Morintides:几丁质结合肽辣木属鉴定

背景

hevin -like peptide是一类富含半胱氨酸和几丁质结合的多肽，由29-45个氨基酸组成。它们的几丁质结合特性对植物防御真菌至关重要。根据其序列中半胱氨酸残基的数量，它们被分为三个亚家族:6C-， 8C-和10c -天链样肽。所有三个亚家族都包含一个三结构域前体，包括一个信号肽，一个成熟的hevein样肽和一个c -末端结构域，包括一个铰链区域，在8C和10c -hevein样肽中含有蛋白质货物。

结果

在这里，我们报道了从鸡腿树中分离和鉴定的两个新的8c - hevin样肽，命名为morintides (mO1和mO2)辣木属鉴定是一种耐旱的树木，属于辣木科。蛋白质组学分析显示莫肽含有44个氨基酸残基，富含半胱氨酸、甘氨酸和天冬酰胺、谷氨酰胺等亲水性氨基酸残基。桑肽抗热和酶降解，能够与几丁质结合，抑制植物病原真菌的生长。转录组学分析表明，它们含有一个由内质网(ER)信号序列、成熟肽结构域和c端结构域组成的三结构域前体。morintides与其他8c - hevin -like peptides的一个显著特征是一个短且无蛋白货物的c -末端结构域。以前，类似的无蛋白c末端结构域仅在银杏中被观察到，这是一种来自裸子植物的8c -天链样肽银杏叶．因此，morintides具有无cargo-末端结构域，是被子植物中一类独立的8c - hein -like peptide。

结论

我们的研究结果扩展了现有的hevein样肽库，并揭示了hevein样肽家族的分子多样性。我们的工作也揭示了8c - hevin样肽的抗真菌活性和稳定性。

Hevein是一种43个氨基酸长的肽，包含一个保守的几丁质结合结构域，首次从橡胶树的乳胶中分离出来橡胶树取代巴西橡胶树Archer等人在1960年[1]。随后，从不同植物中分离出与hevein同源的多肽，由于其与hevein相似，被命名为hevein-like peptides。Hevein和Hevein样肽是一类富含半胱氨酸的肽(CRPs)，全长29-45个氨基酸，富含甘氨酸(5-7个残基)。根据半胱氨酸残基的数量，它们可分为三个亚家族，即6C-、8C-和10c -天链样肽[2[附加文件1:表1)。hevein样肽通过与几丁质结合在植物防御中发挥作用，几丁质是一种重复n-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)单元的聚合物，是真菌细胞壁的主要成分[3.]。甲壳素类肽与几丁质的结合是由一个高度保守的结构域(称为甲壳素结构域)促进的[4]或几丁质结合域[5]，由甘氨酸、半胱氨酸和芳香残基组成，由三到五个二硫键稳定。在几丁质水解酶(几丁质酶)和荨麻属dioica从荨麻中提取的凝集素荨麻属dioica［6]。由于几丁质结合特性，类几丁质肽抑制多种真菌的生长[7]。

到目前为止，有5个8c -hevein样肽，即hevein, 2个fa - amp来自Fagopyrum esculentum［8]和两个pn - ampPharbitis零都是从被子植物中分离出来的[9]。最近，我们的实验室报道了从裸子植物中发现的11种新的富含脯氨酸，不含蛋白质货物的8c -hevein样肽，命名为银杏银杏叶［10]。银杏的初级序列与被子植物的8C-hevein-like肽明显不同。8c - hevin样肽的长度为40-45个氨基酸，含有4个二硫键。在n端排列三个二硫键，形成Cys I-Cys IV, Cys II-Cys V, Cys III-Cys VI的胱氨酸基序，而两个c端半胱氨酸(Cys VII和Cys VIII)形成第四个二硫键。在6c - hevin -like肽中不存在c端第四个二硫键[11，12]而在10c -天链样肽的c端则存在额外的二硫键[2(图。1）.

对6C-、8C-和10C-hevein-like肽的生物合成研究表明，它们具有由信号肽域、成熟肽域和c端域组成的三结构域前体[13]。类肽前体可以是hololectin，具有短的c末端结构域，类似于几丁质酶的铰链结构域(约15-25个氨基酸)或嵌合蛋白，其中c末端结构域携带附着在铰链区域的蛋白质货物。14]。6c - hevin -like肽含有25-30个残基的短c末端结构域，而8c - hevin -like肽含有一个长c末端结构域，通常编码生物活性蛋白货物，如具有Barwin-like结构域的蛋白质[13，15，16]。然而，在从裸子植物中分离出来的银杏中，c -末端结构域很短，没有蛋白质货物。同样，10c - hevin样肽，包括Ee-CBP卫矛europaeus,含有一个长c端结构域，携带一类几丁质酶样蛋白质货物[14(图。2)，而WAMPs的c端结构域则分离自小麦属植物kiharae包含一个短的无蛋白c端结构域[17]。

辣木属鉴定属于开花植物辣木科，通常被称为鸡腿树或马萝卜树[18，19]。它曾经原产于喜马拉雅山麓，但现在在全球范围内都有种植，特别是在热带和亚热带地区[20.，21]。它是一种抗旱树种，可长到10米高，树干直径可达45厘米[22，23]。m .鉴定叶子是维生素C、钙、钾、β-胡萝卜素和天然抗氧化剂的丰富来源[18]。茎皮、花、种子和根可食用且营养丰富，含有生物碱、钾、钙、抗坏血酸和抗氧化剂等化合物[24，25]。自m .鉴定它富含营养，通常被称为发展中国家对抗营养不良的“奇迹树”[26]。由于其极高的药用和营养价值，m .鉴定现在已被纳入保健配方中，作为治疗各种健康疾病的药物销售[27]。m .鉴定种子是最著名的天然混凝剂，通常用于净化浑浊的水。这种凝固特性可能是由于种子中的二聚体蛋白质高度稳定且可溶于水[28]。的水萃取物和乙醇萃取物m .鉴定已知叶子具有抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗溃疡的特性以及降低胆固醇和稳定血压的作用[29]。的种子、茎、根和叶m .鉴定都有抗真菌作用[18，29]。然而，没有关于肽和蛋白质成分的报道，有助于假定的治疗价值m .鉴定叶子。由于静脉样肽主要参与植物对真菌的防御，我们筛选了m .鉴定质谱分析推测的天链样肽。

在这项研究中，我们报道了两个抗真菌的8c -hevein样肽m .鉴定，命名为morintides，缩写为mO1和mO2。LC-ESI-MS/MS测序和转录组学分析显示，莫肽mO1和mO2长度为44个氨基酸。转录组数据(RNAseq)分析显示，莫肽的全长前体包括一个信号肽结构域、一个成熟肽结构域和一个短c端结构域。有趣的是，与静脉(142个残基)相比，桑肽有一个无蛋白货物的c端结构域(15个残基)。由于mO1是最丰富的肽，因此对其功能和稳定性进行了表征。由于其几丁质结合特性，mO1抑制了真菌菌株的生长主产和链格孢属brassiciola,通过抑制真菌菌丝的生长。据我们所知，这是第一次从被子植物中发现不含c端蛋白货物的8c -天链样肽。总之，我们的研究结果揭示了heaven -like peptide的序列多样性，以及它们的几丁质结合特性、抗真菌活性和抗蛋白质水解和热降解的高稳定性。

一般实验程序

采用岛津高效液相色谱(HPLC)和超高效液相色谱(UPLC)。Phenomenex C18色谱柱(粒度，5 μm;孔径，300 Å;CA, USA)，尺寸分别为250 × 22 mm、250 × 10 mm和250 × 4.6 mm，用于制备、半制备和分析反相(RP)-HPLC。采用强阳离子交换高效液相色谱(SCX -HPLC)，色谱柱为聚硫乙基a (250 × 9.4 mm和250 × 4.6 mm)。采用ABI 4800 MALDI-TOF/TOF系统(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)对粗提取物和HPLC组分进行质谱分析。使用Infinite®200 PRO微孔板读取仪(Tecan Group Ltd.， Maennedorf，瑞士德国)测量甲壳素结合、细胞毒性和微肉汤稀释试验的吸光度。分析级化学试剂购自Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) [30.- - - - - -33]。

多肽的分离m .鉴定

m .鉴定叶子(3公斤)购自新加坡本地市场，并经新加坡南洋理工大学南洋草药园经验丰富的草药师Ng Kim Chuan先生鉴定。代金券标本存放于新加坡南洋理工大学生物科学学院标本室。将新鲜叶片与等体积的水在Oster Fusion Blender (Philips, Singapore)中混合6分钟。然后将匀浆后的植物材料在Avanti J25离心机(Beckman-Coulter, USA)中在4°C下8,000 rpm离心10分钟[34，35]。过滤上清后，上到C18闪蒸柱上。使用增加浓度的乙醇(20 - 70%)进行洗脱。通过对洗脱液进行MALDI-TOF质谱分析，证实了所需肽的存在。然后，将含有目标肽的馏分在42°C下，在70 mbar的压力下使用旋转蒸发器进行集中和浓缩。然后用多轮SCX和反相高效液相色谱纯化浓缩的洗脱液。对于SCX-HPLC，从缓冲液a (20 mM NaH)开始的梯度₂阿宝₄5%乙腈，pH 2.8)加入缓冲液B (20mm NaH)₂阿宝_4，采用5%乙腈，0.5 M NaCl, pH 2.8)。从SCX-HPLC中提取的含有所需肽的馏分，通过从缓冲液a(0.1%三氟乙酸水溶液)到缓冲液B(0.1%三氟乙酸水溶液，100%乙腈)的线性梯度进行聚合和RP-HPLC纯化。

RNA提取

从新鲜中提取RNAm .鉴定使用TRIzol®试剂(Life Technologies, Carlsbad, USA)按照制造商的协议进行检测。简单地说,新鲜m .鉴定取叶片(100 mg)用液氮匀浆，加入1 ml TRIzol®Reagent (Life Technologies, Carlsbad, USA)室温孵育5 min，匀浆后加入200 μL氯仿，室温孵育3 min, 4℃离心12000 g 15 min。将含RNA的水相与等体积的异丙醇在室温下孵育10分钟，然后在12,000 g下离心10分钟。将含RNA的球粒用75%乙醇(1 mL)洗涤两次。将颗粒干燥后，用30 μl的焦碳酸二乙酯(DEPC)水重悬。RNA样本被送到Macrogen公司。韩国进行测序。

morintides的序列测定

morintides的还原和烷基化如先前所述[15，36，37]。简单地说，将纯化肽约600 μg与20 mM二硫苏糖醇(DTT)在20 mM碳酸氢铵缓冲液(NH)中孵育₄HCO_3.将还原肽在37℃下用40 mM碘乙酰胺在37℃下烷基化1 h。将还原后的烷基化样品用Millipore ZipTips脱盐并冻干。质谱分析前，将肽在0.1%甲酸中重新溶解。使用Dionex UltiMate 3000 UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)与Orbitrap Elite质谱仪(Thermo Scientific Inc.， Bremen, Germany)进行LC/MS-MS分析。从洗脱液a(0.1%甲酸)到洗脱液B(90%乙腈/0.1%甲酸)以60分钟的梯度洗脱。使用LTQ Tune Plus软件(Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany)将质谱仪设置为正模式进行数据采集。使用Michrom 's Thermo CaptiveSpray纳米电喷雾离子源(Bruker-Michrom, Auburn, USA)产生喷雾。采用Full FT-MS (350 ~ 2000 m/z，分辨率为60000，每谱扫描1 μ扫描)与Full FT-MS和FT-MS/MS交替进行，分别应用27%、30%和32%的高能碰撞解离标准化碰撞能量(110 ~ 2000 m/z，分辨率为30000，每谱扫描2 μ扫描)进行数据采集，分离并破碎3个电荷大于+2、质量差为3 Da的强离子。源电压为1.5 kV，毛细管温度为250℃。自动增益控制设为1 × 10⁶用于全扫描-MS和MS/MS。使用PEAKS studio(7.5版，Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada)处理LC-MS/MS分析数据，亲本容错和片段容错分别为10 ppm和0.05 Da。

系统发育分析

使用MUSCLE对前体序列进行比对[38]，使用MEGA 6.0进行邻居连接聚类分析[39]。系统发育树采用自举法(bootstrap)构建，重复数为1000次，采用泊松模型进行代入建模。系统发育树用iTOL显示[40]。

几丁质结合试验

纯化的桑肽(mO1)与几丁质珠(New England Biolabs, Massachusetts, UK)在几丁质结合缓冲液(140 mM NaCl, 10 mM Tris EDTA 1 mM)中孵育;pH值8.0;然后，加入0.1% (v/v) Tween 20)，在4°C下放置4 h。在每个时间点，珠子在12,000 g下离心1分钟，在280 nm处读取上清的吸光度以评估结合情况。结合肽的洗脱用两种方法进行。第一种方法使用0.5 M醋酸，100℃加热30 min, 1 h;第二种方法使用4种洗脱缓冲液(10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.1% (v/v) Tween 20;pH 8.0)，随氯化钠浓度(300 mM、500 mM、700 mM和1 M)的增加而增加。还原物和烷基化mO1作为对照。用UPLC和MALDI-TOF分析上清液的结合和洗脱情况。

圆盘扩散试验

对中国工业培养收藏中心(CICC)获得的7株真菌的药敏性进行了分析，分别为:Curvularia lunata(40301年中金公司),尖孢镰刀菌(2532年中金公司),黑曲霉(2089年中金公司),黄萎病dahilae(2534年中金公司),辣椒(40259年中金公司),主产(CICC 2465)和链格孢属brassiciola(CICC 2646)对mO1 (17.5 ~ 70 μg)的影响41]。采用马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板进行生长C. lunata, R. solani, V. dahilae A. alternata,答:brassiciola（答:尼日尔在25°C的条件下，在麦芽提取物(ME)琼脂板上生长。当观察到足够的生长时，通过在生长的真菌上打孔并将其转移到新的琼脂板上来收获菌丝。在25℃下孵育48 ~ 72 h，形成径向菌丝体菌落。将浸渍20 μL mO1的6 mm圆片与菌丝生长端等距(1 cm)放置，在25℃下孵育24 h。去离子水作为阴性对照。形成弧形抑制带表明对mO1敏感。

微液稀释试验

最大抑制浓度(IC)的一半₅₀)的mO1对答:alternata和答:brassiciola是通过Wiegand等人描述的微肉汤稀释试验获得的。[42]。将真菌孢子以2.5 × 10的密度播种在半强度马铃薯葡萄糖肉汤中^3.细胞/毫升。将多肽样品(900 μg/mL ~ 0.05 μg/mL)加入96孔板孢子悬液中，25℃孵育24 h。孵育后，用100%甲醇固定细胞30分钟，然后用1% (w/v)亚甲基蓝在0.01 M硼酸盐缓冲液中染色30分钟[43]。多余的染料用水冲洗，干燥板，用1% (v/v)乙醇/0.1 N HCl洗脱染色。使用Infinite@ 200 PRO Tecan微孔板读卡器(Tecan Group Ltd, Germany)在650 nm处读取吸光度。对照微培养只含有半强度马铃薯葡萄糖肉汤。生长抑制百分率计算为试验微培养物吸光度与对照微培养物吸光度之比的100倍。

热稳定性测定

纯化后的mO1 (40 μg)溶于水，100℃孵育1 h。以本实验室合成的线性肽RV-14 (RLYRRGRLYRRNHV)作为对照。孵育后，将样品进行RP-UPLC以评估降解的存在和程度。

蛋白水解酶稳定性测定

纯化的mO1在37℃下与胃蛋白酶或羧肽酶A在100 mM柠檬酸钠(pH 4.5)或50 mM Tris-HCl与100 mM NaCl (pH 7.5)中孵育，最终肽酶比(w/w)分别为20:1和50:1。在每个时间点(0、2、4、6 h)，向UPLC系统中注入50 μL的样品，用MALDI-TOF质谱仪分析所采集峰的质量，以自制的线性肽WV-14 (WRLYRGRLYRRNHV)为对照。

细胞毒性试验

观察桑肽mO1 (1 ~ 100 μM)对Vero细胞(5 × 10)的细胞毒作用⁴细胞/ml)在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中添加10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(PS)。Vero细胞(ATCC CCL-81)是新加坡南洋理工大学生物科学学院刘丁祥博士赠送的礼物。孵育24 h后，孔中加入10 μl PrestoBlue®Cell Viability Reagent (Invitrogen, USA)， 37℃孵育1 h。孵育后，在570 nm处用酶标仪测定吸光度。

核磁共振实验和结构测定

利用二维方法完成了结构的分配和确定¹H -¹杂乱和杂乱的实验。光谱记录使用布鲁克800 MHz核磁共振光谱仪(布鲁克，IL，美国)配备低温探针。核磁共振实验温度为298 K。mO1肽的浓度为1mm，冻干后的肽溶解于含有5% D的milliq水中₂O (pH约为3.5)。TOCSY和NOESY实验的混合时间分别为80和200 ms。光谱中心为4.735 ppm，光谱宽度为12 ppm。使用NMRpipe软件对光谱进行处理[44]。利用Sparky 3.115软件完成NOESY频谱的分配[45]。为了鉴定参与氢键的酰胺质子，使用布鲁克600 MHz核磁共振光谱仪(布鲁克，IL，美国)和低温探针在298 K下进行了H/D交换核磁共振实验。冻干后的肽溶解在100% D中₂在D溶液中溶解较长时间后，记录了肽的一维核磁共振波谱₂O.共记录13个光谱，持续12 h。结构计算采用CNSsolve 1.3软件[46]。这些结构由服务器PDBsum [47来生成Ramachandran图。结构由Chimera 1.6.2软件显示[48]。

植物多肽的筛选和分离m .鉴定

小规模放映m .鉴定叶片上有一簇肽，质量约为4kda。通过在等体积的水中切碎，进行了3公斤植物材料的放大提取。通过多轮SCX和RP-HPLC分离推测的富含半胱氨酸肽(CRPs)。的质谱图m .鉴定结果表明，叶提取物中存在两个主要肽峰，m/z分别为4536.71 Da和4463.76 Da，分别为morintide mO1和mO2。在二硫键还原和烷基化后，观察到+474 Da的质量位移，表明存在8个半胱氨酸残基。采用纳米喷雾质谱法测定morintides的序列。总的来说，该序列包含半胱氨酸(8个残基)、甘氨酸(6个残基)、天冬酰胺(5个残基)和谷氨酰胺(5个残基)，约占莫肽肽序列的50%。n端谷氨酰胺残基自发地转化为焦谷氨酸，使肽抵抗外肽酶的降解。

由于串联质谱不能区分等压残基，如Leu/Ile，因此它们是根据从新鲜提取的RNA中获得的转录组数据进行分配的m .鉴定叶子。莫肽的一级序列在一个氨基酸位置上存在差异:mO1中的Gln-15被mO2中的Gly-15所取代(表2)1）.序列比对显示X的半胱氨酸间隔模式₂cx₈cx₄CC-X₅cx₆cx₅cx_3.cx_3.具有绝对保守的几丁质结合域SXΦXΦCGX₄Φ在循环3和4中，X代表任意氨基酸和Φ表示Trp, Tyr或Phe。BLAST分析和NCBI保守结构域检索显示，morintides属于hevein-like peptide family，与8C-hevein-like peptide的序列同源性大于54%，与hevein的序列同源性最高(64.3%)，与银杏的序列同源性最低(42.9%)g . biloba．

morintide mO1的NMR结构

根据Hα(i-1)、Hβ(i-1)和HN(i)之间的NOE交叉峰进行mO1的顺序赋值。每个酰胺质子HN应该与前一个残基的侧质子有NOE交叉峰。因此，NOESY光谱中的峰的分配没有歧义。由CNSsolve 1.3生成的结构是收敛的。41个残基(Q1-C41)的主链RMSD为1.01±0.35 Å，重原子RMSD为1.71±0.33 Å(附加文件)2表2)。如图所示。3.mO1含有两条反平行的β链，类似于其他类天链肽，其中β1链覆盖Cys-17至Ser-19， β2链覆盖Phe-23至Gly-25。为了确认mO1的二硫键连通性，比较了CNSsolve 1.3生成的20个最佳结构在不同二硫键组合下的平均总能量。在NOESY谱中，H_β观察到Cys-37和Cys-41的s，表明两者之间的距离很近_β此外，这两个H_βs与H没有交叉峰_β进一步验证了Cys-37和Cys-41 (Cys VII- Cys VIII)之间的二硫键模式。通过生成15种不同的二硫键组合来确定其余6个半胱氨酸残基的二硫键模式，假设每个残基在模拟退火过程中产生100个具有相同距离限制的结构(附加文件)3.:表S3和附加文件4:表S4)。对于每个组合，选择总能量最低的20个结构，其平均总能量在附加文件中列出2表S2。Cys I-Cys IV、Cys II-Cys V、Cys III-Cys VI表现出最低的平均总能量(618.67±7.54 kcal/mol)，表明正确的二硫键模式为Cys I-Cys IV、Cys II-Cys V、Cys III-Cys VI和Cys VII-Cys VIII。此外，在结构计算中，我们假设所有的半胱氨酸都被还原了。假设没有二硫键，平均总能量甚至更低3.表S3)。这是由于没有二硫键的结构约束。在这种情况下生成的结构与具有二硫模式的结构几乎相同，Cys I-Cys IV, Cys II-Cys V, Cys III-Cys VI, Cys VII-Cys VIII，证实了推导出的二硫模式是正确的(附加文件)5:图S1)。四个二硫键将环与β链相连。二硫键Cys I-Cys IV和Cys II-Cys V交叉并将环1和环2与β1和β2相连。二硫键Cys III-Cys VI使环4与β1相连。二硫键Cys VII-Cys VIII位于C端，使C端像夹子一样弯曲。四个二硫键维持肽的结构，因此负责mO1的高稳定性。在H/D交换实验中，S19、Q38、C17、C18、C24和S39的酰胺质子在12 H后信号衰减小于20%，表明mO1具有较高的稳定性。图中是几丁质结合域的对比图，以及几丁质和mO1表面电荷的分布。3 c．从图中可以看出，tyr30是绝对保守的，而第21位和第23位分别被Tyr和Phe占据。与hevein的几丁质结合域相比，观察到hevein的表面电荷的形貌是相对中性的，mO1中相应的区域似乎被带负电的残基包围(图1)。3 c）.

几丁质结合活性

为了评估morintides的几丁质结合活性，mO1与几丁质珠在4℃下孵育4小时。RP-UPLC分析表明，mO1在1 h内与甲壳素珠结合(附加文件)6:图S2)。使用高达1 M NaCl的洗脱缓冲液，mO1不能从珠子中洗脱出来，表明有很强的结合相互作用。使用0.5 M醋酸，在100℃下加热，在1小时内有效地洗脱mO1(附加文件)6:图S2)。这些数据表明mO1与几丁质珠结合强烈，因为它只能通过强洗脱缓冲液和高温加热来洗脱。

桑肽的抗真菌活性

采用圆盘扩散法测定了7株植物病原真菌对mO1的易感性。真菌接种后，在25°C条件下生长24-72小时或直至形成放射状菌落。指定浓度的森肽被装载在放置在生长菌丝顶端的圆盘上。在七个菌株中答:alternata和答:brassiciola显示形成月牙形的抑制区，表明它们对mO1的处理敏感(图2)。4）.生成了剂量-响应曲线₅₀在25℃孵育24 h后，根据所测真菌菌株的不同，计算出的浓度范围在25.5 ~ 60.43 μg/ml之间(图2)。4 b）.明光显微镜显示，与未处理的对照相比，mO1处理真菌孢子导致菌丝变短、变粗等形态变化。mo1处理的真菌菌丝体紧密地束在一起，不像未经处理的真菌那样广泛地分支(图2)。4摄氏度）.综上所述，这些数据表明mO1通过以剂量依赖的方式延缓出芽菌丝的生长来抑制真菌的生长。

热和蛋白水解稳定性

通过将mO1在100°C下孵育1小时或与胃蛋白酶和羧肽酶A孵育6小时来评估mO1对热降解和酶降解的稳定性。通过计算RP-UPLC色谱曲线下的面积，可以观察到超过95%的肽在加热1小时和蛋白水解酶处理后保持完整(图1)。5）.线性对照肽RV-14在100℃加热1小时内降解率超过50%，而WV-14在4小时内被羧肽酶A完全消化，而在胃蛋白酶处理6小时后，只有50%的WV-14保持完整。

生物活性

采用PrestoBlue细胞活力试剂检测莫肽对Vero细胞的细胞毒作用。当浓度达到100 μM时，未观察到明显的细胞毒性作用。

桑肽的生物合成

从鲜提取的RNA转录组中共组装了78,561个转录本，全长在201 ~ 22191 bp之间m .鉴定韩国Macrogen公司进行Illumina HiSeq后，使用Trinity进行叶片处理。使用内部软件Protein Analyzer 1.0分析这些转录本，寻找保守的半胱氨酸基序。两个前体序列被指定mo1和mo2被获得。的前兆mo1和mo2包括一个20个氨基酸长的内质网信号肽，随后是一个44个氨基酸长的成熟肽结构域和一个短的15个氨基酸长的c端结构域。序列比较mo1和mo2结果表明，信号肽是相同的，成熟结构域在一个氨基酸残基上不同，c端结构域在三个位置上不同，分别是Asp-67、Glu-71和Gly-76mo1被Ala-67, Gly-71和Ser-76取代mo2．类天链肽的前体组织不同于其他富含半胱氨酸的肽，后者在成熟的肽结构域之前含有一个n端前结构域[30.，49，50]并表明桑肽是核糖体合成的多肽[51]其生物处理过程通过分泌途径进行[52]。

morintide前体序列与其他hevin样肽(包括来自苋属caudatus［11]， aSG1 from其中,sessilis变体green [15]， aSR1 from其中,sessilis变体red []15，他来自橡胶树取代巴西橡胶树［16[qh]， gB1 from银杏叶和Ee-CBP来自卫矛europaeus［14(图。6）.从无花果。6很明显，morintides的整体前体组织与裸子植物中的银杏(ginkgotdes)相似，类似于8c -hevein的肽g . biloba［10]。

在这项研究中，分离了两个新的8c -hevein样肽，统称为morintides，并对其进行了测序和表征。这44个氨基酸长的morintides在蛋白质组学和转录组学水平上被检测到，并且存在一个氨基酸残基的差异。Morintides与hevein和其他8c -hevein样肽(如pn - amp)同源[9]和fa - amp [8]。通过核磁共振对mO1的结构分析，发现其有3个二硫键组成胱氨酸结基序，第4个二硫键位于c端。Morintide mO1抑制了答:alternata和答:brassiciola用IC进行圆盘扩散试验₅₀在微摩尔范围内。转录组学分析显示，morintides的整体前体组织与hevin -like peptides相似，除了它们的短，无蛋白质货物的c -末端结构域。

morintides的序列比较

morintides与hevein和已报道的8C-hevein-like peptides的序列比较显示，除了8个保守的半胱氨酸残基外，3个谷氨酰胺残基(Gln-6, Gln-20, Gln-36)， 2个丝氨酸残基(Ser-19, Ser-37)和Leu-16在所有8C-hevein-like peptides中是绝对保守的(表1)1）.根据半胱氨酸间隔模式，肽序列可分为6个半胱氨酸间环。环的长度是保守的，仅在fa - amp和pn - amp的环5中观察到变化，该环5包含三个残基，而在hevein和mO1中则包含五个残基。除Fa-AMPs外，所有8c -hevein样肽的n端都含有可自发转化为焦谷氨酸的谷氨酸残基。c端通常由一个带正电的残基组成，后面分别是mO1、Pn-AMP1和hevein中的甘氨酸、丝氨酸或天冬氨酸残基。Morintides与富含脯氨酸的银杏显示出最少的序列一致性，可能是因为它们是从裸子植物中分离出来的。g . biloba．

排列的morintides和8C-hevein-like peptides的序列标识用于说明每个位置氨基酸残基的相似性和出现频率(图2)。7）.从序列标志可以清楚地看出，8c - hevin -like肽的分子多样性程度很高。环3和环4构成几丁质结合区域，其中丝氨酸和谷氨酰胺是绝对保守的。环3中的芳香氨基酸是可变的，而环4中的酪氨酸残基是绝对保守的。从这些观察结果可以清楚地看出，尽管序列变化，但与几丁质结合的重要残基都是保守的，这表明8C-hevein-like肽的多样性是普遍的。

Morintide结构

CRPs的整体结构主要是由富含二硫化物的核心以及二级结构和疏水接触来稳定的[53]。类天链肽的二硫键核心具有打结的拓扑结构，其特征是两个相邻的二硫键被第三个二硫键交叉，从而形成胱氨酸结[54]。因此，类天堂肽对热和酶降解具有高度稳定性。上午，mO1也有类似的二硫化物排列。hevein类肽的二级结构，包括hevein本身[55]， Ac-AMP2 from苋属caudatus［56]， aSG1 from其中,sessilis［15]， WAMP-1a来自小麦属植物kiharae［57]和Ee-CBP来自卫矛europaeus［58]，包括至少两个β-链和一个短链\(\alpha \)螺旋。mO1的二级结构与报道的hevein-like肽相似，由两个反平行的β-sheet组成，但缺乏\(\alpha \)-在c端呈螺旋状转动。mO1的c端残基是Arg，而不是Pro-33。这种替换可能会导致缺少\(\alpha \)- mO1的螺旋转弯。heaven -like peptides的几丁质结合特性是由占据几丁质结合位点的残基决定的。在这种情况下，与n -乙酰氨基葡萄糖残基的结合相互作用通过CH-π堆叠相互作用和涉及Trp-21、Trp-23和Tyr-30的范德华接触来稳定[59]。Ser-19的糖段和羟基之间的氢键稳定了该复合物。由于几丁质与mO1的序列同源性，推测几丁质与mO1的结合是通过类似的相互作用进行的。

桑肽的抗真菌活性

在7株真菌中，桑肽mO1能抑制真菌的生长答:alternata和a . brassiciola正如圆盘扩散试验中弧形抑制区所示。处理后菌丝尖部肿胀、生长发育迟缓、分枝菌丝减少等形态学变化答:alternata和答:brassiciola不同浓度的mO1。在形态学上也观察到类似的变化。7]， i -4 [60]及e- cbp [58，61]。目前，有两种被提出的机制，通过这些机制，hevin样肽可能抑制真菌的生长。首先，heaven -like peptide的几丁质结合特性可能导致它们与生长菌丝中新形成的几丁质链中的新生几丁质纤维结合，破坏细胞壁形态发生，阻碍真菌生长[60]。其次，hevein-like肽的小尺寸和高碱性PI可能使它们很容易穿透真菌细胞壁，到达质膜，改变膜极性，导致细胞质物质泄漏，从而抑制真菌生长[2]。9，58，61]。morintides的作用机制仍有待阐明;然而，桑肽的抗真菌活性可归因于它们的几丁质结合特性，因为它们具有中性PI值。

桑肽的生物合成

转录组数据分析显示莫肽以三结构域前体表达，并通过分泌途径进行加工[52]。信号肽酶的n端裂解位点在morintides中是一个高度保守的Ala残基，而c端加工发生在一个绝对保守的Gly残基7）.morintides的15个氨基酸长的c -末端结构域富含甘氨酸残基，与hevein和10C-hevein-like peptides不同，后者具有明显较长的c -末端结构域(142-200个氨基酸残基)，携带生物活性蛋白货物，带有Barwin结构域或富含甘氨酸或丝氨酸的铰链区域，然后是i类几丁质酶的催化结构域[62，63]。为了确定mo1的c端结构域是否在引导成熟肽进入液泡的过程中起到靶向信号的作用，我们在NCBI数据库中进行了胚泡搜索。检索结果显示与NCBI数据库中任何已知蛋白均无同源性。因此，c尾在morintide中的作用仍有待确定。

桑肽的c端结构域富含甘氨酸的性质表明，它可能是几丁质酶中铰链区域的残余物，桑肽可能是截断的几丁质酶。类天链肽的前体组织类似于银杏苷[10]和硫胺素[64]但不同于其他CRPs，如环核苷酸，在成熟肽之前含有n端前肽[31，36，49，65]。

morintide的演化和起源

heaven -like peptide家族可分为三个亚类，使其成为研究遗传多样性的有趣家族。植物门内的遗传分化源于成熟肽的突变，这也导致了功能的多样化。例如，morintide mO1和mO2前体的信号肽和c端结构域高度同源，但成熟结构域的点突变导致mO1中的Gln-15替换为mO2中的Gly-15。类似的遗传多样性也在其他CRPs中被观察到，如从环肽家族中分离的cliotides cT4-cT12Clitoria ternatea［49]，半胱氨酸结α-淀粉酶家族的同种异体黄蔓cathartica［50]和α-和β-硫代硫代蛋白大麦芽［66]。

利用morintides, hevein-like peptides, class I几丁质酶和凝集素的前体序列构建了一个系统发育树来研究它们的进化关系(图2)。8）.数据分析显示，如图虚线所示，有四个不同的簇。8．Morintides与hevein和Ee-CBP归为同一簇(cluster 2b)，它们与几丁质酶相邻(cluster 2a)，这表明hevein样肽与几丁质酶之间存在密切的进化关系。这种聚类进一步表明，morintides的c端结构域可能是几丁质酶结构域的残余物，通过移帧缺失或mRNA剪接事件。我们的分析与Andreev等人的推测一致，他们推测wamp基因是几丁质酶基因的“残余物”。这些“截断”的基因随后被进化选择，因为它们编码抗真菌肽[17]。我们的分析表明，属于被子植物的morintides和属于裸子植物的gingkotide位于不同的集群中，这与它们的进化起源一致[10]。

在本研究中，分离了两个新的8c -hevein样肽(mO1和mO2)，统称为morintides，并对其进行了表征m .鉴定．对44个氨基酸长的莫肽的核磁共振研究表明，它们含有四个二硫键。高度二硫化物约束的结构使mO1耐热和酶降解，使其成为药物开发的有趣支架。Morintide, mO1可以抑制答:alternata和答:brassiciola与集成电路₅₀在微摩尔范围内。它引起菌丝尖端肿胀、菌丝发育不良和分枝较少等形态变化。转录组数据分析显示，morintide前体包括信号肽结构域、成熟肽结构域和c端结构域。几丁质酶前体与其他几丁质样肽的比较表明，它们含有一个急剧缩短的c端结构域，这可能是mRNA剪接或大几丁质酶前体的帧移缺失的结果。这种c端结构域长度的明显差异是一个有趣的发现，它揭示了hevin -like peptides的进化，并有助于定义一个新的8c - hevin -like peptides亚群。总之，这项工作扩大了8c - hevin样肽的文库，并揭示了它们的进化关系和生物合成途径。我们还深入了解了几丁质结合特性和桑肽对真菌生长的抑制作用。

Ac-AMP:

苋属caudatusamp

AMP:

抗菌肽

舒适:

相关光谱法

c反应蛋白:

Cysteine-rich肽

D₂O:

氧化氘

EDTA:

乙二胺四乙酸

呃:

内质网

GlcNAc:

N-acetylglucosamine

高效液相色谱法:

高效液相色谱法

MALDI-TOF女士:

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法

NOESY:

核Overhauser效应光谱学

聚合酶链反应:

聚合酶链反应

总机:

反相

SCX:

强阳离子交换

UPLC:

超高效液相色谱

本研究由新加坡国家研究基金会竞争性研究基金(NRF-CRP8-2011-05)资助。我们感谢南洋理工大学Newman Sze教授实验室的Aida Serra博士对LC-ESI MS/MS的帮助。

资金

本研究得到了新加坡国家研究基金会的竞争性研究资助(NRF-CRP8-2011-05)和南洋理工大学食品研究资助(M4081467.080)的支持。

数据和材料的可用性

mO1的核磁共振结构可以通过PDB登录码5WUZ和BMRB代码36040来查看。在GenBank中可以找到mO1和mO2的完整mRNA编码序列，其加入码分别为KY436355和KY436356。系统发育树、序列数据和比对已存入TreeBASE数据库，可通过永久链接访问:http://purl.org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S20670．

作者的贡献

JPT, SGK, KHW和WLT构思和设计了实验。SGK, KHW, WLT和TX进行实验，分析数据并撰写稿件。JPT修改了原稿。所有作者都阅读并批准了手稿的最终版本。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

发表同意书

不适用。

伦理批准并同意参与

不适用。

出版商的注意

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从属关系

1. 新加坡南洋理工大学生物科学学院，新加坡

   王家辉，陈卫亮，肖天舒，谭伟亮

相应的作者

对应到谭锦华．

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