OsACOS12gydF4y2Ba拟南芥酰基辅酶a合成酶5 (acyl-CoA synthetase5)在水稻花粉外皮形成和花药发育中起重要作用gydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

孢粉素是花粉外壁模式的主要组成部分。在拟南芥中，酰基辅酶a合成酶5 (gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba）参与孢子醇素前体生物合成。在这项研究中，我们确定了它的正轨，gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba，在米饭中（gydF4y2Ba奥雅萨苜蓿gydF4y2Ba)的功能保存比较gydF4y2Ba这些“可信赖医疗组织”gydF4y2Ba在稻米到拟南芥。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

序列分析表明，Osacos12与ACOS5共用63.9％氨基酸序列同一性。的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba由一个过早成熟的终止密码子引起的突变gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba在水稻中表现出有缺陷的雄性不育表型。原位杂交证明了这一点gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在转录物水平上表达Tapetal细胞和幼儿孢子。OSACOS12-GFP的定位证明了OSACOS12蛋白在翅膀细胞和花药局内积累。gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba由此驱使gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba启动子可以部分恢复雄性生育能力gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba在拟南芥突变体。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

OsACOS12gydF4y2Ba是一个正直的gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba这对水稻中的孢子蛋白合成至关重要。gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在单子叶和二萝萝卜物种中保存花粉壁形成。gydF4y2Ba

男性生殖开发是开花植物繁殖的重要生物学过程。花粉发展是男性复制的主要事件。导致雄性不育的发育缺陷广泛用于农业中的杂交生产[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba］．在花粉发育过程中，花粉壁形成是花粉活力和男性生育率所需的关键过程。花粉墙体结构分成外部外部和内部内侧。进出进一步分为特异性的士兵和扁平的腰部[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．雄蕊的主要成分是孢粉素[gydF4y2Ba3GydF4y2Ba]，而缘缘主要由糖蛋白组成[gydF4y2Ba4gydF4y2Ba］．性曲线的生物学功能是提供一种外部屏障，用于适应陆地环境，以确保陆地植物中的微慢性态生存，以抵抗各种环境应力和微生物攻击[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba］．性取向模式也是植物分类的一个重要特征[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

孢粉素被认为是一种复杂的聚合物，主要由长链脂肪酸、含氧芳香环和苯基丙酸组成[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba］．绒毡层是正常的雄性不育体发育和花粉成熟所必需的重要组织[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba］．基于细胞学和分子证据，孢子醇素前体的材料源于塔皮特细胞[gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．孢子醇蛋白前体最初沉积在令人生作的模具中以形成探针和预防结构。在释放微孔后，输出结构的尺寸随着孢子醇的连续沉积和聚合而增加，直到装饰的性感图案形成[gydF4y2Ba12.gydF4y2Ba］．然而，孢子醇前体的确切成分尚不清楚。在拟南芥中，据报道了几种基因涉及孢子醇蛋白前体形成的复杂生化途径，包括用于脂肪酸衍生的化合物代谢，PKSA / B和TKPR1 / 2的CYP703A2，CYP704B1和MS2，用于苯基丙醇合成，ABCG26运输 [gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．所有这些基因都在绒毡层转录水平上表达。在蛋白水平上，MS2定位于绒毡层细胞，而CYP703A2同时存在于绒毡层细胞和花药室[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．孢子醇素前体合成的最后几步可能发生在当局中。gydF4y2Ba

Sporopollenin是一般的组成部分，广泛存在于苔藓，蕨类植物，裸子植物和被子植物中。孢子醇素合成似乎在各种物种中分享常见的代谢途径。Tapetum直接为花粉壁形成提供材料。Tapetum发育的遗传途径通常在水稻和拟南芥之间保守[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．在水稻中，已经确定了几种孢子醇蛋白酶[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．这些酶的生物学功能和合成孢粉素的代谢途径在水稻和拟南芥之间是非常保守的。然而，上述水稻基因突变的花药角质层存在缺陷，而拟南芥的同源突变体花药壁没有明显的形态变化。有人认为，在水稻中脂质途径是多种多样的[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

ACOS5.gydF4y2Ba在拟南芥中编码用于孢子醇素前体合成的脂肪酰基-CoA合成酶（ACOS）[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba27.gydF4y2Ba］．水稻中有九个脂肪酰基-CoA合成酶编码基因[gydF4y2Ba28.gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们描述了一个拟南芥的同源物gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba在大米、gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba（gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba)．该基因的敲除导致水稻雄性不育表型与缺陷的雄性不育层和花药角质层。os12蛋白的绒毡层和花药室定位表明，孢粉素前体的生物合成和运输是同步的。的表达式gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba基因gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体部分地恢复了雄性无菌表型，表明酰基-CoA合成酶基因是拟南芥和水稻之间的保守功能。gydF4y2Ba

OsACOS12gydF4y2Ba在gydF4y2Bao.苜蓿gydF4y2Ba是一个正直的gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba在gydF4y2BaA. Thaliana.gydF4y2Ba

利用拟南芥ACOS5蛋白序列进行BLASTP分析得到gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba在水稻中编码脂肪酰基辅酶a合成酶(gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/gydF4y2Ba)．在拟南芥基因组中，LOC_Os04g24530序列与ACOS5序列相似度最高(63.9%氨基酸序列同源性，图)。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba)．gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba被指定为gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba之前 [gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．酰基活化酶的大超家族包含与amp结合和脂肪酸结合的假定基序[gydF4y2Ba29.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba］．这些图案之间的温度高度保守gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba和gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba1AgydF4y2Ba)．根据GenBank数据库，通过BLASTP搜索，已在多种植物中鉴定出OsACOS12蛋白的同源物。在绿藻的基因组中找不到同源基因。系统发育分析表明，OsACOS12及其同源基因形成了四个不同的分支。的同系物gydF4y2BaPhyscomitrellagydF4y2Ba和gydF4y2Ba卷柏gydF4y2Ba形成了两个在土地植物演化中发散的不同曲线。来自二旋曲霉（二象膜）和单圈种物种的同源物形成另外两种枝条（图。gydF4y2Ba1B.gydF4y2Ba)．序列分析表明，ACOS酶在陆生植物中存在，可能参与孢粉素的生物合成，这是保护配子体适应陆生环境的需要。gydF4y2Ba

osacos12gydF4y2Ba突变体表现完全雄性不育gydF4y2Ba

表征函数gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba，我们得到一个等位基因gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba利用甲基磺酸乙酯诱导的水稻基因组靶向诱导局部病变(Tilling)技术gydF4y2Bao.苜蓿gydF4y2BaSSP。japonica）[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．序列分析显示，该基因在起始密码子下游第1000个碱基处存在a到T的点突变gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba突变体中的基因组序列。这种转变在第一个外显子引起了一个过早终止（AAG-TAG）gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba2AgydF4y2Ba)．的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体表现出正常的营养和小穗发育(图。gydF4y2Ba2C，E.gydF4y2Ba)．然而，突变的花药在没有花粉颗粒的情况下具有白色的白色，这导致了完全的雄性不育（图。gydF4y2Ba2 c, f-hgydF4y2Ba)．与野生类型的互惠交叉引起的野生类型的生育能力不受影响gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体。FgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba用3：1的比例（86:23）隔离的人口表明存在单一的隐性孢子素突变gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba．补充的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变表型，gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba利用GFP自身启动子(1428 bp)，构建了与GFP融合的基因组片段，并转化为杂合子gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba种子。在32根转基因中，鉴定出7种具有纯合的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变背景(图。gydF4y2Ba2 i jgydF4y2Ba)．所有这些纯合线都表现出正常的生育率（图。gydF4y2Ba2DgydF4y2Ba)．这些结果表明了gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba是男性生育能力的主要原因gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体。gydF4y2Ba

花粉雄蕊形成和花药角质层缺陷gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba

利用扫描电子显微镜(SEM)对花药发育的异常形态缺陷进行了分析gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba工厂。的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba与野生型相比，花药短且较小（图。gydF4y2Ba3 a - bgydF4y2Ba)．野生型的花药表面被角质层覆盖(图。gydF4y2Ba3CgydF4y2Ba)，内表面密集分布圆形(图。gydF4y2Ba3dgydF4y2Ba)．然而，gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba花药表面缺乏这些物质，表面光滑(图。gydF4y2Ba3GgydF4y2Ba)，内表面几乎未见圆形(图。gydF4y2Ba3h.gydF4y2Ba)．野生型花药中充满成熟的花粉粒(图。gydF4y2Ba3E-F.gydF4y2Ba)．相反，在花粉中仅能观察到少量退化花粉的残留gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba花药（图。gydF4y2Ba3I-J.gydF4y2Ba)．在互补转基因素中，恢复花药表面和花粉外来（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba：图S1）。gydF4y2Ba

随后，我们获得了半薄横切面，以了解花粉发育的详细缺陷gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba．野生型与野生型之间无明显差异gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba在早期的制度发展中。微孔母细胞（mmcs）和四边形gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba似乎与野生型相当（图。gydF4y2Ba3k-L.gydF4y2Ba，p-q）。在野生型中，新释放的野生型孔孢子的形状是有角度的（图。gydF4y2Ba3MgydF4y2Ba)，变大并液泡化(图。gydF4y2Ba3N.gydF4y2Ba)．在gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba在植物中，释放的小孢子所含的细胞质要少得多(图。gydF4y2Ba3R.gydF4y2Ba）在体积扩大之前/在体积较大之前重新结合（图。gydF4y2Ba3SgydF4y2Ba)．在列中没有观察到成熟花粉颗粒gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba在较晚的花药开发阶段（图。gydF4y2Ba3T.gydF4y2Ba)．的缺陷表型gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba类似于gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba在拟南芥。gydF4y2Ba

进一步澄清异常外出发展的细节gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba用透射电镜观察花粉、花药样品。在四分体阶段，在胼胝质壁和质膜之间形成primexine。这对花粉的壁型至关重要。primexine的形成gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba在四级野生型中符合野生型（图。gydF4y2Ba3U，X.gydF4y2Ba)．在第9阶段，花粉暴露在gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba染色不像野生型那么深，表明孢粉素沉积异常(图。gydF4y2Ba3V，Y.gydF4y2Ba)．在第10阶段，野生型小孢子的外壁层随着孢粉素前体的逐渐沉积而形成(图2)。gydF4y2Ba3WgydF4y2Ba)．但是，在gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba，小孢子表面没有积累孢粉素前体，导致花粉粒萎陷后外壁层表型缺失(图2)。gydF4y2Ba3Z.gydF4y2Ba)．另外，在Tapetum的外观中没有明显的像差gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体(附加文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba：图S2）。这些观察结果表明，ePIDermis的外出形成和角质层结构异常gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

有缺陷的蜡成分gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba花儿gydF4y2Ba

有缺陷的花药角质层和花粉素gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba提示脂质机制在突变体中存在异常。为了证实这一点，我们采用气相色谱-质谱(GC-MS)对野生型和野生型花药的蜡提取物进行了定量分析gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体。结果表明，突变体的表皮蜡质总量减少了约42.6%。gydF4y2Ba4AgydF4y2Ba），这有助于大多数蜡成分的显着减少。蜡的组分，包括长链脂肪酸（C14至C26），烷烃（C30至C36）和醇（C28至C30）显着降低gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba4B.gydF4y2Ba)．因此，化学分析表明gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba参与在水稻花药发育过程中的脂质化合物的合成。gydF4y2Ba

Osacos12位于Tapetum和花药时gydF4y2Ba

在拟南芥中,gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba如通过原位杂交所示，从晚期5至第8阶段的塔皮特细胞和幼儿孢子中表达。gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．分析表达gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在水稻中，进行半定量RT-PCR分析。gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在具有2.5mm至4.0mm的阴影中检测到表达，但未在根，芽，叶和PALEA / lemma中检测到（图。gydF4y2Ba5AgydF4y2Ba)．通过定量实时PCR分析进一步证实该结果（图。gydF4y2Ba5B.gydF4y2Ba)．空间和颞表达式gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba使用RNA检测原位杂交分析gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba您调查。的gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba最初在减数分裂开始时在塔皮特层和微孔母细胞中表达（图。gydF4y2Ba5 c - dgydF4y2Ba)．信号明显增加，在四分体阶段达到最高水平(图4)。gydF4y2Ba5 e-fgydF4y2Ba)．在micromowes阶段，信号的信号gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在Tapetum和幼儿孢子中明显降低了转录物（图。gydF4y2Ba5 g-hgydF4y2Ba)．在该控制中，仅使用四级的感测探针检测背景信号（图。gydF4y2Ba5I-J.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

为了了解蛋白质水平的Osacos12的表达，我们分析了互补的转基因系中的GFP信号（图。gydF4y2Ba2DgydF4y2Ba)．在这种转基因系中，Osacos12-GFP可以补充gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba表现型。因此，这一行的GFP信号代表OsACOS12-GFP蛋白水平。在绒毡层细胞中检测到GFP信号，绒毡层细胞在花药中形成一个圆形。gydF4y2Ba5M-O.gydF4y2Ba)．在花药发育的后期，荧光信号转移到子房内。gydF4y2Ba5P.gydF4y2Ba)．然而，GFP信号在小孢子内不表达(图。gydF4y2Ba5P.gydF4y2Ba)．以水稻野生型花药作为阴性对照(图。gydF4y2Ba5K.gydF4y2Ba)．这些结果表明，根据不同的制剂阶段，Osacos12累积在胶质细胞和花药中。gydF4y2Ba

OsACOS12gydF4y2Ba可以部分满足gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba对拟南芥花粉发育的影响gydF4y2Ba

调查是否是gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba和gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba是功能保守，遗传互补的拟南芥gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体（CS919318，附加文件gydF4y2Ba3GydF4y2Ba:图S3)gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba进行基因组测序。我们生成了两个结构，gydF4y2BaproACOS5gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba和gydF4y2BaproOsACOS12gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba,gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba通过驱动gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba分别发起人。在将构建体引入后gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba/ +杂合植物（图。gydF4y2Ba6A-B.gydF4y2Ba)，分别获得12和14个纯合子转基因株系gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba这些构造的背景(附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba：图S4）。所有12种转基因素gydF4y2BaproACOS5gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba与完整的无菌相比表现出部分生育率gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6e.gydF4y2Ba)．rt - pcr表明gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在转基因株系中高表达(图。gydF4y2Ba6ogydF4y2Ba)．亚历山大染色表明，这些转基因植株含有与野生型植株相似的成熟粒。gydF4y2Ba6i.gydF4y2Ba)．然而，SEM分析显示这些花粉颗粒仍有轻微的形态缺陷（图。gydF4y2Ba6M.gydF4y2Ba)．这一结果表明gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba部分地救出了生育能力gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体，建议gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba能完成的功能gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba在拟南芥。所有的转基因品种gydF4y2BaproOsACOS12gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba完全雄性不育(图。gydF4y2Ba6f.gydF4y2Ba)．RT-PCR证实gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在这些转基因株系中含量较低(图。gydF4y2Ba6ogydF4y2Ba)．亚历山大染色结果表明，在花药发育后期，子房内的花粉粒全部败育。gydF4y2Ba6J.gydF4y2Ba)．然而，SEM表明，在花树中可以形成许多花粉残余物gydF4y2BaproOsACOS12gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba转基因植物虽然这些花粉晶粒仍然有缺陷（图。gydF4y2Ba6N.gydF4y2Ba)．这些结果表明gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba启动子不足以驱动拟南芥中脂肪酰基辅酶a合成酶基因的表达。gydF4y2Ba

OsACOS12gydF4y2Ba是拟南芥的正门gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba用于水稻花粉外壁和花药壁的形成gydF4y2Ba

在水稻中，孢粉素前体的生物合成途径已通过多项遗传研究确定。脂酰还原酶(DPW)将棕榈酰-棕榈酰载体蛋白(ACP)转化为棕榈醇。的gydF4y2BaWDA1gydF4y2Ba基因参与了长链脂肪酸的生物合成。CYP704B2和CYP703A3可催化月桂酸、棕榈酸和油酸生成w-羟基化脂肪酸[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba］．除上述催化反应外，脂肪酰基辅酶a对孢粉素单体的合成也是必不可少的。在拟南芥中,gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba基因将中链到长链脂肪酸酯化为相应的脂肪酸酰辅酶a，以生物合成孢粉素[gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．在这项研究中，我们确定了gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba是正交的gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba在水稻中（图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．敲门声gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba导致小孢子的外壁层缺陷和雄性不育。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3GydF4y2Ba)．这些结果与表型一致gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba在拟南芥gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba］．这些结果表明gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba参与孢子醇素前体所需的脂肪酰基-COA合成。水稻花药有明显的眶下并网状花药[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba］．该角质层对水稻花药开发至关重要，因为它抵抗了非生物和生物压力[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba］．圆球状体被认为在孢子粉素成分的转运中起作用。内表面几乎看不到圆形(图)。gydF4y2Ba3GydF4y2Ba）和蜡组件gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba花药是异常的（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．这一结果表明，OsACOS12不仅在花粉壁形成中起重要作用，而且参与花药角质层脂质代谢。孢粉素相关基因突变包括gydF4y2Ba法gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba，gydF4y2BaABCG15.gydF4y2Ba在水稻中也表现出缺陷的外部和花药夹层夹层形成[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．结果表明，花药角质层和孢子醇素合成在水稻中共享普遍的脂质代谢途径。然而，拟南芥的网状物不受影响gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体（附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba：图S5）。该结果表明拟南芥和稻米之间的脂质途径存在分歧。gydF4y2Ba

os12在绒毡层中表达，并在花粉发育过程中分泌到小室中gydF4y2Ba

Tapetum细胞可能合成孢子醇蛋白前体，随后将它们输送到待组装在花粉表面上的区域中并形成令人生畏的层[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11.gydF4y2Ba］．ACOS5是拟南芥孢子蛋白合成的必要酶。它转录Tapetum，Meiocytes和micropores的组分[gydF4y2Ba17.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba是一个正直的gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba．它显示了类似的表达式模式gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba在转录水平。在互补线中，最初在Tapetal细胞中检测到OSACOS12-GFP信号。在稍后的阶段，信号占据了当局中的自由空间，但不在微微孢子中（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．在花药发育过程中，所有绒毡层细胞降解产物，包括蛋白质，在经过PCD过程后进入花药室[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba］．由于具有绒毡层的分泌功能，OsACOS12很可能在绒毡层中被翻译并分泌到房室中。因此，OsACOS12在蛋白水平上的表达模式与转录水平上的表达模式不同。这种趋势也被观察到gydF4y2BaDYT1gydF4y2Ba是早期绦虫发育的必需调节因素。它的转录物在Meiocytes，Tapetum和幼儿孢子中检测到。但是，Dyt1蛋白仅在胶质细胞中检测到[gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba］．os12基因的表达模式与孢粉素前体生物合成和转运过程相关基因的表达模式一致。CYP703A2催化拟南芥中链饱和脂肪酸转化为相应的单羟基化脂肪酸[gydF4y2Ba13.gydF4y2Ba］．它在Tapetum细胞中表达并在花药后期的晚期分泌到当地中[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba］．已经注意到其分泌累积模式的几种脂质转移蛋白（LTP：LTPC6，LTPC14，OSC6）[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba］．与外壁前体结合或未结合的LTPs从绒毡层细胞分泌成为外壁层成分。os12和CYP703A2的蛋白定位与MS2不同，MS2是拟南芥中另一种合成孢粉素的酶。它只局限于绒毡层细胞[gydF4y2Ba19.gydF4y2Ba］．Osacos12可能由Tapetum与孢子蛋白运输一起分泌。gydF4y2Ba

孢粉素生物合成途径在水稻和拟南芥之间是保守的gydF4y2Ba

在拟南芥中，据报道，大约9种基因参与孢子蛋白生物合成和运输[gydF4y2Ba3GydF4y2Ba］．几个基因的同源物，包括gydF4y2BaCYP704B2gydF4y2Ba，gydF4y2BaCYP703A3gydF4y2Ba，gydF4y2BaOSPKS1.gydF4y2Ba，gydF4y2BaOsTKPR1gydF4y2Ba，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba和gydF4y2BaABCG15.gydF4y2Ba，已在稻米中鉴定[gydF4y2Ba22.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．在这项研究中,gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba被鉴定为gydF4y2BaACOS5。OsACOS12gydF4y2Ba由此驱使gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba启动子能部分恢复不育雄性的育性gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体(无花果。gydF4y2Ba6e.gydF4y2Ba)，表明酰基辅酶a合成酶的功能主要在单子叶和双子叶植物之间保守。以前的研究表明，大米gydF4y2Ba法gydF4y2Ba基因可以完全拯救史上的缺陷gydF4y2BaMS2gydF4y2Ba突变体[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba］．gydF4y2BaPpASCLgydF4y2Ba在gydF4y2BaPhyscomitrella金属盘gydF4y2Ba可以产生羟基烷基a-吡喃酮，这与拟南芥同源物的结果一致gydF4y2BaPKSAgydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba］．孢子醇蛋白生物合成基因的功能很可能在土地植物中非常保守。在转基因线中gydF4y2BaproACOS5gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba，表示gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba可与gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba野生型(图。gydF4y2Ba6ogydF4y2Ba)．然而，这种转基因系列中的花粉颗粒的害虫仍然有缺陷（图。gydF4y2Ba6 e,米gydF4y2Ba)．该结果表明Osacos12的酶活性可能低于拟南芥中ACOS5的酶活性，或者可能对脂肪酸代谢可能存在一些功能性分歧。特定植物物种的花粉壁图案化是一种保守和精心的过程[gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba］．不同的基材和产品gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba可能是导致转基因株系花粉表面缺陷的原因。最近的一项研究也表明，烟草和水稻中保存了几种形成孢粉素的脂质代谢酶，但有些产物不同[gydF4y2Ba23.gydF4y2Ba］．为了gydF4y2BaMS2gydF4y2Ba突变体,gydF4y2BaPpMS2gydF4y2Ba由此驱使gydF4y2BaMS2gydF4y2Ba启动子无法拯救其生育能力。然而，gydF4y2Ba法gydF4y2Ba由此驱使gydF4y2BaMS2gydF4y2Ba启动子可以通过正常的花粉壁形成来挽救其育性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba］．这些结果表明，DPW和MS2具有非常相似的功能，而PpMS2和MS2具有进化上的差异。在gydF4y2BaproOsACOS12gydF4y2Ba：gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba线,gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba由自身启动子驱动，转基因植株表现出雄性不育表型。的表达gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在里面gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba检测到突变体。但是，其表达水平低于gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba野生型(图。gydF4y2Ba6ogydF4y2Ba)．这一结果表明拟南芥孢粉素合成的上游调控因子能够识别gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba启动子。但活化效率较低gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba启动子。gydF4y2Ba

在这项研究中，我们在功能上识别了gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba大米中的基因，这是拟南芥的原始词gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba．我们的结果提供了遗传证据，表明Osacos12参与了水稻中孢子蛋白和角质层合成的脂质代谢。鸟癣细胞和花药中的逐渐积聚表明孢子蛋白生物合成和运输的过程同步发生。遗传互补测定表明gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba在水稻和拟南芥在水稻和拟南芥中的花粉壁形成是功能挽救的。这些发现提供了新的见解，以说明水稻孢子蛋白合成途径中的脂肪酰基-CoA合成酶功能，并提供潜在的雄性无菌线，用于利用作物中的杂种优势。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变体是从耕作技术获得的[gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba］．大米登记入册,包括gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba和野生型中华11（gydF4y2Bao.苜蓿gydF4y2BaSSP。japonica）在上海师范大学（中国上海）的稻田中生长。拟南芥生态型哥伦比亚 - 0和gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba除非具体说明，否则植物在22℃下在22℃的DAT的生长室中生长。gydF4y2Ba

突变表型的特征gydF4y2Ba

将该雄性不育突变体与中华11号杂交，得到FgydF4y2Ba_1gydF4y2Ba的一代。获得了一个纯合的雄性不育突变体gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba代共分离分析。用数码相机(尼康D7000)和解剖显微镜(奥林巴斯SZX10)对拟南芥和水稻小花进行拍照。野生型和gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba突变花药与亚历山大的解决方案染色，并用徕卡显微镜（Leica，USA）观察。对于半薄剖面，SEM和TEM观察，野生型的Spikelets和青花gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba解剖不同阶段的突变体，避免实验偏差。包埋和观察步骤按照Lou等[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

互补的gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba和gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba

对于功能互补，基因组DNA片段包括gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba使用基因特异性引物从中华11个基因组DNA扩增编码区和1428bp启动子序列（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。使用具有BamHI限制酶的PEASY-UNI无缝克隆和组装试剂盒将DNA片段亚克隆到PCAMBIA1300二元载体中。将构建体引入gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2BaEHA105转化为愈伤组织gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba杂合子种子（中国生物，中国）。T.gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba对转基因株系进行基因分型，通过PCR确定纯合雄性不育突变体，并进行DNA序列验证。使用LSM 5 PASCAL共聚焦激光扫描显微镜(ZEISS，德国)检测OsACOS12-GFP荧光。gydF4y2Ba

在转基因抢救实验中，获得了该基因的1047 bp启动子区编码序列gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba， 1428 bp启动子区gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba基因组区域gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba通过PRIMER星DNA聚合酶（TAKARA，日本）和特异性底漆（附加文件）产生PCR扩增生成（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。这些序列随后被克隆到pCAMBIA1300二元载体(CAMBIA，澳大利亚)。将构建物转化为可育杂合子拟南芥gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba植物。以20 mg·L筛选转基因株系gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}潮霉素。对分离群体进行基因型和表型分析gydF4y2Ba_1gydF4y2Ba的一代。gydF4y2Ba

系统发育分析gydF4y2Ba

OSACOS12蛋白序列用于在国家生物技术信息中心的基本局部对准搜索工具（BLAST）在植物物种中搜索从植物物种（gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/gydF4y2Ba)．使用CLUSTALW进行全长蛋白序列的多序列对准，并使用BOXSHADE显示（gydF4y2Bahttp://www.ch.embnet.org/software/ClustalW.htmlgydF4y2Ba)．由Mega6.0程序生成系统发育树，使用邻接方法使用具有1000个引导程序复制的默认参数。gydF4y2Ba

RT-PCR和实时荧光定量PCR检测gydF4y2Ba

使用Trizol套件（Life Technologies，USA）提取不同发育阶段的根，芽，叶，帕勒西和分枝杆菌的总RNA。随后，用AMV逆转录酶用Poly（DT12-18）底漆（Toyobo，Japan）用作逆转录的2μg总RNA作为模板的模板。使用Sybr绿色实时PCR主混合物（Toyobo，Japan）并利用ABI 7300系统（美国生命技术），用三种重复进行定量PCR分析。娄等人之前描述了定量PCR程序和条件[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba］．将靶基因的cDNA水平标准化为内部标准基因gydF4y2Ba奥特林gydF4y2Ba．每个样本3个重复进行基因表达分析。相关引物序列列在附加文件中gydF4y2Ba6gydF4y2Ba：表S1。gydF4y2Ba

原位杂交分析gydF4y2Ba

来自不同发育阶段的新鲜中华的青少年在FAA固定在FAA，嵌入石蜡，并以7μm的厚度段。一个443 bp片段gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba用特异性引物从野生型DNA中扩增出cDNA(附加文件)gydF4y2Ba6gydF4y2Ba:表S1)。将PCR产物克隆到Pbluescript-SK载体（Stratagene）中，然后用BamHI或EcoRI消化以获得模板。这些模板通过T7或T3 RNA聚合酶体外转录，以产生反义或感测探针（Roche，USA）。如Cai等人所述进行组织嵌入，杂交和信号检测[gydF4y2Ba21.gydF4y2Ba］．gydF4y2Ba

花药蜡量化gydF4y2Ba

来自野生类型的标题阶段的花药gydF4y2Baosacos12gydF4y2Ba收集突变体用于GC-MS分析，每个样品约1800个花药。根据先前描述的方法进行花药蜡成分和表面积的分析[gydF4y2Ba24.gydF4y2Ba稍作修改。用1 mL氯仿提取花药1 min，加入10 μg的四环烷(Sigma-Aldrich, USA)提取氯仿作为内标。所得的氯仿提取物被转移到一个新的玻璃小瓶中，在温和的氮气流下蒸发。剩余样品(100 μL)用20 μL的双(N,N-三甲基硅基)三氟乙酰胺(Sigma-Aldrich, USA)在20 μL的吡啶中转换40 min，在70°C下进行GC- ms分析(Agilent GC 6890, DB-1:柱30 m × 0.32 mm × 0.1 μm;柱上注射在100°C，烘箱温度在100°C 2分钟，在10°C·min增加gydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}至200℃，2分钟在250°C，10°C增加·mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba}在310℃，5分钟，310°C，氦载气2mL·mingydF4y2Ba^{－1gydF4y2Ba})．通过积分峰面积，内标完成蜡类化合物的定量。gydF4y2Ba

GC-MS：gydF4y2Ba

气相色谱分析-质谱法gydF4y2Ba

GFP：gydF4y2Ba

绿色荧光蛋白gydF4y2Ba

NCBI:gydF4y2Ba

国家生物技术信息中心gydF4y2Ba

RT-PCR：gydF4y2Ba

逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

SEM：gydF4y2Ba

扫描电子显微镜gydF4y2Ba

TEM：gydF4y2Ba

透射电子显微镜法gydF4y2Ba

感谢胡文利先生(中国科学院上海生物科学研究所植物生理生态研究所)的GC-MS分析。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

国家科技部资助项目(no . 2013CB945100);国家重点研发计划项目(no . 2016YFD0100902);国家自然科学基金项目(no . 31300262)。gydF4y2Ba

可用性数据和材料gydF4y2Ba

支持本文结果的数据包含在文章及其附加文件中。基因和启动子序列gydF4y2BaACOS5.gydF4y2Ba和gydF4y2BaOsACOS12gydF4y2Ba存放于空气污染地带(gydF4y2Bahttps://www.arabidopsis.org/gydF4y2Ba）和RGAP（gydF4y2Bahttp://rice.plantbiology.msu.edu/gydF4y2Ba)根据加入编号gydF4y2BaAT1G62940gydF4y2Ba和gydF4y2Baloc_os04g24530gydF4y2Ba， 分别。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

YLL执行大部分实验，数据处理和起草稿件;DDL原位杂交和细胞学分析;ZLG提供了gydF4y2Baacos5gydF4y2Ba突变体和辅助互补;QSS与YLL合作构建载体;SXX为YLL提供技术支持;CZ对稿件进行了修改;ZNY和JZ设计并指导了实验，并对文章进行了修改。所有作者都已阅读并批准本手稿。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海桂林路100号，200234gydF4y2Ba

   Yueling Li，Dandan Li，Zongli Guo，Zongli Guo，Qiangheng Shi，Shuangxi xiong，Cheng Zhang，Jun Zhu＆中南杨gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应于gydF4y2Ba朱茹gydF4y2Ba要么gydF4y2Ba中南杨gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

开放访问gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

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