产油藻类脂质体蛋白质组分析gydF4y2BaLobosphaera incisagydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

Lobosphaera incisagydF4y2Ba（gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba)是一种产油微藻，在脂质体(LBs)中储存富含花生四烯酸的三酰基甘油(TAG)。随着附着在其表面的蛋白质在TAG储存和代谢中发挥重要作用的证据越来越多，该细胞器在藻类研究中越来越受到关注。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

这里，LB蛋白组的组成gydF4y2BaL incisagydF4y2Ba通过半定量蛋白质组学方法比较不同的细胞组分进行研究。在对蛋白质组数据应用严格的过滤器，以从可能的LB蛋白(lbp)列表中去除污染蛋白后，候选蛋白在烟草花粉管中的异体表达，让我们确认了3个真实的LB蛋白:一种藻类主要脂滴蛋白家族的成员，一种功能未知的小蛋白，推测有脂肪酶。此外，还鉴定出一种TAG脂肪酶，属于油籽植物中已知的TAG脂肪酶SUGAR DEPENDENT 1家族。用an的功能互补验证了其活性gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba缺乏主要种子TAG脂肪酶的突变体。gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

在这里，我们描述了3个lbp和一个TAG脂肪酶从产油微藻gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba并讨论它们可能参与LB代谢。本研究强调了过滤LB蛋白组数据集，逐个验证亚细胞定位的重要性，从而识别出污染蛋白。我们的数据集可以作为鉴别额外的LBs的宝贵资源，为LBs在微藻中的有趣作用提供更多的线索。gydF4y2Ba

微藻是一类具有高度多样性的生物，其进化和生态背景都是如此。一些微藻在细胞内以碳和能量储存的形式积累中性脂质三酰甘油（TAG），这一过程可以通过暴露于不同形式的非生物胁迫来控制。其中，氮饥饿已被证明会导致TAG合成增加[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba，是一种伴随生长停滞的现象[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]，蛋白质组的改变还原氮含量[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]，在转录水平上减少光合作用[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]和叶绿体降解[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．这些变化是可逆的，这一事实使得产油藻类在脂质代谢的研究中特别有趣。gydF4y2Ba

需要以允许在需要时动员的方式存储标记。通过细胞溶质细胞器满足该功能，所谓的脂质体（LBS）[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．除了中性脂质的核心外，它们还由极性脂质和蛋白质组成的单层膜，可以直接或间接地附着在其表面[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．已知的少量结构元素使蛋白质能够直接与LB结合:突出于LB的疏水结构域[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，一个“脯氨酸结”[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba或“脯氨酸旋钮”[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]， β-桶[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba或两亲螺旋[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．然而，一个保守的氨基酸序列，以蛋白质为目标的LB到目前为止还没有被确定。gydF4y2Ba

在许多生物中，已发现LB蛋白（Lbps）参与脂质代谢或维持LB结构[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．前者包括TAG脂肪酶，它需要从储存脂质的主链上去除脂肪酸。单酰基甘油和二酰基甘油(MAG和DAG)脂肪酶可以将剩余的两个酰基部分分离，随后β-氧化将其分解以获得储存的能量。已在酵母中描述了lb相关的TAG脂肪酶[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba，蓖麻豆[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]、油菜籽及芥菜籽[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba以及gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba（gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba)种子gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．直到最近，还没有在任何藻类中确定TAG脂肪酶活性，除了gydF4y2BaPhaeodactylum tricornutumgydF4y2Ba标签LIPASE1。实验证明该酶能水解TAG类似物gydF4y2Ba帕拉gydF4y2Ba-硝基苯丁酸在体外和抑制基因的表达导致标记在体内积累[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]，但到目前为止还没有建立与TAG(而不是DAG或MAG)降解的直接联系。gydF4y2Ba

第二类Lbps包含维持LBS结构完整性的蛋白质。最强烈地研究的结构Lbps系列是在玉米种子中描述的[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]，在许多高等植物中有其特征，并被命名为油酸[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]．它们已被认可具有防止LB聚结的功能，从而保持高的表面/体积比，在需要时有利于快速降解[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]并且用于凝固耐受性[gydF4y2Ba31gydF4y2Ba]．也有研究表明，为了发生LB分解，需要降解油酸[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]．在哺乳动物中，perilipins也有类似的功能[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]和果蝇[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]以及橄榄、鳄梨和油棕营养组织中的脂滴相关蛋白(LDAPs) [gydF4y2Ba36gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]．微藻含量又是另一家结构Lbps系列，其成员主要称为主要脂质液滴蛋白（MLDP），不含任何已知的结构元件。的gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2BaMLDP是第一个被描述的[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]，而且很明显，它吸收了其他蛋白质，特别是微管蛋白，到LB表面[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].此外，gydF4y2BaC.莱因哈德蒂MLDPgydF4y2Ba转录本丰度被用作TAG积累的标记[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．MLDP家族的成员已经在微藻中被鉴定gydF4y2BaHaematococcus pluvialisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),gydF4y2Ba杜氏gydF4y2Ba［gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]，而在团藻目和小球藻目其他成员的基因组中也发现了同源基因[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．的硅藻gydF4y2BaPhaeodactylum tricornutumgydF4y2Ba［gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]和veridozont microalgagydF4y2BaNannochloropsisgydF4y2Ba［gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]每一种都含有独特的LB蛋白结构，与mldp相比，LB蛋白含有与油酸类似的突出疏水结构域。gydF4y2Ba

Lobosphaera incisagydF4y2Ba是一种产油藻类，属于trebouxiophyce纲。在这里，我们调查了SAG 2468菌株，它最初是从日本冰川上分离出来的[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]．积累大量富含花生四烯酸的TAG是不寻常的(ARA, 20:4 (n-6)) [gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]．这种将PUFA分解为TAG的现象在微藻中并不常见[gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]，氮饥饿可进一步将TAG含量从43%推高[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]为总脂肪酸(TFAs)的87%，同时增加ARA的比例[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

该菌株的线粒体和质体基因组已发表[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba，gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]，化学诱变已被成功地应用，导致一个明确的表型[gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]．此外，已经实现了稳定的转变[gydF4y2Ba49gydF4y2Ba，尽管效率较低。更多的分子生物学工具和资源目前可用于模型绿藻gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba，但这种生物需要营养饥饿才能表现出大量的LB形成。与此相反，在不进行操作的情况下，可以很容易地观察到相同的过程gydF4y2Bal . incisa。gydF4y2Ba

到目前为止，已经对几种藻类LB蛋白组进行了分析，但只有极少数假定的lbp的亚细胞定位通过荧光显微镜得到了验证[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba50gydF4y2Ba或免疫标记[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba]．为了更好地了解脂质在产油藻类中的储存gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba，本研究的目的是鉴定与LBs相关的蛋白质，并验证这种定位，以揭示真实的LBP。此外，我们还利用最近测序的核基因组以及表达研究来揭示与标签降解相关的基因。gydF4y2Ba

由于在许多生物体中发现了lb相关蛋白gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba基因组最初是为了寻找这些同源物。藻类基因组中既没有油籽植物中已知的油酸苷、钙红苷或甾醇苷的编码，也没有发现植物LDAPs或哺乳动物珠脂蛋白的同源物。因此从gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba以识别新的lbp。gydF4y2Ba

通过蛋白质组学方法鉴定了推测的lbpgydF4y2Ba

图中列出了分离LB所需的步骤。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．一个gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba培养物在细胞分裂前3天无氮，促进LB的形成。大量的机械和酶的细胞破坏方法(以及它们的组合)已被证明在打破坚强细胞壁的同时保持LBs的完整性是无效的，而在液氮中研磨产生足够数量的完整LBs，经尼罗河红染色证实(图)。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．反复循环的再悬浮和离心可以部分去除粘附膜。从总提取物、可溶性部分和总膜中提取的样品作为后续鉴别真lbp的对照。gydF4y2Ba

表中总结了达到这一目标的蛋白质组数据过滤过程gydF4y2Ba1gydF4y2Ba．在LB样品的所有三个技术重复中检测到的蛋白质，如果它们满足以下四个标准中的至少一个，则考虑进行进一步分析:(i)与一个或多个对照样品相比，LB组分富集强烈，(ii) LB组分丰度高，(iii)在限氮条件下明显诱导基因表达，或(iv)与表明脂质代谢或LB稳态功能的蛋白质同源。从cDNA中成功扩增出编码序列的候选基因进行亚细胞定位分析。感兴趣的基因与报告基因mVenus融合并瞬时表达于gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba（gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba)花粉管。这种易于转化的组织包含大量的LBs，因此是确认植物或藻类来源的假定LBs定位的理想系统[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

进一步研究的11种蛋白详见表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba．对于大多数被调查的候选者，至少有¼的氨基酸序列被肽检测覆盖(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)．与三个对照样品相比，LB组分中的富集差异很大，但在5个最丰富的蛋白质中，有3个可以被证实为lbp，另外一个蛋白质被发现与LBs部分相关。gydF4y2Ba

LiMLDP是一个小而丰富的LBPgydF4y2Ba

由基因编码的蛋白质gydF4y2Bag555gydF4y2Ba基于其在LB蛋白提取物中的高丰度，被鉴定为LBP候选蛋白(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)及其与已知藻类LBP的相似性。BLAST蛋白搜索结果显示gydF4y2BaHaematococcus pluvialisgydF4y2Ba油量蛋白（HPogP）作为具有30％序列同一性的任何生物体中最近的所表征同源物，而这两种蛋白质在沿氨基酸序列分布疏水残留物中的醒目相似度（图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)．这些特性包括藻类MLDPs家族中的蛋白质(图。gydF4y2Ba2 egydF4y2Ba)，相似之处使我们命名了gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba蛋白质LiMLDP。不同的表达gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba花粉管证实了它的定位(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．对缺氮和补氮条件下基因表达的分析表明，在生长限制条件的前3天，基因表达上调(图1)。gydF4y2Ba2摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．图中显示了总脂肪酸(TFA)的含量，以供比较。gydF4y2Ba二维gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

与油酸相反，包括LiMLDP在内的mldp不具有突出的疏水结构域(图。gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)，可以直接将它们固定在LB表面。然而，LiMLDP似乎以某种方式附着在LB上，并对保持LB结构完整性的可能功能进行了测试。该基因被置于种子特异控制之下gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Bannapin A (napA)启动子，并稳定表达gydF4y2Ba拟南芥油1gydF4y2Ba突变体。与野生型相比，被吸收突变体种子中的LBs显著增大，然而15个独立表达LiMLDP的品系T2种子中未观察到功能互补(图)。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba)．见附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba用于确认基因表达。gydF4y2Ba

LiLBP62本地化到LBsgydF4y2Ba

LiLBP62在大肠杆菌的LB组分中富集gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba与对照样品比较(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)也定位于烟草花粉管中的相同细胞器（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)．与LiMLDP相似，它缺乏明显的疏水结构域(图。gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)．它包含一个未知函数域(DUF 4057) [gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba那绝对是植物和绿藻特有的。李gydF4y2BaLBP62gydF4y2Ba在7天的缺氮过程中，其表达没有发生重大变化，但在补氮后转录量立即下降到检测不到的水平(图2)。gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba和gydF4y2BadgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

由于LiLBP62在LBs上的丰度高，且其287个氨基酸的大小较小，因此LiLBP62在LBs的结构完整性中可能起类似油酸的作用。稳定表达的基因gydF4y2Ba拟南芥油1gydF4y2Ba上述突变体在13个独立品系的T2种子中均未发现LB大小的互补。gydF4y2Ba

LiLBP36是一种假定的LB脂肪酶gydF4y2Ba

LiLBP36不仅在gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba与所有3个对照样品相比，至少富集了5倍gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）可以在烟草花粉管中清楚地证实亚细胞定位（图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)．相应的转录水平对氮饥饿的响应在3天内急剧上升，在氮补给后下降到初始值(图2)。gydF4y2Ba5 bgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

Interproscan将LiLBP36注释为3类脂肪酶，并预测了224个氨基酸的二级结构(参见附加文件)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)非常吻合实验确定的一组真菌和酵母分泌的脂肪酶的结构，作用于MAG, DAG和TAG。这些酶含有丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸的催化三联体，在许多脂肪酶中都有[gydF4y2Ba54gydF4y2Ba，丝氨酸残基是一个保守GXSXG基序的一部分。除了组氨酸残基外，所有这些元素都存在于LiLBP36的结构同源部分(图)。gydF4y2Ba5 dgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

基于这些观察以及与LBs的强相关性，我们怀疑该蛋白具有TAG脂肪酶活性。因此，我们研究了LiLBP在一个gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba缺少驱动萌发后生长的主要TAG脂肪酶的突变体:SUGAR-DEPENDENT1 (SDP1)和SDP1- like [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．缺乏活力的gydF4y2Basdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba幼苗需要蔗糖才能形成与野生型同样长的下胚轴，这一特性允许间接观察TAG分解[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．我们介绍了李gydF4y2BaLBP36gydF4y2Ba在培养液中存在或不存在蔗糖的条件下，在黑暗条件下测定T2幼苗萌发5天后的下胚轴长度(图2)。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．对于每个独立的线，然后将具有蔗糖的平均下胚缩长为100％，计算达到蔗糖的相对长度，然后与仅携带空载体的突变体和野生型幼苗进行比较（图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)．在5个株系中，有4个株系的萌发后生长有一定的改善，但不能确定有很强的功能互补(图。gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)．见附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba用于确认基因表达。gydF4y2Ba

一些LBP候选人在测试时没有定位到LBsgydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba花粉管gydF4y2Ba

对lbp的搜索产生了8个候选结果(见表)gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)进行了进一步分析。g9582。p1之所以被选中，是因为它在LB馏分中具有较强的富集性，并且它的Interproscan注释为3类脂肪酶。在烟草花粉管中瞬时表达时，该蛋白定位于某些LBs，但在细胞的其他部分也大量表达。gydF4y2Bag9864gydF4y2Ba在对氮饥饿的反应中，表达急剧上调，并编码一种功能未知的蛋白，在LBs中积累一定程度。g13714。P1，一种与gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba脂肪酸酰胺水解酶，在LBs明显富集。此时，g4703的一个可能的函数。p1无法预测，但Interproscan揭示了一个可能参与蛋白结合的无菌α基序，该蛋白在LB部分中比在整个膜中丰富得多。gydF4y2Bag13209gydF4y2Ba编码一个预测的短链脱氢酶/还原酶，并在氮饥饿期间高度表达。推测的fad结合单加氧酶g12144。P1也是类似的诱导产物，而g13747。P1和patatin相关的g14373。与对照样品相比，p1在LBs处具有显著的积累特征。这7个候选基因在烟草花粉管中表达时不定位于LBs，因此本研究未进行进一步研究。gydF4y2Ba

LiSDP1是TAG脂肪酶gydF4y2Ba

我们很惊讶在通过过滤LB蛋白组数据的蛋白质中没有发现TAG脂肪酶，因此转向了gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba寻找有希望的候选基因。这项研究发现了一种与gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaSDP1因此被命名为LiSDP1。像它的植物同源物一样，这种蛋白质具有一个patatin结构域，这是一组不同的脂肪酶的特征[gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]．该结构域含有一个由丝氨酸残基和一个天冬氨酸残基组成的催化二分体(图)。gydF4y2Ba7 dgydF4y2Ba)．通过在大肠杆菌中的瞬时表达，证实了LiSDP1不是LB蛋白gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba结果表明，LiSDP1-mVenus和Nile Red信号没有重叠。gydF4y2Ba7一个gydF4y2Ba)．在氮饥饿期间，基因表达仅发生微小变化(图2)。gydF4y2Ba7 bgydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)，而在补氮6 h内，其含量显著增加，这是一个以大量脂肪酸动员为特征的生长期(图。gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)．gydF4y2Ba

标记脂肪酶活性通过补充gydF4y2Ba答:芥sdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba突变如上所述。在8个独立的线路中有7个携带着李gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba与突变体相比，突变体的萌发后生长明显改善(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）和表达该基因的三条线构成型效果甚至更强烈（图。gydF4y2Ba8 bgydF4y2Ba，请参阅附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba以确认基因表达)。通过测定不同品系幼苗中的脂肪酸含量，并将其与同一品系种子中脂肪酸的平均含量联系起来，对选定品系进行了扩展(图)。gydF4y2Ba8 cgydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)．在野生型幼苗中，大部分脂肪酸在萌发后的生长过程中被代谢，而突变体保留了80%的脂肪酸。对于大多数补种，在没有光照和蔗糖的情况下萌发5 d后，残留脂肪酸量显著降低。gydF4y2Ba

LBs不再被认为是被动细胞组件，对其所承载功能的兴趣正在增长[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．在以前的研究中，即使在同一藻类中，lbp的数量和身份也有很大的差异。这在最近的LB蛋白组研究中变得很明显gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2Ba:不同的菌株都是光异养培养的，而一项研究没有显示单个LBP [gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]其他群体报告259 [gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]和248 [gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，重叠不到一半。Co-immunoprecipitation与gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2BaMLDP还发现了124种在同一菌株中同一组未发现的蛋白质[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]这种高度的变异可能说明样品制备对蛋白质组学研究中LBP检测的强烈影响。gydF4y2Ba

蛋白质组数据过滤显示真实的lbpgydF4y2Ba

在本研究中，高灵敏度的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)获得了大量推测的lbp。从微藻分离的LB通常含有大量来自其他细胞成分的蛋白质[gydF4y2Ba57gydF4y2Ba，gydF4y2Ba58gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60gydF4y2Ba]，这可能是由于其他细胞器膜与LB表面的相互作用[gydF4y2Ba61gydF4y2Ba或由于细胞分离过程而造成的污染。这解释了为什么需要对蛋白质组学数据进行广泛过滤，以确定本研究中描述的三个清晰的lb相关蛋白。gydF4y2Ba

LB馏分也可能受到质体小球的污染，但这似乎不太可能。到目前为止，质体蛋白组已经在gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba还有绿藻gydF4y2Ba杜氏盐藻bardawilgydF4y2Ba［gydF4y2Ba62gydF4y2Ba，gydF4y2Ba63gydF4y2Ba而在这两种生物中，只发现了很少的LB蛋白组重叠。在电子显微镜的研究中gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba，则无法观察到质体球[gydF4y2Ba64gydF4y2Ba和其他叶绿素一样gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba基因组缺乏质体球蛋白的同源物，这是这些结构的特征[gydF4y2Ba65gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

到目前为止，在其他藻类中被鉴定为lbp的蛋白质可以归类为高度丰富的结构蛋白[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41gydF4y2Ba，gydF4y2Ba66gydF4y2Ba，gydF4y2Ba67gydF4y2Ba和在脂质代谢或运输中起作用的酶[gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]．亚细胞定位的确认对研究LB蛋白组至关重要，烟草花粉管是一个有用的工具[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．在我们的研究中，有三个蛋白可以被鉴定为真正的lbp。gydF4y2Ba

而高等植物中的油酸通过含有脯氨酸结的疏水结构域被固定在LB表面[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，在这里描述的任何lbp中都找不到这样的元素。哺乳动物的缘鳍通过两亲螺旋连接，这是由氨基酸序列的串联重复形成的[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．使用HHrepID在这里描述的lilbp中搜索这样的重复[gydF4y2Ba68gydF4y2Ba，gydF4y2Ba69gydF4y2Ba没有产生任何结果。这也适用于已知与LBs相关的一系列其他蛋白质，包括藻类mldp [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38gydF4y2Ba，gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．这些蛋白质可能通过酰基化或与其他蛋白质相互作用而附着在LB表面。gydF4y2Ba

LiMLDP和LBP62是lb相关蛋白，功能未知gydF4y2Ba

LiMLDP与其他藻类mldp有相似之处:具有一定的序列同源性，沿氨基酸序列的疏水性分布具有高度的可比性，且在氮饥饿早期明显诱导基因表达。不像gydF4y2BaNannochloropsisgydF4y2Ba脂滴表面蛋白[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba然而，在我们的实验中，LiMLDP无法弥补高表面/体积比的LBs ingydF4y2Ba拟南芥油1gydF4y2Ba胚胎。这可能是由于napA启动子驱动基因表达过低或在种子成熟的不恰当时间。人们还可以想象到该蛋白的另一种作用，例如在LB的酶募集过程中。LiLBP62也有类似的功能，它没有任何特征表明其具有特定的生理作用。由于Li的转录，它可能参与了LB的形成或稳态，而不是LB的分解gydF4y2BaLBP62gydF4y2Ba再施氮6 h后，基因迅速终止。gydF4y2Ba

LBP36是一种LB定位脂肪酶gydF4y2Ba

尽管LiLBP36与其他已知蛋白的序列相似性较弱，但根据与一组酵母和真菌降解MAG、DAG和TAG的脂肪酶的结构相似性，LiLBP36可以被归类为推定的脂肪酶。这组酶包括第一个解决了晶体结构的TAG脂肪酶，并在活性位点鉴定出了丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸的催化三联体[gydF4y2Ba71gydF4y2Ba]．在实验确定的这种酶的结构上对LiLBP36建模，允许识别催化残基，除了催化组氨酸，它位于晶体结构的一个部分，与建模的LiLBP36结构没有广泛的同源性。gydF4y2Ba

LiLBP36基因的表达似乎与可能参与TAG降解相矛盾，因为在氮饥饿期间，转录被强烈诱导，而当氮被补充和脂质储备被降解时，转录降低。然而，基因表达可能会在未来需要TAG水解的情况下被诱导，可能会导致蛋白质的非活性形式，一旦环境条件允许再次生长，该蛋白就会被激活。类似的推理也被提出来解释主要的TAG脂肪酶的表达模式gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba种子,SDP1 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

尽管与TAG脂肪酶有这些相似之处，LiLBP36仅对黄化酶萌发后的生长起到很小的补充作用gydF4y2Ba答:芥sdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba幼苗。这可能是由于密码子使用差异导致该蛋白翻译速度慢，考虑到LiLBP36编码序列包含62%的胍和胞嘧啶残基，而平均为gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba编码序列为44%(拟南芥信息资源，TAIR)。另一种可能的解释是底物的特异性，因为仅仅根据脂肪酶的模型结构来预测底物的准确范围是非常困难的。分子TAG物种分布在gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba(主要18:1 (n-9)和ARA， [gydF4y2Ba72gydF4y2Ba)的区别在于gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba种子(主要为18:1 (n - 9), 18:2 (n-6),十八3 (n)和20:1 (n - 9), (gydF4y2Ba73gydF4y2Ba])作用于一个标记池的标记脂肪酶不一定能高效地作用于另一个标记池。在中性脂质中，该酶可能对MAG或DAG具有更高的亲和力，本研究中未对两者进行测试。或者，它可能具有水解在LB表面形成极性单层的膜脂的主要功能，从而允许随后的TAG被其他脂肪酶降解。gydF4y2Ba

LiSDP1是TAG脂肪酶gydF4y2Ba

本研究采用的蛋白质组学方法在lbp的鉴定中被证明是有用的，并且LB蛋白质组数据集可以作为鉴定其他lbp的资源。我们惊讶地发现gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba在我们的LB蛋白数据集中没有SDP1的同源物。我们对TAG水解感兴趣，因此继续对这个基因进行更详细的分析。SDP1及其类似物SDP1- like已被证明能降解TAGgydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba74gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

我们对李的分析gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba转录水平显示，一旦氮不再限制培养和脂质动员开始，基因表达就会迅速被诱导。我们观察到，这种酶实际上能够接管TAG脂肪酶的功能，当引入gydF4y2Ba答:芥sdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba突变体。幼苗和种子的脂肪酸谱在野生型和转基因株系之间没有显著差异，表明了广泛的底物特异性gydF4y2Bal . incisagydF4y2BaSDP1的报告gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba同族体(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．藻酶所发挥的TAG脂肪酶活性总体水平较低，这可能是由于缺乏的TAG物种的专一性gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba种子。当表达由35s启动子控制时，最明显的幼苗的后结肠生长的影响最明显，这已被证明与内源同样有效gydF4y2Ba答:芥gydF4y2BaSdp1启动子互补gydF4y2Basdp1gydF4y2Ba突变体(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．尽管启动子不仅在种子成熟过程中有活性，而且在种子萌发过程中也有活性，但启动子的互补作用较弱，这可能是由于基因表达水平较低或时间较短gydF4y2Ba芸苔属植物oleraceagydF4y2Ba［gydF4y2Ba75gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

我们从缺氮藻类中分离出的LB中不存在LiSDP1，而且它也不定位于烟草花粉管中的LBs，这表明TAG脂肪酶可能是专门被招募到LBs中的蛋白质之一gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba在需要的时候。它已经被证明gydF4y2Bac . reinhardtiigydF4y2BaLB蛋白质组响应氮气再补散而受到巨大变化的影响[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]．然而，最近获得的证据gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗可能支持我们的发现。由此可见，SDP1可能定位于过氧化物酶体膜，仅在TAG动员时才转位到LB膜[gydF4y2Ba76gydF4y2Ba，gydF4y2Ba77gydF4y2Ba]．该基因的表达模式可能支持这一观点，因为LiSDP1的表达仅在对氮补给的响应中被诱导。gydF4y2Ba

l . incisagydF4y2Ba是一种油脂微藻，在脂质代谢的研究中有很大的前景。在这项研究中，我们生成了一个广泛的LB蛋白组数据集，并成功过滤了真实的LB蛋白。gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba在我们的实验装置中，花粉管是验证LB定位的有效工具。两个功能未知的lbp可能在维持细胞器的结构完整性和防止其过早降解方面发挥作用，而另一个lbp可能是脂肪酶活性的候选，可能需要储存脂质动员。本文所研究的其他候选lbp的LB定位无法确认，这强调了验证细胞分离结果的必要性。同时，烟草花粉等异种系统的使用可能会导致靶向信号识别的差异，或者缺乏LB定位所需的特定脚手架蛋白。尽管如此，这里生成的数据集将成为进一步鉴别LB蛋白的有用资源，可能揭示LB代谢和稳态的新方面。gydF4y2Ba

筛选的gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba基因组中发现的主要脂肪酶的同源物gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba幼苗，李gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba．该基因能够在缺乏内源SDP1和SDP1- l的黄化幼苗中重建下胚轴伸长，验证了该酶的TAG脂肪酶活性。这种酶不定位于缺氮的LBsgydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba或烟草花粉管系统，相反，当这些储备需要动员时，可能会被招募到标签存储站点。坚固的细胞壁gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba是分离相对纯细胞器的主要障碍。gydF4y2Ba

l . incisagydF4y2Ba基因组测序gydF4y2Ba

的核基因组的组装gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba是与前文所述的线粒体和质体基因组一起进行的[gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]．简单地说，使用基于超级读的汇编器MSR-CA (MaSuRCA)组装Illumina配对端和长跳跃距离配对对读[gydF4y2Ba78gydF4y2Ba]．用AUGUSTUS 2.6.1预测蛋白编码基因(PMID:16469098) [gydF4y2Ba79gydF4y2Ba]，并使用InterProScan 5.9注释(pid:24451626) [gydF4y2Ba80gydF4y2Ba]，使用ARCH/UBLAST 7.0.1001（Edgar 2010，生物信息学26，2460–2461）和KEGG（使用KAAS服务器：Moriya et al.2007，核酸研究，35，W182–W185）。序列和注释可在gydF4y2Bahttps://giavap-genomes.ibpc.frgydF4y2Ba．请联系ovallon@ibpc.fr获取授权。gydF4y2Ba

液体培养的gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba

l . incisagydF4y2BaSAG 2468菌株最初是在日本冰川上分离出来的[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba由以色列内格夫本·古里安大学的Inna Khozin Goldberg博士亲切地提供。在BG11培养基中培养[gydF4y2Ba81gydF4y2Ba在25°C和190 μmol光子m的连续光照下gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}以及补充1%的曝气(gydF4y2BavgydF4y2Ba/ v)有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba．氮饥饿是通过在BG11培养基中洗涤和重悬实现的，BG11培养基是通过省略纳米修饰的gydF4y2Ba_3.gydF4y2Ba以及柠檬酸铁取代柠檬酸铁铵[gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]．氮由沉降细胞补给，并在全BG11培养基中再次被吸收。gydF4y2Ba

气相色谱法gydF4y2Ba

如前所述，用气相色谱法对藻类物质中的脂肪酸进行了定量[gydF4y2Ba82gydF4y2Ba稍作修改。材料冻干后，用甲基分离脂质gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba-丁基醚(MTBE)提取按[gydF4y2Ba83gydF4y2Ba通过酸性甲醇溶解衍生脂肪酸[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]．在GC测量中使用的温度梯度包括以下步骤:150°C for 1 min, 150°C to 200°C for 4°C/min, 200°C to 250°C for 20°C/min, 250°C for 3 min。gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba种子在60°C下干燥过夜，冷冻幼苗(包括种皮)在直接酸性甲醇分解前进行冻干[gydF4y2Ba84gydF4y2Ba]．3 -15:0被作为定量的内标，样品在使用金属棒的反应过程中被机械破坏，以确保高效的甲醇分解。gydF4y2Ba

磅隔离gydF4y2Ba

离心步骤一般都在4°C的埃普多夫5810 r离心机,最适条件le - 80 K与SW40转子离心器或一个最适条件及与TLS55转子50毫升离心器管,12毫升薄壁聚丙烯管和2.5毫升薄壁聚丙烯管,分别。在分馏步骤之间使用冰冷缓冲液并将样品保存在冰上。gydF4y2Ba

一个gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba培养物在分离LB前3天无氮培养。从50 mL培养液中提取细胞，2500 ×离心沉淀gydF4y2BaggydF4y2Ba用蒸馏水洗一次，然后用液氮研磨10分钟。随后根据[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba经过一些修改。60 mL离心缓冲液A (100 mM Tris-HCl pH 7.5, 3 mM乙二胺四乙酸(EDTA)， 10 mM二硫treitol (DTT)， 1% (gydF4y2BavgydF4y2Ba/v)植物蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich)， 0.6 M蔗糖)加入均质材料中，取细胞总提取物200 μL样品，10000倍离心去除细胞碎片gydF4y2BaggydF4y2Ba将全部上清转移至12ml管中，每管上仔细覆盖10ml离心缓冲液B(缓冲液A加0.4 M蔗糖)，重复离心。用抹刀去除浮在上面的LBs，剩余的上清液以105,000 x的超离心法分离成膜和可溶性部分gydF4y2BaggydF4y2Ba取200 μL的样品，并将沉淀的膜进行复合。将LBs转移到Potter-Elvehjem组织研磨机中，并小心地重新悬浮在10ml离心缓冲液a中gydF4y2BaggydF4y2Ba产生了浮在上面的LB馏分，然后再以这种方式洗涤两次。最后，将LBs重悬在1.5 mL缓冲液A中，转移到2.5 mL的超离心管中，并在100,000 x的超离心前覆盖缓冲液BgydF4y2BaggydF4y2Ba1 h。gydF4y2Ba

磅的蛋白质识别gydF4y2Ba

如前所述，无需进一步分离，即可从每个细胞馏分中提取蛋白质[gydF4y2Ba85gydF4y2Ba，gydF4y2Ba86gydF4y2Ba经过一些修改。它们在90%乙醇中在−80°C下沉淀2小时，在20000 x下沉淀gydF4y2BaggydF4y2Ba4°C 15 min, 80%乙醇洗涤3次。蛋白用100 μL变性蛋白增溶缓冲液(4%十二烷基硫酸钠(SDS)， 4 mM DTT, 8% (gydF4y2BavgydF4y2BaTris-HCl pH 6.8, 0.02% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)溴酚蓝，7m尿素，2m硫脲[gydF4y2Ba59gydF4y2Ba，gydF4y2Ba87gydF4y2Ba]，然后将每个样品一式三份应用于SDS-PAGE [gydF4y2Ba87gydF4y2Ba，gydF4y2Ba88gydF4y2Ba，gydF4y2Ba89gydF4y2Ba，gydF4y2Ba90gydF4y2Ba]直到它移动1厘米。凝胶用考马斯染色[gydF4y2Ba91gydF4y2Ba，gydF4y2Ba92gydF4y2Ba，全部切除。然后，如前所述，对这些蛋白质进行凝胶内胰酶消化[gydF4y2Ba93gydF4y2Ba和肽通过液相色谱-串联质谱法进行鉴定(见附加文件)gydF4y2Ba1gydF4y2Ba详情)。然后通过与所有的蛋白质进行比较来确定蛋白质gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba基于核和质体基因组预测的蛋白质。gydF4y2Ba

对LB样品的三个技术重复中检测到的蛋白质进行进一步分析，通过计算归一化光谱丰度因子(NSAF， [gydF4y2Ba94gydF4y2Ba，gydF4y2Ba95gydF4y2Ba])。通过划分NSAFs来测定与三个对照样品(总提取物、膜、可溶性部分)的富集度。gydF4y2Ba

蛋白质在硅分析gydF4y2Ba

利用BLASTP搜索同源蛋白和保守结构域[gydF4y2Ba96gydF4y2Ba，gydF4y2Ba97gydF4y2Ba]和pfam数据库[gydF4y2Ba52gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53gydF4y2Ba),分别。gydF4y2Ba

Phyre2 [gydF4y2Ba98gydF4y2Ba，gydF4y2Ba99gydF4y2Ba用于预测蛋白质二级结构并寻找结构同源物。gydF4y2Ba

利用ExPASy ProtScale测定氨基酸序列的疏水性[gydF4y2BaOne hundred.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba101gydF4y2Ba]与Kyte & Doolittle氨基酸秤[gydF4y2Ba102gydF4y2Ba，窗宽为19个残点。gydF4y2Ba

使用最大似然法与PhyML推断相关蛋白的系统发育[gydF4y2Ba103gydF4y2Ba，gydF4y2Ba104gydF4y2Ba]与Clustal Omega进行序列比对[gydF4y2Ba105gydF4y2Ba，gydF4y2Ba106gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

编码序列扩增及质粒构建gydF4y2Ba

RNA的分离gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba去除氮培养3天，合成cDNA(见下文)。利用附加文件中列出的引物扩增感兴趣的编码序列并添加限制性位点gydF4y2Ba8gydF4y2Ba然后使用克隆喷气PCR克隆试剂盒(Thermo Fisher Scientific)连接到亚克隆载体。gydF4y2Ba

将无终止密码子的编码序列插入pucc - lat52 - mvenus载体[gydF4y2Ba107gydF4y2Ba，gydF4y2Ba108gydF4y2Ba通过使用从Thermo Fisher Scientific获得的内切核酸酶的限制克隆，在烟草花粉管中表达。类似地，将完全编码序列插入到PELTRY-E载体中[gydF4y2Ba109gydF4y2Ba]，通过Gateway克隆技术转入pCambia植物表达载体43.0。pCambia 43.0以mCherry为报告基因，在种子特异性napin启动子的控制下，在植物中获得了新的表达载体gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Ba．通过PCR扩增napin::mCherry结构，在5 '和3 '端建立了限制性位点SacI和XhoI。pCambia33.0G经SacI和XhoI酶切后与napin::mCherry结构连接以替代gydF4y2Ba酒吧gydF4y2Ba基因在35S启动子的控制下。有关矢量的详细信息，请参阅附加文件gydF4y2Ba9gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

烟草花粉管中基因的瞬时表达gydF4y2Ba

在烟草花粉管中瞬时表达用于验证LBP候选蛋白的LB定位，如前所述[gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]．gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba(生态型Samsun NN)通过粒子轰击瞬间转化花粉粒，并让其在玻片上萌发6小时。然后用PT培养基固定花粉管[gydF4y2Ba110gydF4y2Ba]含甲醛(1% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)，尼罗红染色(终浓度为0.17 ng/μL)。gydF4y2Ba

共焦显微镜gydF4y2Ba

使用蔡司LSM共聚焦显微镜获得荧光图像。在561和488 nm处激发Nile Red和mVenus，分别用HFT 405/488/561和HFT 405/514/633 nm主分束器成像，分别在571-593和507-539 nm处检测荧光。gydF4y2Ba

稳定变换gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba

的gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba突变体gydF4y2Basdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba])和gydF4y2Ba油酸gydF4y2Ba(SM_3.29875，由美国密歇根州立大学Prof. Christoph Benning教授提供相应的野生型)与含有藻类基因的pCambia载体一起转化gydF4y2BaMCHERRYgydF4y2Ba报告基因的花浸法使用gydF4y2Ba根癌土壤杆菌gydF4y2Ba菌株EHA 105 [gydF4y2Ba111gydF4y2Ba]．突变体以及Col-0野生型也被用空载体转化，以产生作为阴性对照的品系。通过荧光显微镜鉴定表达报告基因的T1和T2种子，使用M165C立体显微镜，配备EL6000汞灯、M205FA/M165FC滤光片和DFC3000 G相机(均来自Leica Microsystems)。基因表达证实如下。gydF4y2Ba

基因表达分析gydF4y2Ba

RNAseq,gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba细胞在对照或缺氮条件下生长12或72 h，或在弱光(75 μmol photon. m .)下生长gydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba}或在强光下(150 μmol photon.mgydF4y2Ba^{−2gydF4y2Ba}．年代gydF4y2Ba^{−1gydF4y2Ba})，来自两个生物复制。在液氮中用铁珠破碎材料后，使用SV总RNA分离试剂盒（Promega）从冷冻样品中分离RNA。在2100电泳生物分析仪上检查RNA质量。在HiSeq 1000仪器上，利用Illumina-Truseq高通量短读技术（使用50 nt单端和100 nt双端读）通过法国巴黎高等师范生物学院的转录组学平台对转录组进行测序。对于每个生长条件，对两个生物复制样本进行测序，每个样本分为四个技术复制。它们被映射到转录本上，并使用Haas等人的方案分析差异表达[gydF4y2Ba112gydF4y2Ba使用来自Trinity(发布版r20131110)的工具，RSEM 1.2.9 [gydF4y2Ba113gydF4y2Ba]和DESeq [gydF4y2Ba114gydF4y2Ba，后者还提供了偏差分析(ANODEV)。以5%的错误发现率作为截止值。gydF4y2Ba

对于所选基因，RNA-Seq结果通过qRT-PCR进行验证和扩增。为此，我们从3株植物中分离出总RNAgydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba在缺氮和补氮的不同时间点进行培养。样品被冷冻干燥，然后在液氮中粉碎，以确保在Trizol提取前有效地破坏细胞[gydF4y2Ba115gydF4y2Ba]．然后用DNase I和RevertAid H Minus (Thermo Fisher Scientific)去除残留基因组DNA，合成cDNA。Primer3Prefold [gydF4y2Ba116gydF4y2Ba]和Primer3Plus [gydF4y2Ba117gydF4y2Ba]用于引物设计(见附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba引物序列)和gydF4y2Ba核糖体蛋白S21gydF4y2Ba作为内参基因进行标准化。qRT-PCR采用iQ5 qPCR循环仪(Biorad Laboratories)和Takyon No Rox SYBR Core Kit blue dTTP (Eurogentec)进行。gydF4y2Ba

在干燥的种子中gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba，如前所述，通过提取RNA来证实基因表达[gydF4y2Ba118gydF4y2Ba]，生成如上所述的cDNA，并通过PCR检测转录本。gydF4y2Ba

Postgerminative增长分析gydF4y2Ba

下胚轴长度用于评估黄化幼苗的发芽后生长gydF4y2Ba答:芥sdp1 / sdp1-LgydF4y2Ba如前所述表达假定的TAG脂肪酶基因的突变系[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．种子特异性或构成性转基因表达受gydF4y2Ba芸苔属植物显著gydF4y2Banapin A启动子或花椰菜花叶病毒35S启动子。将T2种子预选至250 ~ 300 μm大小，表面消毒，在含或不含1%蔗糖的½MS琼脂平板上排列。荧光显微镜记录报告基因表达，在4°C分层2天同步发芽。种子在光照下萌发30 min，然后在室温下避光保存5 d。在这一点上，用扫描仪记录幼苗，对于那些源自转基因种子的幼苗，测量下胚轴长度。每行4批至少测定10株幼苗。利用气相色谱法测定了这些幼苗(包括种皮)以及同一品系的转基因种子的总脂肪酸含量。每行分析4批至少10株幼苗，每批的总脂肪酸含量除以幼苗数。然后用每棵幼苗的4个TFA值计算每条线的平均值和平均值的标准误差。用同样的方法分析转基因种子。gydF4y2Ba

磅大小分析gydF4y2Ba

通过表达相应的基因来研究藻类蛋白对LBS结构完整性的影响gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba突变体gydF4y2Ba油酸gydF4y2Ba观察胚下胚轴细胞的LB大小。预选T2种子进行报告基因表达，4℃，在0.1%琼脂中浸泡过夜，在两个玻片间轻轻挤压分离胚。取含有胚的0.1%琼脂100 μL，加入100 ng尼罗红(溶解于丙酮)，室温黑暗孵育10 min，共聚焦显微镜见上所示。只有看起来完全完整的胚胎被更密切地观察，并分析每个株系3个胚胎的下胚轴细胞。与强烈的尼罗红染色相比，MCHERRY蛋白发出的荧光强度可以忽略不计，因此可以清楚地观察到光谱中红色部分的染色LBs。gydF4y2Ba

答:芥gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

拟南芥gydF4y2Ba

ARA:gydF4y2Ba

花生四烯酸gydF4y2Ba

DAG:gydF4y2Ba

甘油二酯gydF4y2Ba

德勤:gydF4y2Ba

DithiotreitolgydF4y2Ba

DUF：gydF4y2Ba

未知函数域gydF4y2Ba

EDTA:gydF4y2Ba

乙二胺四乙酸gydF4y2Ba

FPKM:gydF4y2Ba

每千碱基的片段每百万映射读取gydF4y2Ba

l . incisagydF4y2Ba：gydF4y2Ba

Lobosphaera incisagydF4y2Ba

磅:gydF4y2Ba

脂质体gydF4y2Ba

腰痛:gydF4y2Ba

脂质体蛋白gydF4y2Ba

质/女士:gydF4y2Ba

液相色谱-串联质谱法gydF4y2Ba

LDAP:gydF4y2Ba

脂滴相关蛋白gydF4y2Ba

LDSP：gydF4y2Ba

脂滴表面蛋白gydF4y2Ba

玛格:gydF4y2Ba

单酰基甘油gydF4y2Ba

MLDP:gydF4y2Ba

主要脂滴蛋白gydF4y2Ba

MTBE:gydF4y2Ba

甲基gydF4y2Ba叔gydF4y2Ba丁基醚gydF4y2Ba

n .烟草gydF4y2Ba：gydF4y2Ba

烟草gydF4y2Ba

纳帕:gydF4y2Ba

Napin一gydF4y2Ba

NSAF:gydF4y2Ba

归一化谱丰度因子gydF4y2Ba

OGP:gydF4y2Ba

油珠蛋白gydF4y2Ba

SD:gydF4y2Ba

标准偏差gydF4y2Ba

SDP1:gydF4y2Ba

糖依赖1gydF4y2Ba

SDP1-L:gydF4y2Ba

SDP1-likegydF4y2Ba

SDS:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠gydF4y2Ba

标签:gydF4y2Ba

三酰甘油gydF4y2Ba

组织:gydF4y2Ba

总脂肪酸gydF4y2Ba

感谢Volker Lipka教授和Hassan Ghareeb博士(植物-微生物相互作用分子生物学系)提供荧光立体显微镜用于转基因种子的筛选。我们还要感谢Steven Johnsen教授和Florian Wegwitz博士(门诊，作者:Dr. Jörg Kudla和Dr. Leonie Steinhorst (University of Münster)，利用共聚焦显微镜生成并提供puci - lat52 - mvenus表达载体，用于烟草花粉转化。我们非常感谢Sabine Freitag在脂质提取和GC分析方面的帮助，感谢Andrea Nickel和Janett Wochnik在基因分型和测量下胚轴方面的支持。我们还要感谢Ellen Hornung博士和Amelie Kelly博士非常有帮助的讨论。gydF4y2Ba

资金gydF4y2Ba

本研究得到了欧盟委员会第七期研究与技术发展框架计划(FP7) GIAVAP项目的资助。266401以及Göttingen神经科学和分子生物学研究生院(GGNB)。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有作用。gydF4y2Ba

数据和材料的可用性gydF4y2Ba

的gydF4y2BaLobosphaera incisagydF4y2Ba基因组序列和注释可以检索和分析gydF4y2Bahttps://giavap-genomes.ibpc.frgydF4y2Ba．请联系ovallon@ibpc.fr获取授权。gydF4y2Ba

本研究使用的编码序列的GenBank登录号:gydF4y2Ba

LiMLDP: KY346874gydF4y2Ba

g5830: KY346875gydF4y2Ba

LiSDP1: KY346876gydF4y2Ba

LiLBP36: KY346877gydF4y2Ba

LiLBP62: KY346878gydF4y2Ba

g9864: KY346879gydF4y2Ba

g9582: KY346880gydF4y2Ba

g13714: KY346881gydF4y2Ba

g4703: KY346882gydF4y2Ba

g13209: KY346883gydF4y2Ba

G12144：KY346884gydF4y2Ba

G13747：KY346885.gydF4y2Ba

g14373: KY346886gydF4y2Ba

Illumina RNA-Seq reads可从SRA (Bioproject PRJNA262782)下载。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

HS培养藻类，分离LBs，提取和消化蛋白质，分析蛋白质组数据，进行硅胶分析，生成cDNA，克隆除Li以外的所有编码序列gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba，生成并分析转基因gydF4y2Ba答:芥gydF4y2Ba行和gydF4y2Ban .烟草gydF4y2Ba花粉，解释数据，起草手稿。OVale进行了LC-MS/MS测量，并给出了数据解释建议。TI对花粉管测定的实验设置和数据解释提出了建议，并对Li进行了共聚焦显微镜观察gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba表达花粉管。JP放大了李gydF4y2BaSDP1gydF4y2Ba并进行GC分析。NJT和OVall设计，排序和组装gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba基因组和转录组。IK-G设计了基因组和转录组实验，共同监督脂质体分离实验，为测序实验提供藻类样品并提供建议gydF4y2Bal . incisagydF4y2Ba种植。GHB参与了研究设计并修改了手稿。IF设计了这项研究，分析了数据并审阅了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。gydF4y2Ba

相互竞争的利益gydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。gydF4y2Ba

同意出版gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

出版商的注意gydF4y2Ba

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 德国哥廷根大学，阿尔布雷希特-冯-哈勒植物科学研究所，植物生物化学系gydF4y2Ba

   Heike Siegler, Till Ischebeck, Jennifer Popko和Ivo FeussnergydF4y2Ba

2. 德国哥廷根大学，微生物与遗传学研究所，分子微生物与遗传学系，哥廷根gydF4y2Ba

   Oliver Valerius和Gerhard H. BrausgydF4y2Ba

3. 皮埃尔和玛丽·居里，巴黎，法国gydF4y2Ba

   Nicolas J. Tourasse＆Olivier VallongydF4y2Ba

4. 内盖夫本-古里安大学微藻生物技术实验室，比尔-谢瓦，以色列gydF4y2Ba

   Inna Khozin-GoldberggydF4y2Ba

5. 哥廷根大学哥廷根分子生物科学中心，德国哥廷根gydF4y2Ba

   Gerhard H. Braus和Ivo FeussnergydF4y2Ba

6. 德国哥廷根大学，能源转换国际高级研究中心(ICASEC)gydF4y2Ba

   Ivo FeussnergydF4y2Ba

7. 现住址:Laboratoire ARNA, INSERM U1212, CNRS UMR5320, Université Bordeaux 2;Institut Européen de Chimie et Biologie (IECB)， 2 rue Robert Escarpit, 33607, pesac，法国gydF4y2Ba

   尼古拉斯·j·TourassegydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

写给伊沃·福斯纳的信。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，允许在任何媒体中不受限制地使用、分发和复制，前提是您对原始作者和来源给予适当的信任，提供到知识共享许可证的链接，并说明是否进行了更改。知识共享公共领域专用豁免(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba