烟草TTG2通过ARF8与ARF17和ARF19合作调节营养生长和种子生产gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

植物透明TESTA GLABRA (TTG)蛋白通过生长素信号通路调控各种发育活动。最近，我们阐明了烟草的发育作用(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Bal .)NtTTG2与12个编码生长素反应因子(ARF)蛋白的基因相关，包括NtARF8、NtARF17和NtARF19。在这里，我们发现NtTTG2通过参与烟草生长和发育gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba基因，有gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba基因起着主要作用。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

独立消音的gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba基因对烟草生长的抑制作用强于沉默gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba基因更有效地根除了促生长的作用gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba超表达。相比之下，另外9种沉默对植物生长没有影响gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba监管gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因。在双基因和三基因沉默组合中，沉默gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba基因比沉默更有效gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba基因抑制生长，并使生长增强无效。因此,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba主要与gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtAFR19gydF4y2Ba的gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba功能的途径。gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba同时也有助于ntttg2调控的种子生产gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba过表达对制种量起协同作用，同时沉默两个基因比沉默单个基因造成更严重的种子败育。在植物细胞中，NtTTG2蛋白促进了NtARF8的核导入，并增加了其作为转录激活剂的功能。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

NtARF8是调控烟草生长发育的NtTTG2功能通路的一个组成部分。gydF4y2Ba

透明TESTA GLABRA (TTG)蛋白是植物毛状体和种子发育的重要调节因子[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]并在功能调节方面进行了广泛的研究[gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba］．ttg的特征是存在WD40基序，该基序由保守的色氨酸(W)和天冬氨酸(D)二肽组成，长度约为40个氨基酸残基[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba］．通过WD40, ttg可以直接与各种类型的蛋白质相互作用，或作为影响蛋白质-蛋白质相互作用的可互换底物适配器[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]因此能够调节植物的发育和免疫[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba］．根据合作伙伴的生化特征，ttg在发育和免疫反应方面具有不同的功能[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba15gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

烟草(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Bal .)NtTTG1和NtTTG2具有较高的相似性和4个WD40重复序列[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．WD40结构域使NtTTG1与诱导素蛋白ParA1相互作用，ParA1是由卵菌病原体产生的，在植物中诱导超敏细胞死亡[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．NtTTG1-ParA1相互作用对于诱导细胞程序性死亡至关重要，首先是在叶毛状体中，然后是在叶肉中，这反过来又导致植物对不同病原体的抗性[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．相反，NtTTG2通过间接调节蛋白质NPR1 (NONINDUCER of pathogenesis related GENES1)的亚细胞定位来抑制烟草的病原抗性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]，是免疫应答基因的转录激活物[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．NtTTG2不与NPR1相互作用，但将NPR1从核中隔离，从而阻止NPR1通过转录调节免疫反应[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．在另一个研究范式中，AtTTG1gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaJohannes Thal与bHLH转录因子GL3相互作用，而其异质二元复合物进一步与MYB转录因子GL1相互作用，形成WD40-bHLH-MYB三联体，调节毛状体发育[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．这些发现表明TTGs通过直接或间接地与功能伙伴相互作用来调节植物的发育或免疫。gydF4y2Ba

我们通过分析NtTTG2的发育功能gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba-overexpressing (gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba),gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba沉默(gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai)转基因烟草系与野生型(WT)植物或转基因对照系的比较[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．转基因对照系WT:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba该基因含有编码红色荧光蛋白(RFP)的基因，在营养生长、种子产生以及相关的生理反应如花色素苷合成和花朵着色等方面与WT相似[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．相比之下，生长发育大大增强gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba-overexpressinggydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba行(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，在细胞质和细胞核中积累NtTTG2-RFP融合蛋白[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．的gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba基于发夹的转录后基因沉默可损害WT植物的-赋予性状[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

我们进一步证明NtTTG2发育调节功能通路与生长素信号通路的组分有关[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．特别是生长素反应基因已被鉴定gydF4y2Ba新创gydF4y2BaWT转录组的组装，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba通过RNA-Seq分析，i具有普通烟草品种NC89背景的植物[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．烟草转录组包含303个与生长素反应相关的unigenes，其中包括40个预测编码生长素反应因子(ARF)蛋白的unigenes [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．27的表达水平推定gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba而其他13个基因与NtTTG2基因无关gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba在转录水平上受到NtTTG2的调控[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．这些结果提示NtTTG2在植物发育中的作用可能与生长素信号通路有关。gydF4y2Ba

生长素信号通路调控植物发育的各个方面[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]通过ARFs在生长素应答转录调控中的作用[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba26gydF4y2Ba］．由于arf可能激活或抑制生长素反应基因，因此对发育过程的调节结果是积极的或消极的[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba例如，有23种arf被归类为转录激活因子或转录抑制因子[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．ARF转录激活子的特征是在蛋白质序列的中间区域存在几个谷氨酰胺(Q)残基，而转录抑制子在同一区域富含丝氨酸[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．这些arf靶向生长素反应基因gydF4y2Ba小生长素Up RNAgydF4y2Ba（gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba)、生长素/吲哚乙酸诱导(gydF4y2Ba辅助/ IAAgydF4y2Ba),gydF4y2Ba格雷琴·哈根3gydF4y2Ba（gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba)基因家族[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba33gydF4y2Ba］．不同的ARFs通过结合生长素反应元件TGTCTC, GAGACA [gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，或TGTCT [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]存在于目标启动子中。这些元素与arf有许多潜在的组合[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]，但只有少数生长素反应基因被证明是特定的NtARF靶向和直接调控的[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．此外，arf在功能上由AUX/IAA蛋白的各种组合共同调节[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba36gydF4y2Ba］．从本质上讲，尽管有大量的arf以gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和其他物种，arf的直接目标以及个体和组合作用在很大程度上仍然未知，特别是在其他物种中gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

本研究的目的是确定gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba研究了与NtTTG2发育作用相关的基因，并阐明了NtTTG2与相关基因的功能关系gydF4y2BaNtARFgydF4y2BaS代表烟草。我们关注了13个gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba先前已证实受NtTTG2在烟草中的表达调控的候选基因[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．我们在指定时遵循公认的命名法gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba作为数字后缀的基因候选gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2BaS基于与不同植物物种对应的同源物的最高相似性。gydF4y2Ba

在此之前，一个转录后基因沉默(VIGS)系统是由单组分的DNA组成的gydF4y2BaBegomovirusgydF4y2Basp。gydF4y2Ba烟草曲梢病毒gydF4y2Ba［gydF4y2Ba37gydF4y2Ba］．我们已经使用TCSV VIGS系统来静音gydF4y2BaNtTTG1gydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]和免疫调节基因[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba烟草。在本研究中，我们使用相同的系统来静音gydF4y2BaNtARFgydF4y2BaWT背景下的基因:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba,gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai.基于基因沉默效应，我们提出NtTTG2主要调控NtARF8，其次是NtARF17和NtARF19，从而控制烟草的营养生长和种子产量。gydF4y2Ba

NtTTG2gydF4y2Ba对生长素有反应，但不影响内源性生长素水平gydF4y2Ba

为了推断NtTTG2与生长素之间的功能关系，我们进行了分析gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba在含有表面活性剂和合成生长素1-萘乙酸(NAA)的水溶液中，以表面活性剂溶液为对照，处理WT烟草叶片中的表达。NAA处理高度诱导gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba基于实时定量RT-PCR (RT-qPCR)分析，在植物处理后60 h，间隔10分钟进行(图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba曲线)。的数量gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba与对照组的稳态转录水平相比，NAA处理后的转录水平增加了4 - 6倍(图2)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba曲线)。明显增强gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba植物处理后60 h，用Northern印迹法检测其表达。在北方墨迹，gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba与构成表达相比，转录本在稳态水平上被检测到gydF4y2BaEF1αgydF4y2Ba基因在对照植物中，而gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2BaNAA处理后上调(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba插图)。gydF4y2Ba

我们测定了WT叶片中IAA的内源浓度:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba,gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我的植物。的gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba株系表现出最好的发育性状gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba过度表达，和gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我的线条显示了最高的度数gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba沉默与发展妥协[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．三种基因型烟叶器官内源IAA含量差异不显著。在所有植物中，分别在叶片、花和未成熟果实(蒴果)鲜重约70、150和230 ng/g的基础水平上检测到IAA浓度(附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。因此,gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba对外源生长素的应用有响应，而对内源生长素含量没有影响。因为NtARFs在生长素信号转导和生长素生物合成下游过程中起重要作用[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]，我们认为ntttg2调控gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba候选人(gydF4y2Ba19gydF4y2BaNtTTG2与生长素信号通路之间的功能联系。gydF4y2Ba

13 ntttg2调控gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba候选人代表12人gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因gydF4y2Ba

根据RNA-Seq技术鉴定的unigenes的常规命名法[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba), NtTTG2-regulatedgydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba烟草转录组中出现的候选基因是用单基因编码指定的[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．为了便于描述，我们指定gydF4y2BaNtARFgydF4y2BaUnigenes作为传统的基因符号，具有gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba以数字结尾的根据unigenes的最高相似性gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba13个ntttg2在不同的植物物种中被发现gydF4y2BaNtARFgydF4y2BaUnigenes代表12个gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba因为两个unigenes被归为同一类gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。与拟南芥和番茄等其他植物相比，烟草的序列相似性是优先考虑的(gydF4y2Ba茄属植物lycopersicumgydF4y2Bal .)。12种受ntttg2调控的烟草gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因因此被指定为gydF4y2BaNtARF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF5gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF6LgydF4y2Ba（gydF4y2BaNtARF6-LikegydF4y2Ba)，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF9gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF16gydF4y2Ba来gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19LgydF4y2Ba（gydF4y2BaNtARF19-likegydF4y2Ba)(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。核苷酸序列的相似性很容易与已发表的进行比较gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba同系物使用BLAST。gydF4y2Ba

12个gydF4y2BaNtARFgydF4y2Bas分为ntttg2上调和下调两组gydF4y2Ba

阐明NtTTG2与gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因中，12个ntttg2调控gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba在WT背景下静音:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba,gydF4y2BaTTG2gydF4y2BaI，随后评估不同植物基因型叶片中的基因表达水平。之前使用TCSV的DNA成分开发的VIGS系统[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)，最近被我们小组用来沉默gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba［gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]在本研究中使用了另外11个消音单元gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在平行实验中，gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因沉默构建物被用于转染烟草植物，随后验证转基因整合到植物基因组(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．的相对水平gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba利用RT-qPCR定量分析基因的表达量，其表达量随植物遗传背景的不同而不同(图2)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过半定量RT-PCR检测到的相应基因转录物数量的显著减少，可以看出，精心设计的实验方案导致了高基因沉默效率。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)和RT-qPCR(图;gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)分析。所有12种ntttg2都受到调控gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba与WT下的稳态表达水平相比，基因以高效率(> 95%)沉默:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．下gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景下,gydF4y2BaNtARF6LgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19LgydF4y2Ba有更少的转录本，但额外的十个基因(gydF4y2BaNtARF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF5gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF9gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF16gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF18gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba)累积的转录本比WT多:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba工厂。这些基因在胁迫下表现出相反的行为gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我的背景比较gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．因此,gydF4y2BaNtARF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF5gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF9gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF16gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF18gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba由一组上调的ntttg2组成gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因,而gydF4y2BaNtARF6LgydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19LgydF4y2Ba代表情绪低落的群体。在10个ntttg2上调gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba年代,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2BaNtTTG2表达增强程度最高。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．在下调调控的基础上gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai, ntttg2表达水平上调gydF4y2BaNtARFgydF4y2BaS在双基因沉默中进一步减少gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我/gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba我的台词。相反,gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba表达水平部分恢复gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaRFP /论坛gydF4y2BaI植物，这是由于沉默gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba她在TTG2下gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景(图。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba)．高水平的单身gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因沉默和协同效应gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba双重修饰gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba表达可能在未来的研究中进一步研究，以阐明的作用gydF4y2BaNtARFgydF4y2Bantttg2调节植物生长发育。gydF4y2Ba

NtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba导致gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba调控植物生长gydF4y2Ba

最近，我们根据分别在培养基和盆栽中种植的植物生物量(鲜重)的增加，描述了NtTTG2在烟草生长中的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．不同的贡献gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba通过直接观察生长速率来评估ntttg2调控烟草生长的基因。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba)和通过比较新鲜重量的变化(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)转染后15天，对不同植株进行比较。WT之间的生长率无明显差异:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba和WT均未观察到gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba3gydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)，从而证实在对照组中不存在任何表型效应。潜在的影响gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba通过有和没有ntttg2的植物成像来评估ntttg2对植物生长的影响gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因沉默操作(图;gydF4y2Ba3 gydF4y2Bac-n与图的比较。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．植物生长抑制程度低是由沉默引起的gydF4y2BaNtARF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF5gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF6LgydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF9gydF4y2Ba，分别(图;gydF4y2Ba三氟,hgydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．观察到明显的生长抑制gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,或gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba沉默。三个人的独立沉默gydF4y2BaNtARFgydF4y2Bas导致在WT下植物尺寸显著减小:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景，进一步减少gydF4y2BaTTG2gydF4y2BaI植物的大小，并通过减少植物的生长增强gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba3g k和mgydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．相反，沉默gydF4y2BaNtARF11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF16gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF18gydF4y2Ba,或gydF4y2BaNtARF19LgydF4y2Ba在相同遗传背景下，对植株生长率无明显影响(WT:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba,或gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我;无花果。gydF4y2Ba3i j l ngydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

通过量化转染植株与对照植株鲜重的折叠变化，证实了观察到的植物生长程度差异(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．观察到相似的体重变化(约1.7倍)gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物，而WT的重量:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba与WT相比，植物的变化很小(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这些植物被用作评价农药效果的依据gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba相应遗传背景下的沉默(图;gydF4y2Ba4 b mgydF4y2Ba)．沉默后降低小于0.5倍或无明显变化gydF4y2BaNtARF1gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF2gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF5gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF6LgydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF9gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF11gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF16gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF18gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF19LgydF4y2BaWT下:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景(图。gydF4y2Ba4b-e g-k和mgydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．同样的结果也得到了沉默gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba的背景下的基因gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(或gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba),gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我(图。gydF4y2Ba4b-e g-k和mgydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．与此相反，处理后植株重量分别下降3.6倍、2.8倍和3.1倍gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba在WT下静音:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba背景(图。gydF4y2Ba4f j lgydF4y2Ba)．此外，独立沉默后，植株重量减少了2倍gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba下gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai背景(图;gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， f, j, l)与WT下观测值的比较:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．当gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba都沉默了gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba背景，TTG2的程度gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba-授予的植物生长增强分别降低了0.53倍(53%)和1.5倍(图2)。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba， j和l与图的比较。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．更强的损伤gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba观察植物生长gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba沉默，完全抵消了生长促进作用，鲜重进一步降低了1.3倍(图2)。gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba与Fig相比。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这些发现表明gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba是植物生长NtTTG2功能通路的主要辅助调节因子，而gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba起主导作用。gydF4y2Ba

NtARF8gydF4y2Ba的主要交互者是gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Bantttg2调节植物生长gydF4y2Ba

确认…的角色gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba在NtTTG2功能通路中，我们研究了鲜重的变化gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba用这三种物质分别转染不同叶片后的植株gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba在不同的时间点上使用双和三组合构造和VIGS。在所有转染的植物中，三个基因被>沉默了95%，并且以独立的方式沉默(图2)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．例如，沉默gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba不影响的表达水平gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba，而同时沉默gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba没有影响gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba表达式。此外，表达水平gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba在单株植物中，仅通过三基因沉默处理同时下调(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

在最后一轮转染后14天测定植株重量。根据折叠变化的新鲜重量gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba沉默gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba与野生型株系相比，双基因或三基因沉默处理在损害上起协同作用gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单基因沉默后的植物生长增强(图;gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba)．在沉默后观察到最广泛的植物生长促进妥协gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba在双或三基因沉默条件下。在双重组合中，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba在独立减重的基础上，沉默进一步使植株重量减少了1.9倍和4.9倍gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaAFR19gydF4y2Ba沉默。然而，沉默的gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba同时与gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba与沉默相比，导致植株重量额外减少25%和38%gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba一个人。与单基因沉默处理相比，三基因沉默处理使植株重量分别降低0.56 -、3.5-和6.1倍(56%、350%和610%)gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba,分别。很明显，沉默gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba对植物生长的压制比沉默更大吗gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba．此外,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba在10 - 50日生植物生长叶片中表达，远高于gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba:图S2)。在植物生长过程中gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba内参基因的转录本(gydF4y2BaEF1αgydF4y2Ba)分别为1.02 ~ 1.30、0.76 ~ 1.00、0.70 ~ 0.93。这些发现表明gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba在遗传合作中起主导作用gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba从而使NtTTG2调节植物生长。gydF4y2Ba

NtARF8gydF4y2Ba有助于ntttg2调控的种子生产gydF4y2Ba

与叶片表达相似(图;gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba也在其他器官中表达，包括未成熟的果实，以ntttg2依赖的方式(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)。因此,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba除了营养生长外，还可能参与ntttg2调控的发育过程。我们通过分析两者之间的函数关系来验证这一假设gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba烟草种子生产的基因，这是一个重要的发育性状，由gydF4y2BaNtgydF4y2BaTTG2 [gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．我们证实了并行的协同效应gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba沉默对年长植物营养生长的影响(图;gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba)与较年轻的植物(无花果。gydF4y2Ba3 ggydF4y2Ba而且gydF4y2Ba4 fgydF4y2Ba)．我们还证实了基因合作gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba通过评估并发基因过表达对植物生长的影响(图;gydF4y2Ba6 a - cgydF4y2Ba)．WT的变换gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物与gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，它与编码黄色荧光蛋白(YFP)的基因融合，产生了转基因株系，gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba而且gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba,分别。五个gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba行和五gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba的独立和并发过表达表明，系的特征是基于植物生长增强gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:图S4)。gydF4y2Ba

我们比较了gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2BaLine和agydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2BaWT线:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba我,gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我/gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba我和gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物在种子生产数量方面。尽管在某些基因型中观察到果实的种子密度相似(图2)。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)，不同基因修饰后，单果的种子数有显著差异gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．独立消音gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba导致种子急性败育，而超过97%和96%的种子败育(图2)。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)，分别在gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba我和gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba与WT中观察到的植物相比:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba．并发败种较严重gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba与单基因沉默效应相比，这进一步减少了每个果实的种子数(图2)。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．种子败育导致果实萎缩，这是与种子败育有关的一个明显的表型gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba与WT下观察到的正常种子外观相比的沉默:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．相比之下，的独立过表达gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba大大促进了种子产量，使单果种子数量增加了45%和32%(图2)。gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)，从而形成饱满的果实(图。gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)．同时，观察到种子产量的提高gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba过表达，与独立过表达的效果相比，导致种子数量增加11%和24%gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，分别(图;gydF4y2Ba6 egydF4y2Ba)．这些发现表明gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba是ntttg2调控烟草种子生产的重要组成部分。这一观点与幼果中NtTTG2表达的改变是一致的(附加文件)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:图S3)，并进一步证实了NtTTG2在种子生产中的作用[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

NtARF8是一个解释性靶基因的功能转录激活子gydF4y2Ba

NtARF8蛋白(GenBank midd 24875793)是该蛋白的预测蛋白gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba该基因是我们最近从普通烟草品种NC89中克隆出来的[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．假定的NtARF8蛋白在氨基酸水平上与特征良好的同源蛋白高度相同(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:图S5)，共享中间区域保守的Q区(图S5)。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，以ARF转录激活因子为特征[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31gydF4y2Ba］．富q区位于NtARF8序列的348到598个残基位点。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)，由843个氨基酸组成。基于这些结构特征，NtARF8是一种潜在的转录激活因子。gydF4y2Ba

为了验证这一预测，我们使用了gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba（gydF4y2BaNt-gh3gydF4y2Ba)基因，以说明NtARF8在转录激活中的作用。这个实验背后的基本原理是gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba是烟草中的生长素反应基因[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba并且最近在烟草转录组的ntttg2调控谱中被检测到[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba表达式是gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba依赖的，增强的gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba过度表达，却被压抑gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba沉默,而gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba作为gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba基因影响gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba表达式(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S6)。此外，典型的生长素反应元件TGTCT [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]以两个重复(409-413和798-802)存在gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba启动子(GenBank登录号AJ620494)。在电泳迁移率转移试验(EMSA)中，该元件作为WT探针被证明与NtARF8-His融合蛋白结合，但不与突变体ACAGC结合(图5)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

染色质免疫沉淀(ChIP)使用从WT中分离的染色质:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba我和gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba测试NtARF8是否能与gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba启动子。使用特异性RFP抗体鉴定染色质样品的靶DNA组成，并假设靶DNA与存在于同一染色质样品中的ARF8-RFP融合蛋白结合。沉淀DNA通过PCR与两个相关对照并行定量。一种是输入参考，其中部分染色质样品未经过免疫沉淀。另一种是抗体缺失参考物(−AB)，其中染色质样品的不同部分在缺乏抗体的情况下进行标准免疫沉淀程序。这些DNA样本被PCR扩增使用的引物是特异性的启动子或编码序列(CDS)gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因。数字gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba这表明没有gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba在3种植物的染色质中检测到CDS DNA，而在3种植物的染色质中检测到CDS DNAgydF4y2BaGH3gydF4y2Ba启动子仅在gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba染色质样本，从而表明NtARF8与启动子特异性结合。类似地,gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因在gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba或WT:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，但不在gydF4y2BaARF8gydF4y2BaI植物，基因转录高5倍gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba植物比WT:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)．这些发现表明NtARF8确实是靶基因的转录激活因子。gydF4y2Ba

NtTTG2促进了NtARF8的核定位gydF4y2Ba

为了推断NtTTG2如何调节NtARF8作为转录激活剂的功能，我们测试了两种蛋白是否直接相互作用。使用酵母双杂交检测或双分子荧光互补检测未发现相互作用(附加文件)gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S7)。然后，我们检测转染WT根后NtTTG2-RFP和NtARF8-YFP融合蛋白的亚细胞分布:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我和gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba具有gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba融合基因。转染根细胞的荧光成像显示，NtARF8的亚细胞定位随着NtTTG2数量的改变而改变(图5)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．荧光缺失gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai背景，而在WT的细胞质和细胞核中观察到高水平的RFP荧光:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba细胞。下gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba在此背景下，NtTTG2-RFP融合蛋白在细胞质和细胞核中都有强烈的荧光(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．三种遗传背景对NtARF8-YFP融合蛋白的亚细胞定位有不同的影响。这种蛋白质是用gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai，在WT的高水平积累时:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba根(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．与NtTTG2的双定位相似，在WT的细胞质和细胞核中也检测到NtARF8-YFP:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba细胞。在gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba， NtARF8-YFP主要在细胞核中检测到(图;gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了量化改变NtTTG2水平对NtARF8亚细胞定位的影响，我们计算了显示NtTTG2- rfp荧光的根细胞数量(图5)。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba)或NtARF8-YFP(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)只存在于细胞质中，只存在于细胞核中，并且同时存在于两者中。我们的观察证实了NtTTG2-RFP在细胞质和细胞核中的双重定位。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．不同遗传背景下NtTTG2的数量决定了NtARF8-YFP具有细胞质、核或双位置的细胞数量(图2)。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．NtARF8-YFP仅在细胞质和核中检测到，其比例与WT相当(40% - 50%):gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba而NtARF8-YFP在95%以上的细胞中仅定位于细胞核gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba细胞。在细胞质和核间隙中，NtARF8-YFP均可见少量或未检出gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai背景(图;gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba)．这些数据表明，过表达NtTTG2促进了NtAFR8在细胞核的定位。gydF4y2Ba

ntttg2促进了NtARF8的核定位，增强了其作为转录激活剂的作用gydF4y2Ba

根细胞荧光成像结果(图;gydF4y2Ba8 a - cgydF4y2Ba)与叶细胞细胞质和核部分蛋白质的免疫印迹分析结果一致(图2)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．用磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)和组蛋白H3分别作为细胞质和核标记分析细胞质和核蛋白[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba］．将一组蛋白印迹与我们前期研究中新西兰大白兔免疫产生的NtTTG2抗体进行杂交[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．杂交检测到WT中大量的NtTTG2蛋白:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba而且gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物，虽然低蛋白表达水平观察到gydF4y2BaTTG2gydF4y2Bai.在WT的细胞质和核部分中观察到类似水平的NtTTG2:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba，细胞核中检测到的水平高于细胞质中检测到的水平gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba细胞(图。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．一组独立的蛋白印迹与特定的商业制造的YFP抗体杂交[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．杂交结果表明，NtARF8-YFP融合蛋白在WT的细胞质和细胞核中表达量相近:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba细胞，而在gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我的细胞。在gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2BaNtARF8-YFP在细胞核中检测到较高水平，而在细胞质中检测到较低水平(图2)。gydF4y2Ba8 dgydF4y2Ba)．这些发现证实过表达NtTTG2有助于NtARF8定位于细胞核。这些结果也表明，NtTTG2的充分生产和核定位需要NtARF8的核定位。gydF4y2Ba

核定位是转录因子在基因表达调控中发挥作用的先决条件[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba］．因此，假设ntttg2调节的NtARF8亚细胞定位是影响NtARF8表达的必要条件是合乎逻辑的gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因，它被用作NtARF8的一个说明性靶(图。gydF4y2Ba7罪犯gydF4y2Ba)．一种可能的中间机制是核定位的增加为转录因子与目标启动子结合提供了更多的机会。这一假设通过ChIP PCR检测和叶片基因表达水平的定量验证。通过RT-qPCR对叶片ChIP DNA样本进行定量，同时对输入参比的DNA样本和ab缺失参比的DNA样本进行定量。通过使用这种精心设计的试验，NtARF8-YFP结合的亲和力gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba启动子(gydF4y2BaGH3gydF4y2BaP)的定量为在均匀反应体积下处理的定量叶片样品中PCR产物的相对数量。数字gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba表明ARF8-的表达程度很低gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba检测P的结合亲和力gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba与输入的参考电平进行比较。相反,ARF8 -gydF4y2BaGH3gydF4y2BaP的结合亲和力显著增加gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba与WT相比:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba/gydF4y2BaARF8gydF4y2Ba：gydF4y2BaYFPgydF4y2Ba背景(图。gydF4y2Ba8 egydF4y2Ba)．这些发现表明ntttg2促进了NtARF8的核定位，增加了其与NtARF8结合的能力gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba启动子。gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba就这样被上调了gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba：gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba叶子，但其表达被高度压抑在gydF4y2BaTTG2gydF4y2Ba我:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba与WT叶片中观察到的稳态表达相比:gydF4y2Ba招标书gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)．与之相似的叶片表达模式gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8 fgydF4y2Ba)．因此，NtARF8和NtTTG2除了在亚细胞定位中发挥共同作用外，还涉及到转录水平的协调调节机制。gydF4y2Ba

NtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba协调响应生长素gydF4y2Ba

职能协调gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba两种情况下两种基因同时表达进一步证明。首先,gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba沉默和过度表达可显著增强和抑制gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba的类似修饰，分别表示gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba没有影响gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba表达式(附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S6)。因此,gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba是必不可少的gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba表达式，意味着gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba上游功能gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba在调节植物生长发育方面。第二,gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba就像gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2BaNAA在WT植株上施用60 h后，对生长素的响应和表达增强(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．在平行实验中，的量gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba与对照组相比，NAA处理60 h后转录本增加6.9倍。在同一时间点，gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba与对照组中检测到的稳态水平相比，表达上调5.3倍(图2)。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)．的坐标响应gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba表明这两个基因同时参与生长素信号转导。gydF4y2Ba

先前的研究表明TTGs通过与不同功能伙伴的相互作用或合作来调节植物发育过程和/或免疫反应[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAtTTG1的功能伙伴包括两个不同的转录因子，bHLH [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]和MYB [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba］．在烟草中，NtTTG1通过识别生物激发子和涉及转录因子NPR1来调节免疫反应[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．相比之下，NtTTG2是一种免疫抑制因子的特征，它特别抑制NPR1的功能途径，从而赋予疾病易感性[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．NtTTG2还作为发育的正向调节因子，与生长素信号通路相关，特别是与12的差异表达有关gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．在本研究中，我们阐明了NtTTG2调节营养生长和种子生产的一种以前未被认识的机制。这一新机制是由基因合作gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba,gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba，在生长素相关基因ntttg2上调的转录谱中大量表达[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba](附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)。我们进一步阐明了NtARF8与NtARF17和NtARF19在影响NtTTG2功能通路方面起着主要的合作作用。gydF4y2Ba

研究表明，ARF8在烟草生长发育调控中是NtTTG2和生长素信号通路之间的主要机制连接子。证据已在转录和转录后水平，以及细胞学规模，特别是关于功能之间的关系gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba基因和蛋白质。在转录水平上gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba基因被外源应用的生长素诱导(图;gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，但基因表达水平的改变gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba不影响不同植物器官中生长素的内源性含量(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)。基于之间的联系gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba生长素信号gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba吉恩似乎是最有可能的人选。gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba其中有一种是新的12种特征吗gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba监管gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba基因(附加文件)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1)，最初被认为是13个假定的gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba烟草转录组中的基因[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．的表达式gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba(comp30272_c0和comp42904_c0)上调gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba过度表达和下调gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba沉默。在相同条件下，gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba(comp39443_c0)和gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba(comp38146_c2)显示了与的相似的行为gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba的表达水平较低gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba但是比9要高gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba监管gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba］．这些发现表明NtTTG2在生长素产生后起调节作用gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba基因的表达。gydF4y2Ba

根据基因沉默效应，12种基因中有10种和2种有特征gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba基因分别正向和负向调控NtTTG2(图;gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．在ntttg2上调基因中，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba沉默比沉默更有效gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba或gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba抑制生长和根除增强生长的效果gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba超表达(无花果。gydF4y2Ba3 gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．这一发现提示了…的主导作用gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba关于gydF4y2BaNtARF17gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF19gydF4y2Ba．通过将这些发现与基因沉默对种子产量的影响相结合(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，我们认为NtARF8是ntttg2调控植物生长发育的重要组成部分。在分子水平上，NtTTG2和NtARF8之间的功能关系不同于WD40-bHLH-MYB复合物在毛状体发育中的功能关系[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，也不同于AtARF8-bHLH相互作用对花瓣生长的影响[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．在表型水平上，由NtTTG2和NtARF8组成的功能通路负责营养生长和种子产生，但它是否也影响NtTTG2调控的其他性状[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba仍有待确定。gydF4y2Ba

在细胞学水平上，NtTTG2蛋白通过调节其在细胞核中的定位间接调节NtARF8作为转录激活剂的功能(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．NtARF8作为转录激活因子的功能已被证实gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba，这是一个ntttg2调控的生长素反应基因，以前在烟草中发现过[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba](附加文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba:图S6)作为NtARF8的潜在靶基因。选择烟草的基本原理gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因是基于AtARF8的刺激作用对表达gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba直接同源的gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]，即GH3启动子中存在典型的生长素响应元件(TGTCT) (GenBank登录号AJ620494)。基于ARF转录激活子的元素识别[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]，即NtARF8蛋白与蛋白结合的能力gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba促销员是符合的gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba表达水平随沉默而降低，随沉默而升高gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba超表达(无花果。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．NtARF8的转录调节活性需要NtTTG2蛋白调节下的核输入，而NtTTG2则依赖于其在细胞质和细胞核中的双重位置来完成这一细胞学角色(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．当WT背景下NtTTG2处于稳态水平时，NtARF8也在相同的双位置稳态水平上产生(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这一观察结果表明，NtARF8的稳态水平足以调节ntttg2授予的发育。这种假设的NtTTG2与NtARF8之间的动态关系与NtTTG2蛋白或基因转录本的就绪状态水平是一致的[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)和基础水平的生长素(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba:图S1)在WT背景下。然而，随着过表达，NtTTG2蛋白数量的增加导致NtARF8定位到细胞核的比例升高，并伴有tgydF4y2BaGH3gydF4y2Baupregulation(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．因此，NtARF8的核定位及其激活靶基因表达是NtTTG2功能通路中的重要步骤。这一途径是通过一个与生长素信号的串扰来执行的，这一点可以从植物的坐标响应中得到证明gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba而且gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba对生长素(图;gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)和ntttg2依赖的NtARF8在调节生长素反应基因转录中的作用(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba而且gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

烟草gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因仅被用作NtARF8靶基因的一个例子，以阐明NtARF8作为转录激活子的功能。我们不打算说明是否gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba有助于ntttg2授予的烟草生长和发育。gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因编码iaa偶联酶，这些酶可能会终止植物的生长素信号，以恢复植物生长发育过程中的生长素超敏反应或引发生物应激反应[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44gydF4y2Ba］．在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba， AtARF8过表达导致增强gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba表达，生长素含量增加30%，发育短下胚轴[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba］．这些结果表明，NtARF8在植物生长中的作用与生长素信号的作用与根尖优势的适当水平有关。目前，我们还没有证据表明这种生长素稳态机制是否参与了NtTTG2-NtARF8调节烟草生长发育的功能通路。gydF4y2Ba

NtTTG2和NtARF8亚细胞定位的同时变化对于NtARF8在解释性靶基因的转录调节中执行功能至关重要(图3)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．NtARF8的核定位和转录调节活性显然需要NtARF8蛋白的上调。在这种情况下，gydF4y2BaNtARF8gydF4y2Ba可以诱导基因表达，以确保由NtTTG2过表达引起的蛋白质的进一步生产。因此，NtTTG2和NtARF8的核定位可能诱导了涉及特定基因转录的反馈机制。这种假设的反馈机制可能发生，例如，当NtARF8在NPR1存在的情况下对生长素反应基因执行其功能以激活免疫反应基因时。在后一种情况下，NPR1在单轮基因激活后被水解，这种新的NPR1分子用于每一轮转录调控[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba］．然而，该蛋白水解模型并不排除另一种机制，即过表达的NtTTG2将大量NtARF8转运到细胞核中，NtARF8在细胞核中激活大量生长素响应基因，如gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)．这两个模型的核心问题是NtARF8与NtTTG2在物理上是如何连接的。因为NtTTG2不直接与NtARF8交互(附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba:图S7)，应确定填补ntttg2介导的NtARF8核输入明显空白的其他成分。候选蛋白最有可能是导入蛋白家族的特定成员，因为这些蛋白在蛋白质和核酸的核浆运输中起着货物载体的作用[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba］．未知的介质，如导入蛋白，可能调解NtTTG2和NtARF8之间的联系，并协助NtTTG2将NtARF8运输到细胞核。这一假设的检验将是未来研究的主题。gydF4y2Ba

遗传分析表明，ARF8、ARF17和ARF19参与ntttg2调控烟草生长发育，而ARF8在这一过程中起主要作用。分子证据表明，ARF8是一个功能性转录激活因子，而NtTTG2蛋白通过调节其在细胞核中的定位间接调节NtARF8的功能。从本质上讲，NtARF8是控制烟草生长发育的NtTTG2功能通路的一个组成部分。gydF4y2Ba

植物生长与处理gydF4y2Ba

常见烟草品种NC89与T3纯合代转基因株系[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]被用于本研究。转基因植物在本实验室生成、鉴定、繁殖，WT和转基因植物的种子也在本实验室保存。对根系进行实验，种子消毒发芽，随后，幼苗在10厘米见方的Murashige和Skoog (MS)琼脂培养基上生长，在环境控制的条件下，在植物生长室中，光照14小时(250 μE/m)gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba/s(26°C)和10小时暗(23°C)循环。或者，种子在装满沙子和盆栽土壤混合物的花盆中播种和发芽，随后幼苗在植物生长室中生长。在种子萌发后30天，将幼苗转移到含有相同基质的新花盆中，根据实验目的在不同条件下生长。用于评估营养生长的植物在室内生长，用于制种的植物在23°C - 26°C的温室中生长。在室内连续生长20天后，植物被用于基因沉默实验或用于naa诱导的分析gydF4y2BaNtTTG2gydF4y2Ba表达式。用0.02% (v/v)的表面活性剂Silwet-77修饰2 μM的NAA溶液，用雾化器喷洒于植物表面。0.02%的Silwet-77溶液同样应用于对照。处理后60 h，每隔10 h对处理植株进行基因表达分析。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

根据不同的研究目的，RNA从完整的根、顶部5厘米的茎、顶部6分叶、S3期花[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，以及70天植物的15天未成熟果实。Northern印迹与地高辛标记的特异探针杂交[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba］．RT-PCR和RT-qPCR采用特异性引物(附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S2)和先前描述的协议[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．本构表达式gydF4y2BaEF1αgydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba，gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]作为参考。采用RT-qPCR方法定量检测各被测基因的相对表达量gydF4y2BaEF1αgydF4y2Ba基因作为参考[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

内源性生长素测定gydF4y2Ba

内源性游离生长素(IAA)浓度的测定采用先前描述的方法[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba］．分离游离IAA, 30日生植株上6叶，S3花[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]，并采集70天大植物的未成熟果实。每个器官大约1克，用研钵和杵在液氮中研磨。将组织粉溶解在10 mL 80% (v/v)乙醇中，并加入0.1 mg的抗氧化剂2,6-二叔丁基-对甲酚。匀浆超声30分钟，然后离心(4°C, 10,000gydF4y2BaggydF4y2Ba， 10分钟)。将上清液与等体积矿物醚混合进行液相萃取，重复3次，每次收集底层无机相。将最后一次萃取的溶液调整到pH8.5，加入0.2 g的乙烯基吡咯烷酮，然后用等体积的乙酸酯进行三轮液相萃取，收集上层有机相。最后有机相中的IAA使用OASIS MAX Cartridge 3 cc/60 mg杂化阴离子交换树脂(Waters OASIS)进行层析纯化。用高效液相色谱法对溶质进行分析。采用标准IAA曲线法测定提取物中IAA的浓度。测定植物器官中游离IAA的含量，并以ng/g新鲜组织表达。gydF4y2Ba

中收取gydF4y2Ba

部分碎片(207-495 bp)gydF4y2BaNtARFgydF4y2Ba利用从叶片中分离的RNA和根据相应unigenes序列合成的引物，通过RT-PCR方法克隆基因(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S2)。RT-PCR产物测序确认，每个序列插入TCSV VIGS系统的pBinPlus:Y35 DNA-A载体[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba产生各种各样的gydF4y2Ba东盟地区论坛gydF4y2Ba消声结构。每个构念都被转换成gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaEHA105细胞[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba］．将重组EHA105细胞悬浮液浸入50日龄植株中茎韧皮部。用纯水作为对照进行了类似的转染处理。两周后，基因沉默效率如前所述进行分析[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

EMSA和ChIPgydF4y2Ba

EMSA和ChIP分析采用先前描述的方法进行[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．对于EMSA, ARF8蛋白被融合到His标签上获得6个串列组氨酸残基，并通过原核表达产生融合蛋白[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba］．先前设计的WT探头，5'-CATTATTTACGgydF4y2BaTGTCTgydF4y2BaGTTTTCCTG-3'和突变体5'-CATTATTTACGgydF4y2BatagatgydF4y2BaGTTTTCCTG -3' [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]在生物素标记后用于EMSA。ChIP实验中使用的染色质是从50天大的植物的顶部6片叶子中分离出来的，如其他地方所述[gydF4y2Ba50gydF4y2Ba］．染色质片段和NtARF8-YFP复合物(ARF8-IP复合物)用特定的YFP抗体(Santa Cruz)和蛋白a琼脂糖/鲑鱼精子DNA珠(Millipore)沉淀。通过离心收集与珠粒结合的NtARF8-IP配合物。每次免疫沉淀的抗体和染色质浓度分别为10 μg和50 nM。在没有抗体作为对照的情况下进行了类似的沉淀和离心程序。未沉淀的染色质作为输入。分别对ChIP、对照和输入的DNA样本进行PCR分析，使用的启动子和CDS特异性引物gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba基因(附加文件)gydF4y2Ba9gydF4y2Ba:表S2)。PCR产物经测序确认。gydF4y2Ba

荧光成像技术gydF4y2Ba

的gydF4y2BaARF8-YFPgydF4y2Ba以植物二元载体pCAMBIA1301为载体构建融合基因，并将其转入植物细胞gydF4y2Ba农gydF4y2Ba菌株EHA105使用先前描述的方法[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．将在MS琼脂培养基上生长20天的植株根部浸泡在重组EHA105细胞的悬浮液中进行转化。大约60小时后，在ZEISS LSM710共聚焦显微镜下观察根部样品。在561和514 nm的激发波长下，用氩激光分别在591-630和519-560 nm处捕获红色和黄色荧光[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

免疫印迹gydF4y2Ba

总蛋白提取自上六叶[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]、细胞质部分和核部分[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba50天大的植物。Western blot与我们前期研究中免疫新西兰大白兔产生的YFP特异性抗体(Novagen)或NtTTG2特异性抗体进行杂交[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba］．作为细胞质和核标记的PEPC和组蛋白H3 [gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]分别与特异性PEPC抗体(Rockland)和组蛋白H3抗体(Abcam)杂交。杂交印迹检测使用山葵过氧化物酶偶联二抗(Beyotime)根据制造商的建议。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

所有实验至少进行了三次，结果相似。定量数据采用商用IBM SPSS19.0软件包进行分析[gydF4y2Ba53gydF4y2Ba］．采用Levene检验确定数据的方差齐性，采用Kolmogorov-Smirnov检验和P-P图确认数据的形式分布模式。数据采用方差分析，分别采用Fisher最小显著性差异检验和Tukey-Kramer检验。对不同植物基因型的多重比较差异进行了显著性检验。gydF4y2Ba

Arf，生长素反应因子;gydF4y2Ba辅助/ IAAgydF4y2Ba，生长素/吲哚乙酸诱导剂;ChIP(染色质免疫沉淀);EMSA，电泳迁移率变化分析;gydF4y2BaGH3gydF4y2Ba，gydF4y2Ba格雷琴·哈根3gydF4y2Ba；NAA, 1-萘乙酸;Npr1，发病相关基因1的非表达子;ParA1，由卵菌病原体产生的诱导素蛋白;磷酸烯醇丙酮酸羧化酶;RFP，红色荧光蛋白;RT-PCR，逆转录聚合酶链反应;RT-qPCR，定量实时RT-PCR;gydF4y2Ba阿富汗二月gydF4y2Ba，gydF4y2Ba小生长素Up RNAgydF4y2Ba；TCSV,gydF4y2BaBegomovirusgydF4y2Basp。gydF4y2Ba烟草曲梢病毒gydF4y2Ba；透明的毛苔;病毒诱导基因沉默;YFP，黄色荧光蛋白gydF4y2Ba

我们感谢周雪平博士赠送的VIGS载体。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家自然科学基金(资助号31171830)，中国新型转基因生物育种计划(2014ZX0800910B)，公益性产业专项计划(201303015)。这些资助机构没有参与研究的设计和数据的收集、分析和解释，也没有参与撰写手稿。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

序列信息gydF4y2BaNtARFgydF4y2Baunigenes/candidate在附加文件中提供gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:表S1。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

JG设计并执行了实验并撰写了论文。BL设计并进行实验，并对数据进行分析。DS、JX和JL进行实验。HD设计了实验并撰写了论文。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

作者宣称他们之间没有利益冲突。gydF4y2Ba

发表同意书gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准并同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 南京农业大学作物病虫害综合防治教育部重点实验室，植物生长与防御信号实验室，江苏南京210095gydF4y2Ba

   葛军，李宝燕，沈丹，谢俊义，龙菊英，董汉松gydF4y2Ba

2. 烟台市农业科学院，烟台265500gydF4y2Ba

   Baoyan李gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaHansong董gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创作共用属性4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒介上不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原作者和来源给予适当的赞扬，提供到创作共用许可证的链接，并注明是否进行了更改。创作共用公共领域奉献弃权书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)除另有说明外，适用于本条所提供的资料。gydF4y2Ba

转载及权限gydF4y2Ba