EMS诱变小麦群体的建立、鉴定及耐盐小麦品系的鉴定GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

小麦GydF4y2Ba（小麦）是世界上最古老的作物之一，并且已被用于> 8000年作为北非，西亚和欧洲的食物作物。今天，小麦是人类最重要的粮食来源之一，在大地区的地区栽培，而不是任何其他作物。随着人口的增加，土壤盐度变得更加普遍，对小麦育种者的压力增加了耐盐品种，以满足对产量和籽粒质量的日益增长的需求。在这里，我们开发了使用中度耐盐的孟加拉国品种Bari GOM-25的突变小麦群，具有进一步提高耐盐性的主要目标。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

在测定最佳EMS浓度后，用1% EMS处理约3万粒种子，1676个单株株系前四代均存活。大部分诱变株系表现出与BARI gm -25相似的表型，但在视觉上有差异，如植株矮化、植株巨型、开花早、晚、叶片形态改变等。通过建立耐盐试验和筛选突变群体，我们鉴定出70个耐盐性增强的品系。所选品系在200 mM NaCl滤纸上的发芽率为70%，而BARI Gom-25的发芽率为0-30%。对2个耐盐OlsAro品系(OA42和OA70)的基因组DNA进行了15倍测序。通过对BARI gom25基因组序列的比较分析，共发现683,201 (OA42)和768,954 (OA70) SNPs分布于三个亚基因组(A、B和D)，突变频率约为每20,000 bp 1个。所有70个耐盐品系都在实验室和孟加拉国盐碱地条件下进行了根系生长试验。结果表明，所有耐盐品系的耐盐表型均优于BARI gm -25和其他地方小麦品种。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

这里开发的小麦突变人口将在新的耐盐品种的开发为盐水养殖效益的宝贵资源。GydF4y2Ba

小麦是世界上最重要的作物，2018年期间收获了735万公吨（GydF4y2Bawww.fao.org.GydF4y2Ba）.只有玉米产量更高，约为10亿吨。种植小麦是为了其高产和营养价值，特别是蛋白质、碳水化合物、纤维、脂肪、矿物质和b族维生素[GydF4y2Ba1GydF4y2Ba]。它也是世界范围内使用的意大利面、饼干、面包和糖果等主食的主要成分，占食品工业以谷物为基础的总产量的21% [GydF4y2Ba1GydF4y2Ba那GydF4y2Ba2GydF4y2Ba]。直到2017年，小麦产量每年都在稳步增长，预计2018年的产量将达到7.57亿公吨。然而，2018年小麦总产量首次未能实现此前预测的增长，主要是由于气候问题(GydF4y2Bawww.fao.org.GydF4y2Ba）.人口持续增长，城市稳步增长并向农村地区扩张，而耕地面积由于城市化和土壤破坏而减少。为了满足全球需求，小麦产量需要在未来40年内提高70% (GydF4y2Bawww.fao.org.GydF4y2Ba） [GydF4y2Ba2GydF4y2Ba那GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

盐度是影响全世界作物植物的主要非生物压力源之一。由于高盐度，世界耕地的六个占世界耕地和20％的灌溉耕地的20％不再用于作物培养。此外，据估计，由于盐污染，每天都会损失2000公顷的耕地[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

盐胁迫严重损害作物产量，因为高盐浓度强烈抑制种子萌发和营养生长[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]过量的盐水平会导致细胞内离子失衡，导致不同程度的氧化应激[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]。离子不平衡是钠过量摄取的结果GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba和ClGydF4y2Ba^-GydF4y2Ba离子通过根部，从而导致这些离子中毒水平的积累。这反过来又导致减少人体必需的矿物质营养素例如像K.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba和CaGydF4y2Ba^+GydF4y2Ba，对植物生长有负面影响[GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba]。另外，作为盐胁迫特别是抑制显影植物组织，光合作用是由于受损叶发育减小，从而导致更厚和更小的叶[GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba11.GydF4y2Ba]。盐分的另一个负面影响是当土壤中的盐分浓度超过根细胞内的水平时，就会发生干旱胁迫，这导致由于渗透作用从根细胞中抽走水分。另一方面，将生长中的植物暴露在亚致死盐浓度下，会增加它们对更严重盐胁迫的耐受性，这一现象被称为驯化。在驯化过程中，植物对多个胁迫响应基因进行了差异调控，导致不同组织对钠离子的适应GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba和ClGydF4y2Ba^-GydF4y2Ba，以及其他离子。一种调节机制是细胞质中相容溶质的积累;这些阻碍了在液泡中积聚的有害离子进入细胞质[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba那GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]。大多数差分调节的盐应激反应基因是上调的，但还存在下调基因的实例[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]几种植物激素，如生长素、油菜素类固醇、赤霉素、细胞分裂素和脱落酸参与了对不同非生物胁迫的反应，包括盐胁迫[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba那GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]。盐生植物，即通过限制根离子吸收而能够在高盐土壤中生长和生存的植物，在耐盐性研究中一直是无价的资源[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

在孟加拉国，根据测量区域和时间的不同，地下水含盐量在1至10 d /m之间[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]。地下水盐度高的一个主要原因是潮汐水道，因为这个水道中的水是微咸的，是孟加拉湾的海水和暴雨时期的淡水的混合物。因此，在雨季(6月至10月)的潮汐洪水的严重程度将直接反映在旱季的盐渍土壤中[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba]。因此，由于土壤中的过度盐浓度，在干燥的季节（11月至5月）中，土地的大面积仍然存在。据估计，沿海地区约有100万公顷的土地受盐影响到不同程度的影响[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba那GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba]。理想情况下，在稍微凉爽的冬季，可以在这些区域种植耐盐小麦。GydF4y2Ba

要开发具有特殊特性的小麦品种，如更高的营养价值或更高的非生物耐受性，对这些过程的更深入的分子理解和当前小麦群体中更高水平的变异将是一个优势。在过去的几十年里，人们做了一些努力来开发耐盐小麦品种，但只有有限的成功。此外，耐盐的分子机制仍远未被理解[GydF4y2Ba21GydF4y2Ba]。在以前的研究中，主要使用了两种分子遗传方法:标记辅助育种(MAS)和转基因育种[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]。MAS的使用是有利的，因为群体中的特定性状可以更快地靶向并培育成比使用常规表型选择方法可以实现更高的精度和更精确的精度[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]。理想情况下，应为那些产生所需表型的EMS突变开发MAS标记。这将允许在不同的精英小麦品种中有效地交叉，同时消除交叉中使用的所选择的突变线中的非有益突变。GydF4y2Ba

在这里，我们开发了孟加拉国小麦品种的EMS诱变群体，其是含有三种基因组（AABBDD）的六倍面包小麦品种，每种染色体为七种染色体。Bari Gom-25于2010年发布，它是半矮人，早熟和高收益率。它具有1000粒重量为54-58克，作物持续时间为102-110天，植物高度为95-100厘米，穗起始时间为57-61天。此外，它被分类为盐（〜8-10ds / m）和热量的适度耐受。EMS诱变导致随机点突变主要以G / C的形式到A / T横向。突变将发生在非编码和编码区中。突变可以导致基因表达的上调或下调，通过引入氨基酸变化，止扰密码子或更少帧移位突变来改变mRNA稳定性或蛋白质结构的变化[GydF4y2Ba24GydF4y2Ba]。EMS诱变已成功应用于几种作物，例如燕麦[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba],大麦[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba)、玉米(GydF4y2Ba27GydF4y2Ba，小麦[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba，如Sikora等人所总结的，[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]。通过在大量的种子群体中诱导高频率的突变，并通过大量自交来稳定突变，可以发展出突变系。这样的群体既可以筛选所需的表型，例如耐盐性，也可以直接筛选相关基因的突变。我们利用诱变的BARI gm -25群体筛选和鉴定了70个耐盐水平高到足以使其在200 mM NaCl下发芽的单系。最终，这些品系可以发展成耐盐品种，可以在盐碱地种植。这不仅会带来经济优势，因为孟加拉国等国家可以增加额外的增长期[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba，但这类作物也可以重新利用和修复盐碱地，以推动更可持续的农业。GydF4y2Ba

发展突变小麦人口GydF4y2Ba

为了确定在不杀死由于化合物的毒性导致的未杀死所有种子的最高突变率所需的EMS的量，建立了EMS滴定曲线（图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.在滴定中，EMS的浓度在0 ~ 1.8%之间。从每个处理中，种植200颗种子。基于之前使用六倍体燕麦的研究[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba的目标是发芽成活率约为20%。在小麦系统中，我们发现1% EMS是最优的(图2)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.因为我们的目标是让整个种群的所有基因都发生突变，所以我们使用了3万粒种子作为EMS治疗的起始材料。从这些种子中，大约有6000个种子在M1代萌发。每个株系均播种1粒M1种子，存活2852个不同株系，收获M2种子(图2)。GydF4y2Ba2GydF4y2Ba）.这些株系继续繁殖至第四代，至今仍有1676个株系。从该群体中鉴定出耐盐品系(图。GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba）.由于无菌性，未经生存的线损失，未经许可，未发芽，轴不被填充，对各种疾病的敏感性增加，植物死亡，未能开发新种子等。GydF4y2Ba

巴里Gom-25耐盐性的确认GydF4y2Ba

为了证实BARI GOM-25，的耐盐性以及滴定，以便将小麦突变体群体内的更强烈识别耐盐线的最佳盐浓度，初始测试用使用三种不同的盐BARI GOM-25进行和一系列不同盐浓度（图GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.This showed that at ca 100 mM (approximately 10 dS/m) BARI Gom-25 had a germination rate of 80% with KCl and MgCl_2GydF4y2Ba和90％的NaCl，证实BARI-GOM-25（图11的适中的耐盐性。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.在增加的盐浓度下，发芽率下降，200mM（约20ds / m），萌发率降至NaCl的30％，均为KCl和MgCl的10％GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba（无花果。GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

筛选突变群以鉴定耐盐性线GydF4y2Ba

基于Bari GOM-25盐测试的结果，我们的目的是鉴定突变线，在200mM NaCl下给出至少70％的萌发。我们决定使用NaCl作为该测试的盐，因为它是土壤中最常见的盐水应激源。除了Bari GOM-25控制之外，筛选了1676个单独的M4生成线。为每个突变线使用10种种子，将它们用浸泡滤纸或琼脂平板孵育它们。从测试的1676条线，在培养皿上发芽的70条线以70％或更高的速率（图。GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba）.然后在温室中进一步繁殖这些线，并在现场上繁殖到当前的M8代。GydF4y2Ba

根茎筛选GydF4y2Ba

从种子萌发袋测定的根和芽用尺子测量并计算平均值（图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba)然后将70个选定的诱变品系作为一组进行平均，并与BARI Gom-25作为一组进行比较。这更好地代表了三种盐浓度下的平均根和芽发育情况（表1）GydF4y2Ba1GydF4y2Ba和图。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.与BARI gom25对照相比，诱变群体的根长在50 mM和100 mM NaCl处理下显著增加。在150 mM NaCl溶液中也可以观察到同样的趋势(图2)。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.At 50 mM the average root length in the 70 mutants was 28.13 (±11.39) cm compared to 21.36 (±10.14) cm for BARI Gom-25, at 100 mM it was 16.57 (±9.49) cm compared to 11.77 (±8.78) cm, and at 150 mM it was 8.77 (±6.62) cm compared to 6.39 (±6.12) cm for BARI Gom-25 (Table1GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.70诱变处理线还显示更好的射击发展在所有三个盐浓度、平均拍摄长度在50毫米4.29(±2.23)厘米的氯化钠比巴里Gom-25 3.60(±1.65)厘米,在100毫米氯化钠2.28(±1.74)厘米1.78(±1.69)厘米相比,在150毫米氯化钠1.14(±1.21)厘米比0.77(±0.79)厘米巴里Gom-25(表GydF4y2Ba1GydF4y2Ba,无花果。GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）.最后，测定了三种不同盐分条件下单株总平均根系发育(cm)。这些数据表明，在70个突变品系中，有51个品系的根系发育(以根长和根数衡量)优于BARI gom25。GydF4y2Ba

现场试验GydF4y2Ba

在孟加拉国南部盐碱地进行了田间试验，对在发芽筛和根系试验中鉴定的70个诱变品系进行了试验。作为对照，使用BARI gom25。试验了两个不同的种子批次，一个是由诱变后的BARI gom25植物在瑞典繁殖产生的，另一个是在孟加拉国繁殖的BARI gom25种子批次。这样做是为了评估由于以前的种子适应而在播种时可能存在的种子质量差异。所有种子都是在2017年12月初播种的。以南北向行播方式播种，70个株系大部分播种99粒。这70个株系的每个种子批次被分成3个重复，在大田的几个地点播种，以消除当地土壤差异对每个株系性能的影响(图)。GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba）.来自瑞典和孟加拉国的控制Bari GOM-25种子在70条诱变的线条中随机播种，以避免在比较性能时局部效应。实验开始时的盐度约为7.2ds / m。GydF4y2Ba

2018年1月，记录了所有线条的发芽率，显然所有70条诱变线都比两种不同的控制Bari GOM-25线萌发。诱变线的萌发率范围为54.55至90.91％，而Bari GOM-25孟加拉国种子具有46.62％，而Bari GOM-25瑞典种子具有15.15％。此外，经过两周的生长后，将70条诱变线在植物高度的位置排名，顶部诱变线，显示平均高度为20.75厘米，而Bari GOM-25（孟加拉国）植物的平均高度只有5.51厘米和Bari GOM-25（瑞典）植物的平均高度为15.24厘米，并在68处排名。在增长的最终阶段，土壤盐度水平达到约9.8ds / m。然后，Bari GOM-25（孟加拉国和瑞典）的平均植物高度分别为63.50厘米和60.95，而最佳突变线达到71.12厘米，36条诱变线的高度大于或等于Bari的高度GOM-25。还确定了萌发的种子总量的总粒重。这表明，与Bari GOM-25相比，最佳诱变的线产生了2.17克/发芽的种子，其中1.87克/发芽种子（瑞典种子）和1.12克/发芽的种子（孟加拉国种子）。Bari Gom-25（瑞典）从所有99种播种的所有99种种子产生了28克总粒重。在70个诱变线中只有5个具有较低的值，可能是由于真菌和/或昆虫感染。 All lines from the mutagenized populations were found to be in the top category for single grain weight, germination rate and both combined. The controls were both found as outliers in the PCA plot.

此外，测量参数，如分蘖量，每分蘖小穗，小穗的长度，内核每穗，真菌感染和昆虫侵袭，以及在这里再次应对相比BARI GOM-25与生理盐水条件更好诱变群体。当在PCA分析所有这些参数组合，观察到，而BARI GOM-25控制群集在一起诱变系是离群值（图GydF4y2Ba9.GydF4y2Ba）.To select lines for further analysis and breeding purposes, a cut-off was applied for each parameter: germination rate of at least 60%, harvested tillers/germinated seed being at least 1, spike length over 2.54 cm, a minimum of 30 kernels per spike, less than 30% fungal infection, below 20% insect infestation, and minimum 1 in production per germinated seed. Based on these strict cut-off values, 17 OA-lines were retained for future analysis. Note that BARI Gom-25 did not meet the cut-off criteria.

DNA制备GydF4y2Ba

根据孟加拉国的发芽数据和田间结果，选择了两个诱变品系OA70和OA42。从这些品系和对照品种BARI gom25中提取基因组DNA (gDNA)。由于目的是分离高分子量DNA，因此采用了基于ctab的方案。PFGE获得分子量约为50 ~ 90 kb的gDNA。高分子量gDNA在使用读码长度超过10 kb的第三代测序时是重要的，因为它改善了像小麦那样的复杂基因组的组装[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba]。gDNA从OA70和OA42中提取一份，从BARI gom25中提取一份，并由瑞典国家基因组研究所(NGI)进行测序。对OA70、OA42和Gom24进行全基因组测序，共获得长度为151 bp的阅读序列4216.87万个，每个基因组的阅读序列分别为74722、100105和1142.1万bp。测序得到的reads质量良好，所有样本中大约89%的reads高于Q30%截断值。GydF4y2Ba

读取的映射GydF4y2Ba

Bari GOM-25，OA70和OA42的读对数分别为747.03,478.75和430.43亿读数。修剪的Bari GOM-25，OA70和OA42读数与使用Bowtie2的中国春小麦参考基因组对齐。修剪和消除未映射和多映射读数后两个突变样本的读数的总数分别为370.63和334.23百万读数。对准统计显示，98.67,98.3和97.52％的成对末端读数分别映射到野生型，OA70和OA42的参考基因组。GydF4y2Ba

EMS诱导SNP.GydF4y2Ba

对巴里GOM-25，OA70和OA42的SNP呼吁中国春小麦参考基因组。除去两个突变体和巴里GOM-25共常见的SNP，因此我们可以假设两个突变样本中的剩余SNP是与Bari GOM-25相比的EMS衍生突变。在过滤后，基于SAMTOOLS，分别为OA70和OA42鉴定了总共622,449和597,699个SNP。类似地，过滤使用FreeBayes称为SNP，分别为OA70和OA42发现了总共768,954和683,201。在OA70中的基础变化中，82％的转变，18％是横向。表中列出了使用SAMTOOLS和FreeBayes确定的过渡和横向的数量GydF4y2Ba2GydF4y2Ba.最频繁的转换（图。GydF4y2Ba10.GydF4y2Ba）观察到的是G-> A（220536），C-> T（227030），T-> C（81548）和A-> G（83720）。横向（图。GydF4y2Ba10AGydF4y2Ba）由C-> A（19003），G-> T（19037），A-> C（18810），T-> G（19006），G-> C（16774），C-> G（16967）组成，T-> A（12201）和A-> T（12272）。GydF4y2Ba

类似地，对于分别的oA42,84.6和15.4％，观察到过渡和横向（图。GydF4y2Ba10B.GydF4y2Ba）.过渡类型的频率顺序如下：G-> A（228122），C-> T（206493），A-> G（64847），T-> C（62467）。在横向中，顺序是G-> T（14200），C-> A（14581），A-> C（14205），T-> G（14385），G-> C（12942），C-> G (12789), T- > A (9873), A- > T (9936) (Fig.10B.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

与Bari GOM-25参考基因组相比，OA70表现出比OA42更大的序列变化。OA70的基因组 - 范围突变率为每18,918个碱基的一个变化，而OA42中的每21,292个碱是每21,292个碱的一个变化。在三个亚基因组中，A，B和D，观察到D基因组在突变线中具有最低数量的突变。OA70中A，B和D基因组的基因组突变率分别为每18,765,15,009和30,513个碱基。在OA42中，A，B和D次基因组的突变率分别是每20,514,18,474和29,521个碱基的一个变化。在三种基因组的7个染色体中，在OA70中，在CHR1a，Chr 2b和Chr 7d中观察到最大数量的SNP（图。GydF4y2Ba11个GydF4y2Ba）.在OA42中，chr 1A、chr 3B和chr 7D的SNPs数量最多(图3)。GydF4y2Ba11 bGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

对这三种可能的功能类型的进一步研究发现，OA70和OA42中分别有59.7%和59.6%的非同义SNPs、2.1%和2.6%的无义SNPs以及38.1%和37.7%的同义SNPs。OA70和OA42的非同义/同义比率均为1.5%。GydF4y2Ba

孟加拉国是气候变化威胁最大的国家之一，同时也是一个贫困国家。预计盐碱化和干旱的情况将会变得更糟。因此，迫切需要找到新的方法来开发能够维持粮食生产和改善粮食安全的植物品种。我们以可持续的方式提高贫瘠土地的生产力，从而提高农业生产率，减少贫困，这是朝着这个方向迈出的一步。我们的目标是通过向发展中国家的小农提供负担得起的种子来实现这一点。GydF4y2Ba

孟加拉国约有30％的可耕地在沿海地区。大约100万公顷（对应于瑞典的耕地区40％）。沿海和海上土地290万公顷受盐度的影响。由于盐度过高，因此土地的大面积仍然是休眠季节（1月至5月）。在沿海地区的盐影响地区的作物产量与非盐水区的盐影响区域不同，随着盐水侵入的一些地区的盐度的增加，正常的作物产量面临风险。在这些领域，低产率和生产水平将影响人们的生计，甚至超过在使用更好的现代农业技术的国家的其他地区。与此同时，沿海地区的粮食需求随着人口不断增长的增加。虽然小麦在沿海腰带具有良好的经济潜力，但需要解决许多技术和生物限制，以便探索其全部潜力。通过利用现代分子植物育种活动来开发具有高耐盐性的小麦线，孟加拉国南部的陆地面积可能会更好地利用患有高盐度的孟加拉国。GydF4y2Ba

小麦杂交育种方法正在不断地对全世界的粮食安全产生影响，这包括解决耐盐问题。联邦科学和工业研究组织(CSIRO)发现了钠排斥基因(Nax1和Nax2)，这些基因已经被引入到各种交叉项目中[GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]。然而，利用低驯化品系基因渐渗培育耐盐品系仍是一个精度较低且耗时较长的过程(约10-15年)。另一方面，另一种方法可以加速这一过程，这种方法基于增加已驯化群体的变异，并在育种程序中使用这些品系作为起点(基因来源)，结合使用分子标记的选择。GydF4y2Ba

通过滴定至最佳EMS浓度（1％，图。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)，利用孟加拉国当地品种BARI gom25开发了一个诱变的小麦群体。之所以选择该品种，是因为该品种在本项目开始时(至今仍是)是最耐盐的孟加拉国本地品种，除耐热外，还被归类为中等耐盐(~ 8-10 dS/m) [GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]。用1% EMS溶液处理BARI gom25，发芽率降低约80%，M1代的成活率为8.96%。这与为寻找最优突变条件而构建的初始滴定曲线是一致的(图1)。GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.总共2674种M1线，并用于形成诱变线的群体。较大的人口将提供更高的突变总数，但也更难以在逻辑上处理，时间明智，成本明智和技术上。然而，在较小的人口中，突变频率需要足够高，在全群层面，它会在基因组的每个基因中产生突变[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba那GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

由于EMS诱变是随机的，在突变人群每一行都会随身携带一组不同的基因突变。在诱变BARI GOM-25的人口，理论上所有的基因都根据计算出的突变频率进行突变。阿非同义氨基酸取代可以具有对酶活性的作用，和一个基因的突变上游可以，例如，影响的调节区，修饰基因表达，或解除管制微RNA。这意味着所有可能的特征是在群体中理论上存在，并且在稍后的时间，他们也可通过特定的交叉使用用于特定突变体品系特定EMS突变的分子标记，以确保部分同源基因敲除的“叠加”设计。By designing a germination assay for high-salt tolerance (200 mM, corresponding to ca 20 dS/m) and by screening a population of 1676 different unique lines in the M4 generation, we identified 70 salt-tolerant lines with germination rates of at least 70% (Fig.5.GydF4y2Ba）.这些线条因此显着优于Bari GOM-25控制。GydF4y2Ba

除萌发试验外，还对70个选育品系在不同NaCl浓度下的根和茎发育进行了进一步分析，因为已有研究表明，根表面积和根毛随NaCl浓度的增加而减少[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]。因此，与BARI Gom-25相比，诱变品系具有更好的维持根长能力，被认为是耐盐性的良好指标。结果表明，诱变品系在50 mM和100 mM NaCl处理下根系明显变长，在150 mM NaCl处理下根系明显变长。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba， 桌子GydF4y2Ba1GydF4y2Ba）.与BARI gom25相比，诱变品系在50 mM和100 mM NaCl处理下的茎叶发育更好，在150 mM处理下显著更好(图2)。GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba， 桌子GydF4y2Ba1GydF4y2Ba).我们没有包括200人 mM，因为我们希望保持在孟加拉国即将进行的实地研究的预期范围内（大约5-15 ds/m，等于50-150 ds/m） 因此，根据进行的实验室研究，选择了70个诱变品系在孟加拉国进行田间试验，在更现实的条件下进行种植，以便将结果与实验室试验结果进行比较。GydF4y2Ba

2017年12月，利用之前选择的70个诱变株系进行了一项田间试验，现在是M7代。选定的地点是孟加拉国南部巴里萨尔帕图卡利地区的卡拉巴拉。这项试验是与荷兰非政府组织跨教会发展合作组织(ICCO)指派的当地农民合作进行的。土壤盐分在播期为7.2 dS/m，收获前为9.8 dS/m。以BARI gom25为对照，在田间47个不同位置播种，每3个重复共99粒种子。那块地用栅栏保护起来，不让动物饲养。首先测定了播种种子的发芽率。结果表明，诱变系的萌发率显著高于BARI gom25对照。由于突变系的种子没有在孟加拉国繁殖过，因此它们不适应当地的条件，这有点出乎意料。这种情况尤其明显，因为BARI本地适应的gom25种子与在瑞典繁殖的种子的比较表明，适应效应是一个主要因素。 The locally adapted BARI Gom-25 seeds had a germination rate of approximately 45%, but for the non-adapted BARI Gom-25 it was only ca 15%. In contrast, the best mutagenized line had a germination rate of more than 90%, despite the negative adaptation effect.

其他几个参数来监测整个生长季节的植物，结果表明，该突变系具有压倒性的优势比对照。例如，33个诱变系产生每穗多个内核，34表明单株分蘖多，以及每对的最佳线发芽的种子的生产几乎两倍相比BARI GOM-25控制（局部适配）。从PCA曲线很明显，BARI GOM-25表现为测试线中的异常值，符合在之前的实验室试验观察。此外，应用截止滤光片时，选择未来的实验最好的线，17线出现在短名单和BARI GOM-25不在其中。这给出了关于突变群体中一般和作为从中开发特别耐盐线起点的将来容量优良指示。GydF4y2Ba

已知多倍体物种的EMS突变频率高于二倍体物种[GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]。在两个EMS诱变小麦品系的DNA序列，突变的71％是G / C至A / T的转变，从而证实该突变检测相对于BARI GOM-25参考预期的EMS处理的类型的．在两个突变线（OA70和OA42）中鉴定了总共768,954和683,201个SNP，它们随机分布在小麦基因组的三个亚基因组（A，B和D）的整个三个亚基因组中。OA70比OA42更多的突变。本研究分析的OA70和OA42系的突变率分别为18,918和21,292个碱基。对于突变线，分别在B和D子基因组中观察到最高和最低数量的突变。据报道，诱变基因组中多态性的多态性数量可以与总体基因组大小进行缩放[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]。在小麦的三个亚基因组中，基因组大小的顺序是B（5.180GB）> A（4.935GB）> D（3.951 GB）[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba]。这也许可以解释为什么两个EMS突变体积累的大多数突变在B基因组，并最少在d基因组。GydF4y2Ba

两种突变株的主要突变是C:G > T:A变化，已知这是由鸟嘌呤残基烷基化引起的。A:T > G:C转变被观察到比其他取代更频繁。以前在小麦中也有类似的观察结果[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba那GydF4y2Ba39GydF4y2Ba]在两个突变系中，G到T（OA70）和C到A（OA42）的颠换数量最多，而T到A的颠换频率最低。低数量的C:G > EMS诱导的突变中的G:C突变早有报道[GydF4y2Ba40GydF4y2Ba那GydF4y2Ba41GydF4y2Ba]。虽然这些非典型突变可以被认为是假阳性，但观察到的情况与其他小麦研究报告的情况一致[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba那GydF4y2Ba38GydF4y2Ba,番茄GydF4y2Ba41GydF4y2Ba),南瓜GydF4y2Ba42GydF4y2Ba[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba，表明这些变化是EMS通过未知的机制产生的。GydF4y2Ba

EMS是诱导基因组(编码区和非编码区)突变的最有效方法之一。非同义SNP会导致蛋白质序列中的氨基酸发生变化，从而在不同程度上影响蛋白质的功能。对于这两种突变体，非同义突变的频率(59%)大于同义突变的频率(38%)。有必要借助生物信息学工具分析非同义突变对蛋白质的影响。虽然同义密码子变化的数量比非同义密码子变化的数量要少，而且这种变化不会导致任何氨基酸的改变，但这些变化会导致mRNA稳定性和核糖体转译率的改变，并有许多其他影响[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

该项目的主要目标是开发用于将盐渍土的系统转化为生产性土壤，以便对抗贫困和饥饿。我们选择孟加拉国作为第一个显示概念证明的国家。孟加拉国人口为1.67亿人，是世界第八最为人口的国家。从适应的本地孟加拉国小麦品种的良好品种Bari GOM-25开始，我们提高了EMS治疗的遗传变异。从突变的Bari GOM-25群体中，我们在M4生成中筛选了1676条线，以增加实验室测定中的耐盐性，并使用萌发测定鉴定具有高耐盐性（20ds / m）的70根。GydF4y2Ba

在冬季(2017/2018)，对这70个株系(M7代)在孟加拉国南部(Barisal)的盐碱地(7-10 dS/m)进行了田间试验。试验结果非常有希望;所有供试品系，包括BARI gom25作为对照，由当地农民进行盲测，70个突变品系在发芽试验中均排在前70位。该计划是在孟加拉国重复和扩大这些田间试验，并在未来引入最优秀的耐盐品系(DUS)测试，以便将来农民可以使用这些品系。GydF4y2Ba

从适合当地的品种开始是有利的，这不仅是出于明显的农业原因，而且因为这样的品种更有可能获得种植者和消费者的接受。然而，这并不排除我们的突变群体可以用来生产耐盐分子标记的可能性;这将是一个非常有价值的育种工具，将极大地便利耐盐性渗入到世界各地的其他小麦品种。这是特定意义时考虑到广泛的立法禁止转基因和基因编辑全世界,这意味着它更有利于从化学突变和任何小麦品种中引入这些经典穿越一旦他们已确定在突变体行进行排序。此外，还可以从群体中选择除耐盐外，还具有蛋白质含量高、抗病原体等品质性状的品系，生产出具有较高市场价值的品系。GydF4y2Ba

植物材料GydF4y2Ba

2012年项目开始时，孟加拉国当地的小麦品种BARI gom25被选中，并从孟加拉国农业研究所(BARI)获得;具有耐热性和中等耐盐性(10ds /m)。在最佳播种条件下，其产量约为3600-4600公斤/公顷，并能抵抗叶锈病和双极叶枯病[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba那GydF4y2Ba45GydF4y2Ba] （GydF4y2Bahttp://dhcrop.bsmrau.net/bari-gom-25/GydF4y2Ba）（GydF4y2Bahttp://wheatatlas.org/country/varieties/BGD/0GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

产生EMS突变群体GydF4y2Ba

采用不同浓度EMS处理BARI gom25种子，并在温室中优化生长条件下生长15天，以验证最佳EMS浓度如前所述[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]。发现1%的EMS杀死了约80%的种子，这是燕麦中引入突变的最大数量。为了产生M1突变群体，大约30000个种子，分为200个种子/管，用1%的EMS处理。然后将每批200个种子种植在10个不同的盆中，每个盆中有20个种子。Pla从EMS处理后存活下来并发芽的种子中收获并脱粒，然后从每个存活的植物中再植一个种子进行进一步繁殖。到第4代时，保留了1676个单独的品系，每个品系具有独特的突变组合，并用于耐盐性筛选。GydF4y2Ba

耐盐性EMS突变线的筛选和鉴定GydF4y2Ba

开发了测定以确定巴里GOM-25的发芽频率和盐水培养基上的突变群的不同线。最初，Bari GOM-25朝向MgCl的敏感性GydF4y2Ba_2GydF4y2Ba，NaCl和KCl通过以50%的间隔测试浓度范围来测定 从0到350毫米 每一种盐是多少毫米。在每次试验中，每行使用五颗种子，并将种子放在浸有5颗种子的滤纸上 特定盐浓度的ml。使用240的光照强度孵育平板 μmol/mGydF4y2Ba^2GydF4y2Ba/s, 18 h light/6 h night photoperiod, at 21 °C. The germination frequency was determined after 7 days and the general appearance of the seedlings documented. Germination was considered to be positive if the seedling had manifested root growth and sprouted the initial stem. For the BARI Gom-25 control, approximately 20% of seeds germinated at 200 mM NaCl. This NaCl concentration was then used to screen the whole mutant population of 1676 wheat lines in the M4 generation. Due to the large number of lines a labor-, time- and cost-efficient screen was applied in order to test all lines within a feasible time. From each line, ten seeds were used and divided between two Petri dishes each containing a filter paper soaked with 5 ml of 200 mM NaCl and as a control two plates (also containing a total of ten seeds) with 0 mM NaCl were used. Germination was evaluated after 7 days as in the initial trial and a germination rate of 70% or higher was considered to indicate strong salt tolerance.

根茎筛选GydF4y2Ba

为了进一步证实耐盐品系的耐盐性增加，利用种子萌发袋(Phyto AB)建立了根系测定。用镊子将种子沿胚面朝下放置在育儿袋的特定位置，将10ml NaCl溶液倒入育儿袋中。试验采用3种不同的NaCl浓度(50 mM、100 mM、150 mM)。每个袋在240 μmol/m光照下垂直放置GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba/s, 22°C, 18 h光周期/6 h暗周期。培养7天，测量根长并记录一般根构型。GydF4y2Ba

田间试验与主成分分析GydF4y2Ba

鉴定的耐盐小麦品系在区域CA1100米的场中生长GydF4y2Ba^2GydF4y2Ba与对照品种BARI gomi -25一起。这片田地是由当地资源农民经营的示范田，由孟加拉国教会间发展合作组织(ICCO合作)监督，作为其国家立法后盐溶液项目的一部分。用动力犁将土地犁至约12-15厘米深，并挖了14条沟渠以有效排水。在试验开始时，对土壤的盐度进行监测，发现盐度在7.2 dS/m左右。随着生长季节的持续和土壤的干燥，盐度增加，在季节末达到约9.6 dS/m。在试验的70个株系中，99粒种子分成3个重复，每重复33粒种子，随机在田间小区播种，南北方向行播。株距10 cm，行距1 m，共26行。在试验中记录的参数包括发芽率、株高和小穗高、粒数、分蘖数、总粒重和每粒萌发种子产量(粒重/总萌发种子)。GydF4y2Ba

主成分分析(PCA)包含以下变量:种子播种总数、发芽总数、发芽率、平均高度(cm)、发芽率、收获分蘖数、分蘖率(收获分蘖/萌发种子*100)、平均小穗长、每穗粒数、真菌侵染百分率、虫蛀百分率、总粒重(g)、然后利用发芽种子的产量来确定记录的不同大田参数中哪一个对耐盐性贡献最大。在分析中，主成分分析的数据输入被组织成一个表示X的矩阵，该矩阵由N和K个维度组成，其中N表示耐盐行(观测值)的数量，K表示野外观测值(变量)的数量。在PCA中，定义了一个主成分，即数据集方差最大的k维空间。模型平面在k维变量空间中的方向由载荷设定，量化了每个原始变量对主分量的贡献。主分量是数据矩阵X的协方差矩阵的特征向量，因此是正交的。与数据最大特征值相关联的特征向量对应于数据中最大变化的方向。GydF4y2Ba

DNA制备GydF4y2Ba

BARI GOM-25和两个突变系，OA70和OA42中，使用用于提取基因组DNA。Five plants from each mutant line were grown for 8 days in darkness at 20 °C, and etiolated seedlings were cut and pooled to produce one sample for each mutant line. The material was ground into fine powder using liquid nitrogen. DNA was extracted using a modified CTAB protocol [46GydF4y2Ba那GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]，将10 ml CTAB缓冲液(Tris-HCl (pH 7.5)， 25 mM EDTA, 1.5 M NaCl, 2% (w/v) CTAB, 0.3% (v/v) β-硫醇)加入1 g细粉叶料中，在65℃下每10分钟轻轻搅拌40分钟。样品在20°C下(不冷却转子以避免CTAB沉淀)，以5000 g离心5分钟，收集上清液。上清液中加入同体积的氯仿:异戊醇24:1,20℃，5000 g离心5 min。取上清到新管中，加入5 μl RNase (10 mg/ml)， 37℃孵育15 min，偶尔旋转。加入等量的氯仿:异戊醇24:1，在20℃下离心5min, 5000g，缓慢转移上清到新的管中。先加入半体积的5m NaCl，搅拌后加入三体积95% EtOH，冷却至- 20°C，在- 20°C孵育1 h。收集样品并在5000g纺丝10 min。用5ml 76%乙醇，200mm钠- ac洗涤颗粒15min，然后用76%乙醇，10mm NH洗涤GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba-Ac 5分钟，最后75% EtOH 2分钟。在每个洗涤步骤后，样品在5000g纺丝5min。球团在室温风干15 min后，在500 μl 50 mM Tris缓冲液中5℃重悬过夜。次日以最快速度离心，将含有dna的上清转移到新鲜管中，在−4℃下保存，直到需要时使用。GydF4y2Ba

DNA质量控制GydF4y2Ba

使用Qubit荧光计(Fisher Scientific)测定DNA浓度，使用NanoDrop (Thermo Scientific)确认纯度。脉冲场凝胶电泳根据电荷和大小验证DNA长度[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]。GydF4y2Ba

DNA测序和数据处理GydF4y2Ba

使用Illumina公司的TruSeq无pcr文库制备试剂盒构建文库，插入尺寸为350 bp，读取长度为151 bp。来自BARI野生型gom25和两个OlsAro品系OA42和OA70的3个样本在瑞典sciilifelab Illumina HiSeq X测序机上进行配对测序，共获得11.6271亿个碱基对。在BARI gom25、OA70和OA42样品中分别发现了6、5.6和6.1%的潜在PCR重复。为确保测序质量，所有序列均进行了质量控制检查，如确定产量、序列读取质量和交叉样本污染等。使用FastQC检测序列的质量[GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]。根据sciliiflab的标准程序，在分析之前，对reads中的适配器序列进行修剪。GydF4y2Ba

读取参考基因组的对齐GydF4y2Ba

最近注释的中国春季小麦基因组[GydF4y2Ba50.GydF4y2Ba]从Ensembl Plants (IWGSC RefSeq v1.0)下载，用作读数对齐的参考。Bowtie2(版本2.3.3.1)[GydF4y2Ba51.GydF4y2Ba]使用选项“非常敏感”，然后用其从BARI GOM-25，OA70和OA42 Illumina的数据对齐到中国春参考基因组。比对使用SAMtools V.1.3.1 [处理GydF4y2Ba52.GydF4y2Ba]。由于基因组的复杂性，为了消除与多个位点对齐的reads，随后使用SAMtools选项删除了多重映射和未映射的reads。使用SAMtools flagstat进一步验证了是否成功删除了多映射和未映射读。进一步的处理包括将序列比对图(Sequence Alignment Map, SAM)转换为二进制比对图(Binary Alignment Map, BAM)格式，排序(基于坐标)，子选择比对质量为> 30的reads，并合并不同测序道生成的每个突变副本的BAM文件。使用SAMtools flagstat命令获取三个基因组的映射统计信息。GydF4y2Ba

SNP打电话GydF4y2Ba

两种不同的调用者，SAMtools和FreeBayes，被用来识别snp。SAMtools中的mpileup命令用于在Picard工具(版本2.1.1)删除重复项后从已排序的BAM文件中检测snp (GydF4y2Bahttps://broadinstitute.github.io/picard/GydF4y2Ba)和参数-u(生成BCF输出)-E(用于扩展碱基比对质量，以提高短碱基比对的敏感性)-C 50(用于调整作图质量)-BCF(生成BCF格式的基因型可能性)和-f(用于参考中国春小麦基因组)。使用BCFtools call命令调用snp。FreeBayes使用参数-C 2(最小交替计数)，−F 0.050(最小交替分数)-q 20(最小基本质量)-p(多倍体水平)运行。使用BCFtools和VCFtools v.0.1.13筛选snp [GydF4y2Ba53.GydF4y2Ba]基于总深度（DP> 5）和质量分数（质量> 20）。GydF4y2Ba

支持本研究结果的数据可在合理的请求时从相应的作者获得。GydF4y2Ba

BAM：GydF4y2Ba

二元对齐映射GydF4y2Ba

巴里：GydF4y2Ba

孟加拉国农业研究所GydF4y2Ba

EMS:GydF4y2Ba

乙显示出GydF4y2Ba

ICCO合作，孟加拉国：GydF4y2Ba

跨教会发展合作组织GydF4y2Ba

主成分分析:GydF4y2Ba

主要成分分析GydF4y2Ba

山姆：GydF4y2Ba

序列比对图GydF4y2Ba

作者要感谢CropTailor AB在创造突变种群时提供的非常重要的支持，感谢OlsAro作物生物技术AB、SciLifeLab、非政府组织孟加拉国教会间发展合作组织(ICCO)的Arun Ganguly和Masud Rana在田间试验方面的帮助，和Henrik Aronsson小组的所有本科生(2013-2019年)进行盐筛选和突变品系的繁殖。GydF4y2Ba

这项工作得到了来自卡尔-特里格斯基金会、阿德尔伯特斯卡奖学金、捐赠基金会奖学金、Kungigiga Och HViFeldtSka Stftern、欧盟InterSRR NSR SalFAR项目和瑞典研究理事会（VR）/瑞典国际开发合作署（SIDA）的资助。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿方面没有任何作用。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 哥德堡大学生物与环境科学系，瑞典哥德堡461号箱，SE-405 30GydF4y2Ba

   Johanna Lethin，同名Hassan＆Henrik AronssonGydF4y2Ba

2. 纯系和应用生物化学，隆德，盒124，SE-221 00，瑞典隆德大学GydF4y2Ba

   Shahriar S. M. Shakil, Nick Sirijovski & Olof OlssonGydF4y2Ba

3. 哥德堡大学海洋科学系，461，SE-405，30，哥德堡，瑞典GydF4y2Ba

   垫子Töpel.GydF4y2Ba

贡献GydF4y2Ba

构思设计实验:JL, SS, SH, NS, MT, OO, HA。进行实验:JL, SS, SH, OO, HA。数据分析:JL, SS, SH, NS, MT, OO, HA。撰写论文:JL, SS, SH, NS, MT, OO, HA。所有作者阅读并批准了最终的手稿。GydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应到GydF4y2BaHenrik AronssonGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

伦理批准和同意参与GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

同意出版物GydF4y2Ba

不适用。GydF4y2Ba

利益争夺GydF4y2Ba

提交人声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

出版商的注意GydF4y2Ba

Springer Nature在发表地图和机构附属机构中的司法管辖权索赔方面仍然是中立的。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文根据知识共享署名4.0国际许可的条款分发(GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/licenses/by/4.0/GydF4y2Ba）如果您向原始作者和源给出适当的信用，则允许在任何介质中进行不受限制的使用，分发和再现，提供指向Creative Commons许可证的链接，并指示是否进行了更改。Creative Commons公共领域奉献豁免（GydF4y2Bahttp://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/GydF4y2Ba）除非另有说明，否则适用于本文中提供的数据。GydF4y2Ba

重印和权限GydF4y2Ba