非生物胁迫下基因组分析及表达模式GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba白梨转录因子（GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba）GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

虽然中国白梨（'Dangshansuli'）的基因组已被释放，但对功能，进化历史和表达模式知之甚少GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba迄今为止这个物种的家庭。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这项研究中，我们总共识别了183个GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba转录因子(GydF4y2BaTFS）GydF4y2Ba在梨基因组中，其中146梨GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba（GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba）成员被映射到16条染色体和37次GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因位于支架contigs上。没有GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因被定位到2号染色体上。基于基因结构、蛋白质基序分析和系统发育树拓扑结构，对梨属植物进行了系统发育分析GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba家庭被分为33组。通过比较分析其独特之处GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba在蔷薇科中，我们鉴定出19个亚群GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba特定于梨的子组。我们还发现全基因组复制(WGD)/节段复制在细胞的扩展中起着关键作用GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba家在梨，如83GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba重复的基因对返回两个WGD事件。此外，我们发现净化选择是驱动进化的主要力GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba家族的基因。接下来，我们利用转录组数据研究了梨对干旱和冷胁迫的响应，我们发现C2f、C72b和C100a组中的基因与干旱和冷胁迫响应相关。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

通过系统发育、进化和表达分析GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba中国白梨的基因家族，我们识别11GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba与梨非生物胁迫相关。GydF4y2Ba

转录因子(GydF4y2BaTFS）GydF4y2Ba是通过与特异性结合来调控基因表达所必需的吗GydF4y2Ba独联体GydF4y2Ba-作用启动子元件，从而激活或抑制其靶基因的转录速率[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．GydF4y2BaTFS.GydF4y2Ba调节许多生物过程，包括细胞形态发生，信号转导和环境应激反应[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．的鉴定和功能表征GydF4y2BaTFS.GydF4y2Ba对转录调控网络的重建至关重要[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．名称GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因家族来自三种转录因子：（i）GydF4y2Ba不结盟运动GydF4y2Ba（没有顶端公司），（ii）GydF4y2BaATAF1-2GydF4y2Ba和（iii）GydF4y2BaCUC2GydF4y2Ba（杯形子叶），所有这些都具有相同的DNA结合结构域[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因编码植物特异性转录调节剂，该调节剂构成植物中的大转录因子家族。GydF4y2Ba

关于职能的职能收集了相当大的证据GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba植物生长和发育中的基因，它们在增强对非生物胁迫的耐受性方面发挥作用，从而帮助适应波动的环境[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因首次被发现与茎尖分生组织和原基的形成有关GydF4y2Ba矮牵牛GydF4y2Ba[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]．后来的研究发现GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba成员，参与多种生物过程的转录调控，包括茎尖分生组织的发育[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10GydF4y2Ba，花的形态发生[GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，侧根发育[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]，叶衰老[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15GydF4y2Ba]，应力诱导开花诱导[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba那GydF4y2Ba17GydF4y2Ba),胚胎发生(GydF4y2Ba18GydF4y2Ba，细胞周期控制[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba21GydF4y2Ba，细胞壁发育[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba，激素信号[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]籽粒营养复合[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]并拍摄分支确定[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．特别是一些植物GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba已被发现参与植物对生物和非生物应激的反应[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba包括干旱、盐度、冷休克、机械伤害和病毒感染。逆境应答的GydF4y2BaANAC096.GydF4y2Ba与ABRE结合因素有一种协同关系，并增加渗透和干旱胁迫下的植物存活率[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]．此外,GydF4y2BaATNAC019GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac055GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaAtNAC072GydF4y2Ba特别是绑定到GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba认可的网站(GydF4y2BaNACRSGydF4y2Ba）在启动子GydF4y2Ba对脱水应激的早期反应GydF4y2Ba（GydF4y2BaERD1.GydF4y2Ba）基因增强耐旱性[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba拟南芥NAC016GydF4y2Ba压抑转录GydF4y2Ba脱落酸反应元素结合蛋白1GydF4y2Ba（GydF4y2BaAREB1GydF4y2Ba），在ABA依赖性应力信号中涉及的关键转录因子有助于对干旱胁迫的反应[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．在大豆、38GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba发现基因参与干旱反应[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．GydF4y2BaGmNAC11GydF4y2Ba和GydF4y2BaGmNAC20GydF4y2Ba与不同的非生物压力有关，它们在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba赋予盐和冻结的耐受性[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．同样，过度表达马的表情GydF4y2BaMunac4.GydF4y2Ba在转基因的地生植物中，对膜结构的损伤降低，并在干旱胁迫下提高渗透调节和抗氧化酶调节[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．在小麦中，转基因株系过度表达GydF4y2BaTanac69.GydF4y2Ba在应力诱导条件下生长时，在枝条和根中产生更多生物量[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba那GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]．在玉米、GydF4y2BaZmNAC41GydF4y2Ba和GydF4y2BaZMNAC100GydF4y2Ba被发现与玉米防御网络有关[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]．GydF4y2BaZMSNAC1.GydF4y2Ba，一种应激反应转录因子，增强了转基因植物对脱水的耐受性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]．此外，这是GydF4y2BaSTNAC.GydF4y2Ba（GydF4y2Ba茄属植物tuberosumGydF4y2Ba)基因被诱导反应GydF4y2BaPhytophthora Infestans.GydF4y2Ba感染和GydF4y2BaBNNAC.GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba芸苔属植物GydF4y2Ba是由干旱和寒冷引起的[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41.GydF4y2Ba]．然而，迄今为止，关于植物的方式很少GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba减少压力宽容。此外，这一功能在白梨中的分子基础尚未被确定。GydF4y2Ba

梨是世界上最广泛分布的水果之一，对商业和健康有很大的价值。然而，梨植物经常经常遇到非生物应激，包括干旱和寒冷，这限制了梨生长和发育，并随后对梨作物生产力的影响[GydF4y2Ba42.GydF4y2Ba]．因此，鉴定梨抗旱性和抗寒性的相关遗传因素对农业发展具有重要意义。在植物中,几个GydF4y2Ba南汽GydF4y2BaTFS.GydF4y2Ba通过干旱和寒冷转录诱导，但很少GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba在梨中有功能特征。在这项研究中，我们确定了183GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba来自梨基因组的基因并进行系统发育分析以确定这些基因之间的关系。蛋白质图案和内含子/外显子结构的分析提供了对家庭分类的支持。此外，我们确定了可能导致扩展的重复事件GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba家庭。此外，RNA-SEQ数据显示表达模式GydF4y2BaPbnacs.GydF4y2Ba对干旱和寒冷胁迫的反应不同。本研究为确定提高梨对非生物环境胁迫耐受性的因素提供了经验基础。GydF4y2Ba

识别和分类GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因在蔷薇科GydF4y2Ba

获得GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba梨和四种其他枸杞物种的基因，用于搜索编码含有PFAM PF02365结构域的蛋白质的基因（GydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/family/pf02365/GydF4y2Ba）.我们搜查了中国白梨基因组序列（GydF4y2Bahttp://peargenome.njau.edu.cn/GydF4y2Ba）对于编码蛋白质的基因GydF4y2Ba南汽GydF4y2BaDNA结合结构域。蛋白质序列GydF4y2Ba拟南芥NAC.GydF4y2Ba被用作对对中国白梨基因组数据库进行爆炸搜查的疑问。总共确定183GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因在GydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba（GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba）（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。我们暂时将它们命名为基于GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba更好地识别单个序列（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba：表S1）;例如，GydF4y2BaPBR020642GydF4y2Ba和GydF4y2BaPbr027956GydF4y2Ba同源基因GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba是GydF4y2Baanac002.GydF4y2Ba（爆炸的E值分别为1.45E-151和1.62E-122），因此这些基因被命名GydF4y2BaPbNAC2aGydF4y2Ba和GydF4y2BaPbNAC2bGydF4y2Ba，分别（附加文件GydF4y2Ba2GydF4y2Ba:表S2)。183年的GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因,146GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba成员被映射到16条染色体上（不包括染色体2）;另外37GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因位于支架上面（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.第11号染色体有最多的GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因（20），其次是染色体10，具有17个基因。染色体1是最短和含有的四个基因，而染色体7只包含三个。的GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因聚集在染色体的片段中，而不是均匀地分布在整个染色体中。这可能是由于梨染色体片段的不均匀事件[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．同样，我们确定了171,114,113和127GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba来自苹果的基因（GydF4y2BaMalus Domestica.GydF4y2Ba）， 桃 （GydF4y2Ba碧桃GydF4y2Ba），中国李子（GydF4y2Ba李春万GydF4y2Ba)、草莓(GydF4y2BaFragaria Vesca.GydF4y2Ba）基因组（附加文件）GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。至于GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因，它们在其他四个蔷薇科基因组中的分布似乎是随机的。GydF4y2Ba

基因结构和蛋白质基序分析GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba中国白色梨的基因家庭GydF4y2Ba

确定结构的结构多样性GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因，我们分析了个体编码序列中的外显子/内含子含量GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因。183年的GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因，23没有内含子，而大多数其他基因含有至少一个（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）， 如那个GydF4y2BaPbNAC44bGydF4y2Ba内含子最多的基因(12个)。从所有蛋白质的完整序列中生成系统发育树GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因分开GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因分为33个亚组（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.同一亚组内的基因在内含子数和外显子长度方面具有类似的外显子/内含子结构。例如，大多数GydF4y2BaPbNACGydF4y2BaC100a、C7b、C7c、C30b、C70c、C47a、C104c、C42b、C90e、C83e亚群的所有成员均含有2个内含子，而C2f、C83j、C26b亚群的所有成员除2个成员含有2个内含子外，均仅含有1个内含子。相比之下，C14k、C81b、C20b、C8b、C78b、C91a、C14j、C40b、C90f亚群的成员具有高度可变的内含子成员和分布。GydF4y2Ba

为进一步考察多样性GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因，通过程序MEME预测推定的主题。基于该计划，确定了20个独特的主题。这一结果与Apple中发现的结果类似，其中有19个独特的主题[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]．正如预期的那样，最密切相关的成员具有相似的基序组成，这表明在同一亚群内NAC蛋白之间存在功能相似性(图)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

梨的系统发育分析GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

目的:研究梨属植物间的系统发育关系GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因，一种无源的系统发育树，183次完成GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba通过NAC结构域的多序列比对，构建了相应的基因。对中国白梨183个成员进行了系统发育分析。GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基于蛋白质GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba(100名成员)使用快速树和贝叶斯先生的工具。这些包得到了相似的结果，两种方法的支持值都很高(图)。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba和GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.全部GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba蛋白质含有NAC结构域，但它们的蛋白质结构非常多样化。NAC蛋白的氨基酸序列用于构建系统发育树以研究差异GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba蛋白质。用保守的N末端构建系统发育树GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba使用相同的算法，域A到e。该分析的结果表明，每个子组中的基因可能来自相同的重复事件并具有相似的功能。系统发育树的拓扑允许我们分类GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba蛋白质分为33个亚群，大多数分支具有较高的统计支持度(pp > 0.90;引导> 80%;无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.分支机构内的内部关系也得到了高度保证（PP = 1.00）。我们可以推断每个子组中的基因可以源自相同的复制事件，因此具有类似的功能。但是，10个基因，包括GydF4y2BaPBNAC89.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC29.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC103C.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC28D.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC51cGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC56aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC56bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC25aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC55GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPBNAC17.GydF4y2Ba在任何所识别的思考或亚组中没有形成群集，因此基因组进化的过程可能会赋予这些特殊角色GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba蛋白质。GydF4y2Ba

比较分析揭示独特GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba子组在蔷薇科GydF4y2Ba

使用相同的方法构建额外的无根树，其与四种玉米酸盐物种（苹果，桃子，中国李子和草莓）中的每一种对齐NAC蛋白序列。GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，如图所示。GydF4y2Ba6-1GydF4y2Ba和GydF4y2Ba6-2GydF4y2Ba．我们确定了38个亚组，包括特定物种GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba亚组(R28d、C2h、C25c、C32b、C14k、C26b、C91、R55、C7b、C47a、C14j、C41、R51c、C90f、C81b、R89、R29、C38g、C57)GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba（附加文件GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba：表S3），表明这些蛋白质可能有丢失的专门角色GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba，或者是从最后一个共同祖先分化而来的。除草莓外，所有蔷薇科植物中均存在C2h、C14k、C81b和R29亚群的基因GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba:表S3)。因此，我们可以推测这些基因可能在木本植物中发挥重要作用。此外，我们还发现C47a和C14j亚群仅存在于中国白梨和苹果中。因此，我们可以推断这些亚群的基因在马蹄莲科中具有特殊的功能。C38g亚组不包括任何GydF4y2Ba北亚GydF4y2Ba在GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba或其他四种蔷薇科物种，但确实包括GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba来自中国白色梨的成员，表明这些基因可能会丢失GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba而另外四种玉米酸盐物种或在梨从最后一个共同的祖先的分歧后获得。因此，这种进化分歧表明这些基因可能在梨中具有必要的作用。GydF4y2Ba

全基因组重复和同步分析GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因GydF4y2Ba

有充分的文献证明，基因家族是通过全基因组复制、节段复制和串联复制而进化的，并伴随着复制后的多样化[GydF4y2Ba45.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba46.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47.GydF4y2Ba]．根据拷贝数和基因组分布，单个基因组中的基因可分为单重体、分散重复体、近端重复体、串联重复体和节段/WGD重复体[GydF4y2Ba48.GydF4y2Ba]．在这项研究中，我们关注串联和节段/WGD重复GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba在整个梨基因组中。我们的结果表明，在中国白梨99（54.10％）GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因对和116（63.39％）GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba在WGD或节段事件中重复和保留的基因只有16个(8.74%)。GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因来自基因簇，48（26.23％）GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因起源于串联复制(附加文件GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S4)。因此，我们的结果显示了wgd型的比例GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba中国白梨的基因重复率很高，这可能是由于最近的谱系特异性WGD事件[3000 - 4500万年前(MYA)]。在其他蔷薇科植物中，白梨和苹果的WGD/节段复制和串联复制事件与草莓、李子和桃子表现出不同的趋势。我们的结果表明，WGD是主要的驱动膨胀GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba苹果和中国白梨的基因家族（附加档案GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba:表S4)。GydF4y2Ba

为了研究物种多样性的进化机制GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba我们采用类似于植物基因组复制数据库(PGDD)的方法，鉴定了每对片段的平均Ks和复制类型。我们鉴定了98对共线碎片(附加文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba:表S5，附加文件GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba:数据。S1-S2)。例如，在片段之间检测到syntenyGydF4y2BaPbnac73a.GydF4y2Ba和GydF4y2BaPBNAC73B.GydF4y2Ba;这些显示至少18对同源基因，以相同的方式排列。映射到线性回归模型后的线性回归系数（Q值）为0.99，显示含有其的两个染色体段GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因是由染色体复制事件产生的。18对同源基因的平均Ks值为0.04(标准差为0.03)，说明该复制事件发生的时间较近。这些结果进一步证明，最近的谱系特异性WGD事件导致了GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba中国白梨的基因家族。GydF4y2Ba

历史复制事件GydF4y2Ba

通常，WGD或分段重复事件的进化日期由KS值估计（即，每个站点的同义替换）估计。以前的研究已经确定梨基因组存在两种基因组 - 范围的重复事件：估计已经发生的古代WGD（KS〜1.5-1.8）近似为140 mya [GydF4y2Ba49.GydF4y2Ba]而最近的WGD（KS〜0.15-0.3）估计在30-45 mya [GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．在本研究中，WGD或节段复制事件的进化日期GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba通过k值估计基因家族。额外的文件GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba：表S5显示平均值的值GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba同线区域的重复基因对;k值范围为0.01 ~ 7.18。88对(89.80%)重复基因对分布在两个主峰上(附加文件)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba：图S3）。这些重复可能来自最近的WGD（30-45 Mya）和古代WGD（〜140 Mya）之前报道，表明了GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba是一个古老的基因家族，随着最近的WGD而扩展。10对(10.20%)重复基因对的Ks值较高(2.88 ~ 7.18)。GydF4y2Ba

阳性（达尔文）选择是积累新的有利突变，然后在整个人口中蔓延的过程，而负（净化）选择是去除有害突变的过程[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]．以检测哪个选择过程驱动了进化GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba在中国白梨基因家族中，利用编码序列(CDS)计算同源物的Ka/Ks比值GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因家族。从84个基因对中获得的所有KA / KS比率<1（附加文件GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba：表S6），暗示演变的主要力量GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba家族基因是纯化选择。因此，这81个基因最近似乎经历了一次WGD/节段复制，而8个基因在复制分化后发生了正向选择(GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)(附加文件GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba:表S7)。此外，这8个基因在正选择下的功能包括:核酸结合、DNA结合、分子功能、转录调控、生物过程和应激反应。GydF4y2Ba

的表达GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba干旱胁迫下的基因GydF4y2Ba

先前的研究报道了许多NAC结构域蛋白与植物干旱胁迫有关[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba但是，有关响应的信息有限GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba对中国白梨的干旱胁迫。研究对梨的转发组数据进行干旱胁迫的反应GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba对暴露于干旱处理的植物进行了基因分析。只有109GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因显示出差异基因表达模式;鉴定六个基因簇并在热图中可视化（图。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.集群1包含16GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba干旱处理3 h后基因表达显著上调。聚类2中有31个基因在干旱处理6 h后高度诱导。聚类4包含18个基因，在24 h复水后高度诱导，尽管没有明显的转录差异GydF4y2BaPBNAC81B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC14I.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC14B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC33aGydF4y2Ba,或GydF4y2BaPBNAC104C.GydF4y2Ba．簇6含有23个基因，其转录在0和1小时的干旱治疗中显着增加，而一些基因在干旱治疗后6小时经历了下调。簇3和5中的大多数基因响应干旱治疗而上调，但它们的相对表达水平低于其他簇中的基因。我们选择了36个基因，在干旱处理后至少1.5倍上调，并在其他系统发育组中研究了它们的表达模式（附加文件GydF4y2Ba10GydF4y2Ba:表S8)。GydF4y2Ba

我们发现C100a中有7个基因表达上调，C90e中有5个基因表达上调，C47a、C2f、C72b、C8b、C83j、C83e和C91a中有2个基因表达上调，C42b、C14m、C14j和C82中有1个基因表达上调，6个不属于任何群体的基因表达上调。第2类群中有18个基因在6 h时表达上调明显高于其他类群，其中大部分基因属于C100a、C2f、C72b和C90e类群。这些结果表明，水分缺乏引起GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba不同类群和C100a、C2f、C72b、C90e类群的基因主要参与介导干旱胁迫反应的生物途径。GydF4y2Ba

正向性是一种在物种事件之后区分的同源基因。通常假设正交基因在不同的生物体中保持相同的功能，并分享其他关键特征。同源对（组）是通过演化产生的;祖先基因及其功能由物种事件维持，并且在物种差异后可能在基因内发生突变。在以前的研究中，18岁GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba包括GydF4y2Baatnac002.GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac081GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac102GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac055GydF4y2Ba那GydF4y2BaATNAC019GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC072GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC098GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac054GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC031GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC092GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC078GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac083GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac018GydF4y2Ba那GydF4y2BaATNAC056.GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC025GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac016GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC029GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaATNAC047.GydF4y2Ba是否与压力反应有关GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba54.GydF4y2Ba]．在这里，我们发现了46个直字GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba，但只有9个GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因，包括GydF4y2BaPBNAC17.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC72AGydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC72B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC100bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC87B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC21aGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPbNAC21bGydF4y2Ba干旱治疗后3或6小时上调。这九个压力反应GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因可能会保留与发现的那些相同的功能GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba．综上所述，我们的研究结果表明GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba在很大程度上是节省的。GydF4y2Ba

接下来，我们对同源性最多的C2f、C72b和C100a组进行了基因本体论(GO)分析GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba．这些基因富含以下GO术语：核酸结合，转录因子活性，多细胞生物过程，激素介导的信号传导途径，涉及繁殖，基因表达，胚胎根部发育，转录调节剂活性的发育过程，对压力的反应，脱落酸介导的信号传导途径，对激素刺激的反应，以及对碳水化合物刺激的反应。此外，基因和基因组（Kegg）途径富集分析表明，以下术语与这些基因相关：二次代谢物，苯丙醇化生物合成和异黄酮生物合成的生物合成。这些途径以前已被证明与非生物应激相关[GydF4y2Ba55.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba56.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

为了验证这些基因在干旱胁迫下的差异表达，采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对9个候选基因的相对转录本丰度进行了分析。这种方法的结果描述了相对基因表达的趋势，这在很大程度上与以前的方法一致。7个基因,其中包括GydF4y2BaPBNAC17.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC72AGydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC72B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC100bGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPBNAC87B.GydF4y2Ba，在干旱处理后3、6 h时上调，恢复24 h后下调。然而，我们的qRT-PCR结果为GydF4y2BaPbNAC21aGydF4y2Ba和GydF4y2BaPbNAC21bGydF4y2Ba与热图中所示的那些不同，因为在恢复24小时后它们被上调（图。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

的表达GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba冷治疗下的基因GydF4y2Ba

我们使用了相同的方法来分析GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba就像我们对干旱胁迫的反应一样我们的结果表明113GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因显示差异表达，并将所得的热敷分为六簇（图。GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.聚类1(23个基因)和聚类2(20个基因)在室温恢复24 h后显著上调。集群3包含24个GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba在0小时下表现出明显上调的基因。在簇5（20个基因）和簇6（14个基因）中，大多数基因在冷治疗后5和12小时上调，除外GydF4y2BaPbNAC74aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC56aGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPbNAC91dGydF4y2Ba．但是，在冷治疗后一些基因包括GydF4y2BaPbNAC91bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC83gGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2aGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPbNAC100cGydF4y2Ba0 h时下调。聚类4的基因对冷胁迫的响应没有明显的表达差异。我们选择了26个基因，这些基因在冷处理后的表达水平至少上调了1.5倍，以调查其在其他系统发育组中的表达模式(附加文件)GydF4y2Ba11GydF4y2Ba:表S9)。GydF4y2Ba

我们在C100a中发现了4个基因，在C80b中发现了3个基因，在C47a、C2f、C72b、C42b、C83e和C91a中发现了2个基因，在C104c、C90e、C83j和C14m中发现了1个基因。此外，另外三个没有被分配到任何组的基因在应对冷应激时上调。cluster 5和cluster 6中有10个基因在5 h和12 h的表达较其他cluster中的基因明显上调，这些基因大部分属于C100a、C2f和C72b组。因此,GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba通过冷诱导单独组的基因，并鉴定出相同的基团作为响应冷治疗的生物途径。同样，我们发现了七种同源基因GydF4y2BaPBNAC72AGydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC72B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2aGydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC2bGydF4y2Ba那GydF4y2BaPBNAC87B.GydF4y2Ba那GydF4y2BaPbNAC21aGydF4y2Ba， 和GydF4y2BaPbNAC21bGydF4y2Ba不仅在干旱处理后3、6 h，而且在冷处理后5、12 h均有显著上调。此外,GydF4y2BaPbNAC56bGydF4y2Ba和GydF4y2BaPbNAC25aGydF4y2Ba也发现对冷压力有反应。本研究中GO和KEGG通路分析结果一致。为了验证9个基因在系统发育树群C100a、C2f和C72b中的表达模式，我们对梨幼苗进行了短期冷胁迫下的qRT-PCR分析。结果与我们的RNA-seq数据高度一致(图。GydF4y2Ba10GydF4y2Ba）.9个基因的表达量在恢复后12和24 h均达到最高水平，24 h后均下降。GydF4y2Ba

作为GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba在不同的过程中发挥重要作用，包括发展方案，防御和非生物应激反应，对这些蛋白质的研究大大进行了[GydF4y2Ba57.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba58.GydF4y2Ba]．许多GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba已经确定并在模型和作物植物中的功能表征，包括GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2BaS，米饭，大豆和小麦。而且，GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba已在Apple中识别，但没有大型数据集GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba中国白梨存在[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

在这项研究中，我们进行了基因组分析以确定共183个GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因和大于163GydF4y2Ba杨树GydF4y2Ba[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba， 151 in rice [GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba101在GydF4y2BaBroachypodium distachyon.GydF4y2Ba[GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．的GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因家族是植物物种内的较大家庭，由于扩大了GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因家族。可以推测，附加的存在GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba梨基因组中的基因。通过基因组重复，同源和历史复制事件，我们的分析GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因揭示了这一点GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba是一个古老的基因家族，在最近的WGD中扩大了。以前的研究报告了最近在中国梨发生的WGD事件，大约发生在30-45 MYA [GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba61.GydF4y2Ba]．Su等人。（2013）发现苹果的扩张GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因发生在60-65 MYA的近期WGD [GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba它比梨还早。此外，我们还发现，净化选择是推动物种进化的主要力量GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因家族。GydF4y2Ba

基于基因结构和蛋白质基序分析，GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba家庭被分为33个主要群体。主题和外显子/内含子分析表明，系统发育树中最密切相关的成员具有共同的基序组合物，这指向功能性相似之处GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba同一亚家族内的蛋白质。主题和外显子/内含子与GydF4y2BaBroachypodium distachyon.GydF4y2Ba和苹果GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．检查系统发育关系GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba中国白梨中的蛋白质，我们识别独特GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba通过NAC蛋白序列比对，构建了一棵无根系统发育树。命名和分类方法的不同可能是本研究的系统发生树与以往研究得到的系统发生树存在一些差异的主要原因[GydF4y2Ba44.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba59.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba60.GydF4y2Ba]．它也可以通过在系统发育分析中使用的不同算法解释。虽然存在一些差异，但本研究中获得的系统发育树基本上与先前的研究一致。通过系统发育树，亚组C38G仅在中国白梨中发现，该组的成员可能在与密切相关的物种中分歧后获得的专门角色。并且需要进一步检查该子组的专门角色。GydF4y2Ba

非生物胁迫，如干旱和寒冷，可导致产量丧失，降低果树的质量[GydF4y2Ba62.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba63.GydF4y2Ba]．表达GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba利用RNA-Seq数据，研究了干旱和冷胁迫的响应基因。我们发现36GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因在干旱治疗中上调至少1.5倍，26℃GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba低温处理下的基因。此外，C100a、C2f和C72b组也参与了干旱和寒冷胁迫反应的生物通路。过度表达GydF4y2BaAtnoc019GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac055GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac016GydF4y2Ba那GydF4y2BaAtNAC096GydF4y2Ba和GydF4y2BaAtNAC072GydF4y2Ba增加压力耐受性GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba那GydF4y2Ba64.GydF4y2Ba]．而且，GydF4y2BaATNAC019GydF4y2Ba那GydF4y2Baatnac055GydF4y2Ba， 和GydF4y2BaAtNAC072GydF4y2Ba可以特别绑定到启动子GydF4y2BaERD1.GydF4y2Ba的GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba识别位点(NACRS)，增强抗旱性[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．在米饭中，40岁GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因反应干旱或盐胁迫，而过表达GydF4y2Basnac3.GydF4y2Ba（GydF4y2BaONAC003GydF4y2Ba），GydF4y2BaONAC022GydF4y2Ba那GydF4y2Ba奥纳克5.GydF4y2Ba那GydF4y2Baosnac2.GydF4y2Ba， 和GydF4y2Ba奥纳克6.GydF4y2Ba改善转基因植物中的耐旱性[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba65.GydF4y2Ba]．在小麦中，过度表达GydF4y2BaTanac29.GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaNAC2GydF4y2Ba那GydF4y2BaTaNAC2a,GydF4y2Ba和GydF4y2BaTanac67.GydF4y2Ba还发现增加了对寒冷，高盐度和干旱胁迫的耐受性[GydF4y2Ba66.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba67.GydF4y2Ba]．在这项研究中，11GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba直接同源的GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba(被确定为参与非生物应激反应)GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba对干旱和寒冷胁迫有响应。我们推测GydF4y2BaPbNAC TFsGydF4y2Ba在梨中可能有与它们的功能相等的功能GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Baorthologs。由于基因表达模式可以为其功能提供重要的线索，因此我们检查了所选11的表达GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba使用QRT-PCR，干旱和冷治疗中的基因。有趣的是，这些基因都显示出参与干旱和寒冷的调节。将来，将需要更多的研究来确定职能GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba梨中的基因。GydF4y2Ba

到目前为止，许多研究已经调查的重要作用GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba在植物生长和发展中，以及对非生物胁迫的反应。因此，这是GydF4y2Ba南汽名爵TF跑车的GydF4y2Ba家庭已成为继续关注的主题，因为其潜在的植物容忍工程涉及[GydF4y2Ba68.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba69.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba70GydF4y2Ba那GydF4y2Ba71.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba72.GydF4y2Ba]．我们的结果表明GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba本研究中检测的基因在植物反应中起到非生物胁迫的基本作用，因此可以是具有改善应力阻力的梨植物工程的合适候选基因。总体而言，在这项研究中，我们提供了全面的分析GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba并讨论了该家族与非生物胁迫响应的关系。本报告中提出的结果可能有助于功能表征GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba进一步了解基因家族之间的关系GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba家庭成员。此外，我们的研究结果也有助于我们理解梨重要农艺性状的分子基础，包括果实发育和它们的非生物胁迫响应。综上所述，我们的结果可能有助于确定新的候选人GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba抗逆性增强梨新种质遗传工程的家族基因。我们将在未来的研究中验证这11个基因的耐寒和耐旱能力。GydF4y2Ba

总计183GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba从梨基因组中鉴定了相关基因。根据这些基因之间的系统发育关系，我们对183个基因进行了分类GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因分为33个亚组。保守域的分析表明GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba同一组的基因具有相似的功能。GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba来自梨的基因和GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在大多数亚组中存在，表明这些成员最近的共同祖先。因此，大多数的功能GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba在被子植物的进化过程中，基因可能是保守的。共线性分析表明，最近的WGD (30-45 MYA)可能对大范围扩增有贡献GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba中国白梨的基因家族。净化选择是主要的作用因素GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba家庭基因;八个基因在复制分化后接受阳性选择。确定转录组测序分析GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因可能在对干旱和冷压力的反应中发挥重要作用。表达和功能数据GydF4y2Ba阿纳克GydF4y2Ba基因支持假设GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因在干旱和冷凝压下具有各种独特的功能。总之，我们发现十一个GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba在对非生物胁迫的反应中起关键作用的基因。这将有助于进一步研究生物学功能GydF4y2BaNAC TFS.GydF4y2Ba在梨中，这些基因的功能是该物种进一步研究的重要课题。GydF4y2Ba

鉴定GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba在白色梨基因组中的基因GydF4y2Ba

梨的全基因组、蛋白质组序列和GFFGydF4y2BaPyrus bretschneideriGydF4y2Ba)从GydF4y2Bahttp://peargenome.njau.edu.cnGydF4y2Ba[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．相应的蛋白质序列GydF4y2BaA. Thaliana.GydF4y2Ba下载自GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba资讯资源(TAIR) (GydF4y2Bahttp://www.arabidopsis.org/GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba73.GydF4y2Ba]．在两个蛋白质组数据集中，如果同一轨迹处的两个或更多个蛋白质序列相同，则选择它们重叠的最长序列。从PFAM下载NAM域的HMM配置文件（PF02365）（GydF4y2Bahttp://pfam.xfam.org/family/pf02365/GydF4y2Ba）.HMMER用于搜索包含蛋白质组的自定义数据库，其中阈值设置为PFAM GA收集截止[GydF4y2Ba74.GydF4y2Ba]．HMMER-SECASED蛋白用于原始蛋白质数据库的BLASTP查询。最后，使用Interpro的NAM域扫描BLASTP命中（GydF4y2Bahttp://www.ebi.ac.uk/Interpro/GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba75.GydF4y2Ba]．我们用同样的策略来识别GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba来自另外四种枸杞植物的基因。从植物血红素中下载苹果，桃和草莓的基因组序列（GydF4y2Bahttp://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#GydF4y2Ba）和中文李子基因组序列从中下载GydF4y2Ba李春万GydF4y2Ba基因组计划(GydF4y2Bahttp://prunusmumegenome.bjfu.edu.cnGydF4y2Ba)[GydF4y2Ba76.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

染色体位置，基因结构和保守的主题GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba家庭GydF4y2Ba

我们获得了每个染色体的详细位置信息GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba来自基因组注释文件的基因[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．然后利用Circos软件对这些数据进行整合和绘制[GydF4y2Ba77.GydF4y2Ba]．每个基因结构GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba通过使用基因结构显示服务器在线软件包（GydF4y2Bahttp://gsds.cbi.pku.edu.cn/GydF4y2Ba)[GydF4y2Ba78.GydF4y2Ba]．为了研究蛋白质基序的详细信息，我们使用MEME工具来识别共享的保守基序GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba蛋白质[GydF4y2Ba79.GydF4y2Ba]．分析参数设定如下：最大数量的不同图案：30;最小主题宽度：6;最大主题宽度：50。GydF4y2Ba

系统发育分析GydF4y2Ba

我们使用默认参数设置的MUSCLE对蛋白序列的NAC域进行了多序列比对[GydF4y2Ba80GydF4y2Ba]．我们通过FastTree使用最大可能性方法构建了系统发育树[GydF4y2Ba81.GydF4y2Ba]．MRBAYES 3.2也用于构建系统发育树，参数设定如下：LSET率=伽马，NGEN = 1,000,000，SampleFREQ = 100，NCHAINS = 4，STOPVALE = 0.01，STOPRULE = YES和SUMTBURNIN = 100 [GydF4y2Ba82.GydF4y2Ba]．分类GydF4y2BaPbNACGydF4y2Ba基因根据它们的系统发育关系与相应的关系进行GydF4y2Ba拟南芥AtNACGydF4y2Ba基因。GydF4y2Ba

阳性选择的同步分析和测试GydF4y2Ba

类似于PGDD的方法(GydF4y2Bahttp://chibba.agtec.uga.edu/duplication/GydF4y2Ba)用于进行共时态分析[GydF4y2Ba83.GydF4y2Ba]．首先，我们鉴定了e值小于1e-5的潜在同源基因对。接下来，从左、右两侧提取15个基因GydF4y2Ba南汽GydF4y2Ba基因。同步中的同源基因对的最小数量为3，常见线性部分的E值为0.01。Q值为0.9。如果认为这两个染色体段之间的同源对的对准被认为遵循线性关系（通过线性回归的相关系数确定），我们得出结论，两种片段之间存在共线关系，这可能是由于WGD或分段重复。McScanx下游分析工具用于注释同期基因对的KA和KS替代率。共线部分中同源对的平均ks值反映了复制的近似时间。我们采取了Ka / Ks <1表示否定选择，而值等于1表示中性选择，并且> 1表示正选择。我们选择了Conlinear段，其中KS值<0.3，其子族为背景。然后，通过最大可能性（PAML）进行系统发育分析的程序包来检查分支位点[GydF4y2Ba84.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

Illumina测序和数据分析GydF4y2Ba

三个月大GydF4y2BaPyrus Ussuriensis.GydF4y2Ba采自南京农业大学国家梨工程技术研究中心试验苗圃。为了消除生理和环境的影响，选择了长度和年龄相近的幼苗。制服和健康的植物和广泛洗很仔细,放置在一个生长室在26°C 16 h光/ 8 h黑暗光周期为2 d。干旱处理的幼苗被放在干净的过滤器文件(90×90毫米)和允许干为0,1、3和6 h 26°C在周围的环境中,然后在26°C的水中回收24小时。冷处理时，移入4°C生长室连续处理0、5、12和24 h, 26°C恢复24 h。每个时间点至少使用30株幼苗，采集的样本在−80℃保存至使用。根据Huang et al.(2015)的描述，从样本中分离出总RNA [GydF4y2Ba85.GydF4y2Ba]．如QI等人所述进行索尔氏菌/ illumina测序。（2013）[GydF4y2Ba86.GydF4y2Ba]．在RNA-seq中有一个生物复制。原始序列数据分析和基础调用由深圳华大基因的Illumina仪器软件Analyzer完成。接下来，将干净的测序reads映射到Wu et al.(2013)报道的梨基因组参考上[GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．一种改进的超快短读比对工具(SOAP)比对器/SOAP2随后被用于识别连续基因区域[GydF4y2Ba87.GydF4y2Ba]．为了获得高质量的转录组数据，允许最多两个在清洁读取中的不匹配，并且唯一的映射读数用于进一步分析。每百万千克读数（RPKM）用于获得基因表达水平[GydF4y2Ba88.GydF4y2Ba]．差异表达基因(DEGs)采用XYZ R包进行评估，显著性阈值要求FDR≤0.001，绝对值为对数GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba^{（折叠变化）GydF4y2Ba}≥1。InterPro域(GydF4y2Ba89.GydF4y2Ba]由InterProScan Release 36.0注释[GydF4y2Ba90GydF4y2Ba研究基因表达谱，并将功能分配映射到GO术语上[GydF4y2Ba91GydF4y2Ba]．本研究中GO基因富集分析采用WEGO [GydF4y2Ba92GydF4y2Ba]．根据其结果，对富集的KEGG通路进行了研究GydF4y2BaP.GydF4y2Ba- 高等价值和丰富因素[GydF4y2Ba93GydF4y2Ba]．这是通过对KEGG数据库进行BLAST搜索，然后指明相关的KEGG通路来实现的。GydF4y2Ba

实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

为了验证数字转录本丰度测量得到的表达模式，使用qRT-PCR分析了11个基因，引物在附加文件中GydF4y2Ba12GydF4y2Ba: S10表。用于数字转录丰度测量的RNA样本也用于qRT-PCR。用DNase I处理总RNA，去除基因组DNA污染。根据说明书，使用ReverTra Ace- α First Strand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO, TOYOBO Biotech, Japan)，以约1 μg总RNA为模板进行反转录。使用SYBR®Green Premix试剂盒(TaKaRa Biotechnology, Dalian, China)对Lightcycler480 (Roche)进行QRT-PCR [GydF4y2Ba43.GydF4y2Ba]．PCR混合物的组成如下：10μL2X SYBR PREMIX EXTAQ TM，2.5μL每种引物，以及1μl的CDNA模板，最终体积为20μL[GydF4y2Ba84.GydF4y2Ba]．所有反应都在96孔板中作为重复组成。使用每种技术的三次重复，数据显示为平均值±标准误差（SE）（GydF4y2BaNGydF4y2Ba = 3). Relative expression levels were calculated by using the 2^{——ΔΔCtGydF4y2Ba}方法对梨微管蛋白基因(AB239681)的表达进行归一化处理，作为内对照[GydF4y2Ba94GydF4y2Ba]．real-time PCR的程序如下:95℃变性起始10分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸20秒，共55个扩增周期。读取的荧光数据采集发生在60°C。在60 - 95°C范围内进行熔化曲线，以检查放大产物的特异性[GydF4y2Ba86.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

AREB1:GydF4y2Ba

脱落酸反应元素结合蛋白1GydF4y2Ba

cd:GydF4y2Ba

编码序列GydF4y2Ba

度:GydF4y2Ba

差异表达基因GydF4y2Ba

ERD1：GydF4y2Ba

对脱水压力的早期反应GydF4y2Ba

去：GydF4y2Ba

基因本体论GydF4y2Ba

KEGG:GydF4y2Ba

京都基因和基因组百科全书GydF4y2Ba

NACRS：GydF4y2Ba

NAC认可的网站GydF4y2Ba

PAML：GydF4y2Ba

用最大似然法进行系统发育分析的程序包GydF4y2Ba

PGDD:GydF4y2Ba

植物基因组复制数据库GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

Q值：GydF4y2Ba

线性回归系数GydF4y2Ba

SOAP:GydF4y2Ba

一种改进的短读对齐超快工具GydF4y2Ba

TFS：GydF4y2Ba

转录因素GydF4y2Ba

WGD:GydF4y2Ba

全基因组重复GydF4y2Ba

作者要感谢匿名评论者对这份手稿的评论。GydF4y2Ba

资金GydF4y2Ba

国家重点研发计划项目(no . 2018YFD1000300)和国家自然科学基金项目(no . 31872070)资助实验设计和样品采集。江苏省优秀青年自然科学基金项目(SBK2017030026)和江苏省农业科技创新基金项目(CX(18)3065)资助。论文由南京农业大学中央高校基本科研业务费专项资金(KYZ201607)和南京农业大学园艺学院SRT项目(20170301,20170302,2017007)资助撰写。GydF4y2Ba

可用性数据和材料GydF4y2Ba

本研究使用的干旱转录组测序原始数据已上传到NCBIGydF4y2Ba（GydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/traces/study/?acc=srp148620GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

作者笔记GydF4y2Ba

1. 鑫龚和李吉赵在这项工作中同样贡献GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 园艺学院，南京农业大学作物遗传学国家重点实验室，南京，南京，210095GydF4y2Ba

   龚鑫，赵良义，宋晓飞，林泽坤，顾丙杰，闫金萱，张少玲，陶淑天，黄小三GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

XSH, STT和SLZ对管理和手稿审查做出了贡献。XSH和STT设计了实验，XSH提供了改进的数据收集和分析方法。XFS、ZKL、BJG、JXY为采集样品提供了支持。LYZ和XG参与qRT-PCR实验。XSH和XG对NAC进化的分析有贡献。XG和LYZ对数据的分析和澄清做出了贡献。所有作者都已阅读并批准了最终稿。GydF4y2Ba

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaShutian道GydF4y2Ba或GydF4y2BaXiaosan黄GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

中国白梨基因组数据库来源于梨工程技术研究中心;’的样本GydF4y2BaPyrus Ussuriensis.GydF4y2Ba'从江浦养殖南京农业大学收集。基因组数据库，适用于我们在梨形工程技术研究中心的允许下的研究。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意事项GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文遵循知识共享署名4.0国际许可协议(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

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