解析玉米基因组中的同义突变:同接受突变在密码子共发生偏差的区域更有优势

背景

同义突变不会改变氨基酸，但有时会改变解码特定密码子的TRNA（反摩托斯）。一种异形密码子是共享相同TRNA的同义密码子。如果突变的密码子可以与与原始相同的反逆转录相同的副，则突变被称为异裂菌突变。一个有趣但不太研究的密码子偏见是密码子共发生偏差。在基因组中聚类了isoAccepting密码子存在趋势。密码子共生偏差的提出的优势是从核糖体E位点释放的TRNA可以快速再充电，随后解码以下异征性密码子。这一优势会提高翻译效率。在植物物种中，是否尚未研究Codon共同发生的区域中的异释孔突变的阳性选择的信号。

结果

利用玉米中公开的RNA-seq数据，我们将编码区域的多态突变称为(玉米）.接下来，我们根据上下文将所有同义突变分为三类，即焦点密码子和前端密码子之间的关系，如下所示：isoaccepting，nonisoaccepting和非同义词。我们观察到在等接受环境中较高的等接受突变比例。如果我们查看了次要等位基因频率（MAF）光谱，则异裂化突变具有比其他地区的异常上下文更高的MAF，因此，非吸收突变在非侵入上下文中具有更高的MAF。

结论

我们的研究结果表明，在存在密码子共现偏差的区域，自然选择通过抑制非等接受突变维持了这种模式。然而，如果连续的密码子是非等接受的，突变倾向于将这些密码子转换为等接受的。我们的研究表明，玉米基因组中的密码子共现偏差是通过自然选择选择性地维持的，这一趋势的优势可能是快速充电和重用tRNAs，以提高翻译效率。

同义突变是CDS中不改变氨基酸(AA)序列的突变。然而，由于不同的tRNA(或反密码子)可能携带相同的AA，因此AA不变并不一定保证tRNA(反密码子)不变。用“同接受密码子”这个术语来解决这种混淆情况。等接受密码子是具有相同tRNA(显然带有相同AA)和不同密码子的同义密码子[1，2)(表1）.同样，术语“非异接受同义密码子”表示编码相同AA但从不共享相同tRNA(反密码子)的密码子。如果一个突变密码子的碱基对与原密码子具有相同的反密码子，则该突变被定义为等位接受突变(图。1相反，非等接受同义突变不会改变编码AA，但会导致不同的解码tRNA(图1)。1a).值得注意的是，根据定义，非同义突变也是一种非等接受突变，因为它改变了对tRNA的解码(图1)。1a).然而，为了避免潜在的歧义，在本研究中，非等接受突变仅指改变tRNA的同义突变。

密码子偏差通常是指基因组的同义密码子的不平等使用，这是专门称为密码子使用偏差（幼崽）[3.]．幼兽在所有生物体中普遍存在，而选择作用于同义突变已被广泛揭示[4，5]．CUB的生物学意义可能是其对mRNA翻译伸长过程的影响[6，7，8，9]．虽然翻译延伸率的主要决定因素仍有争议[10.，11.，12.，13.，14.，15.，16.，17.]通常接受优化/有利的密码子通常比不利的那些翻译。快速平移密码子的这种优点在快速细胞生长/划分期间特别有用[18.]．

另一种较少研究的密码子偏压是密码子共发生偏差。发现基因内的密码子发生的顺序被偏置。在酵母中，通过相同类型的TRNA识别的同义密码子倾向于在编码区域中聚集[1]．这些密码子可以是相同的密码子，也可以是等接受的密码子。1b).这种共现偏差的优点是tRNAs可以快速回收。这些trna被转译核糖体附近的氨基酰trna合成酶充电，并迅速重复使用，以解码下列同受体密码子[1] （图。1c). tRNAs的可及性是影响翻译延伸速度的重要因素。trna的快速充电和再利用对局部翻译效率有积极的影响。

在细菌和酵母中验证了密码子序列的非随机分布。然而，在植物界，研究最广泛的密码子偏倚类型是密码子使用偏倚(CUB) [19.，20.，21.，22.]．对密码子共现偏倚的系统和多物种研究还很缺乏。重要的是，“共现同接受密码子”的优点是可以快速充电和重用tRNA。如果这一假设成立，我们应该在密码子共现区观察到更多的同接受突变而不是非同接受突变。这些区域的非等接受突变将会阻止trna的快速循环，因为突变后的密码子不再等接受。

我们在玉米中测试了我们的假设（玉米)基因组。我们利用公开的RNA-seq数据提取了玉米编码区域的多态突变。然后，我们根据环境，即焦点密码子与前一个密码子的关系，将所有同义突变分为三类:等接受型、非等接受型和非同义型。我们观察到在等接受环境中较高的等接受突变比例。如果我们观察小等位基因频率(MAF)谱，等接受突变在等接受环境中比其他区域有更高的MAF。因此，非等接受突变在非等接受环境中具有较高的MAF。

我们的研究结果表明，在包含同接受密码子的区域，自然选择通过抑制这些区域的非同接受突变来维持这种同接受模式。然而，如果连续密码子本身是非等接受的(但同义的)，这些区域的突变也倾向于非等接受的(但同义的)。这种变异偏倚似乎将这些非异接受密码子转换(或固定)为异接受密码子。

在基因组 - 范围内，我们系统地表征了玉米中的密码子共生偏差。密码子共发生偏压被自然选择选择性地青睐和维持。这种共同发生偏差的优点是促进TRNA的快速再充电和重用以提高翻译效率。我们建议，不同类型的密码子偏置（密码子使用偏差和密码子共生）的生物学意义可能导致翻译伸长过程的微调。鉴于密码子共生偏差可能有助于mRNA翻译，并且在快速细胞生长期间高翻译效率是有利的[18.]我们提出了这种模式是否普遍存在植物物种中的问题。

我们的工作从进化生物学的角度深化了对植物中的密码子共生偏见的理解，并且可以提供新颖的观点来帮助解决与Angiosperm Evolutive相关的谜语。

称之为玉米CDS中的多态突变

利用玉米根中公开的RNA-seq数据(方法）.我们将RNA-seq序列映射到参考CDS序列，称之为变体。只有水平在0.02 ~ 0.98之间的变异位点被认为是候选多态性位点(方法）.我们在玉米CD中获得了24,323个多态性突变位点（附加文件1:图S1)。注意，这些网站不包括在相同密码子或连续密码子中进行的那些突变（方法）.CD中的突变可能具有不同的功能后果，例如不改变氨基酸（AAS），改变AAS或诱导止锁密码子，使得我们需要将CD中的这些多态性突变分类为不同的类别。即使同义突变不改变AA，也可能改变与密码子对的TRNA（丙氨酸密码子的示例在附加文件中给出1:图S2)。

定义突变类型

如果密码子发生突变，结果只能是(1)等接受、(2)非等接受、(3)非同义或(4)无意义。等接受突变和非等接受突变属于同义范畴。因此，我们根据突变后密码子与突变前密码子的关系对所有检测到的多态突变进行了分类(图。2和方法）.在24323个多态突变中，9423个为同义突变(6964个为等接受突变，2459个为非等接受突变)，14511个为非同义突变，389个为无义突变(附加文件)1:图S1)。接下来，我们计算了RNA-seq数据检测到的次要等位基因频率(MAF) (方法）.简而言之，如果一个突变的水平是x > 0.5，那么MAF应该是1-x。只考虑了双等位基因位置。

对非同义和无义突变的净化选择

基于我们提到的不同类型的突变数量（附加文件1:图S1)，我们发现RNA-seq数据检测到的MAF谱呈无义<非同义<同义的模式(表1)2)，表明抑制无意义和非同义突变。事实上，这些模式并不新颖，因为该理论已经确立，可以想象，大多数非同义或无意义的突变都是不适应的。然而，对我们来说，展示这个结果是很重要的，以证明我们的数据和方法是可靠和有效的。

根据密码子背景解析突变

鉴于我们检测到的多晶型同义突变，我们的下一步是根据密码子背景对这些突变进行分类。例如，服用玉米基因组，我们获得了39,254个独特的编码基因。这些39,254个独特的CDS总共包含13,958,446个密码子。如果我们看一下这13,958,446密码子之间的焦点密码子和上游密码子（即，环境/上下文）之间的关系，则为334,757是isoAccepting，903,994是非缺陷的，并且12,680,441是非同义的（附加文件1:图S1)。我们打算根据上下文信息对所有多态同义位点(9423个突变)进行分类。然而，如果一个焦点密码子的上下文有多态性(相对较少)，密码子本身不被考虑。

对同接受突变或非同接受突变的选择是区域依赖的:同接受突变在同接受延伸中更受青睐

将同义突变进一步分为异抗性和非吸收性突变。我们会假设非同义词或非本文突变的有害影响是“情境独立”，因为在他们发生的任何地方，他们会导致AA变化（非同义词）或引入过早的止锁密码子（无意义突变）。相比之下，如背景中所述，ISoAccepting延伸（密码子共发生）由于TRNA的快速再充电和再利用，因此在这些密码子共同发生的区域中进行时，仅仅是有利的，因此仅是有利的。邻近密码子之间的关系。换句话说，isoAccepting或非侵入性突变是有利的，也不是“依赖的”或“上下文依赖”。

根据上下文，我们已经将多态性同义网站分为三类。我们计算了每个区域中的所有同义突变（ISO％）的异裂菌突变的分数（图。3.）.我们可以看到，isoacceptcontext中的iso%显著高于非isoacceptcontext中的iso%，而非同义context中的iso%处于中间水平(图3)。3.）.

这些观察结果可以解释如下:等接受突变在等接受的环境中更受青睐，非等接受突变在非等接受的环境中更受青睐，而在其他环境中，如非同义环境中，所有同义突变(异或非等接受)都同样受青睐。

频谱进一步支持在等接受环境中等接受突变的优势

我们从RNA-seq数据分析了多态突变的MAF谱(方法）.我们提到，RNA-seq数据检测到的MAF表现出无义<非同义<同义突变的模式(表2），建议我们的数据和方法可以可靠地检测选择模式。

对于不同密码子背景下的多态同义位点，我们分析了这些区域中异接受或非异接受突变的MAF(图)。4）.有趣的是，同接受突变的MAF谱在同接受环境中明显高于其他环境(图)。4）.同样，非等接受突变的MAF在非等接受环境中显著高于其他环境(图。4）.这是有力的证据，支持在同接受环境中的同接受突变被积极选择。同样的理论适用于非等接受环境中的非等接受突变。

当排除CpG区域时，模式是健壮的

存在潜在的偏倚(或混杂因素)，使得CpG区域的突变谱可能不同。因此，我们需要确保我们的观测不是由这些CpG区域的性质引起的。我们计算了这些基因组中A、C、G、T和CpG的碱基含量。CpG被定义为基因组中的一种CG二核苷酸。我们发现，观察到的CpG含量高于预期的CpG频率(附加文件1:图S3)。我们丢弃了CG二核苷酸的突变(附加文件)1:图S3)。如果我们只使用非cpg区域的突变，该模式是稳健的:(1)等接受突变在等接受环境中更受青睐，而非等接受突变在非等接受环境中更受青睐(附加文件1：图S3）和（2）频谱还支持ISoAccepting上下文中的IsoAccepting突变的优势（附加文件1:图S3)。

在全基因组水平上，我们系统地描述了玉米密码子共现偏倚。有趣的是，在分数比较(图。3.)，我们观察到在同接受环境中同接受突变的比例(iso%)高于在非同接受环境中。然而，要对阳性/阴性选择进行正式测试，我们必须对频谱进行比较。

本研究的局限性在于，我们使用RNA-seq而不是DNA-seq数据来执行变异调用。一方面，频谱(表2）证明了变体部位可靠。另一方面，我们进行了联系不平衡（LD）分析以证明变异位点可能是DNA突变位点而不是RNA水平改变或测序误差。根据两个突变位点之间计算LD的协议[23.)(附加文件1:图S4)，我们计算了成对的R²任何一对突变位点之间的值，可通过单个RNA-SEQ读取可检测到的（方法）.我们发现，大多数的成对R²从RNA-seq数据计算的值是强的(中值= 1，附加文件1：图S4）。自从更大的r²表示较强的联系，只有DNA突变而不是测序误差可能具有如此强烈的联系，我们的结果表明，从RNA-SEQ数据调用的变体部位可能是真实的DNA突变。

在这项研究中，我们揭示了基因组中的密码子共生发生偏差被自然选择选择性地青睐和维持。这种共同发生偏差的优点可能是TRNA的快速再充电和重用，以提高翻译伸长率的效率。由TRNA的更快再充电引起的升高的适应性导致更有效的解码和更快的翻译伸长率。尽管确定蛋白质丰度的关键因素是翻译开始而不是伸长率的过程，但翻译伸长速度的柔性微调也可能是有利的并且受到自然选择的影响。有趣的是，已经确定了密码子使用偏差（幼崽）的生物学意义正在调制当地翻译伸长率[6，7，8，9]．如果我们考虑密码子共出现偏差，这些不同类型的密码子偏差的目的都导致了翻译延伸过程的微调。可能不同的同义密码子之间的切换最初是为了稍微调节翻译过程而设计的。

我们工作的另一个潜在限制是，突变不仅会影响翻译伸长的速率，还会影响转录伸长的速率、剪接效率、mRNA内的定位和长距离分子内碱基配对，以及dna -组蛋白的相互作用，从而影响基因组结构。虽然在这个阶段很难确定任何一个突变对这些“其他方面”的影响程度，但重要的是要指出，我们观察到的后果很可能是多种因素综合作用的混合物。如果有定量测量突变对这些“其他方面”的影响，那么可以进行多元回归分析，以解析多个因素对观察模式的相对贡献。例如拟合的简化线性模型Y～X₁+X₂+……+X_n在哪里Y = the observed biases in the mutation pattern andX₁，X₂， ...X_n代表翻译伸长率、转录伸长率、剪接效率、mRNA分子内碱基对、dna -组蛋白相互作用等因素，可以定量地确定回归效率，从而确定多个因素的相对贡献。

此外，虽然等接受密码子可以接受相同的tRNA，但密码子-反密码子相互作用的动力学可能会影响实际观察到的非等接受突变。这可能是下一个层次的分析。尽管作为快速充电概念的一个方面，这可能与保持高效翻译延伸有关，但它也可能受到与转录、剪接、分子内mRNA碱基对和基因组结构相同的潜在影响，如上所述。同样值得注意的是，翻译延伸率并不总是对所有基因最优的，这就是为什么创建了CAI(密码子适应指数)或tAI (tAI适应指数)等术语来衡量这方面[24.，25.]．如果快速充电实际上发生在体内,从而促进有效的翻译对于许多基因,这可能并非如此,甚至也不是理想的,对所有基因翻译伸长的速度可能是意味着,在某些情况下是这样一个手段,调节蛋白表达。所有基因的表达可能不是为有效的翻译伸长而优化的，这可能是观察到非等接受突变的程度的原因。

在iso - /非iso环境中，iso - /非iso接受突变是否处于平衡状态，或者一方是否比另一方更频繁地被破坏，这仍然是一个未解决的问题。如果有从不同世代收集到的种群基因组数据，就可以调查在一个iso - /非isoacceptcontext中，iso - /非isoacceptcontext中的变异比例是否在世代中持续变化，或者在特定时间点之后是否稳定下来。这将有助于更好地理解不同基因组区域的突变动态。

总之，我们的工作从进化生物学的角度加深了对植物中的密码子共生偏差的理解，并且可以提供新颖的视角，帮助解决与高管培养的进化相关的谜语。

通过对四种植物基因组中多态突变和固定突变的研究，我们发现在同接受密码子共现的区域，自然选择试图通过抑制非同接受突变来维持这种共现模式。然而，如果连续的同义密码子是非等接受的，这些区域的突变往往是非等接受的，因此试图将这些非等接受的密码子转换为等接受的。我们的研究结果支持了tRNA快速充电和再利用的模型。这种等位突变的不均匀分布似乎是自然选择的遗留物。

数据收集

玉米的CDS序列的路径是(也参见附加文件1：图S1）：ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/release-43/plants/fasta/zea_mays/cds/．TRNA数据玉米从基因组tRNA数据库（GTRNADB）下载。RNA-SEQ数据的SRR ID是：玉米(五个库,SRR8560815-SRR8560819)。所有的SRR样品都是从植物的根中进行测序的。

对RNA-seq数据进行处理，推断CDS的多态性位点

由于我们不在乎非编码区中的突变，因此参考CDS序列和深序列的RNA-SEQ数据足以称为编码区中的多态变体。我们映射了RNA-SEQ阅读玉米CDS序列使用Bowtie2（版本2.2）[26.]．考虑到同一基因的不同亚型所引起的多重mapping reads，只选择每个基因中最长的CDS。我们将使用SAMtools(版本1.5)的变量称为带有默认参数的“mpileup”[27.]．为避免测序错误(RNA-seq中频率较低)导致的假阳性变异，只有水平在0.02 - 0.98之间的变异位点被视为候选多态突变。如果在同一密码子或连续密码子内发生多个突变，这些病例不包括在以下分析中。这一过滤步骤的原因是，在下面的分析中，我们根据其密码子上下文对突变进行分类。接下来我们定义了每个位点的小等位基因频率(MAF)。如果一个突变的水平是x > 0.5，那么MAF = 1-x。只包括双等位基因位点。在我们分析的RNA-seq数据中，不同类型突变的中位水平约为0.2~0.3(基于参考基因组);即使在计算MAF时，中值也只是略有下降。

等接受密码子的定义

一个密码子可以与一个到多个(最多三个)不同的反密码子配对，一个反密码子可以与一个到多个(最多三个)不同的密码子配对[24.]．对于给定的密码子，其同接受密码子是能够与相同反密码子(tRNA)配对的同义密码子[2]．表中列出了59个意义密码子(不包括ATG、TGG和3个终止密码子)的所有可能的同接受密码子列表1．在不同的生物体中，由于某些在物种中不存在于某些TrNAS（抗ododons），ISoAccepting密码子的组可能略有不同。丙氨酸密码子之间的ISoAccepting关系的示例在附加文件中显示1:图S2。

异接受突变和非异接受突变的定义

同受体突变是指那些不改变密码子的解码反密码子(tRNA)的突变(图)。1a).非等接受突变是指改变密码子的解码反密码子(tRNA)的突变。在本研究中，非等接受突变仅指改变tRNA解码的同义突变。

密码子上下文的定义

两个连续密码子之间的关系可以是(1)等接受、(2)非等接受但同义或(3)非同义。定义iso/nonisoaccept / non同义上下文的管道如下:我们提取了CDS中的所有多态同义突变。排除多态邻近位点。重点密码子与前一个密码子的关系决定了上下文类型(环境类型)。

从测序数据计算连锁不平衡(LD)

假设基因座1和2是两个突变位点。在RNA-SEQ数据中，总共有N个读取可以涵盖两个站点（附加文件1:图S4)， N = RR + RM + MR + MM，其中R为参考等位基因，M为突变。例如，RM是检测位点1上的参考等位基因和检测位点2上的替代等位基因的reads数量。接下来,P1 = (RR + RM) / N, Q1 = +先生(毫米)/ N, p = (RR +先生)/ N, Q2 = (RM +毫米)/ N,等计算LD参数D D = (RR - RM * *毫米)先生/ N²．最后，计算R的平方值为R²= D²/ (P1 Q1 * P2 * *)。更大的R²表示链接更强。R²范围从0到1。在附加文件1图S4，我们给出了Zm00001d031523_T001基因13个突变位点的配对连锁图。图中显示了这些突变位点的位置。对R的全局分布²显示为箱图(附加文件1：图S4）。

统计分析和代码可用性

所有的统计分析(相关检验、Fisher精确检验)和图形工作均在R环境下进行(http://www.r-project.org/）.本研究中使用的代码可根据要求提供。

支持本文结论的数据集可从NCBI或Ensembl网站获得(如方法部分)。

蔡:

密码子适应指数

CD：

编码序列

宝宝:

密码子使用的偏见

信使rna:

信使核糖核酸

大:

tRNA适应指数

tRNA:

转移核糖核酸

我们感谢Wei Lab的所有成员，以其对此项目的建设性建议。我们还感谢Wiley编辑服务进行语言编辑。

资金：该研究得到了中国国家自然科学基金的财务支持（授予第31770213）。该资助者在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或准备稿件。

从属关系

1. 中国北京市海淀区新街口外大街19号北京师范大学生命科学学院

   段初，赖伟

贡献

LW设计并指导了这项研究。DC和LW都对数据进行了分析。LW定义了本研究中所用植物之间的系统发育关系。DC和LW写了这篇文章。所有作者均已阅读并批准本稿件。

相应的作者

对应到魏莱．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

出版商的注意

施普林格《自然》杂志对已出版的地图和机构附属机构的管辖权要求保持中立。

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