天冬氨酸蛋白酶（AP）基因家族的基因组特征gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba和识别木材形成中所涉及的潜在ptapsgydF4y2Ba

背景gydF4y2Ba

天冬氨酸蛋白酶(asp)是参与植物生长发育的四大蛋白水解酶家族之一。AP基因家族在树种中所知甚少，尽管它已在gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，大米和葡萄。参与树木形成的AP基因尚待确定。gydF4y2Ba

结果gydF4y2Ba

共鉴定了总共67个AP基因gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba(PtAP)，并分为三类(A、B、C)gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因位于基因组复制区段，表明AP家族通过在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba．来自的微阵列数据gydF4y2Ba杨树gydF4y2BaEFP浏览器展示了这一点gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因具有多样化的组织表达模式。半QRT-PCR分析进一步确定超过10gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在发育中的木质部中高度或优先表达。当涉及到gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在木材形成中成为焦点，许多scw相关gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 在这些启动子中发现了gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba．基于gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba_{启动子gydF4y2Ba}:: GUS.gydF4y2Ba技术，活动gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba仅在纤维细胞中观察到促进剂，而不是在转基因中产生的纤维和叶静脉的茎血管gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba树木，在眶纤维细胞，根，花药和萼片中检测到强大的GUS信号gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba_{启动子gydF4y2Ba}:: GUS.gydF4y2Ba转基因植物。不同次生组织中GUS活性的增强表明gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba在木材形成中起作用。此外，大部分PtAP蛋白预测含有N-和(或)o -糖基化位点，PNGase F消化和western blotting整合显示PtAP17和PtAP66蛋白在N-糖基化位点gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

结论gydF4y2Ba

综合表征gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因表明了它们的功能多样性gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba增长与发展。我们的研究结果可以全面了解树木的AP基因家族，并建立更好的基础，以进一步描述的角色gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在木形成。gydF4y2Ba

天冬氨酸的蛋白酶(APs;酶委员会3.4.23)是一组广泛存在于细菌、真菌、动物和植物中的蛋白水解酶。它们是一类相对简单的酶，通常在保守的Asp-Thr/Ser-Gly基序中包含两个天冬氨酸残基，对催化活性至关重要[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]．通常，APs在酸性pH (pH 2-6)下最活跃，并被pepstatin a特异性抑制。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba，gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba4gydF4y2Ba，植物AP基因家族要大得多。在拟南芥中发现了51种潜在的ap (gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba）分为三类：典型的APS，Nucellin样AP和非典型APS [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．随后，拟南芥AP家族进一步扩大到约69个成员[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]．96年之后,gydF4y2Baosaps.gydF4y2Ba和50gydF4y2BaVvAPsgydF4y2Ba在大米(gydF4y2Ba栽培稻gydF4y2BalgydF4y2Ba．gydF4y2Ba）和葡萄（gydF4y2Bavitis ViniferagydF4y2BaL.）基因组分别[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．虽然在植物中发现了AP，但仍然缺乏他们的功能了解。gydF4y2Ba

第一个学习良好的植物AP是来自大麦的Phytepsin（gydF4y2BaHordeum Vulgare.gydF4y2Ba)，具有植物特异性插入域(PSI)，定位于液泡;它可能在管状细胞和筛细胞的主动自溶中发挥作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]．近十年来，少数研究表明APs在蛋白质加工、信号转导和应激反应中具有重要作用[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]．烟草(gydF4y2Ba烟草gydF4y2Ba) dna结合蛋白酶CND41参与了叶片衰老过程中Rubisco的转换[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]．推测OsAP65降解特定的基质，产生花粉萌发和花粉管生长所必需的一些物质[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]．在Bcl-2-ASSOCIATED ATHANOGENE6 (BAG6)触发自噬和防御抗性的过程中发现具有分子伴伴侣的拟南芥类珠心天冬氨酸蛋白酶APCB1 [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]．在拟南芥和水稻中，细胞外AP（组成型疾病抵抗1，CDR1）介导涉及诱导型电阻机制激活的肽信号系统[gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]．相反，通过反馈机制抑制了Applastic AP（Applastic EDS1-Veexent1，AED1）抑制了系统所获得的电阻（SAR）[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]．另一种AP(天冬氨酸蛋白酶IN GUARD CELL1, ASPG1)参与ABA依赖的响应，其过表达可能使拟南芥免于干旱[gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]．另一份报告显示ASPG1参与拟南芥种子萌发，这与种子贮藏蛋白(ssp)的降解和赤霉素(GA)信号通路的调控有关[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

此外，APs在植物程序性细胞死亡(PCD)中也起着重要作用。在大米、gydF4y2BaS5gydF4y2Ba参加gydF4y2Baindica-japonicagydF4y2Ba并能刺激内质网(内质网)应激，引起胚囊内PCD [gydF4y2Ba21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]．gydF4y2BaAtMYB80gydF4y2Ba和米饭gydF4y2BaEAT1gydF4y2Ba通过靶向下游天冬氨酸蛋白酶基因控制绒毡层PCDgydF4y2BaAtUNDEADgydF4y2Ba和gydF4y2BaOSAP25 / OSAP37.gydF4y2Ba,分别。沉默的表情gydF4y2BaAtUNDEADgydF4y2Ba导致绒毡层早发PCD，导致花粉PCD [gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]．OverexpressinggydF4y2BaOsAP25gydF4y2Ba或gydF4y2BaOsAP37gydF4y2Ba诱导拟南芥绒毡层广泛的细胞死亡或过早死亡[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．此外，作为抗细胞死亡成分的细胞存活率1（PCS1）的阿氨酰蛋白酶促进在胚胎发育和繁殖过程中起重要作用，其功能突变导致胚胎的转化和过度细胞死亡引起的转化[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．此外，二糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定，天冬氨酸蛋白酶gydF4y2BaA36gydF4y2Ba和gydF4y2BaA39.gydF4y2Ba双突变体在花粉中显示出意想不到的PCD [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．然而，对树种中的AP基因家族知之甚少。树木演变了与草本植物不同的许多特定性状（如大型木形成和多年生生长）。木材形成是复杂的过程，具有序贯事件，包括血管挂钩细胞分化，细胞伸长率，二次电池壁（SCW）增厚和PCD [gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]．迄今为止，在包括树木在内的植物中没有鉴定或报告植物APS在次级细胞壁形成或木形成中的作用。近年来，在植物细胞壁蛋白质组学中识别出几种AP蛋白[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]．此外，半胱氨酸蛋白酶(CEP1, XCP1/2和AtMC9)已被鉴定在SCW或PCD中在二次生长中起作用[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．因此，仍然确定涉及木材形成的AP基因，是否有一个到几个gydF4y2BaAPsgydF4y2Ba可能是过程中的指示基因gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba木材形成引起了我们的兴趣。gydF4y2Ba

杨树是一种快速生长的树，具有高容量的植物繁殖能力，其在陆地生态系统中具有大的生物量积累。它们广泛用于纸浆和造纸工业，重新造林和生物能源原料。作为模型树，gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba已经引起了广泛关注，特别是由于其基因组序列的可用性[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，这为我们提供了一个全面的全基因组分析的机会，以探索AP基因在杨树中的潜在功能。在本研究中，我们确定了89gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2BaAP基因，其中67个gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba拥有完整的ASP域。对该基因家族的系统发育、基因组织、保守基序、基因复制和表达模式进行了分析。基于SCW-relatedgydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-Elements和启动子::β-葡萄糖醛酸酶（GUS）表达分析，一些gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba构件被建议在木材形成中发挥作用。我们的研究为进一步研究它们的潜在作用提供了重要的基础gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba对一个树种的AP基因家族有更好的了解。gydF4y2Ba

全基因组鉴定和系统发育分析gydF4y2Ba杨树gydF4y2BaAP基因家族gydF4y2Ba

识别AP系列成员gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，采用先前报道的方法进行系统的BLASTP分析gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2BaAP蛋白序列作为查询。92个非还原候选序列被识别gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba基因组(gydF4y2Bahttp://www.phytozome.netgydF4y2Ba）.其中，89个候选序列具有完美的开放阅读框（ORF）。随后，通过智能和NCBI-CDD试验进一步证实这些候选AP基因，并发现67个基因具有两个保守的天冬氨酸催化残基（附加文件）的完整ASP结构域（PF00026）（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba2gydF4y2Ba）.为了进一步方便，这67gydF4y2Ba杨树gydF4y2BaAP基因被命名gydF4y2BaPtAP1gydF4y2Ba到gydF4y2BaPtAP67gydF4y2Ba基于它们在染色体上的顺序(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.剩下的22个基因(命名为gydF4y2BaPTAP样1gydF4y2Ba到gydF4y2Ba22gydF4y2Ba）在这项研究中被淘汰，因为它们通过手动检查（附加文件）在ASP域中是部分或不存在的gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba）.对应的信息gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因，包括基因符号、基因座、基因组、蛋白长度(aa)、分子量(MW)、糖基化预测位点和蛋白亚细胞定位gydF4y2Ba1gydF4y2Ba额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

为了探讨系统发育关系，我们构建了一种具有67个PTAP，30VVAPS和51的系统发育树，以及其他已知的AP蛋白（Nucellin，CND41和Cardosin A）。结果表明，这些67个PTAP可以分为三类（A，B和C;图。gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，类似于gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba葡萄和米[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]．类别A包括7个PTAP和Cardosin A.这些蛋白质与PSI域（包括SAPB_1和SAPB_2）表示典型的APS（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba），揭示更多典型的APgydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba比gydF4y2Ba拟南芥。gydF4y2Ba在B类中，6个ptap由类珠心蛋白APs组成，其中包含两个半胱氨酸，位于高度保守的序列QCDYE和GCGYDQ [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]．其余54例tapap均属于C类非典型APs。此外，树状图显示了与黄芪多糖的亲缘关系gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba、葡萄、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba(如PtAP59-64 / VvAP5-8 / at5g10760 - 10770)，表明许多祖先AP基因早于分化gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba、葡萄、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

基因结构和保守基序gydF4y2Ba

此外，我们分析了67的外显子/内含子排列gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基于其系统发育树的基因（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba一种）。最近的基因在内含子数或外显子长度方面共享类似的基因结构，但是gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba不同类别的基因表现出不同的外显子/内含子结构特征。大多数B类基因有8个外显子gydF4y2BaPtAP53gydF4y2Ba它包含10个外显子，类似于附近的一个亚群。在C类中，基因结构变化更大，外显子数目在1到12之间，但每个亚群内的外显子数目相似。此外，这些结果表明，系统发育和外显子/内含子结构之间有很强的相关性(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Bab）。gydF4y2Ba

为了深入了解PTAP蛋白的特定区域，我们分析了保守基板的分布，MEME在线工具捕获了20个图案（图。gydF4y2Ba2gydF4y2BaC和附加文件gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.每个位点的基序长度在10 ~ 50个氨基酸之间，保守基序数量在9 ~ 15个之间。主题1、2、3、4、5、12和15 PtAPs出现在几乎所有的成员,而主题6和8 A类需要具体问题具体分析,和主题11、13、14 19和20只在类c发现大多数PtAP蛋白质在每个子群显示高度保守的主题和不同的子组包含不同的守恒的图案。gydF4y2Ba

染色体定位和基因复制gydF4y2Ba

我们映射了67.gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Bapopgenie v3数据库的染色体（gydF4y2Bahttp://www.popgenie.org/gydF4y2Ba）.如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba，这些的物理位置gydF4y2BaPTAP.gydF4y2BaS在染色体上分布不均匀。5号染色体的成员数最多(8个)gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因，其次是染色体6和18，每个都有七个gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因。三gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因同时分布在染色体10,15和16上，而染色体11,12,13和17只有一个。gydF4y2Ba

节段复制和串联复制是导致基因家族扩展的主要机制[gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba]．阐明扩大机制gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因家族gydF4y2Ba，gydF4y2Ba我们使用了在之前的研究中建立的重复区块[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba，以确定潜在的片段重复。如图所示。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba， 30对基因复制对对应42对gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因。其中，有一些亚群gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba是相互复制基因吗gydF4y2BaPtAP4gydF4y2Ba/gydF4y2Ba28gydF4y2Ba/gydF4y2Ba40gydF4y2Ba/gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtAP7gydF4y2Ba/gydF4y2Ba21gydF4y2Ba/gydF4y2Ba25gydF4y2Ba/gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtAP27gydF4y2Ba/gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba/gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP30gydF4y2Ba/gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba/gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba，暗示他们可能分享常见的祖先基因。而且，gydF4y2BaPtAP39gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtAP50gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP51gydF4y2Ba在相应的块上重复，但这些重复（gydF4y2BaPotri.010G130100gydF4y2Ba，gydF4y2BaPotri.002G188800gydF4y2Ba和gydF4y2BaPTAP样4gydF4y2Ba分别是不完整或丢失了ASP域。此外，大约18％（共67个中的）gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba（gydF4y2BaPtAP6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba9gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba13gydF4y2Ba，gydF4y2Ba14gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba）基因位于任何重复的块外。通常，基因簇是基因串联复制的结果[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．在这里，我们发现一些gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因彼此相邻(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.例如,gydF4y2BaPtAP31gydF4y2Ba到gydF4y2Ba33.gydF4y2Ba，gydF4y2BaPtAP35gydF4y2Ba/gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba,gydF4y2BaPtAP59gydF4y2Ba到gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba分别在6号、7号和18号染色体上串联定位，提示这些基因可能来自最近的串联复制事件。这些结果表明，串联重复和节段重复在扩增中都起着关键作用gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因家族。gydF4y2Ba

此外，我们根据系统发育分析和染色体分布估计了非同义替换率(Ka)、同义替换率(Ks)和Ka/Ks比值gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba．结果表明，重复事件的大致日期从114.09万年前（MYA）到9.47 Mya（附加档案gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.鉴于数据显示的差异gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba大约100到120 mya，几乎所有PTAP分段重复发生在后gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba和gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba分裂。各基因对的Ka/Ks比值均< 1.0，说明各基因对的Ka/Ks比值均小于1.0gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因对复制后受到纯化选择的影响。gydF4y2Ba

PtAP基因表达模式多样化gydF4y2Ba

分析的表达式配置文件gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba在此基础上，我们回顾了它们在多个组织和器官(包括根、发育中的木质部、幼叶、成熟叶、雄性柔荑花序和雌性柔荑花序)中的转录丰度模式gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba带有相应探测集的eFP浏览器(附加文件gydF4y2Ba10gydF4y2Ba）.总共，57gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因在微阵列数据中被发现(附加文件gydF4y2Ba11gydF4y2Ba）.热图展示了最多gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba具有组织特异性或优先表达模式（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba特指在发育中的木质部中表达;gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP64gydF4y2Ba优先在开发木瓜，根和CATKIN中表达;gydF4y2BaPtAP1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba在幼叶、根和发育中的木质部中高度表达;gydF4y2BaPtAP21gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba在柔荑花序中优先表达;和gydF4y2BaPtAP6gydF4y2Ba/gydF4y2Ba11gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP19gydF4y2Ba/gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba在根和幼叶中分别表现出较高的表达量。这些数据表明gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba期间可能涉及多个流程gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba增长与发展。gydF4y2Ba

此外,12gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba选取发育木质部中eFP值较高的基因(eFP > 1000)，通过半定量rt - pcr检测其在韧皮部、形成层、发育木质部、顶端芽、幼叶、成熟叶和叶柄中的表达水平(图1)。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。最gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因表达谱与微阵列数据一致，而表达水平gydF4y2BaPtAP30gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP40gydF4y2Ba在木质部中略低于幼叶。这个结果可能是由于不同的材料标准造成的误差。此外,gydF4y2BaPtAP1gydF4y2Ba在顶端芽中高度表达gydF4y2BaPtAP10gydF4y2Ba和gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba优先于嵌合百分之表达（图。gydF4y2Ba5gydF4y2BaA)，表明它们可能在这些组织中起作用。qRT-PCR分析显示12gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因在不同组织中的表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Bac)，与半qrt - pcr分析结果一致。gydF4y2Ba

我们进一步探讨了它们之间的关系gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba具有二次细胞壁形成的木质中高度表达的基因。由于第一至第四个间节间（IN）显示出杆伸长率的主要生长，下面的第5位启动了逐渐徘徊的SCWS [gydF4y2Ba35.gydF4y2Ba，我们检测了它们在in 1、2、3、4、5、6、9和12中的表达水平。如图所示。gydF4y2Ba5gydF4y2BaB，层次gydF4y2BaPtAP1gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP30gydF4y2Ba茎伸长区占优势，随着茎次生生长开始逐渐减弱。相比之下,gydF4y2BaPtAP10gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53, 64gydF4y2Ba和gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba表达表达水平的相反趋势，其与开关相关，以在激活二次生长后止动径向生长。我们的结果表明，这些基因可能会起作用gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba二次生长或木材形成。gydF4y2Ba

PtAPs启动子区与SCW形成相关的顺式元件分析gydF4y2Ba

转录网络负责在二次壁形成期间的二次壁生物合成基因表达的协调调节。我们认为PTAP可以在转录网络调节木材二壁形成的下游，并且是次级壁限制因子的目标。鉴于此，我们分析了gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba在木质部中高表达或优先表达的26个ptap(木质部eFP > 1000及相应复制基因)启动子区域中与SCW形成相关的-元素。如图所示。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，共10个gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba在本文中鉴定了 - 在此gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba．这些基因的大多数推动者区域（3000 bp）（除了gydF4y2BaPtAP34 49 57 59gydF4y2Ba和gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba)gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-element snbe。gydF4y2BaPtAP4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba23gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba包含gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba元M46RE。尽管如此,gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-element TERE仅存在于启动子区gydF4y2BaPtAP30gydF4y2Ba．此外，启动子区域gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，gydF4y2Ba11gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba有gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba元素SMRE1,gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba包含了gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba元素ACI。迄今为止，SNBE、M46RE、TERE、SMRE和AC元素已被确定参与木质部发育过程中SCW的形成和(或)PCD [gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba41.gydF4y2Ba]．因此，我们的数据表明gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba应该是功能gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba木形成。gydF4y2Ba

启动子:基于guss的scw相关分析gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在转基因植物gydF4y2Ba

与其他相比gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba， 这gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba主要在木质部中表达(图。gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.除此之外，预计PTAP17和PTAP66预计将在液泡和细胞壁中局部（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），建议在木形成过程中可能参与不同的生物学过程。基于这些，我们首先关注活动gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba启动子使用gydF4y2Baptappro :: gusgydF4y2Ba的方法。在gydF4y2BaPtAP66pro:格斯gydF4y2Ba在次生韧皮部纤维、发育中的木质部、叶主脉和根中柱中均检测到GUS酶活性。gydF4y2Ba7gydF4y2BaF-j)，是次生维管系统的主要组成部分。在茎发育的木质部和叶脉的纤维中，GUS信号特别强烈，而不是在导管中。gydF4y2Ba7gydF4y2Baf和i)。为了证实其可靠性，我们进一步检验了gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba转基因的启动子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba．正如预期的那样，在主要的二次血管组织中仍然检测到GUS活动（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba(a-i)，而后生木质部的束间纤维(而非血管)显示出较强的GUS活性(图2)。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba我)。有趣的是,尽管gydF4y2Baptap5pro :: gus.gydF4y2Ba在转基因gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba在水平上中度表达，在木质部发育的导管中可以观察到GUS信号，而在纤维中看不到(图2)。gydF4y2Ba7gydF4y2Bak-l)。gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba，一对分段复制的基因(图。gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba），在显影木质中显示出他们的促进剂的不同表达模式，表明了不同的作用gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba在木结构中。此外，我们还检查了gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba转基因的启动子gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba植物(图。gydF4y2Ba8gydF4y2Baj-r）。在茎眶纤维，叶形主静脉和根部硬顶中观察到密集的GUS信号gydF4y2BaPtAP17pro:格斯gydF4y2Ba转基因线，如gydF4y2BaPtAP66pro:格斯gydF4y2Ba转基因线。在根尖、花药和萼片中检测到GUS活性gydF4y2BaPtAP17pro:格斯gydF4y2Ba结果表明，转基因株系的活性明显高于转基因株系gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba启动子(无花果。gydF4y2Ba8gydF4y2Bac和e)。这些数据还表明gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba应该参与SCW的形成。gydF4y2Ba

PTAP蛋白的N-糖基化分析gydF4y2Ba

预测PTAP蛋白的潜在的N-和O-糖基化位点，如附加文件所示gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和额外的文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba．除PtAP4、19和40外，64个PtAP蛋白均存在n -糖基化位点，所有PtAP成员均含有o -糖基化位点。我们进一步研究了植物APs中一些关键结构域内的n -糖基化位点是否被保守(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba一个;附加文件gydF4y2Ba4gydF4y2Ba）.所有类珠心蛋白(B类)gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba、葡萄、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba含有不变Tyr75（Pepsin编号）和GCGYDQ保守序列之间的保守的N-糖基化位点。相反，PSI结构域的N-糖基化位点不保守gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba、葡萄、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba在成员较多的C类AP中，gpi锚定的AP亚组中不变Tyr75旁边的n -糖基化位点不完全保守，其他AP亚组结果相似。gydF4y2Ba

为了进一步验证PtAP蛋白的n -糖基化，我们进行了转基因gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba分别过表达PtAP17-FLAG和PtAP66-FLAG (OE，在其羧基端与FLAG标签融合)(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Bab）。使用抗标志抗体的蛋白质印迹分析显示PTAP17-和PTAP66标志蛋白分别为67kDa和52kDa，表明这些蛋白质大于它们计算的Mws（图。gydF4y2Ba9gydF4y2BaC和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.PNGase F酶切后，PtAP17-和PtAP66- flag蛋白在SDS-PAGE凝胶上的迁移速度加快，表明PtAP17和PtAP66发生了n -糖基化。此外，PNGase F消化后的MWs仍高于计算值(图4)。gydF4y2Ba9gydF4y2BaC和附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），表明成熟PTAP17和PTAP66的可能O-糖基化。这些数据提供了进一步调查糖基化在PTAP蛋白的结构和功能中的作用的基础。gydF4y2Ba

越来越多的证据表明，植物APS在蛋白质处理，应力响应，PCD和繁殖中起重要作用[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]．据我们所知，目前还没有关于植物APs参与次生细胞壁形成或木材形成的报道。此外，对黄芪多糖的研究大多集中在草本植物上，尤其是草本植物gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba和大米(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba，gydF4y2Ba16gydF4y2Ba，gydF4y2Ba19gydF4y2Ba，gydF4y2Ba24gydF4y2Ba，gydF4y2Ba25gydF4y2Ba，gydF4y2Ba26gydF4y2Ba，gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba而忽略了树种中的这一科。在本研究中，我们对gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba家庭gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba包括系统发育、基因组织、保守基序、基因复制、表达模式和糖基化位点。此外，一组gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba（gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba等）被提出参与其中gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba木形成，由这些数据从组织表达模式，与之相关的数据gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-Elements和gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba_{启动子gydF4y2Ba}:: GUS.gydF4y2Ba活动。这些观察结果提供了对此的整体理解gydF4y2Ba美联社gydF4y2Ba为进一步研究其在树木生长发育中的作用奠定了重要的基础。gydF4y2Ba

在本研究中，我们鉴定了67个AP基因gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba(附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），这比那些略高于那些gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba6gydF4y2Ba，尽管存在一些基因复制簇。当我们考虑到1.4~1.6的比率推定的杨树同源拟南芥基因[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]， 的数量gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因家庭成员不能满足我们的期望。这gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba基因组至少经历了三次大规模的全基因组复制[gydF4y2Ba32.gydF4y2Ba]，这可能会导致许多部分和不完整的编码序列，如本研究中删除的22个序列所示。此外，大约18% (12 / 67)gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因位于任何复制区域之外。因此,要少得多gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba观察到基因gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba比我们预期的。即便如此，大约78％（67号中的52％）gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因与节段性或串联重复相关，暗示这些基因存在于功能冗余中。为了进一步选择性压力分析，我们发现纯化选择在AP基因家族扩张期间用作初级力gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，这表明这些复制基因可能保留了它们祖先的功能[gydF4y2Ba43.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

同一亚组内的PTAP系列成员显示了类似的主题和本地化模式（图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba）.例如,gydF4y2BaPtAP4gydF4y2Ba，gydF4y2Ba28gydF4y2Ba，gydF4y2Ba40gydF4y2Ba，gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba预计含有糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定（附加文件gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba），与A36和A39一致gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]．此外，很明显，同一亚组gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因分享了三个类别的类似外显子/内含子结构。在C类别中，22类gydF4y2BaPTAP.gydF4y2BaS缺乏内含子和17gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Bas缺少5 ' utr(图。gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba，米饭和葡萄[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba，gydF4y2Ba8gydF4y2Ba，gydF4y2Ba44.gydF4y2Ba]．可能，常见的祖先基因已经拥有这种内含子/外显子结构。虽然内含子对蛋白质序列没有有助于蛋白质序列，但它们的相对位置提供了某些线索用于预测基因和它们相应的蛋白质如何进化并进一步有助于基因家族的多样化[gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba46.gydF4y2Ba]．我们的数据展示了AP基因的分类和进化关系gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba．这一证据也提出了在同一亚群中的植物APs可能具有相对保守的作用的可能性。gydF4y2Ba

基因表达模式与功能高度相关。通过微阵列数据和半定量rt - pcr分析表明，PtAP家族基因有多种表达模式。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba）.作为直本基因的gydF4y2BaPCS1gydF4y2Ba在胚胎发育和生殖过程中起作用，gydF4y2BaPtAP44gydF4y2Ba在柔荑花序中优先表达[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．其他gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba（gydF4y2BaAP17,45,64,66gydF4y2Ba）在Xylems中显示出更高的转录水平，并与茎氧化程度呈正相关。我们寻求这些gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在AspWood (gydF4y2Bahttp://aspwood.popgenie.orggydF4y2Ba)，这是一个高空间分辨率的RNA测序数据库，涵盖次生韧皮部、维管形成层和木材组织[gydF4y2Ba47.gydF4y2Ba]．所有的这些gydF4y2BaPTAP.gydF4y2BaS在发育中的木质部或木质化的木质部高度表达(数据未显示)。总之，这些表达数据表明gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因可能与木材形成的SCW或PCD有关。为此，我们过滤了与scw有关的内容gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-元素在启动子区域。都含有SNBE或M46REgydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba元素(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)，与SCW或PCD有关[gydF4y2Ba36.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba37.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba39.gydF4y2Ba]．此外,活动gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba启动子在转基因gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)表明它们可能参与木材的形成。有趣的是，GUS染色数据显示gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba在纤维细胞中表达而不是在血管中表达，但是gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba是相反的。这个结果超出了我们的预期，因为gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba是节段性重复基因，具有87％氨基酸序列同一性。这种可能性是在基因重复后导致其不同的表达模式后其调节区域中的突变发生。亚细胞定位预测显示PTAP66作为细胞壁蛋白（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba）.假设PtAP66参与SCW或木材形成可能有助于质膜(PM)和/或细胞壁中的蛋白质的降解或成熟。推测这些蛋白可能是结构壁蛋白、壁修饰酶或pm定位信号蛋白。共免疫沉淀、酵母双杂交和蛋白质组学方法有助于寻找PtAP66的靶蛋白。gydF4y2Ba

迄今为止，只有一种类型的蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶（XCP1 / 2和ATMC9），已经在SCW地层期间与PCD和容器中的自分解相关[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba，gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba，gydF4y2Ba31.gydF4y2Ba]．对木质纤维的PCD和自溶解的理解有限。在A类中的这些PTAP（PTAP6,11,17和45）已经预测在血管渣中并且在跛行的木耳中高度表达（图。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba；附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba），建议在木形成过程中涉及这些PTAP或自溶的自水解。两个Snbe.gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba- 在启动子区发现了gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba（图。gydF4y2Ba6gydF4y2Ba）.从微阵列数据中，一个拟南芥同源基因(At4g04460)被认为是次级壁相关NAC DOMAIN PROTEIN1 (SND1)和血管相关NAC- domain7 (VND7)的下游靶点，但未检测[gydF4y2Ba38.gydF4y2Ba]．然而,gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba在木质纤维中特异性表达，而不是其启动子活性的提示（图。gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)，暗示。的表达gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba应该由SND1而不是VND7调控，VND7是与血管SCW和PCD相关的直接转录调控因子[gydF4y2Ba48.gydF4y2Ba]．这些结果表明，在白杨树和拟南芥中，典型的天冬氨酸蛋白酶在SCW形成过程中存在功能差异。然而，需要获得这方面的遗传学证据来确定其上游转录调控因子。gydF4y2Ba

糖基化，真核生物中常见的翻译后修饰，在蛋白质结构和功能中起着至关重要的作用[gydF4y2Ba49.gydF4y2Ba]．大多数PTAP蛋白具有潜在的N-和O-糖基化位点（附加文件gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)，两种n -糖基化的PtAP17和66通过本研究的实验数据得到证实(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Ba）.由于大多数ptap具有信号肽，并且位于分泌途径(如细胞外和液泡)，因此需要糖基化。分析了不同类型植物多聚磷酸酶关键结构域的n -糖基化位点是否存在保守性。类nucelin ap (B类)在gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba、葡萄、gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba已发现在不变的Tyr75和GCGYDQ基基之间存在保守的n -糖基化位点，但A类和C类植物APs不存在(图。gydF4y2Ba9gydF4y2Baa).这表明不同种类的植物AP蛋白在糖基化修饰方面存在差异或混淆。在以前的研究中，去糖基化StAPs在gydF4y2BaSolanum Tuberosum.gydF4y2Ba影响了亚细胞在质外体中的积累和抗真菌活性[gydF4y2Ba50.gydF4y2Ba]并且替换与糖蛋白B的PSI结构域（具有糖基化位点）的P​​SI域（其没有糖基化位点）的P​​SI结构域已经改变了真空分选的PSI机制[gydF4y2Ba51.gydF4y2Ba]．PtAP蛋白中糖基化位点的存在与否可能是决定其分子功能或靶向途径的关键结构。未来，通过点突变去除或添加ptap中的糖基化位点，将揭示其在蛋白质结构和分子功能中的作用。gydF4y2Ba

此外，某些植物AP的效果将导致形态变化。MisexpressiongydF4y2Ba娜娜gydF4y2Ba基因(gydF4y2Ba娜娜gydF4y2Ba）改变叶片形态并导致延迟开花时间[gydF4y2Ba42.gydF4y2Ba]．异位表达gydF4y2BaPCS1gydF4y2Ba导致花药开裂失败和雄性不育[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]．诱导表达gydF4y2BaOsAP25gydF4y2Ba或gydF4y2BaOsAP37gydF4y2Ba展示广泛的细胞死亡gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba叶及子叶[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]．过表达激活标记突变体CDR1导致矮化到毒性gydF4y2Ba两gydF4y2Ba［gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]．而在过表达PtAP17和PtAP66转基因中gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，与野生类型相比，我们没有观察到增长和发展的任何差异。在这些转基因中需要进一步研究木材形成期间的SCW和/或PCD是否通过PTAP进一步研究gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba．下一个努力获得这些gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba敲除突变体将阐明其遗传功能和潜在的分子机制。gydF4y2Ba

在这里，我们提出了AP家族的总体特征gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba，包括基因鉴定，基因结构，系统发育关系等gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因具有不同的组织表达模式，这意味着它们的功能多样性。此外,一些gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因(gydF4y2BaPtAP5gydF4y2Ba，gydF4y2Ba17gydF4y2Ba，gydF4y2Ba45.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba，等等)已与gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba木材形成，最可能通过SCW和PCD过程，由SCW相关建议gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-Elements和gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba_{启动子gydF4y2Ba}:: GUS.gydF4y2Ba活动分析。到目前为止gydF4y2Ba美联社gydF4y2Ba在SCW发育或木材形成过程中，包括树木在内的植物的基因尚待确定。因此，我们下一步研究CRISPR/ cas9靶向的表型gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因敲除gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba树木，可以清楚地揭示它们的作用gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba在木形成。简而言之，本研究提供了我们对树中AP基因家族的理解，并为确定这些基因的功能分配提供了更好的基础。gydF4y2Ba

AP基因的鉴定gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba

共51条AP蛋白序列gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba［gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]被检索并作为查询来鉴定AP基因gydF4y2Bap . trichocarpagydF4y2Ba基因组(gydF4y2Ba52.gydF4y2Ba使用BLASTP程序。随后，利用SMART数据库对这些候选序列进行分析[gydF4y2Ba53.gydF4y2Ba]及NCBI-CDD [gydF4y2Ba54.gydF4y2Ba]的工具，以确认它们具有完整的Asp结构域(PF00026)和两个保守的天冬氨酸催化残基。在人工检查时，部分和缺陷序列被消除。ExPASy程序(gydF4y2Bahttps://web.expasy.org/compute_pi/gydF4y2Ba)用于计算蛋白质的分子量。五tools-Plant-mPLoc [gydF4y2Ba55.gydF4y2Ba]，loctree3 [gydF4y2Ba56.gydF4y2Ba， ProtComp 9.0 (gydF4y2Bahttp://linux1.softberry.com/gydF4y2Ba），Yloc [gydF4y2Ba57.gydF4y2Ba]及ngLOC [gydF4y2Ba58.gydF4y2Ba-用于预测蛋白质亚细胞位置，并根据多数给出最终结果。N-和o -糖基化位点由NetNGlyc 1.0依次预测(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/gydF4y2Ba)及NetOGlyc 4.0服务器(gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/gydF4y2Ba），是的，是，没有代表正面和负面结果。gydF4y2Ba

多序列对准和系统发育分析gydF4y2Ba

自从22gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba候选基因缺乏完整的ASP结构域，因此被排除在系统发育分析和进一步研究之外。其中67个tapaps、30个vvpaps和51个AtAPs(胃蛋白酶样型)，大麦珠蛋白(GenBank accession no. 029529531)。U87148) [gydF4y2Ba59.gydF4y2Ba]，烟草CND41（D26015）[gydF4y2Ba60.gydF4y2Ba， cardoon cardosin A (CAB40134) [gydF4y2Ba61.gydF4y2Ba和猪胃蛋白酶A通过Clustal X 2.0进行比对[gydF4y2Ba62.gydF4y2Ba]．系统发育树采用MEGA 5.2和默认参数下Neighbor-Joining (NJ)方法构建，并使用1000个重复进行bootstrap分析[gydF4y2Ba63.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基因组组织和重复分析gydF4y2Ba

67年gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba通过根据popgenie数据库鉴定它们的染色体位置来映射到染色体上的基因[gydF4y2Ba64.gydF4y2Ba]．基因组中的串联复制被定义为密切相关的基因落在彼此的50kb内[gydF4y2Ba34.gydF4y2Ba]．同时，从植物基因组复制数据库(PGDD)下载复制片段[gydF4y2Ba65.gydF4y2Ba]．如果它们位于重复的染色体段上，则认为基因被认为经历了节段性重复。从PGDD中提取Ka和Ks值的数量。根据公式估计复制时间：T = Ks /2λ。为了gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba时，类时钟速率λ为9.1 × 10gydF4y2Ba^{- 9gydF4y2Ba}［gydF4y2Ba66.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

基因和蛋白质结构分析gydF4y2Ba

基因组序列和相应的编码序列(CDS)gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba加载到基因结构显示服务器(GSDS)中，以确定外显子/内含子排列[gydF4y2Ba67.gydF4y2Ba]．应用模序阐明(Multiple Expectation Maximization for Motif Elucidation, MEME)系统鉴定AP蛋白的保守模序[gydF4y2Ba68.gydF4y2Ba]．参数设置如下:最优motif宽度设置为10-50，最大可识别的motif数量设置为20个，其他参数均默认。对于每个鉴定的PtAP蛋白，使用SignalP 4.1 (gydF4y2Bahttp://www.cbs.dtu.dk/services/signalp//gydF4y2Ba)，使用CDD和SMART的ASP结构域，以及使用big-PI植物预测器的gpi锚定添加位点[gydF4y2Ba69.gydF4y2Ba]．用狗1.0软件构建蛋白质结构图[gydF4y2Ba70gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

与次生壁形成有关的gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba元素分析gydF4y2Ba

3 kB启动子序列（5'-UTR的上游DNA序列）gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因(木质部eFP > 1000及相应复制基因)扫描scw相关基因gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-元素通过人工检查。这里的10gydF4y2BaCIS.gydF4y2Ba-元素列表如下:SNBE (wnnybtnnnnnnnnnnnamgnhw)、TERE (CTTNAAAGCNA)、M46RE (RKTWGGTR)、ACI (ACCTACC)、ACII (ACCAACC)、ACIII (ACCTAAC)、SMRE1 (ACCAAAT)、SMRE2 (ACCAACT)、SMRE3 (ACCAAAC)和SMRE5 (ACCTAAT)。这些图表gydF4y2BaCIS-gydF4y2Ba使用狗1.0软件绘制启动子区域的元素。gydF4y2Ba

植物材料和生长条件gydF4y2Ba

野生型gydF4y2BaPopulus Trichocarpa.gydF4y2Ba(nisqualli -1)在23-25℃长日照(16 h光照/ 8 h黑暗)条件下，在东北林业大学温室内种植。收集9株以上100天龄幼树，检测不同组织和器官的表达水平，并进行3次生物复制。样品包括顶端芽、韧皮部、形成层、发育中的木质部、幼叶、成熟叶、叶柄和根。第1 ~ 6节，第9节和第12节之间，发育的木质部，形成层和韧皮部的样品被收集在以前的研究中[gydF4y2Ba71.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

拟南芥（gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba；在120 μmol photons m的光照强度下，在温室中(光照16 h /黑暗8 h)生长gydF4y2Ba^{- 2gydF4y2Ba} s^{- 1gydF4y2Ba}22°C。5日龄和14日龄的幼苗在加1%蔗糖的灭菌1/2 Murashige和Skoog平板上进行GUS染色。gydF4y2Ba

芯片数据分析、RNA分离、半qRT-PCR和qRT-PCR分析gydF4y2Ba

组织特异性表达数据gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba下载自gydF4y2Ba杨树gydF4y2BaeFP浏览器(gydF4y2Ba72.gydF4y2Ba]．探针组对应gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba使用netafffx分析中心提供的在线探针匹配工具(gydF4y2Bahttp://www.affymetrix.com/gydF4y2Ba）.热图由heat map illustrator (HemI)以默认设置生成[gydF4y2Ba73.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

用植物RNA提取试剂(Bio-Flux，中国)分离总RNA。使用PrimeScript RT试剂试剂盒(TaKaRa，中国)对每个样品进行1 μg总RNA逆转录成总cdna。的表达式gydF4y2Baptactin2.gydF4y2Ba用作同一CDNA的内部控制。表达式的gydF4y2BaPtAPsgydF4y2Ba用ExgydF4y2BaTaqgydF4y2Ba（Takara，中国）。反应混合物（20μl）由1μlcDNA模板组成，每个基因特异性引物（10μm），2μl10×前gydF4y2BaTaqgydF4y2Ba缓冲液（mg.gydF4y2Ba^{２＋gydF4y2Ba}2 μl dNTP混合物(每个2.5 mM)， 1.6 μl MgClgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba和0.1 μl ExgydF4y2Ba-TAQ.gydF4y2Ba．PCR参数为94℃3 min;然后25-32个循环，94°C for 30 s, 58°C for 30 s, 72°C for 30 s;最后一步，72°C, 7分钟。所得到的PCR产物在2%琼脂糖凝胶上运行，并在紫外透照器下进行可视化，以验证产品尺寸。本研究中用于半qrt - pcr的引物均列于附加文件中gydF4y2Ba12gydF4y2Ba．每个反应重复三次，以确保结果的重现性。gydF4y2Ba

验证gydF4y2BaPTAP.gydF4y2Ba基因表达谱，使用与上面的半QRT-PCR实验中使用的相同cDNA模板和引物进行这些基因的QRT-PCR分析。根据制造商的说明，在ABI Prism 7500系统（Applied Biosystems）的Sybr Green（Takara，中国）进行了QRT-PCR实验。反应混合物（20μl）由10μl2×Tb绿色组成gydF4y2Ba预混料Taq交货gydF4y2BaII (Tli RNaseH Plus)，每个基因特异性引物0.8 μl, ROX Reference Dye II 0.4 μl, cDNA模板1 μl，去离子化HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaO. PCR参数如下：95°C为30秒;40℃为95℃，5s，60℃，60℃，72℃30秒。gydF4y2Baptactin2.gydF4y2Ba用作内部控制和比较CT（2gydF4y2Ba^{-gydF4y2Ba△gydF4y2BaCtgydF4y2Ba})方法计算基因表达量。每个样品做了三次技术重复。gydF4y2Ba

质粒构建和gydF4y2Ba农杆菌gydF4y2Ba介断的转化gydF4y2Ba

使用植物基因组DNA提取试剂盒（Bioteke，China）从叶子中提取基因组DNA。用这种基因组DNA被用作模板，约3kb的启动子区域gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba通过PCR扩增，克隆到pENTR/D-TOPO (Gateway, Invitrogen)中，生成进入克隆(Additional filegydF4y2Ba12gydF4y2Ba）.DNA测序后，通过LR重组反应将进入克隆的启动子片段构建到Gateway二元载体pGWB3中。这些构念被转换成gydF4y2Ba农杆菌肿瘤术gydF4y2Ba应变GV3101并引入到gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba采用浸花法栽种的植物[gydF4y2Ba74.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

的光盘gydF4y2BaPtAP17gydF4y2Ba和gydF4y2BaPtAP66gydF4y2Ba使用番茄嗪cDNA作为模板扩增来自植物沸子以构建PGWB11-PTAP17 / PTAP66-FLAP的过表达载体，并在附加文件中列出引物gydF4y2Ba12gydF4y2Ba．在测定DNA测序后，将所得构建体（过表达和启动子）引入gydF4y2BaA. Tumefaciens.gydF4y2Ba菌株GV3101gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba如前所述转换[gydF4y2Ba75.gydF4y2Ba]．gydF4y2Ba

GUS染色gydF4y2Ba

对于每一株转基因植株，至少有6个独立的株系进行GUS染色分析。在代表性品系中记录了一致的GUS染色结果，并以GUS组织化学阴性的野生型植物作为对照。GUS染色如所述[gydF4y2Ba76.gydF4y2Ba]．GUS信号形成后，用75% (v/v)乙醇多次清除样品的叶绿素。图片的写意部分gydF4y2Ba拟南芥gydF4y2Ba茎和gydF4y2Ba杨树gydF4y2Ba静脉用BX43体视显微镜(Olympus, Japan)捕捉，其他组织用SZX7体视显微镜(Olympus, Japan)捕捉。gydF4y2Ba

通过PNGase F处理和western blot进行去糖基化gydF4y2Ba

将转基因植物材料研磨在液氮中并在蛋白质萃取缓冲液（50mM Tris-HCl，200mM NaCl，2％SDS，5mM DTT，pH8.0）中均化。将悬浮液以18,000×g离心5分钟，上清液（蛋白质提取物）用于蛋白质脱糖基化与/没有PNGase F（新英格兰Biolabs，UK）。然后将这些处理的蛋白质提取物在10％SDS-PAGE凝胶中溶解并转移到PVDF膜中。使用抗标志抗体（ABMART，CHINA）和Pierce ECL化学发光底物（Thermo，USA）进行蛋白质印迹。gydF4y2Ba

统计分析gydF4y2Ba

学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba采用SPSS19.0统计软件(美国芝加哥)检验RT-qPCR基因表达数据是否存在显著性差异。不同水平的差异有统计学意义(gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.05和gydF4y2BaPgydF4y2Ba< 0.01)分别标记为*和**。gydF4y2Ba

支持本文结论的数据集包含在文章及其附加文件中。gydF4y2Ba

记者:gydF4y2Ba

天冬氨酸的蛋白酶gydF4y2Ba

爆炸:gydF4y2Ba

基本的局部比对搜索工具gydF4y2Ba

CD：gydF4y2Ba

编码序列gydF4y2Ba

CRISPR / Cas9:gydF4y2Ba

定期聚集间隔短回文重复序列/ crispr相关蛋白-9核酸酶gydF4y2Ba

eFP:gydF4y2Ba

电子荧光象形文字gydF4y2Ba

谷歌价格指数:gydF4y2Ba

糖基膦酰氨基肌醇gydF4y2Ba

格斯:gydF4y2Ba

β-葡萄糖醛酸酶gydF4y2Ba

兆瓦:gydF4y2Ba

分子量gydF4y2Ba

子:gydF4y2Ba

开放阅读框gydF4y2Ba

PCD：gydF4y2Ba

程序性细胞死亡gydF4y2Ba

PtAP:gydF4y2Ba

Populus Trichocarpa.gydF4y2Ba美联社gydF4y2Ba

QRT-PCR：gydF4y2Ba

定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

SCW：gydF4y2Ba

次生细胞壁gydF4y2Ba

sds - page:gydF4y2Ba

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳gydF4y2Ba

Semi-qRT-PCR:gydF4y2Ba

半定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba

SND1:gydF4y2Ba

二级壁相关NAC结构域蛋白1gydF4y2Ba

UTR：gydF4y2Ba

未经翻译的地区gydF4y2Ba

VND7：gydF4y2Ba

血管相关的NAC结构域7gydF4y2Ba

我们要感谢审稿人和编辑对这份手稿的认真阅读和有帮助的评论。gydF4y2Ba

实验设计和样品采集由中央高校基本科研业务费专项资金(2572016AA02)资助。黑龙江省自然科学基金项目(JC2016003)资助测序、数据分析和手稿撰写。gydF4y2Ba

从属关系gydF4y2Ba

1. 2 .东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，黑龙江哈尔滨gydF4y2Ba

   曹神权，郭孟杰，王冲，徐文静，石天元，童桂敏，郑诚，程浩，杨传平，程玉祥gydF4y2Ba

2. 埃及坦塔大学农学院农业植物系gydF4y2Ba

   纳比尔·易卜拉欣ElsheerygydF4y2Ba

贡献gydF4y2Ba

实验由SC、CY和YC设计。SC、MG、CW、WX、TS、GT、CZ、HC、CZ和NI进行了实验和数据分析。SC撰写了手稿。YC监督了这个项目，并修改了手稿。所有作者阅读并批准了手稿的最终版本。gydF4y2Ba

相应的作者gydF4y2Ba

对应到gydF4y2BaChuanping杨gydF4y2Ba或gydF4y2Ba渝程gydF4y2Ba．gydF4y2Ba

伦理批准和同意参与gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

同意出版物gydF4y2Ba

不适用。gydF4y2Ba

利益争夺gydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。gydF4y2Ba

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施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。gydF4y2Ba

开放获取gydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/gydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(gydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/gydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。gydF4y2Ba

再版和权限gydF4y2Ba