过氧化氢参与了硫化氢诱导的番茄幼苗侧根形成GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

硫化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS)和过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)分别被认为是参与根形态发生的一种高度活性分子。在这个报告中，相应的因果关系控制侧根形成被调查。GydF4y2Ba

方法GydF4y2Ba

通过使用药理学，解剖学和分子方法，这里提出的证据表明，由H引发的番茄侧面发育的分子机制GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

一个H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS供体氢氧化钠(NaHS)引发HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，上调GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba转录物，然后番茄横向根部形成。以上反应对H敏感GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba清除剂（二甲基硫脲; DMTU）和NADPH氧化酶的抑制剂（二苯基雌烷; DPI），显示H的累积GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba并增加GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba分别预防转录。侧根原根和侧根形成也受到损害。进一步的分子证据表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba细胞周期调控基因的表达，包括上调GydF4y2BaSlCYCA2; 1GydF4y2Ba那GydF4y2BaSlCYCA3; 1GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaSLCDKA1.GydF4y2Ba和下调的下调GydF4y2BaSLKRP2.GydF4y2Ba通过用DMTU或DPI进行共同治疗预防。上述诱导表型与侧根形成相关的microRNA转录物的变化一致：上调GydF4y2BamiR390aGydF4y2Ba和GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba，并具有其靶基因的相反趋势（编码植物症响应因子）。当DMTU或DPI加入时，观察到对比趋势。h的发生GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba介GydF4y2BaS.GydF4y2Ba在上述反应中，初步发现了-硫水合作用。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

总的来说，这些结果表明了一个重要的作用GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba介导HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas诱导番茄侧根发育，相应的HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在转录和翻译后水平调控S-靶蛋白。GydF4y2Ba

完全源自狭窄创始人细胞的侧根（LR）形成对植物根系结构至关重要[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．通常，LR形成取决于遗传决定因素和产后发育过程，主要是植物激素（通常是生长素）和环境因素的影响，包括水和营养可用性[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．遗传和分子证据表明，蟾蜍素通过调节细胞周期调节基因的转录物，例如细胞周期和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）在周围细胞中调节LR形成[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．前期研究结果表明，一氧化氮(NO)在番茄LR原基形成初期介导了生长素依赖的细胞周期调控基因CYCA2;1、CYCA3;1、CDKA1和细胞周期抑制因子kip相关蛋白KRP2的激活[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．另一方面，生长素反应因子(auxin response factor, ARFs)在植物生长发育(包括LR的形成等)中调控生长素的基因表达中起着重要的作用。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．十年前，一种被称为microRNAs (miRNAs)的小型非编码rna被发现可以调节基因表达[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．一些与ARFs相关的mirna已经通过计算方法检测到[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]， 如GydF4y2Ba的miR390GydF4y2Ba瞄准GydF4y2BaARF2.GydF4y2Ba那GydF4y2BaARF3.GydF4y2Ba和GydF4y2BaARF4.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]， 尽管GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba瞄准GydF4y2BaARF10.GydF4y2Ba那GydF4y2BaARF16GydF4y2Ba和GydF4y2BaARF17GydF4y2Ba[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在NO和一氧化碳(CO)之后[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba)，硫化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS）被提议作为第三气态信使参与保卫细胞信号传导[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]，根有机组织[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]，减轻重金属暴露对种子萌发的抑制[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]．在哺乳动物细胞中，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas可以从四个酶中内源产生，例如胱硫氨酸 -GydF4y2Baγ.GydF4y2Ba-lyase（CSE），胱硫脲 -GydF4y2BaβGydF4y2Ba合酶（CBS），半胱氨酸氨基转移酶和3- mercaptopyruvate硫转移（3- MST）[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．在植物中，hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS合成部分催化GydF4y2Ba_L.GydF4y2Ba-Cysteine脱硫胺（DES;动物中CSE的同源物）[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．相关实验发现HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS可能参与番茄幼苗生长素诱导的LR形成[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．重要的是，HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在动物和植物中都是GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- - 磺酸水合物：蛋白质半胱氨酸残基的后期改性（具有过硫化物R-SSH形成）[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．以上修改方式是反对的GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-nitrosylation，蛋白质的半胱氨酸残基的另一种翻译后修饰通过与NO的形成GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-亚硝基胱氨酸残基(R-SNO) [GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．然而,蛋白质是否GydF4y2BaS.GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-LR介导的形成，仍是未知数。GydF4y2Ba

众所周知，过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)除毒性作用外，在信号转导中起着重要作用。事实上,HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba是NADPH氧化酶，多胺氧化酶（PAO）和二胺氧化酶（DAO）等的重要产物。[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．后续结果表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba对逆境的应力介导的植物反应和发生在植物发育过程中的一部分，包括气孔关闭[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]，根向地[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，细胞伸长[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．特别是，H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba也参与了助流信令[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]，不定根生根[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]和LR形成[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

虽然^ hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba分别建议为根架构所需要的[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在番茄LR开发中，尚未完全阐明。在本报告中，H分析H.GydF4y2Ba_2GydF4y2Bas调控的促进LR的机制得到了扩展。通过使用药理学，解剖学和分子方法，这里提出的证据支持的作用GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba介导HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba对番茄LR发育的调控作用GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba初步阐明了lr相关ARFs基因通过miRNAs表达的潜在机制。另外，HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS可能发生在转录和翻译后水平(蛋白GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 磺酸水等）。结果以上的结果为H提供了见解GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba■在植物发育的信号。GydF4y2Ba

增加的内生GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba内容和GydF4y2BaLR.GydF4y2Ba由NaHS诱导形成GydF4y2Ba

单用硫氢化钠相比，下降^ hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS生产（通过光学选项检查确定），然后在次龙管（HT; H.）时先前观察到损伤的LR形成。GydF4y2Ba_2GydF4y2BaSCAAVENR）与NAHS一起加入[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．进一步确认上述NaHS反应是否为HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas依赖，商品化的特异性荧光探针AzMC用于HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS为应用。正如预期的那样，当与HT一起或GydF4y2Ba_DL.GydF4y2Ba- 丙基甘氨酸（PAG; H的合成抑制剂GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS)、azmc相关荧光密度和NaHS实现的LR形成也受到损害(图。GydF4y2Ba1A-E.GydF4y2Ba）.上述结果清楚地证实，NaHs在LR形成诱导中的反应是H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-依赖。GydF4y2Ba

此外，秧苗装载有活性氧物种（ROS）特异性的荧光染料ħGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA，和激光共聚焦扫描显微镜（LCSM）被用来研究在ROS诱导的荧光变化。同时，外源用H施加GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba被视为一个积极的控制。数字GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和b显示的图像和定量H中检测到的荧光水平GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-在DMTU存在或不存在的情况下处理幼苗(a HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba清除剂)或DPI (NADPH氧化酶的抑制剂)。结果表明，DMTU和DPI至少部分降低了根组织中dcf依赖的荧光，这与部分荧光(如果不是大部分)是由内源H引起的解释一致GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．因此，荧光被用来报告内源性HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba水平。GydF4y2Ba

后续结果显示内源性hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba当施加NaHS时，也诱导生产，因为与对照样品相比，DCF依赖性荧光增加了56％（图。GydF4y2Ba图1b，dGydF4y2Ba）.而HT和PAG的加入则减弱了NaHS诱导的上述荧光，提示NaHS诱导HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能被H的去除明显阻断GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba同时，单独使用HT或PAG，不仅降低了相应的荧光，还抑制了LR的形成(图。GydF4y2Ba1 eGydF4y2Ba）.结合LR密度的变化及其数量，因此我们推测了内源性H之间的潜在相互关系GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在侧根形成过程中。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba诱导的番茄侧根对去除很敏感GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba

为了研究H的贡献GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaLR期间形成触发由HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS、DMTU、DPI与NaHS、H联合使用GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba评价番茄LR发展。结果如图所示。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba表明单独添加DMTU或DPI可以引起LR密度的降低（图。GydF4y2Ba3A和B.GydF4y2Ba)， LR长度(图。GydF4y2Ba3 cGydF4y2Ba)和LR编号(图。GydF4y2Ba3 dGydF4y2Ba）;虽然，主要根（PR）长度增加（图。GydF4y2Ba3 eGydF4y2Ba）.进一步的实验显示Nahs-和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在DMTU和/或DPI的存在下，诱导的侧生根显著减少。显微分析表明，NaHS-和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba- LR Primordia（LRP）呈现了类似的解剖结构，并通过NaH和H实现的诱导效应GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可以通过DMTU或DPI显然预防（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.上述结果表明一个假设，即内源性^ hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能需要hGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas诱导侧根发育。此外，当NaHS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba一起应用。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba是由触发的侧根形成所必需的GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba

H的作用GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-诱导侧根发育通过监视H进一步检查GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba合成响应施加的Nah。如预期的那样，H的显着增加GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba番茄幼苗的根，与对照样品相比（在观察到 - 相关荧光硫氢化钠处理过的GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)，提示HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-mediated HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba生产(图。GydF4y2Ba2 a和bGydF4y2Ba）.DMTU和DPI联合治疗证实了这一推论。我们还注意到当NaHS和H在一起时GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，荧光中没有添加剂响应。内源性H的变化GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba用分光光度照相术检测到类似的趋势（图。GydF4y2Ba2摄氏度GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

为了评估H的可能来源GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，则对式求值GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba它是HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba番茄幼苗根的合成[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．如预期的，显著增加GydF4y2Barboh1.GydF4y2BaNaHS在番茄幼苗培养过程中表达量显著增加，表达量显著增加GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba转录物由DMTU或DPI反转（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.与此同时，显着但较弱的归纳法GydF4y2Barboh1.GydF4y2Ba在H的加入下，可以观察到相应的转录GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba有或没有nah。结果表明hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaH引发的LR的形成可能需要GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba调节细胞周期调控基因在表达GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS -GydF4y2Ba诱发GydF4y2BaLR.GydF4y2Ba形成GydF4y2Ba

为进一步研究HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在LR形成的诱导中，Nahs，H的影响GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba分别应用DMTU和DPI单独或联合应用对细胞周期调控基因的表达进行qPCR分析。类似于HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，硫氢化钠导致的上调GydF4y2BaSlCYCA2; 1GydF4y2Ba那GydF4y2BaSlCYCA3; 1GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaSLCDKA1.GydF4y2Ba成绩单，与同时下调在一起GydF4y2BaSLKRP2.GydF4y2Ba转录物（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.然而，DMTU或DPI显著阻断了由NaHS和/或H处理引发的上述转录本调控GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．这些结果表明hGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas触发LR的形成可能是通过上调HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba介导周期调控基因。GydF4y2Ba

miRNA的表达及其靶基因GydF4y2Ba

在随后的实验中，几个LR形成相关的miRNA及其靶基因进行了调查，以检查他们是否参与H中GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS触发的LR开发。结果如图2所示。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba透露，既不是nahs和hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba差异GydF4y2BamiR390aGydF4y2Ba和GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba成绩单;同时，它们相应的靶基因，包括GydF4y2Ba刹车GydF4y2Ba和GydF4y2BaSlARF16GydF4y2Ba，显著减少。氢氧化钠和氢氧化钠的变化明显不同GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba与DMTU或DPI一起添加。上述结果证实了miRNA和靶基因之间变化之间的相反效果。GydF4y2Ba

检测GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- H中的磺胺蛋白质GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS治疗的番茄GydF4y2Ba

进一步分析h的分子机制GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在LR形成s信令，的图案GydF4y2BaS.GydF4y2Ba采用改良生物素开关法对番茄根中的-硫蛋白进行了分析。结果如图所示。GydF4y2Ba8GydF4y2Ba示出用Na番茄根提取的该治疗GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(另一个HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代捐赠;[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba)增强GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 用DTT（亚磺化抑制剂）缓解的 - 硫化水; [GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]）。始终如一地，用NaHS，HT和PAG处理番茄幼苗，单独或它们的组合处理，然后使用根提取物进行分析GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-sulfhydrated型材（图GydF4y2Ba8 bGydF4y2Ba）.同样，NaHS增加了GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 用HT或PAG部分封闭的磺化蛋白质。另外，与对照样品相比，单独略微降低硫酸盐的HT或PAG。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS被提议作为第三气体信使后NO和CO履行在植物中的许多重要的角色，包括的LR形成的诱导[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba那GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]．h的重要功能GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在生长素诱导的LR形成中的作用[GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．虽然^ hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba参与其中GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba发现了拟南芥根系的S诱导的耐盐途径[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba， HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在LR形成基本上不清楚。在这里，我们为H以前未知的角色提供了证据GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在HGydF4y2Ba_2GydF4y2Bas诱导番茄幼苗LR的形成。GydF4y2Ba

首先，我们的结果表明，增加内源HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba由分光光度检查和LSCM确定，是由H引发的LR形成的信号通路中涉及的最早反应之一GydF4y2Ba_2GydF4y2Bas（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这些结果与在受盐胁迫的拟南芥中得到的结果一致[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]，显示出硫氢化钠诱导的H逐渐抬高GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在NaCl胁迫苗根部。这是一个很重要的一点，因为hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba被视为信号转导途径的无处不在的组件之一[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]，包括负责设立土地注册处牌照[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]和不定根[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

进一步的药理学和显微证据表明内源H的要求GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在促进番茄LR形成的诱导GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.这一结论基于几件证据：（i）去除内源性H.GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过其膜可渗透的清除剂DMTU损害了H引起的LR形成的诱导GydF4y2Ba_2GydF4y2Bas（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba和GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）;（ii）所述类似的抑制响应由DPI，NADPH氧化酶抑制剂，H中触发GydF4y2Ba_2GydF4y2Bas诱导hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba生产(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)，随后LRP形成和侧生根(Figs。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）显着，暗示番茄RBOH1的参与至少部分。改变在GydF4y2BaSlRBOH1GydF4y2Ba转录物证实了这笔扣除（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.当然，其他的候选者用于hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba合成(如PAO、DAO;[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba在这一过程中也不能轻易排除。虽然我们不能排除上述化学品可能不是专门针对H的可能性GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，以上结果清楚地表明HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba可能是H的下游信使GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS信号负责LR形成。这种扣除与最近的遗传结果一致[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]，表明这一点GydF4y2Barboh.GydF4y2Ba-介导的ROS的产生促进了拟南芥LR的出现。GydF4y2Ba

有力的证据证明，细胞周期调控基因的表达中起重要作用的早期LR起始生长素和NO [存在GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．与先前的结果相似[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]我们的进一步分子证据显示hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS可以调节四种细胞周期调节基因，包括GydF4y2BaSlCYCA2; 1GydF4y2Ba那GydF4y2BaSlcyca3; 1 SLCDKA1GydF4y2Ba和GydF4y2BaSLKRP2.GydF4y2Ba，模仿H的动作GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.相比之下，当DMTU或DPI分别与H补充在一起时，观察到阻断效果GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代和/或HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．结合表型的变化(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba），我们进一步推测使得hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-triggered HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过靶向细胞周期调节基因，在早期的LR启动中是重要的。GydF4y2Ba

众所周知，植物mirna在叶片形态发生中起着重要的作用[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba，叶极性[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba那GydF4y2Ba48GydF4y2Ba，开花时间[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba那GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]，和花的发育[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]．一些研究也聚焦于与植物根器官发生相关的mirna [GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]．例如，Marin等人。[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba和Yoon等[GydF4y2Ba53GydF4y2Ba]透露，GydF4y2Ba的miR390GydF4y2Ba和生长素响应因子（ARFs）形成的生长素应答调控网络（GydF4y2BamiR390-TAS3GydF4y2Ba-GydF4y2BaARF2 / ARF3 / ARF4GydF4y2Ba）控制侧根发育。另外的miRNA，GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba，被证实具有通过靶向的LR形成诱导了积极的作用GydF4y2BaARF16GydF4y2Ba在拟南芥GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]．因此，几个与ARFS和LR形成相关的代表性miRNA [GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]， 包含GydF4y2BamiR390aGydF4y2Ba为GydF4y2Ba刹车GydF4y2Ba[GydF4y2Ba55GydF4y2Ba]， 和GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba为GydF4y2BaSlARF16GydF4y2Ba[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba]选择。在这项研究中，QPCR的结果显示GydF4y2BamiR390aGydF4y2Ba和GydF4y2BamiR160GydF4y2Ba通过H增加成绩单GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，并在它们的靶基因中观察到的对比变化，包括GydF4y2Ba刹车GydF4y2Ba和GydF4y2BaSlARF16GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.通过去除内源性H显然预防上述改变GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba当DMTU或DPI一起加入时。这些结果与内源性H的变化一致GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba水平(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba），并且其后LR形成（图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.因此，我们推断生长素信号是由HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba-诱导的miRNAs表达可能是HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.当然，应在不久的将来调查相应的遗传证据。GydF4y2Ba

最近,HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS-dependentGydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 已经描述了通过使用改性生物素开关方法检测的半胱氨酸-SH残基转化为过硫化物（-SSH）的转化，这在哺乳动物和植物中起着至关重要的作用[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．然而，无论是GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 磺化水合涉及植物LR形成仍然未知。在我们的实验条件下GydF4y2BaS.GydF4y2Ba当从番茄幼苗根蛋白提取物用Na -sulfhydration条件得到了加强GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba(另一个HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代捐赠;[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba])，并加入DTT(一种硫水化抑制剂;[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]）损害上面的效果（图。GydF4y2Ba8GydF4y2Ba）.由于DTT可以减少二硫键，我们的结果表明修饰是共价并涉及巯基。当番茄幼苗对与内源性的交替相关的化学物质进行番茄幼苗时，获得了类似的结果GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS Hoosuttasis（图。GydF4y2Ba8 bGydF4y2Ba）.因此，结合在LR形成相应的表型（图GydF4y2Ba1GydF4y2Ba），我们提供了初步发现GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-ulfdration可能涉及hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-GydF4y2Ba促进LR形成，虽然具体GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-硫蛋白(s)尚未得到纯化和阐明。事实上，Aroca等人[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]确定了106个GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 磺化蛋白蛋白GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，鉴定的一些蛋白质（抗坏血酸过氧化物酶和过氧化氢酶）与反应性氧物种（ROS）代谢有关。由于表明ROS在LR出现的发展中作用了植物素作用的下游[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba和抗坏血酸过氧化物酶(APX;HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba）以前被证实为GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 磺化水合[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]，应采用遗传和生化(体外和体内试验)结合蛋白质组学和转录组学分析的方法来检查APX是否作为GydF4y2BaS.GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS信号与LR形成有关。GydF4y2Ba

综上所述，本研究结果表明，HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba生产可能是HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba这有助于通过（i）调节细胞周期调节基因的表达的LR形成诱导;（ii）调节MiRNA表达介导的植物素信号传导;（iii）至少部分涉及GydF4y2BaS.GydF4y2Ba-sulfhydrated蛋白(无花果。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.此外，我们的结果提供了转录和翻译后的监管机制的迹象，这有助于发育H引起的LR形成GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba年代。GydF4y2Ba

化学品GydF4y2Ba

除非另有说明，所有化学品均购自Sigma (St Louis, MO, USA)。以1 mM的氢硫化钠(NaHS)作为HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba捐赠者。200μmshopataurine（ht; hGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS清除剂)和2 μMGydF4y2Ba_DL.GydF4y2Ba- 丙基甘氨酸（PAG; H的合成抑制剂GydF4y2Ba_2GydF4y2BaS）也被使用。过氧化氢(HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba)施加在100 μM。GydF4y2BaN，N'GydF4y2Ba-dimethylthiourea（DMTU），H的清道夫GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，用500μm使用。将0.1μm二苯基雌核（DPI）被认为是H的抑制剂GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba合成酶（NADPH氧化酶）。一个H.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba小号荧光探针7-叠氮基-4-甲基香豆素（AzMC）和反应性氧物质（ROS）的荧光探针2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA)的最终浓度均为20 μM。通过中试实验，确定了上述化学物质的有效反应浓度。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

番茄 （GydF4y2BaSolanum lycopersicumGydF4y2BaL.）种子播种“白果强丰”进行表面消毒2％次氯酸钠6分钟，充分冲洗并在黑暗中在蒸馏水中在25±1℃下发芽3天。此后，与胚根2-3毫米所选相同幼苗用的200微摩尔米的光强度转移到含有所指示的化学品4毫升处理溶液和生长在照明培养箱（25±1℃）GydF4y2Ba^-2GydF4y2BaS.GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在14/10小时（光/暗）光周期。GydF4y2Ba

在4 D或指示时间点处理后，拍摄照片。同时，根据之前的方法[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]，出现侧根数(LRs;>1 mm)、主根长(PR)、根长(LR)和出芽根密度(每cm主根的LR数量;LRs/cm)用Image J软件测定。此外，用根南瓜制剂处理3 d后，观察每个幼苗的LR原基(LRP)，并在光学显微镜下进行定量。除非另有说明，只有侧根诱导段用于后续的生化和分子分析。这样就切断了根顶端分生组织，并在根-芽交界处以下进行了切苗。GydF4y2Ba

激光扫描共聚焦显微术GydF4y2Ba

根据以前的方法进行微小修改[GydF4y2Ba56GydF4y2Ba那GydF4y2Ba57GydF4y2Ba]，内源性ħGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba和HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba的生产通过激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）使用ROS荧光探针H上面GydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA和HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaS荧光探针AzMC。处理后，将根置于含有20 μM探针的20 mM HEPES-NaOH缓冲液(pH 7.5)中，置于25°C黑暗中培养30分钟。然后用新鲜HEPES缓冲液洗根3次(每次15分钟)，用Zeiss LSM 710共聚焦显微镜(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)相同曝光时间观察。GydF4y2Ba

所有操作均在25°C下进行。每张照片采用ZEN软件(沿Z叠加的300 μm截面)，基于20个15 μm的重叠共焦平面，在5倍放大目镜下拍摄。每幅图片中，主根成熟区(约50万μm面积)的整体荧光GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba)，细胞开始分化，后期侧根出现。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．对应于所述的荧光图像的明视场（BF）的图像也显示在照片的左上角。至少15个样本的每个实验的分析后，获得具有类似的结果代表性照片。然后，计算的15张照片（每个样品1张照片）对每个处理的平均强度。相对荧光是作为相对于对照样品的值。GydF4y2Ba

测量GydF4y2BaHGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba内容GydF4y2Ba

h的内容GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba采用FOX1方法分析[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]．样品用200mM高氯酸萃取（高氯酸GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba）.4°C离心后，10000GydF4y2BaGGydF4y2Ba15分钟后，将500μL上清液转移到含有500μM的硫酸亚铁铵，50毫米高500微升测定溶液GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba，200μM二甲酚橙，和200mM山梨糖醇，在黑暗45分钟（25℃）。然后，在560nm处进行检测的吸光率值。对于H中的特异性GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过消除ħ测试GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba在反应混合物与过氧化度（猫）。H的标准曲线GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba通过添加可变量的H来获得每个独立实验GydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

实时定量RT-PCR (qPCR)分析GydF4y2Ba

定量PCR来分析的细胞周期调节的基因，基因ARFs和miRNA的表达。各种处理后，从约100mg（鲜重）的样品的总RNA通过使用Trizol试剂（Invitrogen，盖瑟斯堡，MD，USA）分离。然后，将RNA样品使用的寡d（T）引物和M-MLV逆转录酶（BioTeke，北京，中国）反转录。使用Mastercycler®EP进行定量RT-PCR反应GydF4y2BarealplexGydF4y2BaSYBR®实时PCR系统(Eppendorf, Hamburg, Germany)GydF4y2BaPremix前Taq.GydF4y2Ba™（Transgen Biotech，北京，中国）根据制造商的说明。附加号（Genbank / miRBase）和寡核苷酸引物在附加文件中显示GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。在qPCR中进行了3个生物学重复和3个技术重复。用2 . 2计算相应基因的相对表达量GydF4y2Ba^{-ΔΔGydF4y2BaCGydF4y2Ba}_T.GydF4y2Ba方法 [GydF4y2Ba60GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61GydF4y2Ba，表示为在指定时间内相对于相应对照样品的值，并进行归一化处理GydF4y2Ba施GydF4y2Ba和GydF4y2BaGAPDHGydF4y2Ba转录水平。GydF4y2Ba

采用One Step PrimeScript miRNA cDNA synthesis kit (TaKaRa Bio Inc.， Dalian, China)合成cDNA，通过qPCR分析miRNA表达。具体的5 '引物列在附加文件中GydF4y2Ba1GydF4y2BaS1:表。在试剂盒中提供3'底漆。GydF4y2BaU6 SnRNAGydF4y2Ba用作内部控制。其余步骤与先前描述的方法相同[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

改性生物素开关方法GydF4y2Ba

改进的生物素开关方法按照前面描述的方案进行，只做了少许修改[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]．将从样品中提取的总蛋白质在含有250mM Hepes-NaOH（pH7.7），1mM EDTA和0.1mM Neocuproine的母鸡缓冲液中均化，并在10000处离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba在4°C下15分钟。将上清液转移到新鲜管中，并加入三个体积的封闭缓冲液（母鸡缓冲液，补充有2.5％SDS和20mM甲基亲烯酸甲酯（MMTS））。然后，将溶液在4℃下温育12小时以阻断游离巯基。然后除去MMT，使用冰冷的丙酮在-20℃下沉淀蛋白质20分钟。除去丙酮后，将蛋白质重新悬浮在母鸡缓冲液中（补充有1％SDS的母鸡缓冲液）。之后，这GydF4y2BaS.GydF4y2Ba- 使用4mm标记 - 磺化蛋白质GydF4y2BaNGydF4y2Ba-[6-(biotinamido)hexyl]-3 ' -(2 ' -pyridyldithio)丙酰胺(Biotin-HPDP)，在25°C黑暗下保存3小时。GydF4y2Ba

以上生物素标记蛋白在12%聚丙烯酰胺凝胶上使用非还原性SDS-PAGE分离。然后，根据制造商的说明，将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜(瑞士巴塞尔罗氏)。抗生物素抗体(HRP) (Abcam antibody, Cambridge, UK) 1:10 000稀释。同时，使用考马斯亮蓝染色凝胶来确认相同数量的蛋白质负载(数据未显示)。GydF4y2Ba

统计分析GydF4y2Ba

所有结果均显示为至少三个独立实验的平均值±SE，每个实验至少为每个生物重复。通过使用SPSS 17.0软件，通过单向分析的差异（ANOVA）进行分析数据，然后是Duncan的多个范围测试，GydF4y2BaP.GydF4y2Ba值<0.05被认为是统计学意义的。GydF4y2Ba

3-MST:GydF4y2Ba

3-Mercaptopyruvate sulfurtransferaseGydF4y2Ba

APX：GydF4y2Ba

抗坏血酸盐过氧化物酶GydF4y2Ba

ARFS：GydF4y2Ba

生长素反应因素GydF4y2Ba

AZMC：GydF4y2Ba

7-azido-4-甲基伞素素GydF4y2Ba

Biotin-HPDP:GydF4y2Ba

NGydF4y2Ba- [6-（Biotinamido）己基] -3' - （2'-pyridylithio）丙酰胺GydF4y2Ba

猫：GydF4y2Ba

催化剂GydF4y2Ba

哥伦比亚广播公司:GydF4y2Ba

半胱氨酸 -GydF4y2BaβGydF4y2Ba-Synthase.GydF4y2Ba

CDK：GydF4y2Ba

Cyclin依赖激酶GydF4y2Ba

CO：GydF4y2Ba

一氧化碳GydF4y2Ba

CSE：GydF4y2Ba

半胱氨酸 -GydF4y2Baγ.GydF4y2Ba-Lyase.GydF4y2Ba

刀:GydF4y2Ba

二胺氧化酶GydF4y2Ba

DMTU：GydF4y2Ba

二甲基硫脲GydF4y2Ba

DPI:GydF4y2Ba

二苯idoniumGydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaDCF-DA：GydF4y2Ba

2'，7'-dchlorofluorescein酸二酸酯GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2BaO.GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba：GydF4y2Ba

过氧化氢GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2GydF4y2Ba史:GydF4y2Ba

硫化氢GydF4y2Ba

HRP.GydF4y2Ba

抗生物素抗体GydF4y2Ba

H T：GydF4y2Ba

hyp龙鱼GydF4y2Ba

LR：GydF4y2Ba

侧根GydF4y2Ba

含:GydF4y2Ba

侧根原始GydF4y2Ba

LSCM:GydF4y2Ba

激光扫描共聚焦显微镜GydF4y2Ba

mirnas：GydF4y2Ba

microRNA;GydF4y2Ba

MMTS：GydF4y2Ba

甲基甲基磺酸甲酯GydF4y2Ba

纳斯：GydF4y2Ba

钠氢硫化物GydF4y2Ba

没有:GydF4y2Ba

一氧化氮GydF4y2Ba

PAG：GydF4y2Ba

_DL.GydF4y2Ba-PropargylglycineGydF4y2Ba

PAO：GydF4y2Ba

多胺氧化酶GydF4y2Ba

公关:GydF4y2Ba

主根GydF4y2Ba

ROS：GydF4y2Ba

反应性氧气GydF4y2Ba

QPCR：GydF4y2Ba

实时定量rt - pcrGydF4y2Ba

没有任何。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

该工作得到了中国国家自然科学基金（31772292），中国江苏省的自然科学基金（BK20141361），以及江苏高等教育机构的优先学术计划发展（PAPD）。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

所有相关数据都在本文及其支持信息文件中。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 生命科学学院，生命科学学院，南京农业大学实验中心，南京，210095，中国GydF4y2Ba

   梅玉栋，沈文标GydF4y2Ba

2. 南京农业大学科学学院，南京，210095GydF4y2Ba

   昊天陈，魏申＆李琴黄GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

本研究的构思与设计:LH。研究数据的获取:YM, HC, WSGydF4y2Ba^1GydF4y2Ba, WSGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba．分析工作数据：YM和WSGydF4y2Ba^1GydF4y2Ba．对工作数据的解释：YM，HC，WSGydF4y2Ba^1GydF4y2Ba，WS.GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba和lh。所有作者阅读并认可的终稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2BaLiqin黄GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

番茄 （GydF4y2BaSolanum lycopersicumGydF4y2Ba种子“百果强丰”购自江苏省农业科学院。番茄种子经中华人民共和国农业部批准，植物检疫证书号为620,900,200,000,857。GydF4y2Ba

同意出版GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba