基因组特异性重复元件的分子细胞遗传学分析GydF4y2Ba柑橘克莱门蒂娜GydF4y2Ba长的矮。棕褐色。及其分类学意义GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

克莱门汀普通话（GydF4y2Ba柑橘克莱门蒂娜GydF4y2Ba长的矮。是世界上最著名和最广泛种植的柑橘品种之一。在真核生物基因组中占主导地位的重复DNA序列的组成和分布变化被认为是物种、基因组甚至染色体特异性的。基于重复dna的荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization, FISH)是分子细胞遗传学研究的有力工具。然而，到目前为止，对Clementine重复成分和细胞遗传学核型的研究还很少。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

进行了一种基于图的相似性序列读取聚类方法，以分析克莱门丁胺基因组中的重复DNA系列。生物信息学分析表明，重复的DNA构成柑橘基因组的41.95％，大部分重复元素是回析膜和卫星DNA。使用探针混合物的顺序多色鱼类包含Cl17，四个卫星DNA，两个RDNA和（TTTAGGG）的寡核苷酸GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba用Clementine体细胞中期染色体进行。基于明确和可重复的染色体鉴别，建立了柑橘的完整核型。这些探针的分布模式在几个GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba通过广泛的鱼分析总结了物种。在三个属中通常观察到多态性和杂合子。克莱门汀中一些不对称的鱼基因座与其杂交产地一致。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

对Clementine基因组中重复元素的组成和丰度进行了分析。基于FISH的多色核型分析为Clementine染色体的杂合性提供了直观的证据，FISH杂交信号明显不对称。我们检测到一些相似和可变的重复dna分布模式GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba这些重复元素标记在植物分类、系统发育和进化关系研究中具有潜在的应用价值。GydF4y2Ba

克莱门汀普通话（GydF4y2Ba柑橘克莱门蒂娜GydF4y2Ba长的矮。(n = 2x = 18) [GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]，属芸香科[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]，是全球最着名的商业柑橘品种之一[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．由于其在人类饮食，商业利润和育种计划中至关重要，克莱门特在全世界的消费者，种植者和育种者上受到了增加的关注[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]，特别是在一些地中海国家，如西班牙，意大利和法国，以及阿根廷，乌拉圭，南非和秘鲁[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

重复的DNA序列代表较高真核生物中的基因组大部分[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，达到基因组大小的20%，在某些情况下甚至高达90% [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，由串联重复序列(卫星、小卫星和微卫星)和分散的转座子(转座子和反转座子)组成[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．重复的dna可以物种——或者genome-specific甚至chromosome-specific在许多物种分类家人或不同的类群,有些重复是高度保守的,而其他人则进化最快的部分基因组,甚至表现出明显差异密切相关的物种之间(GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．长期以来，认为重复的DNA被认为是“垃圾”，或者更糟糕的是“自私”DNA [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]．最近的许多研究都强调了重复dna在决定基因组大小、组成和进化方面的重要作用。因此，了解重复dna的结构和组织的分子特征是至关重要的。从计算的角度来看，重复序列总是对序列比对和基因组组装程序提出技术挑战[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

染色体是每个真核细胞的核内遗传物质的主要载体，核型可以提供关于染色体的最高级结构和功能组织的有价值的信息[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．相关的物种越紧密，它们共享的核型越多[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．核型特征与内部基因表达，外部环境条件和其他混杂因素无关[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，可以代表一种隔离机制，是物种形成和宏观进化过程中的主要驱动因素[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．总之，核型可以为分类和系统发育分析提供一个极好的机会[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．近年来，荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)对重复dna的定位已经成功地应用于许多核型研究，特别是对相关物种的定位[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

随着简单序列重复（SSR）标记的不断增加，表达序列标签（EST）数据库，基因微阵列比较分析和物理和遗传映射研究，国际柑橘基因组联盟（ICGC）已成功释放了柑橘的基因组序列作为主要参考基因组GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关的属于未来[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．然而，重复成分和细胞遗传学核型的特点是不清楚的。GydF4y2Ba

少数柑橘品种的高度重复的DNA序列已经通过CSCl-放电霉素D梯度或去年的分子克隆成功地表征，包括GydF4y2Bac . ichangensisGydF4y2Ba摇摆。[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]，GydF4y2Bac .利GydF4y2Ba（L.）缅甸[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]，GydF4y2Bac . sinensisGydF4y2Ba[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]，GydF4y2Baponcirus trifoliataGydF4y2Ba[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba那GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]， 和GydF4y2Bac .神奇GydF4y2Ba[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]．尽管如此，它们在染色体中具体的物理杂交位置仍然没有很好地确定[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．Wu等人对几种柑橘品种的基因组进行了测序和比较，但在他们的文章中没有显示卫星dna [GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

本研究的主要目的是建立一种高效、精确的基于基因组特异性重复DNA序列的柑橘个体染色体鉴定方法，并构建标准的整合核型。因此，我们进行了生物信息学分析，以描述Clementine基因组中的重复元素。主要的串联重复dna的细胞学位置被序列多色FISH和其他一些重复的探针鸡尾酒揭示，从而形成一个微调的Clementine核型。此外，我们还探讨了这些探针在杂种鉴定和某些物种分类关系研究中的潜在适用性GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba．最后，我们的研究结果将增加与全球知识库有关的GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba遗传和育种。GydF4y2Ba

重复的DNA组成和丰度GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba以及卫星重复的识别GydF4y2Ba

总共379个集群(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）由簇大小阈值产生0.01％。生物信息学分析数据显示，克莱门丁基基因组，如其他高真核植物基因组，含有大部分不同的重复DNA元素。在表格中概述了克莱门丁胺基因组中每个重复DNA的比例的比例总结在表中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba，特定信息列于其他文件中GydF4y2Ba1GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

Clementine全基因组的总定量重复dna数量占41.95%，包括反转录转座子(LTR. gypsy、LTR. copia、LTR. caulimovirus、ucclassified LTR、LINE)。LINE.Penelope,LINE.RT)，转座子(DNA.CMC.EnSpm，GydF4y2BaDNA.hAT.AcGydF4y2Ba, DNA.hAT。Tip100 DNA.MULE。MuDR DNA.PIF。预兆,DNA.TcMar。， rDNA，卫星dna，简单重复，低复杂度重复和一些非机密重复。Clementine中的重复元件以反转录转座子和卫星dna为主，分别占整个基因组的22.40和11.01%。在ltr -反转录转座子中，Ty3/Gypsy元件是主要的重复元件，占总数的12.60%，在基因组中所占比例超过Ty1/copia约1.59倍。其他LTR-反转录转座子的基因组比例相对较小，包括LTR. caulimovirus(1.45%)、LINE(0.70%)和未分类LTR(0.08%)。DNA转座子仅占柑橘基因组的1.31%。DNA. mule . mudr含量为0.475%，是DNA转座子中的优势组分。rDNA元件占Clementine基因组的2.93%。 Simple repeats and low-complexity repeats represented 1.80 and 1.87%, respectively. The estimation of repetitive DNA abundance showed that 2.08% of the repetitive elements were unclassified (Table1GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

通过生物信息化学分析，Cl1，Cl2，Cl3和Cl 4鉴定四个主要卫星DNA，分别占基因组的3.16,3.01,1.55和1.21％（附加文件）GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.我们从Clementine基因组中分离并克隆了4个主要的卫星dna、2个rdna和一个着丝粒特异性逆转录转座子序列CL17。扩增这些重复序列的特异性引物见附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

重复DNA的染色体映射GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba

含有Cl17，四个主要卫星DNA，两个RDNA和克莱静体中的端粒重复的探针混合物在其自身尖端制备的自己的体细胞中染色体上杂交。为了获得更详细和准确的信息，在三种独立试验中从这些探针获得鱼杂交信号，每个试验包括五个染色体制剂的载玻片。在每个载玻片上分析至少15种有丝分裂中期染色体的涂布。GydF4y2Ba

确定染色体数目，并与2n = 2x = 18的Clementine的预期染色体数目匹配。CL17在Clementine的每条染色体的着丝粒或中着丝粒区域产生了明显的FISH杂交信号，而在其他区域没有检测到额外的信号(图)。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba）.端粒重复在每个染色体的末端位置产生透明的杂交信号（图。GydF4y2Ba1 kGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

四颗卫星DNA的信号表现出关于染色体上杂交信号的数量，位置和强度的多样化模式。鱼杂交信号对单个体细胞染色体的差异亮度表示信号的不同强度（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB，D，F和H）。CL1和Cl2探针显示10个与染色体的长短臂的下端和末端位置相邻的10个类似的信号，以及染色体对9的每个同源物上的一个唯一信号（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab, f). CL3和CL4探针分别产生8和7个信号(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba高清）。虽然四种不同的串联重复具有不同的分布模式，但同时杂交分析显示它们在一对或多对染色体上与克莱门汀中部分或完全重叠信号的一对或多对染色体共定位（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa, e)。Clementine也表现出一个高度杂合的rDNA位点，带有一对共定位的5 s- 45 s-rDNA位点，一个单一的5 s和一个单一的45 s rDNA位点(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Bag，j）。GydF4y2Ba

核型分析的分析GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba基于有丝分裂中期染色体的多色FISHGydF4y2Ba

本研究中使用的鱼探针为核型分析分析提供了良好的染色体标记。在相同中期板上的三个连续的多色鱼之后，克莱门丁胺中的所有单独的中磷染色体都明确区分（图。GydF4y2Ba1米GydF4y2Ba）.在单个染色体成功识别的基础上，基于fish的Clementine中期染色体集成表意图如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，其中通过在中期下降的总长度下序和指定染色体。测量和染色体分类总结在附加文件中GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba．有趣的是，我们在Clementine染色体上发现了几个明显的不对称FISH信号。如图所示。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，染色体对8和9携带不同的5 s和45 s的rDNA信号。染色体对9的特征是次级收缩和卫星，其定位在短臂上。在染色体对9的一个同源物的大区域中观察到强45秒信号，从短染色体臂的远端跨越次级收缩几乎达到染色体卫星的末端，而另一个中等45秒的RDNA杂交信号发生在短臂的近端部分和二次收缩之间;因此，45秒的RDNA产生了不同强度和位置的清晰信号。值得注意的是，染色体对4对四个卫星DNA中的任何一个没有产生相同的信号。在染色体对1和5上也观察到不对称CL4基因座，其中它仅在一个同源物的长臂的端子位置产生一个鱼信号。类似地，CL1和CL2在染色体对的长臂的每个端部产生一个杂交信号。GydF4y2Ba

这些探针的FISH模式在几个基因型之内GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关的属GydF4y2Ba

测试这些探针对其他基因型的潜在应用GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关属进行了连续的多色FISH实验GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba基因型及相关属。测试中这些探针的FISH信号号GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba物种和相关属呈现在表格中GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，并在附加文件中呈现所有详细图像GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

这些探测的同时本地化显示了一些类似的分布模式GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba甚至在相同的属中，物种内的一些变异性。通常观察到的鱼信号数量不均匀，如表所示GydF4y2Ba2GydF4y2Ba．端粒DNA可能是所有测试的生物型常见的，并且在具有36个总鱼信号的染色体上定位（附加文件）GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.这些探针的鱼杂交信号数范围为2至21，即使在同一属中，也显示出高度的变化。通常，在18个生物型中，分别检测到230,240,221和Cl4基因座的230,240,221和240个信号GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba，并且每种生物型具有6至21个这些重复的DNA基因座。在18个测试的生物型中分别存在68和38个信号，其中45秒和5s rDNA基因座，包括一种生物型中的2,3,4或6位点。GydF4y2Bac . ichangensisGydF4y2Ba那GydF4y2BaC. Hongheensis.GydF4y2BaY. L. D. L.和GydF4y2BaC. Grandis.GydF4y2Ba（L.）Osbeck具有最多的重复DNA基因座GydF4y2Ba那GydF4y2Ba然而GydF4y2BaC. daoxianensis.GydF4y2BaS. W.他，GydF4y2Bac .利GydF4y2Ba和GydF4y2Bac .立花GydF4y2Ba棕褐色。在测试基因型中的数量最低GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba．剩下的12种基因型GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba它们的数量介于这六种物种之间在两个生物型中分别有21、20、20和18个CL1、CL2、CL3和CL4信号GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba．两个都GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba生物型有6个45 s和6个5 s rDNA位点。长寿金桔4个卫星dna分别有14、14、12和14个信号，4个45 s rDNA位点和2个5 s rDNA位点。citrange和Swingle citrumelo两个种间杂交种的CL1、CL2、CL3和CL4信号分别为23、26、25和20个。这两个杂交种都有4个45 s rDNA位点。Citrange和Swingle citrumelo分别有3个和4个5s rDNA位点(见表)GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

基于重复dna的FISH技术能够可靠地识别个体GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba染色体GydF4y2Ba

染色体长期以来被视为携带多细胞真核遗传物质的遗传遗传单位[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．对单个染色体的明确和可复制的鉴定可以为进一步的细胞学研究以及随后的基因组和遗传学研究奠定基础[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]．全部GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba物种具有相对较小的染色体（2和4μm），具有相似的形态学[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba];结果，基于形态学的染色体相当具有挑战性[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

初步调查GydF4y2Ba柑橘GydF4y2BaKrug进行了核学研究[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba使用光学显微镜。随后，c带技术显示在GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba近缘属在中期染色体上可区分[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．随后，GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba根据染色体的异色CMA，将染色体分为8种不同的染色体类型GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba/ dape.GydF4y2Ba^−GydF4y2Ba荧光频段在数字和分布方面的变化[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．CMA带和基于rdna的FISH的结合被广泛探索以提供额外的染色体标志[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．这些先前的细胞遗传学研究发现了存在染色体的异族性GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关的属，也鉴定了几种染色体对的簇。然而，他们无法识别并区分所有单个染色体对[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．在这项研究中，我们重新分析了克莱门汀的重复DNA。我们研究中使用的几种重复的DNA用作鱼探针是有效的细胞遗传学标志物，使柑橘中的个体染色体的明确鉴定能够。因此，使用染色体测量和基于重复的DNA元素的鱼类信号的组合建立了详细的克里默氏型核型（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.我们现在能够提出第一个详细的克里默曲线，并证明其分子细胞遗传学表征。GydF4y2Ba

重复DNA的分布特征GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关的属GydF4y2Ba

许多研究表明，通过扩增，缺失和分化，重复的DNA对于真核基因组在功能上很重要[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．包括头部到尾部串联重复的卫星DNA被认为是最具动态的组件[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]，在较短的进化时期内，在地点数目及位置上发生最迅速的变化[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．在这里，我们使用了新开发的软件包RepeatExplorer对Clementine中的重复元素进行生物信息学分析，因为它已经被广泛用于几种植物的重复元素特征[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

“重复面具”未能识别卫星重复，促使我们重新分析克莱门汀基因组中的重复元素[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．我们的生物信息学分析表明，重复DNA元件占整个Clementine基因组的41.95%。此前发表的Clementine基因组的相似结果(45%)，具有不同的ltr -逆转录转座子元素和大量的非特征元素[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．一种可能是，卫星DNA是基因组中最难组装的部分[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．因此，可能会错过或归类为由重复掩码器被归类为其他重复元素的卫星元素。在这里，我们发现卫星DNA在柑橘基因组中非常丰富（9.28％）。相比之下，在萝卜中发现了相对高的卫星DNA（GydF4y2BaRaphanus sativusGydF4y2BaL.）12.93％[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba),GydF4y2BaTripsacum dactyloidesGydF4y2Ba有14.66% (GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]，而在GydF4y2Ba薏苡属lacryma-jobiGydF4y2BaL.品种BJ，0.60％，GydF4y2BaCoix Aquatica.GydF4y2BaRoxb。栽培品种HG为4.89％[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]和向日葵(GydF4y2BaHelianthus Annuus.GydF4y2BaL.）1.53％[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

重复dna的分布可能与核型特征和染色体组织有关。在Clementine中，CL17优先位于着丝粒区(图。GydF4y2Ba1 cGydF4y2Ba)，极大地提高了确定单个染色体着丝粒位置的准确性，并有助于描述同源染色体的特征。端粒相关重复单体5 ' -TTTAGGG-3 '在Clementine染色体的末端和端部具有非随机分布(图2)。GydF4y2Ba1 kGydF4y2Ba)，表明9对同源Clementine染色体对共享相同的端粒相关重复单体[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．对这一结论的进一步支持来自其他几种植物端粒重复的类似模式[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．5 ' -TTTAGGG-3 '代表高等植物染色体特异性的基本和典型端粒序列[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．这两种重复的DNA分别位于克莱门汀的焦化剂和端粒，这可能反映了它们在染色体保护和核组织中的重要结构和功能作用[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

我们发现，45 s rDNA位点通常位于Clementine短臂的末端区域，携带继发性收缩(fig .)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.在许多情况下，还观察到45秒的RDNA限于核仁组织者区域和在此处研究的其他几种基因型中的短臂的端粒区域（附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.在以前的几项研究中也有类似的情况GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba物种，作为45秒基因的活性通常与核仁组织区域和次要收缩相关[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]．在同一染色体短臂末端发现相邻的45s和5s rDNA位点GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba)和本研究中调查的许多其他物种(补充文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），表明45s和5 s rdna基因座可能是正相关的，并反映该臂中两个位点的优先分布[GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]．45 s rDNA基因座的FISH模式比5 s rDNA基因座的FISH模式更具多态性，除毛里求斯papeda (GydF4y2Bac . hystrixGydF4y2Ba，有四个位点(表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在分子水平下，卫星DNA是异铬胺的主要成分，通常与染色体的焦化，脑大致，亚细胞体和端粒区域相关[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba那GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．本研究的细胞遗传学映射结果表明，四颗卫星DNA优先分布在克莱莫氏菌和某些端粒远端区域中的分布（图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB，D，F，H）。它们在克莱门丁胺和其他基因型中显示出不同的网站数;然而，有利于终端位置可以被认为是它们染色体分布的一般趋势（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba），其在广泛报告的分布模式范围内。通常，卫星DNA位点在数量和物理染色体定位中显示出比本研究中的RDNA位点更多的可变性（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.虽然这些优先分布的重复DNA的原因并不完全已知，但是在文献中假设了几种可能的解释。例如，卫星DNA的存在，没有优先浓缩的浓缩或脑熵分布在测试基因型中GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba而相关属可能表明多种反转录转座子包含着着丝粒区[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]．另一个潜在的说明是终端偏好分布与调节染色体稳定性或分枝杆菌和减数分裂的关联[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]．此外，观察到的趋势可能与动态过程有关[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]．根据Garrido-Ramos [GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]，植物卫星dna通常结构为异染色质，常存在于中端粒和亚端粒区域。GydF4y2Ba

本研究检测到的探针部分或完全重叠的信号与报道的5 s - 45 s rDNA位点相连的病例一致[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba] CMA的共同定位GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba带及45s rDNA位点[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba或卫星dnas [GydF4y2Ba26GydF4y2Ba在枳壳亚科(芸香科)的几个生物型中。在以前的研究中，这些位点连接的可能原因被认为是祖先的条件[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]，而未连接的位点可能反映出这些重复的DNA元件在物种进化过程中保持可移动[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

基于重复dna的FISH在杂种鉴定中的应用GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba和相关的属GydF4y2Ba

尽管现有的工具种类繁多，但混合识别仍然具有挑战性GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．为了探索基于重复DNA的FISH技术在杂种鉴定中的应用，我们将这些重复DNA探针应用于一些推测的杂种GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba物种和三种杂交种，包括围裙和摆动柑橘。这里描述的重复DNA的多色鱼的分子细胞遗传学方法使能在物种和杂种中鉴定某些特征染色体GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba（桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

在理论上，同源染色体应具有相同的鱼分布图案，但是这里的鱼信号在同源染色体中并不总是在同源染色体中表现出平行模式。显着，鱼类测定的23种研究中的属性GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba相关的Genera证明了不均匀和非症状信号通常（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba，附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.这与前一个视图一致，即大多数柑橘类作物通常具有高度杂合性的特征来表征[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．细胞遗传学数据也证实了一个被广泛接受的信念，即许多甚至大多数GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba物种源自天然（自发）或人工（人工）杂交[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．例如，具有奇数基因座的不对称鱼信号肯定可以提供足够的证据，即克莱门汀是杂交起源，与先前的研究一致（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba， 桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.克莱门汀被认为很可能起源于来自中国的自发杂交，并在一个世纪以前的阿尔及利亚的父亲'克莱门特选出[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]．在形态学特征的基础上，摆动已经证明克莱门汀是横向的GydF4y2Bac . deliciosaGydF4y2Ba十个和GydF4y2Bac .橙GydF4y2BaL. [GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．后来的血清学研究表明，Clementine与“Baladi”柑橘和“Baladi”血橙关系最密切[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]．分子标记支持该假设柑橘是普通话和甜橙之间的杂交[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]．虽然有一个位于506的暗示不相容的基因型，但仍通过单核苷酸多态性（SNP）确认了地中海普通话×甜橙的假设，表明不相容的基因型[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]．Wu等人。[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba通过明确地识别柳树普通话来调查序列水平的猜想（GydF4y2Bac . deliciosaGydF4y2Ba)及甜橙(GydF4y2Bac . sinensisGydF4y2Ba）每个克莱门丁胺座的等位基因。在我们现在的工作中获得的细胞学信息的类型在调查克莱门汀的杂交起源方面具有很大的帮助。但是，我们没有确认或讨论其推定的父母。这项工作将成为未来研究的主题。然而，我们的研究使我们能够得出结论，异族性可能是克莱门丁胺中杂交的表观指示。重要的是，我们研究中的核型分析分析可以提供克莱默染色体的杂合性质的直接视觉证明。GydF4y2Ba

相似的重复DNA分布模式在其他物种和杂种内部GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba在这项研究中，与三本身之间存在显着保守的结论是一致的[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]．一种有趣的解释是，三个密切相关的属于在物种之前的共同祖先的基因组，这在基因组中受到保守GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba植物，因为卫星dna可能在异染色质组织中的作用[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba那GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]．另外，在三个属中通常观察到在现场数量和重复DNA基因座的染色体位置的变化中的多态性（表GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.据报道类似的结果表明了这一点GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba染色体表现出高度的多样性和杂合子，通过，我们可以获得进一步的基本信息，以在系统发育和分类关系的情况下脱光GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba及相关属[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba那GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．对观察到的染色体分布变异的一个合理解释是重复成分的快速扩增和/或减少[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

从分子细胞遗传学的角度，我们发现信号多的生物型更古老，而信号少的生物型更进化或杂种起源。例如,GydF4y2BaC. Hongheensis.GydF4y2Ba来自亚因素GydF4y2BaPapeda.GydF4y2Ba（摇摆。）在摆动和田中的系统中得到了很多关注[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．这里，GydF4y2BaC. Hongheensis.GydF4y2Ba与其他物种不同，显示相同数量的Cl1，Cl2，Cl3和Cl 4位点。古代物种GydF4y2Bac . mangshanensisGydF4y2BaS. W.他展示了比调查的其他普通话基因型更多的鱼信号。如上所述，45秒的RDNA鱼基因座显示出两到六个位点的数值变化，而5S RDNA呈现出保守数量的网站（两）GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba除了GydF4y2Bac . hystrixGydF4y2Ba（桌子GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.伟大的相似之实GydF4y2Bac . hystrixGydF4y2Ba由Pang等人展示。[GydF4y2Ba50GydF4y2Ba的多态性AFLP片段含量较高，Zhou等[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba[聚类数据是否有关其形态特征，其共同促进其杂交起源。这里呈现的分子细胞遗传学数据可以作为进一步阐明核型演变和分类关系的起点GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba在未来的更大规模。GydF4y2Ba

总结，柑橘普通话中重复元素的组成和丰度（GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba）基因组重新分析。使用含有Cl17的几种探针，四个主要卫星DNA，两个RDNA和端粒重复TTTAGGG，用于开发柑橘细胞遗传学核型的柑橘细胞遗传学核苷酸。达到了单个柑橘染色体的明确鉴定。基于多色鱼类的核型，提供了克莱门胺染色体的杂合性的直接视觉证明，其显示出明显的不对称鱼类杂交信号。此外，我们在23个基因型中检测到一些类似和可变的分布模式GydF4y2Ba柑橘GydF4y2Ba那GydF4y2BaPoncirus.GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaFortunella.GydF4y2Ba揭示了这些属的显着保守，而且显着的多态性和杂合子，提供了这些重复元素标志物的潜在效用，用于研究未来的分类，系统发育和进化关系。GydF4y2Ba

植物材料和基因组DNA提取GydF4y2Ba

资料(附加档案GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）由中国重庆市柑橘种质储存库提供。从从开放授粉的母植物获得的发芽种子收获根尖。为了增加与Nucellar而不是Zygotic胚胎合作的机会，优先单独分析来自每个物种的幼苗的五个根尖端，并且只接受在至少三根尖端中表现出相同的核型的那些进行分析，以分析为Nucellar胚胎[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．如果在至少三个幼苗中重复核型，则它可能代表了核心和母体核型。CTAB方案使用幼叶提取克莱汀基因组DNA。克莱门特的基因组信息从网站上公开提供GydF4y2Bahttps://www.citrusgenomedb.org/species/clementinaGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

重复组成分析GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba

RepeatExplorer具有基于图的序列聚类算法，用于从头识别重复元素，并更详细地探索它们在Clementine基因组中的比例组成[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．聚类分析采用聚类大小阈值0.005% [GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．首先预处理测序数据以使用“按质量过滤”（在RepectExplorer中提供）删除低质量读数，然后使用Fasto Interlacer（也可以在重复浏览器中提供）丢弃未配对的读取。从过滤的数据中，随机选择99,500读（100,495,000bp）。使用基于相似性的读取聚类方法识别De Novo的重复。单个簇内的读入代表相应重复的序列变体的Contig。使用组合方法进行基本重复分类，包括群体图形的检查，DNA和蛋白质数据库的相似性搜索，以及在组装的CONTIG中检测子排除。通常，具有卫星DNA的簇具有星形和圆形图形表示。Contig中的群集图拓扑和亚类的子级别也是识别串联重复的主要标准。为了将推定的卫星单体分类在各个簇中，将组装的COLDIG进行串联重复发现器软件[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

染色体制备、探针标记和FISHGydF4y2Ba

染色体制剂，探针标记和鱼类程序遵循CAI等人描述的协议。[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba稍作修改。根系收获后，立即在大约150 PSI的压力下暴露于一氧化二氮2小时，固定在Carnoy的溶液和乙醇-醋酸(GydF4y2BaV.GydF4y2Ba/v, 3:1)在室温下保存2-24小时，并在−20℃下保存至需要时。根尖用蒸馏水洗涤后切成细段，去除上述固定液，用含3% (GydF4y2BaW.GydF4y2Ba/GydF4y2BaV.GydF4y2Ba)纤维素酶和0.3% (w/v)果胶酶，37°C, 1.5 h。然后，去除酶溶液，加入一滴蒸馏水，低渗10分钟，去除水，加入新鲜的Carnoy溶液。最后，样品被放在冰冷的玻片上粉碎，然后在火焰上烘干。GydF4y2Ba

通过PCR从PCR扩增卫星重复和RDNA的DNA探针GydF4y2BaC. ClementinaGydF4y2Ba基因组DNA。利用从提取的重复序列中设计的引物克隆卫星重复序列和rDNA。质粒分别用生物素-16- dutp、地高辛-11- dutp、二乙基氨基香豆素-5- dutp和CY5-DUTP进行标记。一种(TTTAGGG)寡核苷酸GydF4y2Ba_3.GydF4y2Ba在5 '端用地高辛标记以检测端粒重复位置。染色体用DAPI在vectasshield抗褪色溶液中进行反染色。GydF4y2Ba

后续的FISH过程是从先前发布的协议中修改的，只做了少许修改[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]．在第一轮鱼和图像捕获后，用清除剂（Sigma）洗涤载玻片两次，一组PBS（磷酸盐缓冲盐）缓冲液，和乙醇系列（70,95和100％），然后固定一世n Carnoy’s solution, ethanol-acetic acid (v/v,3:1) and 4% (w/v) paraformaldehyde before hybridization with the set of probes.

核型分析GydF4y2Ba

染色体细胞学测量和核型分析遵循先前研究中描述的程序[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba那GydF4y2Ba18GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．Sensys CCD摄像头（Qimaging，Retiga-SRV，FAST 1394）连接到Olympus BX61 eBiforescearce显微镜（东京，日本）用于鱼类图像采集。使用的染色体和使用的探针的杂交状态被捕获在不同的荧光染料通道下。有丝分裂的中尚图像叠加，伪彩色，并合并在图像专业加上6.5软件（媒体Cyber​​netics）中。使用imagej软件（美国国立卫生机构，Wayne Rasband，MD，USA）测量自动合并的图像。通过测量染色体的短和长臂的长度，不包括卫星和核仁组织区的长度来估计整体染色体大小。基于染色体长度，形态特征和重复DNA鱼信号来鉴定同源染色体。调整最终图像，并通过Adobe Photoshop CS6软件减少顺序组织染色体。基于测量和鱼类信号绘制了表示。GydF4y2Ba

CCD：GydF4y2Ba

电荷耦合器件GydF4y2Ba

CMA:GydF4y2Ba

Chromonycin A3GydF4y2Ba

CTAB:GydF4y2Ba

十六烷基二甲基溴化物GydF4y2Ba

DAPI：GydF4y2Ba

4'6-二氨基-2-苯基吲哚GydF4y2Ba

est序列:GydF4y2Ba

表达序列标签GydF4y2Ba

鱼：GydF4y2Ba

荧光原位杂交GydF4y2Ba

ICGC:GydF4y2Ba

国际柑橘基因组联盟GydF4y2Ba

线:GydF4y2Ba

长时间的核元素GydF4y2Ba

LTR：GydF4y2Ba

长终端重复GydF4y2Ba

PBS:GydF4y2Ba

磷酸盐缓冲盐水GydF4y2Ba

rDNA:GydF4y2Ba

核糖体DNAGydF4y2Ba

SSR：GydF4y2Ba

简单的序列重复GydF4y2Ba

我们感谢两位匿名审稿人对这份手稿的宝贵评论和编辑。我们非常感谢刘慧君博士在荧光原位杂交方面提供的宝贵帮助。我们也向中国农业大学金伟伟博士实验室的所有成员表示衷心的感谢，感谢他们给予了我们这么多的帮助和这么多的美好时刻。最后，我们感谢梁国禄博士的所有同事和合作者为我们的工作做出的贡献。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

重庆市研究生创新工程资助项目(NO.201606990048);国家留学基金资助项目(NO.201606990048);基金资助:国家自然科学基金资助项目(NO. 5130471);国家科技支撑计划资助项目(2014BAD16B0102-1)。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本发布的文章及其补充信息文件中。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 西南大学园艺与景观建筑学院，重庆，400715GydF4y2Ba

   红红邓，苏琼翔，齐涛郭借国亮GydF4y2Ba

2. 中国农业大学农学与生物技术学院国家玉米改良中心，北京100193GydF4y2Ba

   魏伟金＆zexi caiGydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

WJ和GL对研究进行了构思和设计，并对手稿进行了修改。HD进行实验，撰写和修改手稿。ZC进行了生物信息学分析，并对手稿进行了修改。SX负责材料收集和核型分析，QG负责数据分析。所有作者都认可了最终的手稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba泽熙蔡GydF4y2Ba或GydF4y2BaGuolu LiangGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

作者的信息GydF4y2Ba

梁国禄、蔡泽西为本手稿的共同通讯作者。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba