前所述[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba］．为了检测光盘的果皮乙烯生产的，每四个圆盘置于12毫升瓶1个小时，如上所述，分析1个毫升的气体样品。GydF4y2Ba

RNA提取和实时PCRGydF4y2Ba

使用QIAGen RNA提取套件提取果实总RNA（GydF4y2Bahttp://www.qiagen.comGydF4y2Ba)．的cDNA从1微克使用Transgen一步法的gDNA去除和cDNA合成超混合液总RNA（合成GydF4y2Bahttp://www.transgen.com.cnGydF4y2Ba)．采用Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR检测系统，SYBR Green Supermix (Transgene，GydF4y2Bahttp://www.transgene.com.cnGydF4y2Ba)．用熔融曲线分析验证产物，用相对标准曲线法分析mRNA丰度，归一化至GydF4y2Ba攀登GydF4y2Ba。所有底漆序列都列在附加文件中GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba。在其他文件中提供了用于RT-PCR和在此工作印迹基因标识GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

抗体制备GydF4y2Ba

磷酸LeACS2的抗体由北京创新蛋白制备（GydF4y2Bawww.proteomics.org.cnGydF4y2Ba)根据以往的研究[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．磷酸肽（NHGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- cknnlrlpsfskmmy - oh)，其ser460位点磷酸化[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba，对应于Lys-454 - tyr466序列。用磷酸肽结合牛血清白蛋白多次皮内注射免疫家兔。将兔血清应用于非磷酸肽结合柱，并将流过的馏分应用于磷酸肽柱。用0.1 M甘氨酸- hcl (pH 2.5)洗脱结合IgG，并立即调整至pH 8.0。GydF4y2Ba

用抗原区域532〜703AA制备用于检测LeWaK12的抗体。兔多克隆抗体是通过北京蛋白质创新制备的（GydF4y2Bawww.proteomics.com.cnGydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

蛋白质的提取和变性条件GydF4y2Ba

约0.5 g的水果样品用1.5 mL 10%三氯乙酸丙酮均质，16000离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4℃下3分钟，然后将沉淀与0.1M乙酸铵混合在80％MeOH中，以16,000离心 GGydF4y2Ba4°C保存3分钟。用1.5 mL苯酚/SDS溶液[三酚，pH 8.0;SDS缓冲液(30%蔗糖，2% SDS, 0.2 M Tris pH 8.0, 5% β-巯基乙醇);v:v = 1:1]， 0.1 M醋酸铵在80%甲醇中加入，−20℃孵育过夜。离心机在16000GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C条件下，用甲醇和80%丙酮连续洗涤小球3分钟，风干后，用100μL SDS缓冲液（0.5 M Tris pH 7.0，1.4%SDS）悬浮蛋白质。采用Bradford法测定蛋白质浓度[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]使用牛血清白蛋白作为标准。蛋白质溶解在5×样品加载缓冲液中[125mM Tris-HCl（pH6.8），2％SDS，2％β-巯基乙醇和0.1％溴苯酚蓝]，在100℃下沸腾3分钟并立即插入冰中。GydF4y2Ba

免疫印迹分析GydF4y2Ba

采用SDS-PAGE(8%丙烯酰胺凝胶)分离蛋白，并在硝化纤维素膜(0.45 μm;绘画纸,GydF4y2Bahttp://www.whatman.comGydF4y2Ba)．用5%脱脂乳和0.05% Tween 20在tris缓冲盐水[20 mM Tris-HCl (pH 7.5)， 150 mM NaCl]中室温封闭膜2 h。纯化的抗磷酸化leacs2或leakl2抗体在4°C孵育过夜。用0.05% Tween 20在tris缓冲盐水中洗涤膜，然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (EASYBIO，GydF4y2Bahttp://www.bioeasytech.com.GydF4y2Ba）稀释1：10,000。Willipore Corporation购买了西方化学发光HRP基板。Adobe Photoshop CC量化带的相对强度。GydF4y2Ba

ogg诱导的番茄果实成熟是发育调控的GydF4y2Ba

野生型AC番茄果实在MG 1，2进行处理，并如先前报道制备的3个阶段与OG了[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．处理后每天检测乙烯产量，并拍摄果实。只有MG1果实表现出加速成熟的过程，且MG1果实在两个方面存在差异。乙烯合成加速至3 nL·gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯·hGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba比对照组早约3天(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．此外，乙烯生物合成的最大速率也得到了提高。乙烯积累到~ 8nl·gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba弗兰克-威廉姆斯·hGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在治疗后4天，在此高价值保持在6天后，当它开始缓慢且稳定地减少。在对照水果中，检测到相对较低的乙烯合成速率直至处理后8天。8天后，这两个群体中的速率相似。OG处理的果实的乙烯合成率没有与其他阶段进行对照溶液处理的乙烯合成率没有显着差异（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

随着乙烯的产生，og处理的AC mg1期果实的颜色变化加快，比对照组的颜色变化提前约2天(图2)。GydF4y2Ba2aGydF4y2Ba)．在OG处理的Mg 2或Mg 3阶段果实上发现颜色变化的定时没有改变（图。GydF4y2Ba2aGydF4y2Ba)．在果胶处理过的水果中，红色出现的模式是在水果的表面线性出现的，而不像在对照组中那样从水果的顶部出现。GydF4y2Ba2bGydF4y2Ba)．我们进一步发现，果实表面的红色区域对应于隔层，通过果实与果柄连接处进行真空渗透处理时，OGs主要聚集在隔层。GydF4y2Ba

结果表明，OGs能诱导番茄果实产生乙烯，促进MG1果实成熟。不同果期的结果表明，番茄果实对OGs诱导成熟的反应是受发育调控的。GydF4y2Ba

乙烯感知和信号通路对于OG促进的果实成熟是必要的GydF4y2Ba

确定乙烯感知和/或信号通信路径是否参与了OGS促进果实成熟，番茄果实突变体GydF4y2Ba未熟(Nr)、未熟抑制剂(rin)、未熟(nor)GydF4y2Ba,GydF4y2Ba无色非成熟（CNR）GydF4y2Ba用OGs或对照溶液处理。MGGydF4y2BaNrGydF4y2Ba果实乙烯产量在处理后持续增加，但处理组与对照组无明显差异(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．作为GydF4y2BaNrGydF4y2Ba是乙烯受体突变体，导致抑制乙烯感知[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba[该结果表明，OGS刺激的成熟过程依赖于乙烯感知。GydF4y2Ba

这GydF4y2BarinGydF4y2Ba那GydF4y2Ba也不GydF4y2Ba,GydF4y2Ba中国北车GydF4y2Ba突变体均具有显着降低乙烯的生产水平和成熟过程中不能由曝光到外源乙烯被恢复，这表明乙烯信令功能性缺陷[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］．我们用OGS对待这些突变体来测试乙烯信号通路是否是OG诱导的乙烯生产以及果实成熟所必需的。没有发现明显的差异GydF4y2BarinGydF4y2Ba那GydF4y2Ba也不GydF4y2Ba,GydF4y2Ba中国北车GydF4y2Ba果实成熟有或没有OG了处理过程（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba），表明OG诱导的番茄果实成熟是必需的乙烯信号转导途径。GydF4y2Ba

在OG促进番茄果实成熟的实验中，从OGs处理后第1天开始测量乙烯生成量。Campbell等人发现，经果胶低聚物处理的番茄果盘中的乙烯生成量表现出短暂的增加[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．因此，为了进一步检查乙烯生产中是否存在于OG处理的番茄成熟突变体果实中的短期增强，我们测量了乙烯生产GydF4y2BaNrGydF4y2Ba那GydF4y2BarinGydF4y2Ba那GydF4y2Ba也不GydF4y2Ba,GydF4y2Ba中国北车GydF4y2BaOGs处理后的果盘。在OGs处理后，在所有突变果实中观察到一个短暂的乙烯生成（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．这些结果表明，在缺乏转录因子RIN、NOR、CNR或乙烯受体NR的情况下，og诱导的瞬时乙烯生成并没有受到抑制。GydF4y2Ba

eg调控乙烯合成相关基因的表达模式GydF4y2Ba

为了探究OGs是否影响乙烯合成相关基因的表达水平，我们测量了OGs的长期表达水平GydF4y2BaLeaCs1a.GydF4y2Ba那GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba那GydF4y2BaLeACS4GydF4y2Ba那GydF4y2BaLeACS6GydF4y2Ba,GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba在OGS治疗后（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba)．GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba那GydF4y2BaLeACS4GydF4y2Ba,GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba在OGs治疗12 h时表达上调，但在第2 d后无显著差异。GydF4y2BaLeaCs1a.GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACS6GydF4y2Ba两组均维持在较低水平。由于OGs对乙烯产生的影响以及在第一天内相关基因转录水平的显著变化，需要获得更详细的前24 h乙烯产生和基因表达谱。GydF4y2Ba

我们首先测得的乙烯生产AC水果与OG了治疗或对照溶液后的24小时内。如图1所示。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba，与对照相比，OGs处理5 h、8 h和12 h时诱导乙烯产量显著增加。GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba在治疗后由OGS 1 H诱导，虽然这种增强仅持续2小时。然后，从8小时再次增加，在处理后12小时对对照组增加〜50倍（图。GydF4y2Ba6B.GydF4y2Ba)．找到了类似的表达模式GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6e.GydF4y2Ba)，尽管这一变化不像……那么显著GydF4y2BaLems2。LeACS6GydF4y2Ba还通过诱导处理后OG了1个小时，但是这种效果是短暂的，而不是强如GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6D.GydF4y2Ba)．未发现明显的差异，治疗组之间为GydF4y2BaLeaCs1a.GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACS4,GydF4y2Ba从处理后1 h开始均迅速下降(图2)。GydF4y2Ba6 a, cGydF4y2Ba)．结合乙烯生产和乙烯合成相关基因表达的结果表明GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba是参与OGs诱导瞬时乙烯生成的转录调控的两个相关基因。GydF4y2Ba

OGs诱导的乙烯合成受磷酸化调控，LeACS2在OGs处理后被磷酸化GydF4y2Ba

LeACS2的翻转通过磷酸化/脱磷酸化调节，在乙烯合成中占据重要地位。ser460位点上磷酸化的LeACS2被证明更稳定，并促进乙烯合成[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．为了确定OGs是否参与了磷酸化/去磷酸化过程，在OGs处理前1小时用蛋白激酶/磷酸酶抑制剂处理水果。处理后的乙烯产量检测如图所示。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba。蛋白激酶抑制剂K252a显然抑制了处理后5小时的OGS促进乙烯合成。相反，蛋白质磷酸酶抑制剂冈卡酸（OA）增强了OGS诱导的乙烯生成，与单独的OGS治疗相比，治疗后的差异显着8小时，12小时和24小时。这表明磷酸化/去磷酸化影响了OGS诱导的乙烯合成。GydF4y2Ba

此外，我们选择LeACS2作为靶点，在OGs处理后，使用Ser-460处的抗磷酸化LeACS2的western blot分析检测磷酸化水平。OGs从1h开始诱导磷酸化LeACS2的积累，其最高值出现在5h，随后发现少量磷酸化LeACS2（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba)．蛋白激酶抑制剂K252A在处理后逐渐减少LeMS 2，尽管检测到的值在第一小时比较单独使用OGS处理的样品比较。在用OA预处理时，磷酸化的Lemcs2也在1小时内积聚，但这种效果迅速下降，直至12小时左右，显示OA对OGS治疗的长期影响。GydF4y2Ba

LeWAKL2是由OGs作为候选受体诱导的GydF4y2Ba

WAKs/WAKLs家族成员被认为是OGs的候选受体GydF4y2BaA.拟南芥GydF4y2Ba并参与OGs治疗后的信号转导[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46GydF4y2Ba］．这里，我们发现了GydF4y2BaLewakl2.GydF4y2Ba在处理后2小时，OGs诱导的水平大约是对照果实的三倍（图。GydF4y2Ba9AGydF4y2Ba)．我们还用抗lewakl2 (532-703 aa)进行了western blot分析，检测处理后的蛋白水平。LeWAKL2在处理后继续积累，在8 h达到最大值，对照溶液处理的果实中未检测到LeWAKL2信号(图2)。GydF4y2Ba9B.GydF4y2Ba)．GydF4y2Ba

OGs作为植物诱导子，可以在植物发育和天然防御中调节乙烯、生长素和其他植物激素[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba-GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．我们的实验证实，外源OGs可以在短期和长期内诱导乙烯生成，并加速果实成熟，这与之前使用果皮盘的研究一致[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba］．结果表明，MG - 1期果实的成熟受到发育的调控，且MG - 1期果实表现出明显的表型。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．推测瞬时乙烯生成在番茄果实成熟过程中起关键作用，OGs对MG2/3果实的影响可能被掩盖在果实成熟并产生更多乙烯的过程中。Cutillas-Iturralde等人的研究表明，乙烯是由外源性应用柿子中的木葡聚糖衍生寡糖诱导的(GydF4y2BaDiospyros Kaki L.GydF4y2Ba）和后收获果实显示更明显乙烯生产处理后的[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba］．虽然柿子果实合成的乙烯比番茄果实低，但这一现象强化了寡糖对果实乙烯合成的作用与果实发育阶段有关的观点。GydF4y2Ba

该系统-2乙烯合成在更年期果实成熟的开始启动，并且自动催化乙烯合成在系统-2乙烯合成中的关键作用，以及成熟过程[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba那GydF4y2Ba49GydF4y2Ba］．无论诱导果实成熟所需的乙烯信号转导的加速OG了不清楚。在我们的实验中，我们发现，果皮交流的光盘，GydF4y2BaNrGydF4y2Ba那GydF4y2BarinGydF4y2Ba那GydF4y2Ba也不GydF4y2Ba,GydF4y2Ba中国北车GydF4y2Ba经OGs处理后，所有患者均出现明显的短期乙烯爆裂（另附文件）GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba)．我们认为OG诱导的瞬时乙烯产生类似于通过伤害引发的乙烯生产，这可以迅速引发[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]. 然而，我们的数据表明，乙烯生物合成中具有缺陷的更年期呼吸的突变果实的长期乙烯合成和成熟过程均不受OGs的影响（图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba，附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)．因此，我们推测OGS的果实成熟所需的系统-2乙烯合成和通过乙烯信号通路的自催化调节。此外，之前的研究发现，外源性ABA可以加速Mg番茄果实的成熟过程，这似乎需要乙烯生产，因为1-MCP可以完全阻止ABA对果实成熟和软化的影响[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba］．因此，OG-和aba诱导的果实成熟都需要自催化合成乙烯。GydF4y2Ba

乙烯合成的转录和翻译后调控被证明是植物发育和成熟的关键[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52GydF4y2Ba-GydF4y2Ba54GydF4y2Ba］．证实先前的研究创伤 - 和ABA诱导的乙烯合成大多依赖于转录后调控[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba55GydF4y2Ba］．然而，我们发现，OGS对乙烯生产的调节是转录和翻译后的水平。在转录层面，GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba在OGS治疗后诱导两次（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)，这与之前的研究一致，其中GydF4y2BaAtacs6，Ataco.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtERF1GydF4y2Ba,GydF4y2BaAtERF5GydF4y2Ba是否都是由OGs引起的GydF4y2BaA.拟南芥GydF4y2Ba细胞悬浮液[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba］．此外，我们发现phospho-LeACS2在处理后积累，在处理5 h后达到最大值。K252a降低了蛋白积累量，OA增加了蛋白积累量，尤其是在处理12 h后(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba)．虽然K252A和OA不是特异性蛋白激酶抑制剂，但之前的研究表明K252A可以通过MAPK和CDPK阻断LeaC2的磷酸化[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．玫瑰花朵中发现了类似的结果[GydF4y2Ba57GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

WAK / WAKL系列是与细胞壁连接的受体样激酶，并含有细胞质蛋白激酶结构域[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．AtWAK1已被证明是使用域交换方法[一个OG了受体GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]， AtWAK2在胁迫下起MAPK上游的作用[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．在这里，我们发现，在转录和翻译后水平上，OGs促进LeWAKL2的产生(图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba)．以前的研究发现了GydF4y2BaLewakl2.GydF4y2Ba基因可以在番茄根和细胞悬浮液中的早期增加GydF4y2BaOrobanche ramosaGydF4y2Ba[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba］．因此，LeWAKL2可能是一个OGs受体，传递来自OGs的信号并激活特定的LeMAPKs或LeCDPKs，尽管还需要进一步的研究来阐明OGs是否可以结合LeWAKs/WAKLs或OGs诱导的乙烯生成是如何被LeWAKs或LeWAKLs调控的。GydF4y2Ba

本文研究了OGS的番茄果实成熟的加速，并解释了乙烯合成的详细调节。OGS治疗不同的水果阶段表明OGS对成熟的影响是发育调节的，并且MG1阶段番茄果实表明加速成熟现象。我们还使用了乙烯受体突变体GydF4y2BaNrGydF4y2Ba以及一些乙烯信号缺陷突变体，GydF4y2Ba凛，也不是GydF4y2Ba,GydF4y2BaCGydF4y2BanrGydF4y2Ba，以确定OGs在乙烯信号通路上的功能。OGs没有加速突变果实的成熟过程。因此，我们证明了OGs对果实成熟的作用需要通过乙烯信号通路和乙烯合成的自催化调节。我们的研究还揭示了GydF4y2BaLeACS2GydF4y2Ba和GydF4y2BaLeACO1GydF4y2Ba在OGS存在下迅速上调。此外，OGS可以在SER-460诱导LEAFS2的磷酸化。这些结果表明，OGS在转录和翻译后水平诱导Mg 1番茄果乙烯生物合成，然后促进了番茄果实的成熟。另外，我们发现OGS，Lewakl2的候选受体，其也被OGS在基因和蛋白质水平诱导。GydF4y2Ba

阿巴：GydF4y2Ba

脱盐酸GydF4y2Ba

AC：GydF4y2Ba

Ailsa Craig.GydF4y2Ba

ACC：GydF4y2Ba

1-氨基环丙烷-1-羧酸GydF4y2Ba

华:GydF4y2Ba

ACC氧化酶GydF4y2Ba

ACS:GydF4y2Ba

ACC综合GydF4y2Ba

CNR：GydF4y2Ba

无色非成熟GydF4y2Ba

DAP：GydF4y2Ba

授粉后的几天GydF4y2Ba

DMSO：GydF4y2Ba

二甲基亚砜GydF4y2Ba

DP:GydF4y2Ba

聚合程度GydF4y2Ba

GC:GydF4y2Ba

气相色谱仪GydF4y2Ba

MALDI-MS：GydF4y2Ba

矩阵辅助激光解吸电离质谱GydF4y2Ba

MG:GydF4y2Ba

成熟的绿色GydF4y2Ba

也不：GydF4y2Ba

非成熟GydF4y2Ba

Nr:GydF4y2Ba

漫游者GydF4y2Ba

OA：GydF4y2Ba

冈田酸GydF4y2Ba

og:GydF4y2Ba

Oligogalacturonic酸GydF4y2Ba

答:GydF4y2Ba

polygalacturonase.GydF4y2Ba

PGA：GydF4y2Ba

聚半乳糖醛酸GydF4y2Ba

PME：GydF4y2Ba

果胶甲基酯酶GydF4y2Ba

rin:GydF4y2Ba

成熟抑制剂GydF4y2Ba

薄层色谱:GydF4y2Ba

薄层色谱法GydF4y2Ba

WAK /姿态:GydF4y2Ba

壁相关激酶/类激酶GydF4y2Ba

基金资助:国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(No. 2013CB127104)。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京，中华人民共和国100083GydF4y2Ba

   马颖萱，周磊磊，王志超，陈建廷，瞿桂琴GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba桂琴曲GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

Myx进行了OGS制备，RT-PCR，Western-Blotting，数据处理和稿件写作。ZLL进行乙烯测量和RNA提取。WZC对蛋白质提取进行了蛋白质萃取。CJT参与乙烯测量和数据记录。QGQ负责整体概念和实验设计，数据集成，分析和解释以及稿件写作。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

作者的信息GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba