嫁接牛油果miRNA丰度和树成熟度的接穗控制GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

嫁接是牛油果常见的繁殖方法，主要有利于果园生产，因为它减少了树木生产的时间。它还允许使用专门为提高生产力和商业接受而选择的接穗和砧木。鳄梨的砧木可以从成熟的树木扦插(“成熟”)或从种子(“幼”)繁殖。虽然使用成熟的接穗材料可以促进早结早熟和经济回报，但接穗和砧木在早结早熟和减少幼体方面的分子因素尚不清楚。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在这里，我们利用了少女和开花相关的miRNA;MiR156和MiR172及其推定的靶基因以促进鳄梨的不同组合筛网接枝和后移植物。成熟miR156，miR172和miR156靶基因的丰富GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba，表现出与鳄梨中的中隙和砧木材料的成熟的强烈相关性。在年植物中探讨了MIR156和MIR172的接枝传动率。在这里，我们表明，植物成熟度不会影响涉及这些因素的接枝树成熟度，而砧木成熟度不会显着影响中断中的miRNA丰富。我们还证明了切割砧木上的叶片的存在支持移植的成功，并有助于涉及碳水化合物 - 标记的血糖移植信号GydF4y2BaTPS1GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

在这里，我们认为接穗在很大程度上控制着嫁接鳄梨树的分子成熟度，然而，砧木上的叶子不仅促进嫁接的成功，而且可以影响接穗中miRNA和mRNA的丰度。这是首次利用miR156-研究接穗和砧木对嫁接树成熟度的贡献GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba-miR172调节模块作为幼体和生殖能力的标记。GydF4y2Ba

嫁接是一种古老的技术，广泛用于农业作物改良。它是两个兼容的植物通过一个植物的芽或枝条(接穗)和另一个植物的根(砧木)结合在一起的过程。在像鳄梨这样的果树中，嫁接提供了一种双植物系统来提高果园的生产力。通常，高产优质的接穗被嫁接到抗逆性更好的砧木上。在这种双株制中，还选择砧木，通过控制幼苗的活力和提高接穗的产量来提高果园效率。增加早熟是嫁接的另一个好处，因为从成熟树木上取下的接穗明显比从种子上生长的树木更早结实和成熟。为了获得更快的投资回报，许多幼龄较长的树木作物被嫁接种植。GydF4y2Ba

嫁接的成功需要接合处的充分愈合，以允许生物分子信号和营养物质在根和茎之间运输，这是维持两个器官生长和存活的必要系统。这包括光合产物(碳)、离子、水、营养物质、激素和蛋白质/氨基酸在韧皮部和木质部维管中的运输。在木质部中，从根到茎的信号传递是单向的，而双向的信号传递可以通过韧皮部进行，韧皮部由特化的维管束组成，通过胞间连丝(气孔)连接。最近，这些孔被证明有助于调节分子(包括蛋白质/RNA)的长距离信号传递[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba异种移植物显示，超过100个mRNA转录本可能穿过移植物结合[GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]．这种信使rna的移动既可以从根到根，也可以从根到茎[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]．这种现象也在多年生植物葡萄藤中观察到[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．除了mRNA转录本，嫁接实验还显示了小RNA (smrna)分子通过韧皮部到达特定组织的流动性[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba]．在这些smrna中，microrna (mirna)被证明参与了接穗/砧木信号调节生物和非生物因子，如干旱胁迫和块茎[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

miRNA是20-24核苷酸（NT）长，非编码RNA分子，通过靶向用于降解的特定基因转录物来负化基因活性。有趣的是，已知涉及青少年成人相转变，miR156和miR172的关键植物miRNA被证明是在马铃薯中传播的移植物[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．miR156和miR172的序列活性通过下调多年生植物和一年生植物的成员介导了从幼年到成年的转变GydF4y2BaSQUAMOSA启动子结合蛋白样(SPL)GydF4y2Ba和GydF4y2BaAPETALA2-likeGydF4y2Ba转录因子基因家族，分别[GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba14.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba]．MiR156的过度表达导致开花的延迟，而MiR172过表达导致相反的表型。在青少年植物中，MiR156非常丰富，间接抑制miR172，而成熟的树木具有低miR156水平和高miR172水平。我们之前已经表明，此模型在鳄梨中对MiR156和MiR172丰度保持了真实[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

有研究认为，来自叶片的移动信号调节植物的相位变化，包括miR156的抑制[GydF4y2Ba18.GydF4y2Ba]．落叶的实验GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和GydF4y2Ba烟草benthamianaGydF4y2Ba导致幼期延长，miR156水平升高。糖信号可以被认为是这种移动调节的潜在候选人[GydF4y2Ba19.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]．最近，已经提出了海藻糖-6-磷酸酯（T6P）调节拍摄顶端分类和叶子中的开花[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．更远，GydF4y2BaTrehalose-6-Phosphate合酶1GydF4y2Ba（GydF4y2BaTPS1GydF4y2Ba），调节碳水化合物可用性的T6P途径中的关键酶，在Florigen的上游功能GydF4y2BaFT.GydF4y2Ba在叶的年龄依赖性开花途径中[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

用于嫁接的牛油果砧木可以通过种子或从成熟树木上扦插的无性系繁殖获得。在克隆砧木的情况下，这种材料被认为是生理成熟的，因为它来自成熟的树木切割和生根诱导。同时，幼苗在生理上是不成熟的。GydF4y2Ba

由于嫁接在幼苗或克隆砧木上被广泛用于商业繁殖，我们质疑这些砧木生理成熟度的假设差异是否反映在这些mirna的丰度上。考虑到miR156和miR172在其他物种中的嫁接可传性，我们也质疑砧木来源是否会影响嫁接后接穗中的miRNA水平及其靶基因。在牛油果中，如果条件有利，嫁接树木通常在种植后的下一季开始开花，而不管砧木。这说明接穗成熟度决定了嫁接植株的成熟度。然而，也有人认为，无性系牛油果砧木可能比幼苗砧木更早开花和结果，因为它们来自成熟的组织，但这还没有正式研究[GydF4y2Ba23.GydF4y2Ba]．在这项研究中，我们假设成熟接穗的成体性状信号克服了与幼苗砧木相关的任何潜在的年轻因子，从而产生的嫁接植株表现得像处于生殖阶段的植株。miR156和miR172的丰度在幼苗和砧木之间存在显著差异，但这对成熟芽苗木接穗的mirna和靶基因丰度影响有限。相反，我们揭示了在这种木本作物中，接穗主要负责成熟miR156和miR172的丰度，因此接穗的成熟反映了这些mirna的局部丰度。然而，我们确实发现了一些长距离信号的证据，这些信号可能涉及移植物连接下方的叶片，调控碳水化合物制造基因GydF4y2BaTPS1GydF4y2Ba这些microrna。GydF4y2Ba

为了量化幼苗与无性系砧木中相变化相关mirna (miR156和miR172)的丰度，并检测鳄梨中任何可能的根-茎信号，设计了嫁接实验。短句来源为了研究接穗与砧木成熟度对嫁接牛油果接穗中成熟microRNA和基因表达的相对影响，研究了接穗与砧木成熟度对牛油果接穗中成熟microRNA和基因表达的影响。GydF4y2Ba

评估前成熟度GydF4y2Ba

我们之前已经证明，在鳄梨中，类似于其他物种[GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]，叶片中miR156和miR172的高丰度与植物的幼嫩度显著相关[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．因此，为了预测预嫁接材料的成熟度/阶段，我们对砧木和接穗叶片样品进行了miR156和miR172丰度分析。幼苗砧木的miR156水平显著高于无性系砧木，这与幼苗砧木的较幼态一致。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa)，而miR172呈相反的表达模式(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Bab).此外，这两种mirna在克隆砧木中的表达完全反映了直接从田间树木中获得的成熟的‘Hass’接穗材料(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa, b).这表明牛油果无性系砧木虽然经历了无性系砧木产生过程，但仍然保持了亲本树的分子成熟度。GydF4y2Ba

为了进一步探索这一假设，我们对miR156和miR172推测的靶基因的表达进行了分析。预测miR156靶点的丰度水平，GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba，与miR156呈负相关，在无性系砧木和芽接枝中最高，与miR172呈负相关。GydF4y2Ba1GydF4y2Baa、c)。GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba已知的促进植物向生殖成熟的过渡，至少部分通过激活各种花的身份基因[GydF4y2Ba25.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba26.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba27.GydF4y2Ba]．miR172对miR156具有拮抗作用，被认为是通过抑制开花的正调控因子GydF4y2BaAP2喜欢GydF4y2Ba花抑制基因[GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba28.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．转录本丰度GydF4y2BaAP2GydF4y2Ba同源物，GydF4y2BaPARAP2.7B.GydF4y2Ba，与miR172呈负相关，且在幼苗砧木和接穗中相对于无性系砧木和芽接穗高表达(图。GydF4y2Ba1GydF4y2BaB, d)，与它作为花抑制因子假定的作用一致[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba31.GydF4y2Ba]．综上所述，幼体和开花标记的表达数据表明，鳄梨幼苗砧木和接穗处于幼体期，克隆砧木和芽接木处于成体或生殖期。GydF4y2Ba

嫁接后：鳄梨的移植信号和成熟度GydF4y2Ba

为了确定砧木成熟度和miRNA表达对嫁接后接穗的可能影响，在嫁接后3个月和6个月，从嫁接植株的接穗上取最年轻的完全展开的叶片，然后对成熟的miR156进行图谱分析(图1)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba), miR172(无花果。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）及其推定的靶基因（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba在嫁接后3个月，miR156的丰度似乎受接穗的控制(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa). Budwood接穗在下一个花期开花，保持了其较低的miR156丰度，而未开花的幼苗接穗则表现出较高的miR156表达量。这一趋势在6个月的样本中保持相似，然而在这种情况下，结果因样本之间缺乏显著性而混淆了——尽管嫁接到无性系砧木上时，幼苗接穗中的miR156减少到百叶木水平，但与幼苗/幼苗嫁接相比，这一减少并不显著。GydF4y2Ba

然后,我们描述GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba看miR156表达模式能否转化为靶效应。在这里，研究结果再次表明接穗主要起支配作用GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba转录本丰度，如miR156(图。GydF4y2Ba2GydF4y2BaC）。GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba嫁接后3个月转录本丰度与miR156丰度呈较强的负相关，其中芽接木接穗转录本丰度高，幼苗接穗转录本丰度低(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Bac)然而，与miR156不同的是，在移植后6个月，GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba表达是显着的依赖性的。这表明了局部监管的可能性GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba独立于直接miR156依赖的年龄通路。GydF4y2Ba

有趣的是，在接枝后3个月嫁接到苗木与克隆砧木的豆芽区间隙之间的miR172表达差异。移植到幼苗砧座上的芽汁具有类似地低miR172表达模式，因为围绕幼苗和克隆砧木接枝的幼苗间隙。另一方面，嫁接在克隆砧木上的奖杯显着高的miR172（GydF4y2BaP.GydF4y2Ba< 0.05)。在嫁接植株上观察到miR172较低的表达，这表明砧木也可能在决定嫁接植株miR172水平和潜在命运中发挥作用(图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab）。然而，这种效果在接枝后缺席6个月，其中嫁接在幼苗和克隆砧座上的斗伍德均具有相似的表达模式（图。GydF4y2Ba2GydF4y2Bab).一般而言，表示模式GydF4y2BaPARAP2.7B.GydF4y2Ba与miR172水平相关，并受砧木类型的影响。GydF4y2Ba2GydF4y2Bad）。GydF4y2Ba

我们还分析了额外推定的miR156目标基因，GydF4y2BaPaSPL9a PaSPL9b,GydF4y2Ba哪些是假定的同系物GydF4y2BaSPL9.GydF4y2Ba（鳄梨有两个副本GydF4y2BaSPL9.GydF4y2Ba)，以及GydF4y2BaPaAP2GydF4y2Ba和GydF4y2Baparap2.7a.GydF4y2Ba，这是推定的miR172目标。然而，根据嫁接材料的成熟，这些转录物没有观察到明确的模式（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba图S1和S2)，这与我们之前的研究结果一致，表明这些转录本可能不参与叶片的成熟途径[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．这种观察可能表明缺乏mir156-GydF4y2BaSPL9.GydF4y2Ba和mir172-GydF4y2BaAP2-LikeGydF4y2Ba嫁接鳄梨叶片的转录调节模块。这些观察基于mRNA转录丰度，不排除miR156和miR172分别对SPL9和ap2样蛋白进行翻译/翻译后调控的可能性。另一个可能的脱节可能是这些基因的调控独立于各自的mirna调节模块。GydF4y2Ba

采集嫁接植株的嫁接成功率、树高和开花数据。成熟的芽接枝嫁接到幼苗和无性系砧木上的嫁接成功率超过80%(商业实践)。使用育苗接穗时嫁接成功率较低GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。无性系砧木比实生砧木高(平均高度(cm)值与标准差(SD):百叶接穗/幼苗根茎= 46.5 cm±4.7，幼苗接穗/幼苗根茎= 43.5 cm±7.8，百叶接穗/无性系根茎= 92.8 cm±6.6，幼苗接穗/无性系根茎= 88.6 cm±9.6GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S2)。开花数据与miRNA/target基因表达模式在成熟度方面相关，芽接木接穗在接枝后的下一个季节开花。另一方面，幼苗接穗在两个砧木上都不开花GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S2)。GydF4y2Ba

作为穿过移植交叉点的信号传导的潜在来源GydF4y2Ba

在商业上，为了获得更高的嫁接成功率，在嫁接过程中通常不去除无性系砧木上的叶子，因为它们被认为是嫁接愈合的能量来源。与此同时，由于带叶的生长茎尖被切除，导致幼苗砧木无叶，推测接枝愈合是由种子剩余能量促进的。由于叶片的存在是无性系砧木和幼苗砧木之间的主要区别，我们假设叶片不仅有助于嫁接健康，而且有助于嫁接信号的传递。因此，为了检查叶片是否对克隆嫁接中明显的嫁接间信号传导有影响，我们设计了一个独立的实验，将' Hass ' budwood嫁接到' Velvick '克隆砧木上，两组;一组叶片留在砧木上(叶片' WL '嫁接)，另一组叶片从砧木上去除(叶片' WOL '嫁接)。然后，我们在移植后3个月在两种移植组合的接穗中分析miR156和miR172。我们还分析了GydF4y2BaPaTPS1GydF4y2Ba，表明植物中碳水化合物的可利用性[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba，作为可能来自砧木的碳水化合物转移到接穗的标记。GydF4y2Ba

与行业技术相一致，带叶嫁接的嫁接成功率在80%以上，而无性系砧木在嫁接前取叶的嫁接成功率在30%以下(附文件)GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S1)。此外，与我们的假设相一致的是，与以上B/C嫁接相比，叶片导致了更高的miR172水平，与摘除叶片的嫁接相比，有叶片嫁接的接穗中观察到的miR172丰度显著更高(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Baa). miR156丰度观察到相反的趋势，从砧木上摘除叶片的嫁接植株中，miR156丰度显著更高(图2)。GydF4y2Ba3.GydF4y2Bab).同样，对于miR172，GydF4y2BaPaTPS1GydF4y2Ba在未去除砧木叶片的嫁接中，接穗中丰度较高。GydF4y2Ba3.GydF4y2BaC，D）。这表明叶片在鳄梨中的MiR156，MiR172的接枝中叶片中的可能作用，并且可能涉及移动糖。GydF4y2Ba

接枝被广泛用作园艺树中繁殖的优选方法，其将所需的温度与合适的砧木品种相结合以改善生产率结果。在鳄梨中，幼苗材料包括从成熟树木的成熟树木收集的奖金，而砧木可以衍生自种子或成熟的树木切割。虽然生产更难以生产，但是使用根的切屑提供了这些侧面交叉物种的砧木的遗传均匀性。GydF4y2Ba

现场观察表明，嫁接的一个主要好处是减少了嫁接树的幼期，导致早期生产力。然而，嫁接材料成熟度对嫁接树成熟度的相对影响及其分子机制尚不清楚。我们之前已经证明了与mirna miR156、miR172和miR156靶基因相转变相关的mirnaGydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba，可可靠地用于区分鳄梨幼树/材料和成树/材料[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]．在马铃薯中已有miR156和miR172的移植物传递信号的报道[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．这使得这些miRNA理想的候选人探索植物源自幼苗或成熟切割的砧木显示出不同的分子成熟度剖面，以及如果这可能对ChIOS成熟度概况有任何影响。在这里，我们使用分子策略来研究使用幼苗和切割砧木的接枝和接枝后鳄梨树的成熟度。GydF4y2Ba

一般来说，两个月大的牛油果幼苗可以作为砧木进行嫁接。另一方面，克隆砧木的制备需要使用一种专门的技术，以诱导从成熟树的扦插/芽接木上生根。但是，这些无性系砧木经过生根过程后，是否能保持与源树相同的成熟水平尚不清楚。GydF4y2Ba

使用mir156-GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba/miR172模型的幼嫩和相变，在这里，我们检查了嫁接前材料的成熟度水平，除了嫁接植株在典型商业供应时间。牛油果幼苗、接穗和砧木与成熟树的芽接木相比表现出幼年miRNA谱:幼苗miR156丰度高，芽接木材料miR156丰度低，其下游靶标反之GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba和miR172。这与之前对鳄梨的研究结果一致[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba和其他作物[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba在那里，类似的分子图谱与幼植物和成虫有关。我们进一步观察到，牛油果无性系砧木的miRNA谱与budwood材料相似，miR156和miR172丰度低，与它们的靶转录本呈负相关(GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba和GydF4y2Baparap2.7a.GydF4y2Ba)(图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.这与这些基因在其他物种中的作用一致，并表明即使这些无性系砧木经受了强烈的生根过程，它们仍然保持了源树的成熟水平。GydF4y2Ba

此前已有研究表明，miR156和miR172是马铃薯嫁接传递mirna [GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba]．这里的问题是，嫁接树的基因不同部分(接穗和砧木)是否可以交换与幼体有关的分子信号。为了分析鳄梨嫁接后与成熟相关的mirna，并检测来自不同成熟度砧木的任何可能的嫁接间信号，我们评估了嫁接后样品的miR156和miR172丰度和靶基因效应。与miR156在植物幼态促进中的作用一致[GydF4y2Ba12.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba]，鳄梨幼苗间隙的MiR156丰度仍然明显大于嫁接后3个月的Budwood Scens。此外，在miR156和其预测的靶基因之间观察到抗相关关联GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba在3个月。嫁接后6个月，嫁接在克隆砧木植物上的幼苗间隙的成熟MiR156丰度降低到蒲团水平，表明砧木效应。然而，这种减少相对于幼苗移植物的幼苗并不重要，因此无法确认鹿砧木对幼苗下行Mir156水平的显着效果。同样，对于蒲蛋德伍德，既不是mir156也不是GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba受砧木成熟度的影响(幼苗vs克隆)。因此，尽管miR156和GydF4y2BaPaspl4.GydF4y2Ba两种砧木类型之间的丰度预接枝，似乎没有显着传播这种状态的植物。此外，与功能均匀的mir156-一致GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba鳄梨的监管模块，MiR156的水平和GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba通常是封环的，虽然这少于透明6个月后接枝，MIR156表达下降。这可能表明了可能性GydF4y2BaSPL4.GydF4y2Ba根据观察到的鳄梨中依赖于MIR156依赖年龄调节途径的规定GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba在哪里GydF4y2BaSPL3/4/5GydF4y2Ba独立于mir156依赖的年龄通路调控[GydF4y2Ba22.GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

商业繁殖的牛油果植株，包括budwood接穗嫁接在幼苗或克隆砧木上，观察到在大田种植后的非常下一季获得开花能力。然而，据我们所知，这一现象尚未在文献中得到量化。用成熟的接穗嫁接在接枝后的下一个花期开花。与此同时，不管砧木是什么，用幼苗接穗嫁接都不开花。这与现场观察和分子数据一致，表明主要是接穗控制的幼体相关基因上面讨论。GydF4y2Ba

尽管如此，在这里，我们在至少一个接枝组合和时间点的鳄梨中对MiR156和MiR172的接枝调节提供了一些有限的证据。在嫁接后3个月，德伍德分区的MiR172的表达受砧木的影响，水平降低到为幼苗接枝的幼苗平分区观察到幼苗砧木的幼苗。这可以提供从幼苗砧木移动到成熟的温度的MiR172的可能阻遏物的证据，或者从克隆砧木移动的miR172的启动子。给出负调节器的明显候选者是移动MiR156，或MiR156调节的信号，给定MiR156是MiR172的间接负调节器GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba和其他植物[GydF4y2Ba13.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba15.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba24.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba32.GydF4y2Ba]．然而，我们没有发现嫁接在幼苗砧木上的芽苗木接穗中miR156丰度增加的证据。GydF4y2Ba2GydF4y2Baa).最终，嫁接后6个月，芽苗木接穗的miR172水平在幼苗和无性系嫁接之间是相等的。这表明，尽管接穗可能存在早期嫁接传递效应，但接穗中的miRNA水平在很大程度上取决于接穗材料。GydF4y2Ba

在商业苗圃环境中，叶片通常留在克隆砧木上，因为这些叶片被认为是嫁接成功的关键。幼苗砧木缺乏叶片，但他们仍然从子叶的能量储存，认为有助于嫁接采取。一般来说，叶片参与植物的多向长距离信号传递;朝向根和顶端分生组织[GydF4y2Ba33.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba35.GydF4y2Ba]．分子因子从叶向顶端分生组织的运动已经确定[GydF4y2Ba34.GydF4y2Ba]．我们假设克隆砧木上的叶片的存在可能是一个与成熟度无关的分化因素，影响砧木依赖的基因在接穗中的表达。在这里，我们揭示了克隆砧木的叶片去除确实影响了接穗中miR156和miR172的丰度(图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.叶片是植物的动力源，是产生能量和光合产物的主要来源。为了进一步研究植物的碳水化合物可用性是否可能在这种情况下起作用，我们对碳水化合物可用性标记进行了分析GydF4y2BaTPS1GydF4y2Ba(T6P途径中的关键酶)，已知与miR156上游的年龄依赖性开花途径相互作用[GydF4y2Ba21.GydF4y2Ba]．我们展示了这一点GydF4y2BaPaTPS1GydF4y2Ba中隙叶中的转录物在从砧木中除去叶片的移植物中减少（图。GydF4y2Ba4.GydF4y2Bab）。这表明在移植联合会下方的叶片有助于这些物种中的中隙中的糖信号传导。通过这种方式，去除叶片可能会影响碳水化合物可用性对支持商业行业实践的植物来保留叶子以增加移植物成功。从我们的观察结果中，我们手中的移植成功的观察结果进一步明显，移植物中的成功小于30％的叶子从砧木中除去叶子。GydF4y2Ba

综上所述，嫁接树的成熟程度主要受接穗的控制。然而，我们为miR156和miR172的移植物传递调控提供了一些证据，这可能涉及移植物连接下方的叶片。我们的发现与嫁接树成熟度的工业观察相一致，并首次开始解释其潜在的分子机制。这些信息将有助于更好地了解园艺树木嫁接、嫁接成功和繁殖的瓶颈，接穗和砧木材料的类型在很大程度上影响繁殖成功和操作成本。GydF4y2Ba

植物材料与嫁接GydF4y2Ba

鳄梨的简历。“哈斯”和简历。“Velvick”种子和繁殖材料由Anderson Horticulture Pty Ltd.提供，并在位于澳大利亚新南威尔士州Duranbah的Anderson苗圃中种植。所有鳄梨嫁接试验均在Anderson Horticulture Pty Ltd.苗圃进行(获得适当许可)。砧木和接穗分别育成2月龄左右的品种‘Velvick’和‘Hass’。' Velvick '无性系砧木是用恩斯特，1999年修改的Frolich方法制备的[GydF4y2Ba36.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba37.GydF4y2Ba[和Anderson园艺的商业练习，从成年树收集成人树木的Hass'成熟的苏相属（Budwood）。楔形移植物（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Baa)采用4种可能的组合，12株(接穗/砧木)。GydF4y2Ba5.GydF4y2BaB.-e): 1) budwood ‘Hass’/seedling ‘Velvick’, 2) budwood ‘Hass’/clonal ‘Velvick’, 3) seedling ‘Hass’/seedling ‘Velvick’, and 4) seedling ‘Hass’/clonal ‘Velvick’. Leaf samples were collected immediately pre-grafting and at 3 months and 6 months post-grafting. Another independent experiment was designed to determine the effect of clonal rootstock leaves on inter-graft signalling. Here budwood ‘Hass’ was grafted on ‘Velvick’ clonal rootstocks in two groups of 12 plants; 1) ‘With Leaves (WL)’ - where leaves were left on the rootstock as per conventional practice, 2) ‘Without Leaves (WOL)’ - where leaves were removed from the rootstock (Fig.5.GydF4y2Baf, g)。移植后3个月采集用于表达分析的叶片。在所有情况下，最年轻的完全展开的叶子被取样，直接放在干冰上，并存储在-80°C的冰箱中。GydF4y2Ba

RNA提取GydF4y2Ba

叶片组织在液氮下研磨成细粉，使用MasterPure Plant RNA纯化试剂盒(Epicentre, USA)提取总RNA。使用纳米滴ND-1000分光光度计对RNA进行定量，并用1% TAE琼脂糖凝胶进行质量评估。对于miRNA的定量，使用miScript Plant RT Kit (Qiagen，荷兰)，利用500 ng总RNA进行低分子量cDNA合成(定量成熟miRNA)。为了进行基因定量，使用SensiFAST™cDNA Synthesis Kit (Bioline, Australia)用600 ng总RNA合成高分子量cDNA。GydF4y2Ba

定量实时聚合酶链反应GydF4y2Ba

miRNA量化GydF4y2Ba

使用miScript SYBR®Green PCR Kit(使用miScript Plant RT Kit制备的cDNA) (QIAGEN，荷兰)对每个生物复制进行重复的qRT-PCR反应。mirna的引物序列(miR156和miR172)和管家转录本(U6 [GydF4y2Ba38.GydF4y2Ba， 5.8S rRNA [GydF4y2Ba39.GydF4y2Ba]）在附加文件中显示GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S3。反应在roto - gene Q 6000 (Qiagen, The Netherlands)上进行，并使用roto - gene Q 2.3.1.49软件(Qiagen, The Netherlands)进行可视化。GydF4y2Ba

基因量化GydF4y2Ba

引物序列来自我们最近的手稿[GydF4y2Ba17.GydF4y2Ba]用于基因量化（附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba:表S3)使用SensiFAST™SYBR®No-ROX试剂盒(bio - oline，澳大利亚)在BioRad CFX384 Touch™Real-Time PCR检测系统(Bio-Rad，美国)，按照制造商说明，并在CFX Manager™软件(Bio-Rad，美国)上可视化。GydF4y2Ba

对于所有qPCR运行，PCR效率使用LinReg PCR 7.5版本(阿姆斯特丹大学，荷兰)计算。然后对这些数据进行进一步分析和评估，以确定miRNA和基因的相对丰度，使用公式:GydF4y2Ba

如果PE是引物效率，并且CT是每次反应的循环阈值。为了检查数据的统计学意义，使用SPSS版本23（IBM，USA）使用Tukey校正（Hoc多个比较测试进行比较方式的HOC多个比较测试）进行单向分析（ANOVA）。使用GraphPad Prism 6（GraphPad Software Inc.）用标准误差绘制miRNA和基因相对表达的平均值。GydF4y2Ba

在当前的研究中使用和/或分析的数据集可从通信作者在合理的要求。GydF4y2Ba

microrna的:GydF4y2Ba

microRNA.GydF4y2Ba

QRT-PCR：GydF4y2Ba

实时定量聚合酶链反应GydF4y2Ba

SPLGydF4y2Ba：GydF4y2Ba

Squamosa启动子结合蛋白样GydF4y2Ba

WL：GydF4y2Ba

用树叶GydF4y2Ba

WOL：GydF4y2Ba

没有叶子GydF4y2Ba

我们感谢Anderson Horticulture Pty Ltd. (Duranbah, NSW, Australia)为开展这项工作提供的材料、技术和后勤支持。GydF4y2Ba

该项目由农业和渔业部(DAF;澳大利亚昆士兰大学和新南威尔士州第一产业部(新南威尔士州，澳大利亚)作为由澳大利亚Horticulture Innovation Australia Limited (Hort Innovation)共同资助的“矮树高产计划”的一部分，该计划使用了跨园艺税和DAF的自愿捐款，以及澳大利亚政府通过Horticulture Innovation项目“改造热带/亚热带树木作物”提供的匹配资金生产力”。GydF4y2Ba

资金组织提供了财政支持，并没有参与对数据的实验，收集，解释或分析的实验，收集，解释或分析或稿件的起草。GydF4y2Ba

从属关系GydF4y2Ba

1. 昆士兰农业和食品创新，昆士兰大学，圣卢西亚，布里斯班，昆士兰州，4072，澳大利亚GydF4y2Ba

   Muhammad Umair Ahsan, Alice Hayward, Mobashwer Alam, Jayeni Hiti Bandaralage, Bruce Topp和Neena MitterGydF4y2Ba

2. 昆士兰大学生物科学学院，圣卢西亚，布里斯班，昆士兰州，4072，澳大利亚GydF4y2Ba

   克里斯汀·安妮·贝弗里奇GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

M.U.A.，A.H.和N.M.构思和设计了这项研究。m.u.a.和A.H.进行的现场/玻璃室实验。m.u.a.进行所有实验室实验。m.u.a.和J.B.收集的表型数据。m.u.a.分析，解释和执行实验数据的统计数据。m.u.a. and A.H. wrote the manuscript. M.A., B.T., C.B. and N.M., provided technical feedback and edited the manuscript. All the authors approved the final manuscript.

相应的作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2Ba作为米特GydF4y2Ba。GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

我们声明，我们获得了使用该植物材料和进行本研究实验的许可。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放访问GydF4y2Ba本文根据创意公约署署署的条款分发了4.0国际许可证（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba)，它允许在任何媒体上无限制地使用、分发和复制，前提是你给予原作者和来源适当的荣誉，提供一个到知识共享许可协议的链接，并指出是否作出了更改。创作共用及公共领域专用豁免书(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba)适用于本条提供的数据，除非另有说明。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba