玫瑰的基因组特征（罗莎对) WRKY家族及RcWRKY41在抗灰霉病中的作用

背景

Wrkys是植物转录因素的主要系列，可在对生物和非生物胁迫的反应中发挥作用;然而，以玫瑰的腕骨般的家庭综合研究（罗莎Sp .)以前从未被执行过。

结果

在本研究中，我们进行了基因组的分析怀疑玫瑰的基因(罗莎对)，包括它们的系统发育关系、基因结构、染色体位置和共线性。通过系统发育分析，我们将56个物种进行了分类RcWRKY基因分为三个亚群。的RcWRKYS在所有7条玫瑰染色体上分布不均匀，一项对它们共线性的研究表明，基因组复制可能在其中发挥了重要作用RcWRKY基因复制。KA / KS分析表明它们主要经历净化选择。葡萄孢菌感染诱导19的表达RcWRKY其中大多数在进化过程中经历了基因复制。这些RcWRKYS可调节玫瑰抵抗b .灰质．基于我们的系统发育和表达分析，RcWRKY41被鉴定为应答b .灰质这是通过病毒诱导的基因沉默来证实的。

结论

本研究为进一步研究玫瑰的功能提供了有益的信息怀疑基因家族。

转录因子在植物的生长、发育、代谢和逆境反应中发挥着重要作用。转录因子通常具有dna结合结构域、反式激活结构域、寡聚位点和核定位信号等结构域。wrky是植物中最重要的转录因子家族之一。这些蛋白都至少具有一个WRKY结构域[1]，这是一个dna结合区域，结合其目的基因启动子区域的W-box (TTGACC/T)序列以调节其表达。此外，WRKY转录因子的c端通常含有锌指结构。在拟南芥蒂利亚纳， WRKY蛋白家族可以分为三个不同的组:组I蛋白包含两个WRKY结构域，组II蛋白只包含一个WRKY结构域。III组蛋白也具有单一的WRKY结构域，但其锌指结构与其他两组蛋白不同[2]．

WRKY转录因子参与植物各种过程的调控，包括生长发育、对非生物胁迫的响应和抗病;例如，AtWRKY45通过赤霉素信号通路参与调控植物叶片衰老[3.]．在水稻(栽培稻），OSWrky53积极调节芸苔类固醇信号，以影响植物建筑[4]．表达ATWRKY22.拟南芥在淹水过程中受到强烈的淹水诱导，其蛋白产物结合到拟南芥的启动子TREHALASE1，以抑制其表达[5]．ATWRKY8.在植物根中高度表达，在盐胁迫下显著上调atwrky8对盐更敏感的敲除突变体[6]．Wrkys也是植物抵抗病原体的关键球员;例如，ATWRKY33由MAPK信号通路激活，并调节植物植物蛋白的生物合成，以增强拟南芥的病原体抗性[7]．相比之下，Atwrky38和ATWRKY62编码两个结构相似的wrky，负调控防御两；这两个基因的过度表达降低了植物对该病原体的抗性，以及Atwrky38，ATWRKY62.， 和ATWRKY38 ATWRKY62失去功能的突变体表现出增强的抗病能力[8]．这些结果表明，植物基础疾病抗性中，WRKYS在植物基础疾病抵抗力中发挥阳性和阴性调节作用。

玫瑰（罗莎sp。）是全球最重要的商业花卉作物之一[9]．主要的玫瑰产区包括非洲和南美洲的热带高原地区（包括肯尼亚，埃塞俄比亚，厄瓜多尔和哥伦比亚），这些地区具有适当的气候条件和低劳动力成本，而玫瑰采购在很大程度上集中在欧洲发达国家和欧洲发达国家北美 [10.]．玫瑰的长距离物流和运输给采后保存带来了挑战，玫瑰经常受到采后病害的影响，如由坏死营养真菌病原体引起的灰霉病葡萄孢菌［11.]．

一些wrky增强了作物和模式植物(如拟南芥)对各种疾病的抗性，包括b .灰质；然而怀疑尚未确定参与玫瑰灰色耐磨性的基因。我们之前探讨了玫瑰抗性的分子基础b .灰质使用从头RNA-Seq分析，显示大量的基因，包括怀疑家族基因，在玫瑰中显著上调b .灰质感染 [10.]．在本研究中，我们在玫瑰中对腕子家族进行了基因组分析，并使用病毒诱导的基因沉默（Vigs）来证实RcWRKY41对灰霉病的玫瑰抗性起着重​​要作用。

鉴定RcWRKY基因在上升

辨认玫瑰怀疑利用WRKY HMM谱(Pfam: 03106)作为查询，搜索玫瑰基因组数据库(罗莎对纯合基因组V2.0;可用AT.https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/rchiobhm-v2/）[12.]．HMM搜索导致识别56候选者RcWRKY玫瑰基因组中的基因。我们使用保守域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，证实所有56个RcWRKY蛋白都含有WRKY dna结合区域。候选RcWRKY蛋白中有25个含有2个WRKY结构域，另外31个含有1个WRKY结构域。所有56RcWRKY基因可以映射到玫瑰染色体上，并被命名RcWRKY1来RcWRKY56根据他们在染色体上的顺序。

RcWRKY蛋白的大小差异很大。RcWRKY19是最长的，包含729个氨基酸，而RcWRKY10是最短的，只包含120个氨基酸。RcWRKY蛋白的平均长度为359个氨基酸。的细节RcWRKY基因，包括其登录数量、染色体位置、内含子和外显子数量、蛋白大小和基因分类1．

蔷薇的系统发育分析怀疑基因

系统发育分析RcWRKY使用邻居连接方法进行基因检测(图。1）.我们随后分析了外显子内含子的结构RcWRKYS与系统发育分析的结果一致。的RcWRKYS包含1 ~ 6个内含子，大多数RcWRKY同一思工中的基因表现出类似的外显子系统结构，例如RcWRKY8，RcWRKY51，RcWRKY4，RcWRKY5，RcWRKY21，RcWRKY6， 和RcWRKY22（桌子1；无花果。1）.也有一些例外;例如,RcWRKY39和RcWRKY40被分组到同一落后，但是RcWRKY40有两个内含子RcWRKY39有五个。此外，它的长度RcWRKY内含子是高度可变的，从数万个到数千个核苷酸不等。RcWRKY11内含子长度最长，为2369 bp;内含子长度最短，为51 bpRcWRKY16．此外，我们在玫瑰棘蛋白中分析了保守的Wrky主题序列（图。2）.

共66岁ATWRKY.之前在拟南芥中发现的基因[13.]．也有越来越多的证据表明WRKY转录因子在各种植物的抗病中发挥着关键作用(附加文件)2:表S1)。为了评估rcwrky、atwrky和已知参与抗病调控的植物wrky之间的进化关系，我们使用邻居连接方法生成了一个复合系统发生树(图。3.）.根据它们的进化关系，atwrky以前被分为三个组，组I包含两个WRKY域，组II和组III只包含一个WRKY域[13.]．在本研究中，我们发现RcWRKYS与拟南芥包组一致;这RcWRKY基因与I组聚类ATWRKY.基因包含两大圆形，而另一个RcWRKY基因只包含一个棘爪域。我们发现据报道的人物参与疾病反应的调节分布在所有三个群体中。

染色体位置，基因复制和微织物

的RcWRKY基因不均匀地分布在所有七个玫瑰染色体上(见表)1；无花果。4；额外的文件1:图S1)。我们观察到高密度的RcWRKY包括3号染色体的短臂和1号和6号染色体的长臂。相比之下,RcWRKY在染色体1和6的短臂上未发现基因。染色体2和5含有最多的RcWRKY基因(10)，其次是3号染色体(9)，而数量最少RcWRKY在染色体4和6上发现基因(6)。染色体1、3和7包含RcWRKY来自所有三组的基因，而其他染色体仅包括在内RcWRKY来自I和II组的基因。不平衡RcWRKY跨越玫瑰染色体的位置表明在进化过程中发生了遗传变异。

我们进一步调查了基因重复事件RcWRKYs。在玫瑰基因组中发现了17个基因对（表2）.在同一染色体上有两个重复的基因(RcWRKY2/RcWRKY7和RcWRKY34/RhRKYY38），它们可能是串联的重复。其他RcWRKY基因对位于不同的染色体上，表明在这些区域内发生了节段复制，这可能是在玫瑰的全基因组复制过程中发生的[12.]．共线关系RcWRKY染色体之间的基因如图所示。4．

为了研究重复序列之间的选择约束RcWRKY基因，计算17对基因的Ka/Ks核苷酸替换率(表1)2）.一般情况下，Ka/Ks比值> 1为阳性选择，Ka/Ks < 1为纯化选择。17对重复基因的Ka/Ks比值均< 12），表明重复RcWRKYS在其进化过程中经历了功能分化有限的净化选择。

的表达模式RcWRKY基因对b .灰质

越来越多的证据表明怀疑家庭在植物防御反应中扮演各种病原体的关键角色。这涉及上调怀疑表达对病原体感染。学习RcWRKY反应b .灰质，在接种后30小时（HPI）和48 HPI后，我们从暴露于该病原体暴露于该病原体的RNA-SEQ转录组数据。10.]．在玫瑰花瓣,b .灰质Conidia在24 HPI时发芽，并且认为在30 dpi中发生了对感染的早期反应，因为这一点没有可见的疾病病变。当病变开始从接种点扩展时，48 HPI时光对应于后来的响应[10.]．

19的表达式RcWRKY基因(RcWRKY2，RcWRKY4，RcWRKY7，RcWRKY8，RcWRKY13，RcWRKY18，RcWRKY21，RcWRKY23，RcWRKY28，RcWRKY29，RcWRKY30，RcWRKY33，RcWRKY34，RcWRKY35，RcWRKY38，RcWRKY41，RcWRKY46，RcWRKY51， 和RcWRKY54)在48 hpi时显著升高b .灰质，建议他们可能会涉及对该病原体的玫瑰抗性。在这些当中b .灰质- 诱导RcWRKYS，七的表达式RcWRKY基因在30 hpi时也显著增加。这些结果表明，这些wrky可能是防御反应早期阶段的特定调控因子b .灰质（桌子3.）.

进一步验证来自RNA-SEQ的表达谱，六个RcWRKY采用qRT-PCR对基因进行分析。qRT-PCR分析的结果与使用RNA-Seq数据获得的表达谱基本一致(图)。5）.

RcWRKY41是玫瑰抗b .灰质

利用从感染的玫瑰花瓣中提取的RNA-seq数据b .灰质，我们确定了19b .灰质诱导怀疑基因。为了进一步说明这些基因在玫瑰抗性中的潜在作用b .灰质，我们推翻了的表达RcWRKY41使用中收取。RcWRKY41被选为本VIGS研究的原因是:1)它的表达在早期(30 hpi)和晚期(48 hpi)的b .灰质感染(图。5；表格3.)，因此被认为是抗该病原体的重要候选调节剂;2) RcWRKY41属于第一类RcWRKY与许多国家密切相关怀疑S在多种植物的抗病性中发挥作用，如NbWRKY7，NbWRKY8，NbWRKY9，VvWRKY33，OsWRKY53， 和ATWRKY33.(无花果。3.；额外的文件2:表S1)。

测试是否RcWRKY41是否参与提供抵抗b .灰质，我们推翻了的表达RcWRKY41在玫瑰花瓣。为此，我们克隆了一个片段RcWRKY41编码序列为pTRV2载体[14.]生成TRV-RcWRKY41．农杆菌属细胞携带TRV-RcWRKY41和TRV1.［14.]构建物按1:1比例混合，然后真空渗透到玫瑰花瓣盘中生成RcWRKY41- 玫瑰花瓣。随后接种了沉默的花瓣b .灰质．与带有空的TRV载体接种的控制花瓣相比（TRV-00.)，接种的植物TRV-RcWRKY41表现出更严重的疾病症状，病灶大小明显增大(图。6A和B）。我们进一步证实了QRT-PCR的沉默效率（图。6这些结果表明RcWRKY41对玫瑰的抗性起着重要的作用b .灰质．

转录因子经常控制功能相关基因的簇，因此适当的（广谱）耐药作物的基因工程目标。的怀疑基因是植物转录因子的一个重要家族，具有许多重要的功能，包括对病原菌的响应。此前已在拟南芥中进行了WRKY家族的系统和全面的全基因组分析[13.)、大米(15.,番茄16.]， 棉 （Gossypium raimondii.和g .分子）[17.),黄瓜(Cucumis巨大成功）[18.),杨树(杨树trichocarpa）[19.和其他物种;然而，综合分析RcWRKY基因家族以前没有报道过，这使得玫瑰wrky的功能在很大程度上不清楚。玫瑰(r对)基因组测序项目最近完成，为全基因组分析提供了有用的工具RcWRKY基因家族。在本研究中，我们综合分析了怀疑蔷薇科，包括其系统发育、基因结构、染色体位置、基因复制事件和表达谱b .灰质感染。

玫瑰RcWRKY与黄瓜(55个)相比，拟南芥(66个)、水稻(98个)、番茄(81个)、棉花(116个)的基因数量较少g . raimondii就和102年g .分子)和杨树(104)，表明怀疑在其进化过程中，各种基因复制事件在不同植物物种中扩展到不同植物物种的不同程度。基因复制被发现在玫瑰中这种基因家族的扩展中发挥着非常重要的作用;在56中确定了17个重复事件RcWRKYs，其中大多数(15)涉及节段复制，而2个涉及串联复制。17个样品的Ka/Ks比值RcWRKY对< 1，表明该基因家族经历了纯化选择而不是正向选择，表明该基因家族具有高度保守性。在植物中,反抗（R)编码识别特定病原体的免疫受体的基因通常处于积极的选择压力下[20.]．为所有人检测到净化选择RcWRKY因此，他们建议他们可能参与植物的基础防御，而不是在种族特异性抵抗力。

系统发育分析中鉴定的大多数含有拟南芥和玫瑰的人物，暗示这两个物种接受了相当保守的进化。然而，有一些例外;例如，ATWRKY38，ATWRKY62，ATWRKY63，ATWRKY64，ATWRKY66和ATWRKY67属于不包含任何RCWRKYS的进化分层。这表明，在从其共同的祖先分歧后，这些腕代理在玫瑰中丢失或在拟南芥中获得（通过复制和分歧）。

许多怀疑基因已经被证明与植物抗病有关，这促使我们寻找候选基因怀疑与玫瑰反应有关的基因b .灰质感染。基因表达模式的阐明往往为其功能提供线索;因此，我们检测了在RcWRKY当暴露于b .灰质感染。总共19个RcWRKY发现基因被显着上调b .灰质在玫瑰花瓣中，大部分(14 / 19)发生了基因复制事件。我们进一步确认了RcWRKY这可能会参加b .灰质通过将它们加入植物的系统发育树来阻力怀疑它与疾病反应有关。在19日b .灰质- 诱导RcWRKYS，RcWRKY41在进化上与抗病能力接近怀疑S的表达量从早期到晚期均呈增加趋势b .灰质感染。RcWRKY41因此被认为是一个候选基因参与b .灰质利用VIGS沉默其在玫瑰花瓣中的表达，使其抗性降低灰质。这表明RcWRKY41在玫瑰花瓣抗灰霉病中起着重要的正向调节作用。

我们进行了全基因组分析RcWRKYS，探索它们的系统发育关系，共同性和表达谱。共有56个非冗余玫瑰RcWRKY通过系统发育和保守域分析，将其划分为3类;其中，ⅰ组22人，ⅱ组26人，ⅲ组9人。我们的表达式分析表明19RcWRKY在蔷薇花瓣中诱导了家族基因b .灰质感染。通过将这些序列与已知疾病抵抗所涉及的其他植物的序列进行比较，我们透露了这一点RcWRKY41参与调控玫瑰花瓣抗灰霉病能力，利用VIGS证实了这一点。这些结果为进一步的功能分析提供了新的信息RcWRKY年代的玫瑰。

识别和特征怀疑玫瑰基因组中的基因

完整的玫瑰(罗莎对' Old Blush ')的基因组序列https://lipm-browsers.toulouse.inra.fr/pub/rchiobhm-v2/．以识别非冗余怀疑玫瑰基因组中的基因，从PFAM下载了Wrky隐马尔可夫模型（HMM）的共有蛋白质序列（PF03106;http://pfam.xfam.org）.该HMM图谱随后被用于查询玫瑰基因组，从而识别出所有含有e值<1e的WRKY域的玫瑰序列^{- 3.}．最后，利用Pfam数据库和保守域数据库(CDD;https://www.ncbi.nlm.nih.gov./ Structure / cdd / wrpsb.cgi)以确定它们包含核心域。

系统发育分析

从拟南芥信息资源（TAIR）中收集了总共66个拟南芥包装蛋白序列（http://www.arabidopsis.org/）.根据之前的研究结果，额外的序列怀疑从Genbank收集植物疾病抗性的基因，包括来自棉花的植物（gossypium hirsutum)、水稻(栽培稻)、油菜籽(芸苔属植物显著），葡萄（葡萄），烟草（尼古利亚娜·宾夕法尼亚州）， 大麦 （Hordeum Vulgare.)、胡椒(Capsicum Annuum.）.利用系统发育分析确定这些基因的同源性是否存在于玫瑰基因组中。利用ClustalW软件对WRKY蛋白的氨基酸序列进行比对。利用WRKY序列比对进行系统发育分析。在MEGA 6.0软件中使用neighbor-joining (NJ)方法构建系统发育树图[21.]．分支旁边显示了在引导测试中关联类群聚集在一起的复制树的百分比(1000个重复)。进化距离用p-距离法计算，以每个位点的氨基酸差异数为单位。所有现场覆盖率低于50%的岗位均被淘汰。

Conlinearity分析

为了识别共线性，多个共线性扫描工具包[22.用来检测它们之间的微织物关系怀疑基因。然后使用colineearscan (e值<1e⁻¹⁰）.

计算非同义(Ka)与同义(Ks)核苷酸取代比

利用Ka/Ks比值分析确定了驱动演化的选择模式RcWRKYs.这些比率是使用TBtools软件计算的[23.]．

的表达RcWRKYS回应b .灰质

来自玫瑰花瓣的RNA-SEQ数据感染b .灰质来自国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(登录号PRJNA414570)。将干净测序序列映射到玫瑰参考基因组，并使用每kb /百万reads (RPKM)来确定基因表达水平。为了验证RNA-Seq结果，将6RcWRKY采用qRT-PCR对基因进行分析。为此目的，从玫瑰花瓣接种b .灰质，使用Takara逆转录酶M-MLV（Takara）。通过在与KAPA SYBR快速定量PCR试剂盒（KAPA Biosystems）的反应中使用1μL的第一链cDNA，在步骤过多的第一种链cDNA上进行定量RT-PCR。rhubi.被用作管家基因。用于确定转录本丰度的引物列在附加文件中3.S2:表。

中收取

获取TRV-RcWRKY41构造，一个片段的编码区域RcWRKY41引物对RcWRKY41-TRV-F (5 ' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTTTACCAAGCCACAATACCAA-3 ')和RcWRKY41-TRV-R (5 ' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAACACAGCAATGATTCAAAA-3 ')扩增，并克隆到烟草使病毒向量TRV2.［14.]．为了在玫瑰花瓣中建立重视，花瓣从玫瑰花朵的最外面的螺旋中脱离（r .矮牵牛“萨曼莎”)，在花朵开放的第二阶段。然后从每个花瓣的中心打出一个15毫米的圆盘。根癌土壤杆菌含有表达的构建体的培养物TRV1.［14.]和重组TRV2.在1：1的比例中混合并真空浸润到花瓣盘中。在TRV感染后6天，接种了花瓣磁盘b .灰质．使用至少48个磁盘重复VIGS至少3次。后b .灰质接种后，记录病变大小，1例为学生t- 最低用于确定任何显着差异。

在当前研究期间使用和/或分析的数据集已包含在补充数据中。植物材料可在合理的要求上获得相应的作者。

CDD:

保守域数据库

唔：

隐马尔可夫模型

现病史:

接种后的小时

NJ：

Neighbor-joining

RPKM:

每kb每百万次读取的读取次数

伟大的人：

病毒诱导基因沉默

一个也没有。

本研究由国家自然科学基金项目(no . 31772344)资助。资助方在研究设计、数据收集和分析、决定发表或手稿准备方面没有发挥作用。

隶属关系

1. 北京观赏作物，中国农业大学观赏园艺系的观赏作物开发与质量控制重点实验室，袁明源Xilu 2，北京100193

   新通刘，丹丹李，石亚张，玉林徐赵张

贡献

Z Z。和X.L.构思和设计了实验。X.L.，D.L.和Y.X.进行实验。X.L.和S.Z.分析了数据。Z Z。和X.L. wrote the paper. All the authors have read and approved the final version of the manuscript.

通讯作者

对应到赵张．

伦理批准和同意参与

不适用。我们的研究没有涉及任何人类或动物科目，材料或数据。本研究中使用的植物材料由中国农业大学提供，并在机构，国家和国际准则之后自由参加研究目的。

同意出版

不适用。

相互竞争的利益

作者声明了该研究在没有任何商业或财务关系的情况下进行的，这可能被解释为潜在的利益冲突。

出版商的注意事项

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