拟南芥核stemin - like 1 (NSN1)通过与核小体组装蛋白AtNAP1合作潜在地调控细胞周期GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

在哺乳动物中，核stemin (NS)是一种核仁GTPase，参与干细胞增殖、胚胎发生和核糖体生物发生。拟南芥GydF4y2Ba肌炎素样1GydF4y2Ba（GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba)已被证明是植物生长和发育所必需的。然而，NSN1在细胞增殖中的作用尚不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

使用GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba，一种拟南芥功能缺失突变体GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba，我们研究了NSN1在植物细胞增殖和细胞周期调控中的作用。形态,GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba在叶和根中都表现出发育缺陷，产生的营养器官严重减少，细胞数量比野生型少得多。叶片和根系生长的动态分析显示，在生长过程中，细胞增殖率较低，细胞分裂较慢GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba．始终如一的是，关键细胞周期基因的转录水平，包括调节G1-S和G2-M的转变的那些，急剧减少GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba．的引入GydF4y2BaCyclin B1 :: GUSGydF4y2Ba成GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba导致GUS在叶子原基和根系中狭窄的表达，表明细胞增殖被突变阻碍了GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba．经博莱霉素和甲基甲磺酸(MMS)治疗后，GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba植物对这些基因毒性物质表现出超敏反应。在细胞核中，NSN1与核小体组装蛋白1 (AtNAP1;1)相互作用，这是一种高度保守的组蛋白伴侣，在细胞增殖中发挥作用。值得注意的是，拟南芥NSN1的n端保守结构域对其物理相互作用至关重要。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

拟南芥NSN1作为哺乳动物核仁干蛋白的保守同源物，在胚胎发生和核糖体生物发生中起着关键作用。在这项研究中，GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba被发现在细胞周期进程中起正调节作用。NSN1与组蛋白伴侣AtNAP1;1相互作用，对基因毒性的敏感性高度相似GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnap1; 1GydF4y2Ba说明这两种核蛋白对细胞周期的调控是不可缺少的。这项工作为拟南芥中gtp结合蛋白与核小体组装/拆卸蛋白的合作精细控制细胞增殖提供了一种见解。GydF4y2Ba

在多细胞生物中，器官发生需要严格控制细胞增殖。核stemin (NS)是一种核仁gtp结合蛋白，首次在小鼠的干细胞和一些癌症细胞系中发现[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．它涉及干细胞增殖，细胞周期维持，核糖体生物发生和胚胎发生[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2 gydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba］．例如，小鼠体内NS的耗尽或过表达通过抑制小鼠双分钟2 (MDM2)的活性，从激活p53引起G1-S和G2-M转变的停止，MDM2是一种针对p53的E3泛素连接酶，用于蛋白酶体介导的降解[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]. NS存在于一个含有前rRNA加工相关核仁蛋白的大型蛋白复合物中，如Pescadillo（Pes1）、DDX21（也称为RHII/Guα）和EBNA1结合蛋白2（EBP2）[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba，提示在核糖体生物发生中起关键作用。GydF4y2Ba

NS是原核生物和真核生物中保守的GTPase的成员，属于YlqF/ yag GTPase家族[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba］．人类NS家族由核stemin、Guanine Nucleotide binding protein like 3 (GNL3L)和Ngp-1组成，实验表明这三种成员在体内均与GTP结合，这与这些蛋白中GTP结合域的存在是一致的[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11GydF4y2Ba］．此外，NS在c端还含有一个酸性氨基酸(AAA)结构域，在n端含有一个碱性氨基酸(BAA)结构域和一个螺旋状螺旋结构域[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．后两个域主要发挥其在动植物细胞周期进程中作为核仁蛋白的生物学功能[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

与哺乳动物不同，只有NS基因的两个亚属（GydF4y2BanucleosteminGydF4y2Ba和GydF4y2BaNGP-1就像GydF4y2Ba）已在拟南芥中鉴定出没有GydF4y2BaGNL3L-likeGydF4y2Ba家族的基因(GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．拟南芥的核stemin-like1 (NSN1)被发现具有哺乳动物NS的共同结构域，gfp融合的NSN1主要定位于烟草BY-2细胞的核仁[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．这GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变体在胚胎发生以及叶和花器官的发育中都表现出缺陷。一致地,GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在发育中的胚胎、花、茎顶端分生组织和器官原基中高度表达[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．分生组织基因表达减少的观察包括GydF4y2Ba本人GydF4y2Ba那GydF4y2BaCLV3，STMGydF4y2Ba和GydF4y2Ba蚂蚁GydF4y2Ba在GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba表明,GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在胚胎发生中起重要作用[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．近年来，NSN1通过调节核糖体的生物发生，在植物生长和衰老过程中起着重要作用GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba导致拟南芥和烟草的生长迟缓和早衰[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．已经发现包括PESCADILLO和EBP2的几种核糖体蛋白与NSN1相互作用，并且已经显示NSN1的耗尽可能通过延迟60s核糖体亚基的生物发生来压制全球平移[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．综上所述，拟南芥NSN1在植物生长发育中发挥着重要作用，但具体机制尚不清楚。GydF4y2Ba

核小体组装蛋白1 (NAP1)是核小体组装/分解中的组蛋白伴侣，从酵母到人类高度保守[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba］．已知NAP1缺陷会导致酵母中约10%的核基因表达紊乱[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba，以及哺乳动物和果蝇的胚胎致死率[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]. 在植物中，GydF4y2BaNAP1GydF4y2Ba已在包括水稻、大豆、烟草和拟南芥在内的多个物种中发现[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．在拟南芥中,GydF4y2BaNAP1GydF4y2Ba是一个多基因家族，有4个成员:GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAP1; 2GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAP1; 3GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtNAP1; 4GydF4y2Ba．在表型上，个体突变体与正常生长条件下的野生型植物相似，这表明同源基因的功能冗余[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．两个等位基因(GydF4y2BaM123-1GydF4y2Ba和GydF4y2BaM123-2GydF4y2Ba)的三重突变体GydF4y2BaAtnap1; 1 Atnap1; 2 Atnap1; 3GydF4y2Ba表现出由UV-C照射引起的DNA损伤的过敏反应[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba，揭示了一个角色GydF4y2BaAtNAP1GydF4y2Ba基因在核苷酸切除修复DNA。对AtNAP1;1的研究表明，与水稻和烟草的同源蛋白一样，一些AtNAP1;1- gfp融合蛋白在叶片发育的早期以细胞核为目标，而大量的融合蛋白保留在细胞质中[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．其促进细胞分裂或扩张的功能和蛋白质的farnesylation状态已被发现与它的亚细胞定位有关[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．在双分子荧光互补(BiFC)实验和下拉实验中，AtNAP1;1已被证实与核糖体蛋白S6 (RPS6)相互作用，支持其在植物rDNA转录中的正调控作用[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba］．AtNAP1;3在c端缺少34个氨基酸，该截断蛋白的分析揭示了拟南芥对ABA (ABA)处理和盐胁迫的响应，在ABA响应中发挥了主导负因子的作用[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

除了NAP1之外，Arabidopsis还具有两个与NAP1相关的蛋白质，ATNRP1和ATNRP2。两者都主要是核，和双突变体GydF4y2BaAtnrp1-1Atnrp2-1GydF4y2Ba表现出短根并增加对遗传毒性治疗的敏感性[GydF4y2Ba2 gydF4y2Ba］．最近一项使用同源重组(HR)报告结构的研究表明，在双突变体中HR水平降低GydF4y2BaAtnrp1-1Atnrp2-1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba)和GydF4y2BaAtNAP1GydF4y2Ba三突变体GydF4y2Bam123-1,GydF4y2Ba提示NRP和AtNAP1通过平行途径协同促进体细胞HR。GydF4y2Ba

在本研究中，我们关注的是GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在细胞周期调节中。分子、组织化学和遗传分析表明矮化突变体生长发育迟缓GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba是由于其细胞周期受阻。NSN1和AtNAP1;1的相互作用，它们参与细胞周期进程和超敏反应GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba和GydF4y2Baatnap1; 1GydF4y2Ba遗传毒剂意味着在拟南芥中GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba通过与组蛋白伴侣蛋白ATNAP11合作来调节细胞循环和DNA损伤修复。GydF4y2Ba

增长的缺陷GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变体GydF4y2Ba

在以前的研究中,GydF4y2BaNucleostemin-like1GydF4y2Ba（GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba）在拟南芥中，通过参与调节胚胎发生和营业发育的调节至关重要，对营养生物和生殖器官的生长至关重要[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．在这里，我们调查了GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在叶和根器官的细胞增殖和分裂。与研究结果一致的是GydF4y2Bansn1,GydF4y2Ba一个功能突变突变体GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba，在胚胎后期开始[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba，推迟了第一片叶子的出现GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba观察到矮化植物（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，第一个叶片在萌发后第9天(DAG)，而野生型植株的第5天(DAG)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在叶片扩展过程中，在起始后第9天(DAI)，野生型第5叶的叶面积最大，而野生型对应叶面积最大GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba完全展开并在第21 DAI达到最大面积(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.因此,GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba在生命周期中表现出严重的生长迟缓。除非另有说明，本研究使用第五叶对。叶面积分析表明，子叶和第五叶的大小GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba分别约为野生型的50%和40%(图。GydF4y2Ba1B，DGydF4y2Ba）.作为一个结果,GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba叶片尺寸较小，表现出矮化(图。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba）.在根的根部中观察到类似的发育延迟GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba初生根长度约为野生型的40%（图。GydF4y2Ba1e，fGydF4y2Ba）.因此，无论是空中还是地下的器官GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba植物表现出生长缺陷，说明生长缺陷是不可缺少的GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba植物的生长。GydF4y2Ba

细胞增殖缺陷GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba叶子GydF4y2Ba

植物器官的大小是由其组成细胞的数量和大小决定的。目的探讨侏儒症的病因GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba测量并分析了第五叶对的拨肉面积细胞的数量和尺寸。与Dwarf雕像一致GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba，栅栏细胞的数量减少到野生型的56%(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba). 在里面terms of cell size, although cells in the palisade cell layer from the cross-section ofnsn1GydF4y2Ba叶片比野生型略大(图。GydF4y2Ba2B-E.GydF4y2Ba)，两基因型间栅栏细胞直径差异无统计学意义(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba>(图0.05)。GydF4y2Ba2 fGydF4y2Ba)，提示细胞大小并不是侏儒症的主要来源GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba．因此，叶片的整体尺寸减小GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变是由于细胞数量的减少而不是细胞大小的改变。GydF4y2Ba

寻找细胞减少的原因GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba，检查叶面积和细胞增殖率的动力学，并与野生型植物进行比较。留下生长的动力学分析表明，在启动后野生型叶片面积显着增加，并在第7位达到最大值，而逐步叶片生长GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba相对较慢，在第17 DAI时达到最大值(图。GydF4y2Ba2 gGydF4y2Ba）.细胞增殖的长期持续时间GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba表明矮化突变体的细胞增殖速度较慢。同时，叶片/细胞数动态也表现出最大细胞数的显著差异GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba野生型约为3.4 × 10GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba在第17代GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba和4.9×10GydF4y2Ba^3.GydF4y2Ba野生型细胞第7代细胞(图。GydF4y2Ba2 hGydF4y2Ba),分别。总的来说，阻碍了叶子的生长GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba是由机器故障引起的GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在细胞增殖。此外，野生型的栅栏细胞层和海绵状细胞层易于分化，细长的栅栏细胞的纵向轴向与叶表皮垂直(图2)。GydF4y2Ba2 bGydF4y2Ba). 在里面GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba而栅栏细胞异常，形态不规则，大小、形状变化大(图)。GydF4y2Ba2摄氏度GydF4y2Ba），表明除了调节细胞增殖和分裂外，GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba也可以在叶片发展中起作用。GydF4y2Ba

细胞增殖效率低下GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba根GydF4y2Ba

与根系生长发育迟缓相一致GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba1e，fGydF4y2Ba)， 10日龄突变体的初生根较短，根分生组织区存在较少的分生细胞GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba比野生型(图。GydF4y2Ba3 a, bGydF4y2Ba). 在里面terms of root growth rate, root length was monitored during the first week after germination. The length of primary root ofnsn1GydF4y2Ba在头7天内，约为野生型的25-35%(图。GydF4y2Ba3 cGydF4y2Ba)，在第10天，GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba根达到野生型的40%（图。GydF4y2Ba1e，fGydF4y2Ba）.与分生组织细胞的测量一致，由GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba约为野生型根的三分之一。GydF4y2Ba3 dGydF4y2Ba）.因此，我们的分析表明，根系伸长减慢和根细胞日产量减少GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba解释了突变体中观察到的生长缺陷。GydF4y2Ba

受损的细胞周期进程GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba

鉴于侏儒症GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba是由细胞增殖和分裂缺陷引起的，我们研究了GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变影响了5个细胞周期标记基因的转录水平，其中包括3个细胞周期蛋白家族基因GydF4y2BaCYCA2；3.GydF4y2Ba那GydF4y2Bacycb1; 1，GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYCD3; 1GydF4y2Ba和两个S期特异基因GydF4y2Ba组蛋白H4GydF4y2Ba和GydF4y2Ba核苷酸还原酶GydF4y2Ba（GydF4y2BaRNR)GydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba］．对于这三个周期蛋白基因，GydF4y2BaCYCD3; 1GydF4y2Ba已被报道为G1-S过渡的关键基因，通过控制细胞分裂率[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba，而剩下的两个基因，GydF4y2BaCYCB1; 1GydF4y2Ba和GydF4y2BaCYCA2; 3、GydF4y2Ba已发现影响细胞周期的G2/M转变[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba］．定量分析表明GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba，细胞周期蛋白基因的表达水平约为野生型的30-40%，转录水平为GydF4y2Ba组蛋白H4GydF4y2Ba和GydF4y2BaRNRGydF4y2Ba，是DNA合成途径中的关键酶[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]，分别降至野生型的约60%和50%(图。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba）.这些细胞周期调控基因在GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba暗示了G1-S和G2-M过渡的中断。GydF4y2Ba

为了进一步分析NSN1在细胞周期调控中的作用，我们进行了流式细胞术分析。对两个发育阶段(4日龄和成熟)的叶片进行核分离。我们的结果显示2C核的百分比更低GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba比杨氏和成熟阶段的野生型：79 vs.95％和18％，分别为60％（图。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.与野生类型相比，在GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba在幼叶中检测到16%以上的4C核，在成熟叶中观察到42%以上的多倍体，包括4C、8C、16C和32C核（图。GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba). 检测到较高比例的多倍体，表明DNA含量浓缩GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba由于…故障GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba细胞分裂中的突变。GydF4y2Ba

使…的效果形象化GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在细胞周期进程中，转基因植物表达GydF4y2Ba周三GydF4y2BaB1; 1::格斯GydF4y2Ba表达β-葡萄糖醛酸酶(GUS)在细胞周期蛋白启动子下与有丝分裂破坏序列(D-box)融合GydF4y2BaCYCB1; 1GydF4y2Ba[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，被交叉了GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变获得GydF4y2Ba周三GydF4y2BaB1; 1::格斯GydF4y2Ba包含GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba行。GUS活性标记G2期和M早期细胞[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba，因为融合基因在进入G2时表达(通过GydF4y2BaCYCB1:1GydF4y2Ba启动子)，其蛋白产物从中期退出时降解(通过D-box) [GydF4y2Ba32GydF4y2Ba］．组织化学分析表明，在野生型背景下，gus阳性细胞主要分布在叶原基区域(图2)。GydF4y2Ba4摄氏度GydF4y2Ba）.什么时候GydF4y2Ba周三GydF4y2BaB1; 1::格斯GydF4y2Ba被引入GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba，然而，GUS的表达局限于一个包含茎尖分生组织细胞的小得多的区域(图。GydF4y2Ba4 dGydF4y2Ba). 在里面根那一种Clearly lower number of GUS-positive cells were observed innsn1GydF4y2Ba与对照装置中的装置相比（图。GydF4y2Ba4 e, fGydF4y2Ba）.的限制GydF4y2Ba周三GydF4y2BaB1; 1::格斯GydF4y2Ba信号在根和茎尖分生组织GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba植物提供了被捕细胞循环的遗传证据GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba．因此，我们的分子和遗传数据揭示了叶和根的细胞周期进程GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba受到了GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变。GydF4y2Ba

超敏反应GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba基因毒性药物GydF4y2Ba

考虑到GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba对甲基甲磺酸(MMS)和博莱霉素(bleomycin)的敏感性进行了研究。众所周知，MMS会导致DNA烷基化，而DNA聚合酶很难复制DNA [GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]，而用类放射药物博莱霉素治疗会引起多种类型的分子损伤，包括双链断裂(DSBs) [GydF4y2Ba34GydF4y2Ba］．将四天叙述拟南芥Plantlet用MMS和Bleomycin治疗。什么时候GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba幼苗暴露在25ppm MMS中，莲座叶片变黄，根系生长受到严重抑制(图2)。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba）.50ppm的MMS抑制了叶片和根器官的生长，导致叶片黄化和植株死亡。MMS引起的损伤是剂量依赖性的(图。GydF4y2Ba5GydF4y2Ba). 在里面CO.ntrast, the growth of wild type was not obviously affected by MMS at 25 ppm, and for treatment of 100 ppm MMS, no plant death was observed although rosette leaves were yellowish and root growth was badly inhibited (Fig.5GydF4y2Ba）.这些结果表明GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba与野生型相比，对MMS处理过敏。生存率GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba博莱霉素处理显著降低了植株的存活率，特别是当剂量高于6 mg/L时(图2)。GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.剂量为12mg /LGydF4y2Bansn1GydF4y2Ba植株在处理1周后死亡，而野生型植株约有60%存活(图1)。GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.因此,GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba与野生型植物相比，NSN1对这两种基因毒性因子表现出更明显的敏感性，这意味着NSN1参与了植物细胞周期的进程。GydF4y2Ba

NSN1与AtNAP1的相互作用；1体外和体内GydF4y2Ba

与哺乳动物NS一样，拟南芥NSN1与核糖体生物发生中涉及的几个核仁蛋白相互作用[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．为了寻找潜在的与NSN1物理相互作用的植物特异性蛋白，进行了酵母双杂交筛选。我们从pAD-GAL4-2.1构建的ABRC(砧木CD4-30)中筛选拟南芥花cDNA文库。GydF4y2BaNSN1GydF4y2BacDNA被克隆到PBD-Gal4（战略，美国）中并用作诱饵。PBD-GAL4和PAD-GAL4-2.1的空载体被用作阴性对照，用于验证候选克隆。GydF4y2Ba

筛选了约一百万酵母菌落，并验证了候选菌落以消除误报。一个菌落显示出选择性培养基的一致生长，菌落被确定为GydF4y2BaNAP1; 1GydF4y2Ba（AT4G26110.2），核小体组装蛋白1的成员（NAP1）[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．进一步分析表明，该酵母菌落表达的全基因组编码序列(CDS)GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba在选择性培养基上健康生长，在X-gal指示板上变蓝（图。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba)，提示编码蛋白与NSN1之间存在相互作用。对于对照载体，如预期，在X-gal覆盖试验中，酵母几乎不能在极淡蓝色的选择培养基上生长(图。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba上图）。相互作用强度的定量揭示了表达NSN1和ATNAP1的细胞中的显着强的信号; 1（图。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba(上图)，表明NSN1和AtNAP1;1的存在是观察到的相互作用所必需的。有趣的是,类似于GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba也被证明可以调节细胞增殖和叶子发育[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

NSN1包含核干细胞蛋白的常见保守结构域，包括碱性氨基酸结构域（BAA）、卷曲螺旋结构域（CC）、GTP结合结构域（GBD）、RNA结合结构域（RBD）和酸性氨基酸结构域（AAA）（图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.为了研究NSN1的哪个结构域对于与ATNAP1的体外相互作用是必不可少的; 1，测试了两个相邻的组合结构域，包括驻扎用于N-末端BAA和CC结构域的BC和GBD和RBD结构域的GR（图。GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.结构域缺失分析表明，在BC结构域中，酵母生长和强蓝色信号被观察到，而在空载体中包含任何一个被测试的多肽的对照是阴性的(图)。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba），表明，NSN1的两个N末端结构域，BAA和CC的存在对于相互作用是必不可少的（图。GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba）.未检测到AtNAP1;1与NSN1的两个中间结构域如GBD和RBD(数据未显示)之间的物理相互作用。这些结果表明，NSN1与AtNAP1之间的物理相互作用是由n端两个保守结构域(BAA和CC)组成，而非中间两个保守结构域(RBD和AAA)组成;GydF4y2Ba

为了检测NSN1和AtNAP1;1是否在体内相互作用，我们使用了BiFC检测，这是一种广泛使用的工具，用于可视化活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用。NSN1和AtNAP1;1编码序列分别与增强GFP (enhanced GFP, eGFP)的n端和c端片段融合在框架中[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]. 融合蛋白（YFP）GydF4y2Ba^NGydF4y2Ba-NSN1和YFPGydF4y2Ba^CGydF4y2Ba-NAP1;1)在烟草叶片中共同表达GydF4y2Ba农杆菌属GydF4y2Ba渗透。48 h后用共聚焦激光扫描显微镜检查烟草浸润后的叶表皮细胞，YFP转染后的烟草叶细胞核内可见GFP荧光GydF4y2Ba^NGydF4y2Ba-NSN1和YFPGydF4y2Ba^CGydF4y2Ba-NAP1;GydF4y2Ba6摄氏度GydF4y2Ba）.该结果与先前的研究一致，即NSN1主要归入核仁[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba］．而在YFP时没有检测到YFP信号GydF4y2Ba^NGydF4y2Ba-NSN1在烟草细胞中与未融合pSPYCE (M) 155 (YC)共表达(图)。GydF4y2Ba6摄氏度GydF4y2Ba）.这些结果表明，NSN1在体内与AtNAP1;1相互作用，AtNAP1蛋白之一，在核小体组装/分解中作为组蛋白伴侣。GydF4y2Ba

近年来，从拟南芥和烟草中鉴定出了植物核干蛋白同源物[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．据报道，拟南芥GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在花分生组织发育、花器官鉴定、胚胎发生、叶片发育和衰老中起关键作用[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]. 这项工作的目的是从功能上描述GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在拟南芥中的细胞周期调节中。基于细胞循环组分的分子和遗传分析及细胞增殖动力学GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba突变体，我们得出结论GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba是正确控制细胞增殖不可缺少的。AtNAP1;1是一种组蛋白伴侣，作为NSN1的相互作用伙伴，表明这两种蛋白可能在核仁复合物中发挥调节细胞周期进程的作用。GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba通过维持适当的细胞周期进程参与植物的生长和发育。有记录表明，在动物中GydF4y2BaNSGydF4y2Ba缺失或过表达，细胞周期停止，G1-S和G2-M的转变停止[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba］．假定是拟南芥功能缺失突变体GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba表现出侏儒症，NSN1主要定位于核仁，这是细胞生长的关键特征，GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba可能影响植物细胞周期进展。该观点是核心细胞循环基因的均匀下调的分子证据支持，例如GydF4y2BaCYCA2；3.GydF4y2Ba那GydF4y2BaCYCB1；1，CYCD3；1.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba组蛋白H4GydF4y2Ba和GydF4y2BaRNRGydF4y2Ba,在GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba(无花果。GydF4y2Ba4GydF4y2Ba). 在里面一种D.D.ition to controlling cell-cycle transition, the core cell cycling components have been documented to function in coordinating cell division with differentiation and development in plants [36GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37GydF4y2Ba］．观察到更多的多倍体百分比，严重减少CYCLIN B1;1:: gus表达细胞，细胞增殖减慢GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba说明细胞分裂不足。因此，nsn1的叶和根均表现出生长迟缓的现象GydF4y2Banbnsn1.GydF4y2Ba也使烟草植物沉默[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba］．这些结果提供了与烟草拟南芥同源物相似的遗传和分子证据GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba调节细胞循环。因此，除在胚胎发生和叶、花器官发育中发挥作用外[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba，核蛋白NSN1在维持拟南芥细胞正常增殖中不可或缺。GydF4y2Ba

似乎核小体组装蛋白AtNAP1;1和NSN1可能共同作为一个功能蛋白实体的亚基发挥作用。这一观点得到了以下事实的支持:这两种蛋白质有几个共同特征，包括参与细胞周期进程、细胞核定位以及它们的突变体对基因毒性反应的相似性。作为保守的组蛋白伴侣，植物的NAP1s和NRPs在单子叶和双子叶植物中都有记录[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．例如，在拟南芥中过表达GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba增加的表达GydF4y2BaCYCB1; 1GydF4y2Ba并缩短G2相，从而促进细胞划分[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．双突变体GydF4y2Banrp1-1 nrp2-1GydF4y2BaG2/M时细胞周期进展受阻[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．在烟草,GydF4y2BaNAP1GydF4y2Ba基因在G1/S转变时已被观察到高表达[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba］．结合我们的发现GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba因此，我们认为AtNAP1;1和NSN1都参与了细胞周期进程的调控。GydF4y2Ba

支持的是，对NSN1和AtNAP1;1的胞内定位分析表明，这两种蛋白都位于细胞核中[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．结果NSN1的n端结构域主要决定其定位[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]与哺乳动物NS的研究结果一致，NS的核仁定位是由n端碱性结构域确定的[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba］．基于我们的发现，NSN1的n端结构域对其与AtNAP1;1的相互作用至关重要，我们假设这两个蛋白在细胞核内相互作用。这一假设得到了BiFC实验的支持，该实验显示了烟草叶片细胞核中NSN1和AtNAP1;1之间的体内相互作用。有趣的是，就像哺乳动物的NS [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]， AtNAP1;1同时位于细胞核和细胞质中，该蛋白似乎在两个细胞器之间穿梭[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba］．对函数或函数损失突变体的研究表明，当局部归入核时，GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba在叶发育的早期促进细胞分裂[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba］．NSN1和AtNAP1;1在细胞核中的共同定位(图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)提供了新的证据，表明这两种蛋白质可能在细胞周期调节中作为一个复合物的亚基。进一步研究这两种蛋白的穿梭机制将为功能表征提供有价值的信息。GydF4y2Ba

此外，表型特征GydF4y2BaAtnap1; 1GydF4y2Ba都很容易让人想起那些GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba经受UV或其他DNA损伤剂。ATNAP1; 1属于多基因家族。突变GydF4y2BaAtNAP1sGydF4y2Ba单独或同时在标准实验室条件下几乎不产生可见表型[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba，表明这些基因在正常条件下对植物生长发育是不可缺少的。当暴露在博莱霉素或紫外线处理下，GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtnap1GydF4y2Ba突变体包括单倍，双倍，三倍和四倍，以及GydF4y2BaAtnrp1和Atnrp2GydF4y2Ba，对基因毒性物质表现出超敏反应[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba］．NSN1和AtNAP1s对基因毒性治疗的反应相似，表明它们参与了dna损伤修复过程，但其功能机制尚不清楚。GydF4y2Ba

有报道称，在哺乳动物中，NSN1与DDX21、EBNA1结合蛋白2 (EBP2)、Pescadillo (PES)和一组核糖体蛋白形成一个大的蛋白复合物[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba］．在拟南芥中，EBP2的同源基因AtEBP2和PES的同源基因AtPES也被发现与NSN1相互作用，特别是其n端结构域(1-174个氨基酸)[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba，提示NSN1及其相互作用伙伴通过调节核糖体的生物发生来调控植物生长。在寻找参与细胞周期调节的潜在的nsn1相互作用伙伴时，GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba(At4g26110.2)经酵母双杂交系统鉴定(图6)。拟南芥中有4个AtNAP1家族成员(AtNAP1;1, AtNAP1;2, AtNAP1;3和AtNAP1;4)和2个NRP蛋白(AtNRP1和AtNRP2) [GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba，在系统发育树中聚类为两个分支(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1a)。在AtNAP1子组中，AtNAP1;1与AtNAP1;3、AtNAP1;2和AtNAP1;4的序列标识分别为80.3、72.4和46.4%(附加文件GydF4y2Ba2 gydF4y2Ba:表S1)。AtNAP1;1与NSN1的相互作用可能与AtNAP1;1的c端不同有关GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图印地)。另一个可能的原因是GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba从筛选中挑选出来的可能是，本实验中用作祈祷的花库的覆盖率不足以包含低表达基因，如GydF4y2BaAtNAP1; 3GydF4y2Ba，其在花中的表达水平约为GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:图S1c)根据拟南芥eFP Browser (GydF4y2Bahttp://bar.utoronto.ca/efp_arabidopsisGydF4y2Ba) [GydF4y2Ba39GydF4y2Ba］．通过删除AtNAP1;1的结构域，进一步的研究将提供与NSN1相互作用所需的AtNAP1;1结构域的信息。未来的研究将集中在GydF4y2Bansn1 Atnap1; 1GydF4y2Ba揭示双突变体的分子功能GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba在调节植物生长和发展中的互动伴侣。GydF4y2Ba

拟南芥的生物学功能GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba在维持正常的细胞周期进程方面，有分子和遗传学方法的特点。我们的研究结果为侏儒症提供了直接证据GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba是突变体植株茎和根的分生组织中细胞增殖不当的结果。拟南芥NSN1作为阳性细胞周期调节剂，与核小体组装蛋白AtNAP1;1共定位并相互作用。这两种蛋白质参与了细胞周期进程及其突变体的调控，GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtnap1; 1GydF4y2Ba，对遗传毒剂的处理过敏。我们提出NSN1和ATNAP1; 1作为功能性蛋白复合物的亚基在细胞循环进展调节中起作用。因此，与其在哺乳动物中的同源物一样，拟南芥中的NSN1保守用于调节植物细胞循环。这项研究揭示了串扰之间的新灯GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba在植物细胞周期调控中的作用。GydF4y2Ba

植物材料和生长条件GydF4y2Ba

这GydF4y2Bansn1-1GydF4y2BaT-DNA插入系(SALK_029201)GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba生物资源中心(ABRC) [GydF4y2Ba16GydF4y2Ba),GydF4y2BaCyclin B1 :: GUSGydF4y2Ba表达植物是Peter Doerner教授的礼物（英国爱丁堡大学）。在正常条件下植物在土壤中生长，在21°C下16小时光/ 8小时黑暗。GydF4y2Ba

植物治疗GydF4y2Ba

灭菌拟南芥（COL-0和GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba)种子在4°C处理2天后转移到正常条件下，在半强度MS板上发芽。垂直板被放置在种子萌发和萌发后4天,幼苗被转移到一半力量板块(控制)或女士一半力量板块女士补充与甲基显示(MMS)浓度的25岁,50岁,75和100 ppm,或与博来霉素在3、6、9和12毫克/ L。分别用MMS和博莱霉素进行基因毒性治疗1周和3周后，采集图像并记录生存率。GydF4y2Ba

建筑物和GydF4y2Ba一种GydF4y2BagrobacteriumGydF4y2Ba-介导的瞬时表达GydF4y2Ban benthamianaGydF4y2Ba

在生物分子荧光互补(BiFC)实验中，编码区GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba利用引物pBD-NSN F: 5 ' -GTC GAC AGA TGG TGA AAC GGA GTA AAA AGA G-3 '和pBD-NSN R: 5 ' -GTC GAC TTT TTC TTC GGC AAA AGT CCA G-3 '进行RT-PCR扩增，并克隆到载体pCR2.1 (Invitrogen)中。表达YFPGydF4y2Ba^NGydF4y2Ba-NSN1,GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba将cDNA片段连接到载体pSPYNE（R）173中[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba经SGydF4y2Ba艾尔一世。GydF4y2Ba建设GydF4y2BaNAP1; 1-cYFPGydF4y2Ba,GydF4y2BaNAP1; 1GydF4y2Ba1 F: 5 ' - GTC GAC ACA AAT AAA CTT TAG TTC TGA AAG G-3 '和pNAP1引物用RT-PCR扩增(At4g26110.2)编码区。PCR产物克隆到载体pCR2.1中，再亚克隆到pSPYCE (M) 155中。GydF4y2Ba

对烟叶进行渗透处理时，将两种结构体转化为GydF4y2Ba根癌土壤杆菌GydF4y2BaGV3101，并按所述进行渗透[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba］．GydF4y2Ba

扫描电子显微镜(SEM)和显微术GydF4y2Ba

扫描电镜进行了描述[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba］．简而言之，在含有2％戊二醛和2％多聚甲醛的50mM磷酸盐缓冲液中固定植物组织过夜。将固定组织用50mM磷酸盐缓冲液冲洗三次，并在4℃下保持在十六颗氧化锇（1％）过夜。用50mM磷酸盐缓冲液冲洗三次后，将组织脱水30,50,70,95和100％醇梯度。将脱水组织涂有金色并在SEM下观察。GydF4y2Ba

叶片起始定义如下[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba］．对于叶面积的测量，每天拍摄第5片叶，使用ImageJ测量叶面积。每个叶片的细胞数计算为叶片面积除以细胞面积。所有解剖叶片用水合氯醛处理3 d。廓清后，用蔡司显微镜及DIC晶状体拍摄栅栏细胞照片。对于单个叶片，使用ImageJ测量10个栅栏细胞的面积，并相应地计算每个栅栏细胞的平均面积。对每个时间点分别测定5株植物的第5叶片，并进行3次生物重复。GydF4y2Ba

根长为70粒野生型和拟南芥不育种子GydF4y2Bansn1GydF4y2Ba在含0.8%琼脂的1/2ms培养基上萌发。每天采集牙根尖端的图像，并用ImageJ测量牙根长度。为了分析发芽后4天内每天的细胞产量，在过去24小时内生长的10个初生根尖被切割并每天使用缓冲液（水合氯醛：甘油：水）安装在载玻片上 = 8:3:1). 采用蔡司共焦显微镜（德国蔡司Axioskop）的DIC光学系统进行图像采集。计算根尖一侧的皮层细胞数量。GydF4y2Ba

定量rt - pcrGydF4y2Ba

从野生型和野生型10日龄幼苗中分离到总RNAGydF4y2Bansn1GydF4y2Ba使用RNeasy工厂试剂盒，然后根据制造商说明使用RNase-free DNase I进行处理(Qiagen, Germantown, MD)。以2 μg RNA为模板，用SuperScrit III (Invitrogen)合成cDNA第一链。cDNA稀释100倍，以5 μl cDNA为模板。Real-time PCR的混合物包括10 μl的2× SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio Inc.， Otsu, Shiga, Japan)、0.8 μl的正向和反向引物混合物(0.2 μM最终浓度)、0.4 μl的50 ROX Reference Dye II和3.8 μl的去离子水。PCR在ABI 7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行，95℃初始变性2分钟，95℃(15 s)和60℃(40 s) 40个循环GydF4y2BaCYCA2；3.GydF4y2Ba(F: 5 ' -GGC TAA GAA GCG ACC TGA TG-3 '和R: 5 ' -TAC AAG CCA CAC CAA GCA AC-3 ');为了GydF4y2BaCYCB1; 1GydF4y2Ba(F: 5 ' -AAG CTT CCA TTG CAG ACG A-3 ' and R: 5 ' -AGC AGA TTC AGT TCC GGT C-3 ');为了GydF4y2BaCYCD3; 1GydF4y2Ba（F：5'-ACA ACT CTC GTG CAT TAA CAG GAA-3'和R：5'-GAA GAT TGG ATG TGG ATC TGT AAA C-3'）;为了GydF4y2BaH4GydF4y2Ba(F: 5 ' -TTA GGC AAA GGA GGA GCA AA-3 '和R: 5 ' -CTC CTC GCA TGC TCA GTG TA-3 ');和GydF4y2BaRNRGydF4y2Ba(F: 5 ' - CAA GTG GCT CAG GAC TGT CA-3 '和R: 5 ' - tcc ATC AGG TCA ACA GCT TG-3 ')。GydF4y2BaActin2GydF4y2Ba（GydF4y2BaAt3g18780GydF4y2Ba)作为内部对照(F: 5’-TGG TGT CAT GGT TGG GAT G-3’和R: 5’-CAC CAC TGA GCA CAA TGT TAC-3’)。根据ΔΔCt值计算相对表达水平。GydF4y2Ba

流式细胞术GydF4y2Ba

如前所述进行流式细胞术[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba稍作修改。在冷核隔离缓冲液中，用剃须刀片将叶片(起始后4天或完全展开的叶片)切成细条(Partec, Müster，德国)。过滤后，将提取物保存在冰中，直到测量。采用FACS Caliber流式细胞术(BD Biosciences, USA)检测细胞核DNA含量。细胞核用2 μg mL染色GydF4y2Ba^{−1GydF4y2Ba}达皮。每个样品制备三次，并分别进行FACS口径的细胞计数。每次分析总共测量了大约10000个核。GydF4y2Ba

酵母双杂交测定GydF4y2Ba

酵母双杂化实验如所述（Stratagene，USA）进行。Abrc股票CD4-30，一个GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba以8期花序分生组织、花分生组织和花芽的cDNA文库为基础。将cDNA文库克隆到大肠杆菌中GydF4y2Ba天哪GydF4y2BaI - X.GydF4y2Ba何GydF4y2BaI位点的pAD-Gal4-2.1 (Stratagene)，转化酵母菌株PJ69-4a (GydF4y2Ba他的低浓缩铀,ura所言;Gal1-HIS3、Gal2-ADE2 Gal7-LacZGydF4y2Ba）.完整的长度GydF4y2BaNSN1GydF4y2Ba使用引物PBD-NSN（F：5'-GTC GAC AGA TGG TGA AAC GGA GTA AAA AGA G-3'，扩增编码区域和对应于BC结构域的片段。R：5'-GTC GAC TTT TTC TTC GGC AAAAGT CCA G -3'）和PBD-BC（F：5'-GTC GAC AGA TGG TGA AAC GGA GGA AAA AGA G-3'; R：5'-GTC GAC CTC TTC ATG CTT ATT GGG ACC GGC-3'),分别。将两种片段克隆到PBD-Gal4（凸轮）中并用作转化成酵母菌株PJ69-4α的诱饵（GydF4y2Ba他的低浓缩铀,ura所言;Gal1-HIS3、Gal2-ADE2 Gal7-LacZGydF4y2Ba）.的全长cdGydF4y2BaAtNAP1; 1GydF4y2Ba（GydF4y2BaAT4G26110.2GydF4y2Ba引物(pNAP1;1 F: 5 ' -GAA TTC ATG AGC AAC GAC AAG GAT AGC-3 ';1 R: 5 ' -CTC GAG AAT AAA CTT TAG TTC TGA AAG -3 ')。将这两种酵母菌株的细胞配对并在添加了Glu-Trp-Leu-Ade的培养皿中选择。在Ade选择板(Glc-Ade-Trp-Leu + His)上进一步选择酵母菌落生长。在X-gal覆盖测定中，将含有1 mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷(X-gal)的琼脂糖溶液置于Z缓冲液中至55GydF4y2Ba^O.GydF4y2BaC，并倒入在Ade选择板上生长的冷却酵母菌落中。GydF4y2Ba

Y2H ß-半乳糖苷酶测定的定量GydF4y2Ba

使用Y2H ß-半乳糖苷酶试剂盒(Molecular Biotechnology)测定ß-半乳糖苷酶活性。简单地说，从选择板上挑选几个酵母菌落接种到1ml合适的选择培养基中，培养到指数期后期。收集酵母细胞，在含染料溶液的裂解液中重悬。显色在615 nm分光光度计监测。进行三个独立的生物重复，并用学生t检验评估差异。GydF4y2Ba

DAG:GydF4y2Ba

几天后萌发GydF4y2Ba

戴:GydF4y2Ba

天后开始GydF4y2Ba

GUS：GydF4y2Ba

β葡萄糖醛酸酶GydF4y2Ba

MDM2:GydF4y2Ba

鼠双分钟2GydF4y2Ba

NAP1:GydF4y2Ba

核小体组装PROTEINS1GydF4y2Ba

nrp:GydF4y2Ba

NAP1相关蛋白GydF4y2Ba

NS:GydF4y2Ba

NucleosteminGydF4y2Ba

诺西:GydF4y2Ba

Nucleostemin-likeGydF4y2Ba

感谢Peter Doerner教授(英国爱丁堡大学)提供的种子GydF4y2Ba周三GydF4y2BaB1:格斯GydF4y2Ba表达植物和长边陈教授（明尼苏达大学，美国圣保罗，美国）为批评撰写稿件。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

该工作由NSF拨款（MCB 0548525至Zh）以及来自中国的农业科技创新计划（ASTIP-IAS14至QY）的经济支持。资金机构在研究和收集，分析或解释的设计中并没有发挥作用以及撰写稿件。GydF4y2Ba

数据和材料的可用性GydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通讯作者请求。GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 王真、王小民对这项工作贡献相当。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京100193GydF4y2Ba

   王真，杨青川GydF4y2Ba

2. 爱达荷大学植物科学系，莫斯科，爱达荷83844，美国GydF4y2Ba

   王小敏，谢波，洪宗烈GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

ZH、XW、ZW和QCY设计了本研究；XW、ZW和BX进行了实验，XW和ZW撰写了这篇文章。所有作者都阅读并批准了最终手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaZonglie香港GydF4y2Ba或GydF4y2Ba青川县杨GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用GydF4y2Ba

相互竞争的利益GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

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