全基因组关联研究确定了六倍体甘薯连续贮藏、根形成和膨大的候选基因

背景

从农艺学和生物学的角度来看，甘薯的连续贮藏根形成和膨大(CSRFAB)是一个重要的性状。关于CSRFAB特性的分子机制信息尚缺乏。

结果

在这里，作为了解甘薯CSRFAB遗传基础的第一步，我们使用来自四个不同发育阶段的表型数据和33,068个单核苷酸多态性(SNP)和插入-删除(indel)标记进行了全基因组关联研究(GWAS)。基于Bonferroni阈值(p-value < 5 × 10⁻⁷)，我们鉴定出34个独特的snp与种植后150天(DAP)的CSRFAB复杂性状显著相关，以及7个独特的snp与种植后90天(DCSRFAB)的不连续储存根形成和膨大相关。重要的是，大多数与这些已鉴定的snp相关的位点都位于基因组区域内番薯trifida参考基因组)先前报道了控制相似性状的数量性状位点(QTL)。基于这些性状相关snp，分别对12个和7个候选基因进行了CSRFAB和DCSRFAB性状的注释。dcsrfab相关的候选基因调控氧化还原信号，参与生长素介导的侧根形成，而CSRFAB则富含控制生长和衰老的基因，这与不连续和连续储存根形成和膨胀之间的对比和反比关系一致。

结论

本研究中发现的候选基因在细胞壁重塑、植物生长、衰老、胁迫、根系发育和氧化还原信号传导等方面具有潜在的作用。这些发现为了解功能网络以制定提高甘薯产量的策略提供了有价值的见解。这项开创性研究为CSRFAB鉴定的标记和候选基因为甘薯和其他块根作物提供了重要的基因组资源。

多年生植物是指寿命超过2年的植物，占粮食作物的13%，比一年生作物有优势，因为它们增加了储存器官的碳[1]并因其生长季节较长而减少土壤侵蚀[2]。虽然人们对一年生谷物的多年化越来越感兴趣[1在美国，甘薯是作为一年生作物种植的。它是多年生植物，具有不同程度的成熟和衰老，导致生长期有短有长。这种性状的遗传变异使其适于为商业和自给农业系统培育甘薯。商业农业需要在收获时同步成熟或不连续储存，根系形成和膨胀(DCSRFAB)。自给农业系统使用零碎/多次收获策略，通过确保其产品在较长的生长季节的可用性(由于连续储存、根系形成和膨胀)来提高盈利能力。甘薯多年生与CSRFAB有关[3.]由于其能够长期保持营养生长，从而增加光合作用活性，并使干物质持续分配到储存根器官[4]。CSRFAB基因型主要投资于营养生长，然后通过增强碳分配来储存根系发育，同时继续营养生长，从而进入繁殖阶段[5，4]。这大大提高了生产力，因为与DCSRFAB基因型相比，CSRFAB基因型增加了光合作用的绿色物质[6]。甘薯品种由于长时间持续的光合作用，能够延缓衰老和维持碳同化[7]。

甘薯是撒哈拉以南非洲地区重要的粮食作物。其在东非和中非的产量继续增加，这是由于最近人们对该作物的兴趣，因为它具有无与伦比的促进健康的价值，并且是该区域的主要粮食作物。该地区的高产记录在乌干达和坦桑尼亚[8然而，根据人均产量，卢旺达、坦桑尼亚和布隆迪是最大的甘薯消费国，人均分别为80.6公斤、64.1公斤和56.9公斤。在东非国家，零碎收割是中小型甘薯农民的主要收割方式。这种做法包括在土堆、山脊或田地的一部分上连续连根拔起相同的甘薯植物的成熟储存根，用于一餐或几餐，或用于现成的市场。该方法也适用于其他块根和块茎作物，包括马铃薯[9和木薯。虽然这种做法使储存根保持在地下，并在整个种植季节提供持续销售的可能性，但它也为延长储存根的萌发和膨胀创造了空间，从而增加了下一次收获的产量[7]。育种和选择基于一次性收获(DCSRFAB)，并且没有直接的努力来了解与甘薯种植系统中这些常见收获做法相关的遗传潜在性状。尽管零碎收获在撒哈拉以南非洲(SSA)被认为是重要的，但它也可以应用于温带地区的小园丁或提供多年生植物遗传基础的基本理解。

通过各种研究网络，各国和各大洲的甘薯育种者在育种的一般优先领域表现出突出的一致性，其中大多数表明需要提高产量潜力并抵抗生物和非生物胁迫。经常提到的育种目标，以增加甘薯的采用率和广泛利用为目标，围绕着提高鲜储根产量、贮藏根干物质含量(DMC)、对当地主要病虫害的抗性、对恶劣土壤和气候条件的耐受性、良好的植物习性、观赏品质和其他品质性状[qh]10]。目前有相当多的研究旨在提高营养价值(如维生素A原、类胡萝卜素、微量营养素)和工业用途(如淀粉)。生物强化的目的是克服资源贫乏的农民普遍缺乏维生素A的问题，同时增加产量将提高作物的商业生产[11]。

一些报道描述了受控条件下甘薯贮藏根形成和发育的解剖和生理过程[12，13，14，15]和实地试验[16，17，18]，然而，用于育种目的的CSRFAB的遗传和分子基础在很大程度上仍然未知。了解这些变异背后的遗传机制，以及性状的适应性，对未来的选择实践具有重要意义，同时考虑到各种甘薯种植系统。

基于dna的遗传标记在帮助植物育种者鉴定感兴趣的基因和检测与性状密切相关的标记以开发新品种方面具有很大的潜力。Tanaka et al. (2016) [19回顾了贮藏根形成的分子研究，发现了许多与贮藏根形成相关的发育阶段差异表达的基因。贮藏根的形成似乎是甘薯贮藏根发育的一个默认过程，目前尚不清楚是否存在启动贮藏根发育的特定信号。尽管如此，遗传差异应该存在于甘薯和相关的植物物种之间，不产生储存根。最近两个二倍体物种的全基因组序列，番薯trifida和即triloba［20.]，是研究六倍体甘薯的有用资源。现在可以使用高密度全基因组SNP标记[21]和祖先二倍体祖先的健壮参考基因组[20.]以了解复杂的六倍体甘薯基因组中最重要性状的遗传基础。

在本研究中，我们在田间条件下对358份CSRFAB和DCSRFAB甘薯选育材料进行了评价。我们对该多样性面板进行了基因分型，并使用SNP和indel标记对其进行了数量性状核苷酸(QTNs)分析，以确定与CSRFAB和DCSRFAB性状相关的基因组区域和多态性。

甘薯产量组成性状与CSRFAB的关系

成对相关提供了两个性状是否相关的信息。这种关系的大小和方向(消极或积极)的信息可以帮助育种选择决策。因此，CSRFAB与储藏根数(SRN)、储藏根产量(SRY)和收获指数(HI)呈高度正相关(图2)。1）.CSRFAB在4个收获时期的响应，以及生长进度曲线下面积(AUGPC)和斜率具有不同的相关量级(图2)。1-对)。4个采收期(90,120,150和180dap)之间的相关性很低，甚至没有相关性。各收获期AUGPC与产量组成性状呈正相关，在150 DAP时正相关系数最高(0.91)。斜率与AUGPC呈负相关(- 0.5)。在120 DAP和180 DAP时，AUGCP与其他性状的相关系数最低。斜率与各性状呈负相关(图2)。1）.

CSRFAB的表型变异

基因型性能在四个收获时期(HT)的分布使用箱线图可视化(图2)。2）.在两个实验点，CSRFAB的平均得分为3.4分，最高得分为7.8分，最低得分为1.4分。结果表明，前3个时间点(90dap、120dap和150dap)的基因型分布相似，而在180dap时，基因型的变化更大。三个收获时间点的中位数得分约为4，而第四个收获时间点(180 DAP)的中位数得分约为3。

我们以前[3.报道了基因型变异随时间的变化。在DCSRFAB基因型中，由于种群中基因型因子的作用增强，基因型变异随着植株的生长而增加。在120 DAP时增幅最大，此后逐渐减小。数字2由于DCSRFAB基因型的高频率降低了储存根的起始和膨胀，在收获4时群体中位数下降。发生在A季和B季之间(种植后4 ~ 6个月)的干旱期也可以部分解释种群中位数低的原因。我们观察到相反的模式，CSRFAB的产量随着时间的推移而增加，这是由于5个月后观察到的CSRFAB基因型的再生(在5 MAP之后)。这种延缓衰老或保持绿色的现象[22]导致CSRFAB和DCSRFAB植株之间的总体表型差异很大。

SNP呼叫和等位基因剂量依赖性基因型

基因型呼叫的准确性对生物学解释具有根本性的影响。我们将甘薯样本读取到基因组组装[20.]推测的二倍体祖先(即trifida和即triloba)，以确定与六倍体甘薯基因组中的二倍体、四倍体和六倍体基因型相对应的2倍、4倍和6倍剂量序列。基于种群中每个个体的读取深度分布(图2)。3.)，在应用15倍读深度阈值之前和之后，中位数读深度分别约为20倍和40倍。

我们使用GBSapp生物信息学管道检测了剂量和二倍体基因型变异的基因型质量[20.]。在约85%的置信水平和45倍的读取深度阈值下，仅5839个snp(未经maf滤波)可以调用剂量信息，其中5.54%是多剂量(双剂量和三剂量)。对较大的snp集进行基因型调用导致低置信度剂量调用(即基于65%置信度，15倍读取深度阈值且未进行maf过滤的约41,060个snp)。考虑到高置信度的剂量型snp数量有限，这对于全基因组关联分析来说不是最优的，因此通过仅将基因型标记为杂合或纯合来对较大的低置信度的剂量型snp进行二倍体化。为了保证准确的二倍体呼叫，读取深度阈值设置为15倍。这导致最小等位基因频率(maf)为0.05的SNPs总数为33,068个，缺失数据不超过20%。

多倍体甘薯的连锁不平衡

全基因组连锁不平衡(LD)的模式和程度，即不同位点上等位基因的非随机关联，用箱线图表示，该箱线图显示了LD在标记对之间一定距离内的分布(图2)。4）.所有成对的LD (r²)值使用二倍体基因型数据计算。总的来说，基于即trifida基因组组装大小为526.4 Mb [20.]，共有33,068个snp (16 Kb标记间隔)，本研究中的标记分辨率显示LD在16 Kb距离以下衰减，并且可能在小于1 Kb的距离下衰减(图2)。4）.在异交物种中，特别是在多倍体中，多倍体在多倍体化后重组增加。23]。根据Vos等人的说法。[24快速的LD衰减意味着精细定位致病基因的分辨率很高，因此，需要使用高标记密度，以二倍体snp的形式进行全基因组关联分析。

全基因组SNP数据

基于Bonferroni校正阈值，在该GWAS分析的33,068个snp中，34个和7个snp分别与CSRFAB (150 DAP)和DCSRFAB (90 DAP)显著相关。与其他csrfab相关性状(即90 DAP、120 DAP、150 DAP、180 DAP、slope和AUGPC)相关的显著snp数量见表1．与收获时间相关的显著snp数量在0 (120 DAP)和34 (150 DAP)之间。AUGPC具有较高的标记效应(21.45)，其次是150 DAP(1.23)。与其他收获时间相比，150 DAP和AUGPC相关的snp解释了更多的表型变异(分别为4.3至79%和12.6至24.6%)，而120 DAP和180 DAP的表型变异解释最少(分别为4.4至5.3%和5.3至9%)。

在不同贮藏根发育阶段与CSRFAB和DCSRFAB相关的57个snp中，一些snp在150 DAP、AUGPC和180 DAP之间共享，另一些snp在90 DAP、120 DAP和slope之间同时检测到。在1号染色体上检测到的相关SNP标记数量最多，在150 DAP上记录到的显著关联数量最多，其次是斜率(表2)1）.大部分与90dap和slope相关的显著snp在染色体上共定位，而与150dap和AUGPC相关的显著snp在染色体上共定位(相同或接近)。

34个snp(约60%的显著snp)与150 DAP收集的CSRFAB评分相关，集中在第1、6和8号染色体上。在5%的Bonferroni校正率下，显著snp的次要等位基因频率(minor allele frequency, MAFs)均在10%以上，相当于推荐的严格MAFs阈值。所有超过Bonferroni阈值5%的显著性snp调整后得分均较低P-值(FDR adj p值)范围从8.11E-43到1.79E-03，这意味着假阳性snp的I型误差被最小化。最具信心的4个snp发现分别是Chr04_6057850、Chr12_903336、Chr01_30468732和Chr09_6258404。大多数通过5% Bonferroni显著性阈值的显著snp也与150 DAP和R的CSRFAB变异相关²大于9%，大多数解释了超过15%的变异。在之前的研究中，提出了150 DAP和90 DAP来预测CSRFAB和DCSRFAB性状，本研究将仅针对这两次进行进一步的研究[3.]。

显著相关的snp

GWAS结果采用曼哈顿图和分位数-分位数(QQ)图进行目测检验[25]。曼哈顿地块(图2)5和6)在y轴上表示以10为底的负对数P当测试性状和标记之间的频率差异时，基因组中每个snp的值(沿着x轴)。该线显示了全基因组显著性的阈值(P-value < 5 × 10⁻⁷）.每个点是一个SNP，从左到右分布在甘薯染色体上，高度对应于与所研究性状的关联强度(150 DAP和AUGPC见图)。2;90 DAP和斜率见图。6）.曼哈顿地块在150dap和90dap处观察到较大的峰值。这些细胞系显示，尽管关联信号的强度不同，但150 DAP和AUGCP位点上的大多数显著snp位于同一染色体上。在90 DAP和斜率上的显著snp一致地出现在同一染色体上，并一致地减少了-log₁₀斜率为p值。我们的结果显示了1号染色体上的一个主要位点(GAPIT输出)https://data.cipotato.org/dataset.xhtml?persistentId=doi%3A10.21223%2FKM16BH）.1、3、4、6、8和12号染色体在4个收获时期有大量的关联，形成集群，其中多个性状可能由于一组连锁基因而相关。这些区域包括:1号染色体(6个性状)、3号染色体(4个性状)、4号染色体(4个性状)和12号染色体(4个性状)。在多重图上，我们沿着x轴在特定位置放置垂直线，以确定一致相关的qtn(图2)。5和6）.使用Q-Q图来评估假阳性率(由于混杂因素导致的虚假关联)并计算调整值p值。观察到的-log₁₀P-值表示关联统计的显著性水平，如图所示。5和6在y轴上从最小到最大排列。对应的SNP标记根据零假设下在x轴上没有关联的分布绘制。可以预期，从恒等线观测值的偏差包含潜在的真实关联。关联信号的强度有两种显示方式。强度的一个指标是-log垂直轴上的高度₁₀假定值;高度越大，这种联系就越强。-log在纵轴上的高度₁₀150 DAP的p值最高，其次是90 DAP和AUGPC。

候选候选与相关snp共定位

GWAS对于确定与感兴趣的性状相关的基因组位置是有用的，然而，所提供的信息并不能捕获感兴趣区域下基因的功能。因此，通过不同的功能基因组方法确定和研究假定的因果基因功能是非常重要的。众所周知，很少有相关的标记涉及先前报道的与感兴趣的性状相关的基因，有些标记在基因组位置发现，没有已知的基因，有时是调控元件[25]。因此，我们研究了我们的显著snp的基因组位置，以确定哪些蛋白质编码基因snp位于或邻近，使用在线数据库即trifida参考基因组(http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/）.与最高显著snp共定位的候选基因列于表中2．

根据相关snp与预测基因的接近程度，确定了可能导致CSRFAB变异的候选基因(表2)2）.CSRFAB在第4染色体150 DAP处(PV = 3.7E-47)与参与根毛发育的纤维素合酶样D1基因存在强烈的关联。26]。另一个高度显著的SNP (PV = 4.8E-33)位于chr12上，与NHH基因的编码区(外显子)处于强LD位置，该基因属于nudix水解酶同源家族，具有nudix box-containing蛋白，先前报道了植物对生物和非生物胁迫的防御反应[27]。

相关的Chr01_30468732 SNP与P-LNPHP基因共定位，P-LNPHP基因编码含有核苷三磷酸水解酶超家族蛋白的p环，参与调节植物生长和激素信号。HVA22基因被发现与Chr02_16003392位点相关，该位点编码基本螺旋-环-螺旋bhhl - dna结合超家族蛋白，先前报道该基因调控叶片衰老、细胞死亡和脱落酸(ABA)的生物合成[qh]28]。经注释的SAG基因被发现与Chr03_18988293位点相关，并编码被称为植物特异性事件关键调节因子的转导蛋白/ wd40重复样超家族蛋白，在生物学上在发育和胁迫信号传导中发挥重要作用[qh]29]。基因CSLD1与SNP Chr04_2472869共定位，该基因编码纤维素合成酶样D1，据报道，该基因对多种农学性状具有多效性作用，通过改变细胞分裂过程改变植物器官大小[30.]，是拟南芥根毛形态形成所必需的[26]。其他与CSRFAB相关的snp包括Chr06_13670137、Chr07_19060345、Chr08_14465821、Chr10_5821301、Chr11_18261627、Chr12_903336和Chr12_5341809，它们分别位于AMP-M1、KAKUA4、PLLSP、CMmIP、NF-Y、P-RID、NHH、MARP3K-like、DUF668、cle相关和假想的位点上或邻近位点上。这些基因分别编码调控植物生长、叶片寿命和胁迫反应的氨基肽酶M1，调控核形状和大小通常影响胁迫适应的蛋白aku4，调控拟南芥衰老、细胞死亡和芽枝分枝的DHHC-typezincfinger家族蛋白[j]。31]， HVA22同源物A在植物胁迫诱导的程序性细胞死亡和叶片衰老中起重要作用[32]，萜烯合成酶，赤霉素的前体，对植物生长发育起重要作用，推定的重组起始缺陷蛋白，在植物生长发育过程中起重要作用[33]，裸水解酶同源物，参与抵抗生物和非生物胁迫[34]以及与甘薯纤维根相比，在起始贮藏根中被上调的前70个contigs中发现的保守的假设蛋白质[35]。所有这些基因都与150 DAP和AUGPC相关，与90 DAP和斜率观察到的基因不同。

在甘薯贮藏根发育过程中检测到DCSRFAB特异性基因

候选基因TRO-Z与Chr03_18599676 SNP标记相关，该基因编码硫氧还蛋白z，此前报道硫氧还蛋白z是植物通过整合能量转导、代谢、基因表达、生长发育来应对波动环境的促进因子[qh]36]。该基因名为agc -激酶，位于Chr03_18916775位点附近，编码自抑制Ca(2+)- atp酶，通过整合发育信号和碳源有效性，在幼苗早期发育过程中发挥蔗糖信号传导作用[j]。37]。该基因GBLD与chr0622463100 SNP相关，编码转谷氨酰胺酶样超家族结构域，该结构域含有已知在整个生命树的防御和应激反应系统中具有调节作用的蛋白质[38]和ABH基因与Chr07_22973475位点相关，编码α / β水解酶，是植物中赤霉素、独角麦内酯和卡里金信号通路中植物激素和配体受体的核心结构，并已进化出复杂和专门的化学适应，以适应广泛变化的生物和非生物生态环境[qh]39]。DUF803和MFSP基因参与赤霉素(GA)和脱落酸(ABA)信号通路调控生长[j]。40]， MFSP是响应化学渗透离子梯度的小溶质转运体，允许植物吸收必需的营养物质和离子[41]。这些基因大部分在表中进行了总结2在下面。

甘薯贮藏根发育过程中发现的共享基因

维恩图(图1)7)显示了性状如何共享snp(图2)。7a)和相关基因(图2)。7b).维恩图(图2)。7a)表明90 DAP和150 DAP的QTNs完全不同，表明两个阶段的基因调控系统不同。斜率和90 DAP具有共同的snp。然而，大多数常见的snp都减少了P斜率为-值，表明斜率不能很好地预测90 DAP时的反应。5个全基因组范围的snp在150 DAP和AUGPC时到达共同染色体区域(图2)。7a)，而7个和2个qtn是150 DAP和AUGPC所特有的。在150 DAP和AUGPC中普遍鉴定出4个最近的基因，而在90 DAP和slope中没有共同的最近基因，证实了7的发现。一个。

相关性和变异性分析

在本研究中，我们发现CSRFAB、SRN、SRY和HI是高度相关的，表明它们的遗传基础在一定程度上受多效性控制(即一些等位基因影响CSRFAB所涉及的四个性状中的两个或全部)。这意味着我们可以预期CSRFAB表达增加的品种的SRN和SRY会发生积极变化。在育种中，这意味着当我们选择CSRFAB时，我们可以在SRN和SRY中获得相关响应。对4个收获期CSRFAB性状响应及其各自预测因子(AUGPC和斜率)的进一步详细分析表明，AUGPC与150 DAP呈高度正相关(R²= 0.91)。这表明AUGPC和150dap紧密影响相同的表型。在之前的一项研究中[3.]， 150 DAP被建议作为甘薯中CSRFAB的评分时间，因为它有可能解释乌干达两种不同环境下的再生和生长停止。表型性状之间的遗传相关性意味着间接选择是可能的，并且是直接选择的一种有吸引力的选择，在育种策略中不应忽视。

我们发现CSRFAB在不同采收期具有高变异性，这种变异性具有时间生长模式，在两个采收期(90 DAP和150 DAP)更为明显。在之前的一项研究中[3.这些收获时间对于描述生长类型至关重要。对于150个DAP基因型，对数生长使生长速度加快，在90 ~ 120 DAP时达到峰值，随后生长速度下降。在90个DAP基因型中，生长后期或生长模式的变化更为多样。这些结果表明，以改良CSRFAB为目的的选择可以提高甘薯贮藏根产量。Egbe等人(2012)[42]， Afuape等人(2011)[43]， Thiyagu et al. (2000) [44]同意我们的研究结果，并将产量增加归因于储存根数量和单个储存根重量的增加。CSRFAB与150 DAP的相关性表明，我们可以通过150 DAP的评分反应来选择CSRFAB基因型。这些相关系数在育种中很重要，并提供了一种在育种和选择中联系性状的方法。

关联分析

我们使用全基因组关联(GWA)分析鉴定了甘薯中与CSRFAB和DCSRFAB相关的snp。GWA分析提供了比以前用于植物复杂生长性状的双亲本定位群体的QTL定位方法更精确的物理定位。我们观察到P-值(即3.75 e -47, 4.8E-33, 1.39E-28, 8.83E-28)表明存在一些主要到中等的QTL，特别是潜在的CSRFAB(甘薯的野生型或主要习性)，而DCSRFAB(栽培甘薯的习性)似乎由次要等位基因控制。多样性面板中LD的快速衰减将基因组分解成小的LD块，这为我们提供了精细定位QTL的能力，通常是在基因水平上[45]。在这组甘薯无性系中，含有CSRFAB位点的1、3、4、6和12号染色体是LD分布最广的5条染色体之一[46]。我们检测到34个snp映射到150个DAP上，并且snp簇一致地映射到180个DAP和AUGPC上。与150 DAP、180 DAP和AUGPC相关的snp大多处于高LD，但与180 DAP和AUGPC相关的snp记录的p值降低，其中一些在5% Bonferroni阈值下不显著。因此，与150 DAP、180 DAP和AUGPC相关的snp可能与相同的潜在因果变异有关。同样，与DCSRFAB相关的snp (90 DAP, 120 DAP和斜率)也处于高LD。然而，在一个集群的snp与另一个集群之间没有观察到重叠，这表明在CSRFAB和DCSRFAB中鉴定的snp与不同的因果多态性相关。

候选基因

我们使用了公开的数据即trifida基因组序列，以确定包含或邻近这些snp的候选基因。我们确定的几个候选基因在植物生长途径中发挥作用。候选基因也可以根据它们在数量性状位点(QTL)图上的位置或基因表达模式来鉴定[47]。所鉴定的基因参与了一种表型的表达，这种表型受许多基因的影响，但影响很小。这种基因模式的性质在适应性复杂性状如CSRFAB中有报道[48]。铃木(2017)[48认为特征可以部分地分解成子组件的集合。复杂性状的中间版本存在于现存物种中，如甘薯，Lee et al.， 2012 [49]根据储藏根膨大的表现将甘薯品种分为野生型和现代型。有趣的是，这种中间表型是由同源亚组分(等位基因)经过一些修饰或添加新组分的不同组合形成的。众所周知，主基因几乎总是具有多重效应(多效性)，可以在同一生物体上同时传递不同的有利性状和不利性状[50]。在这种情况下，甘薯作为六倍体作物的状态提供了选择，其净效应有利于CSRFAB基因在自然界中生存。大多数增长领域遵循两种不同类型的增长:对数增长曲线和指数增长曲线。表征DCSRFAB的对数生长曲线[3.]开始时增长较快，但随着时间的推移，增益减小且变慢;而指数增长曲线(CSRFAB)开始时增长缓慢，但随着时间的推移，增益增大较快且变大。植物中的这一基本原理很复杂，甘薯中的CSRFAB也存在这一基本原理。已确定的基因包括生长素、赤霉素和乙烯信号等生长激素。例如，大量的观察表明生长素、乙烯和侧根形成之间有密切的联系。这些激素先前已被报道参与植物保持绿色过程的调节[51通过保持叶片的绿色或通过叶片衰老的开始和进展。在低水平下，乙烯促进生长素的生物合成和/或响应，并促进幼根部分侧根的形成。当乙烯水平增加时，乙烯与主根尖端的生长素相互作用，抑制根的生长。这抑制了生长受到抑制的根区侧根的形成。同时，乙烯促进了现有侧根原基的出现。乙烯在受胁迫植物的所有部位产生，生长素在顶端分生组织中形成，并通过韧皮部运输到根[52]。与DCSRFAB相关的snp簇主要与乙烯生物合成有关(即含核苷p环、Nudix水解酶、dhhc型锌指、HVA 22同源物A、Ca^2＋而与CSRFAB相关的基因簇主要涉及生长激素信号，如生长素、ABA、赤霉素(即纤维素合成酶样D1、氨基肽酶M1、钙调素相互作用蛋白、自抑制Ca^2＋−atp酶)。前者调节由于衰老、老化和干旱胁迫而下降的生长。据报道，ABA参与抑制发芽、干旱反应和促进叶片衰老[51]。

这种情况使得连续贮藏根的生长调控成为一个高度复杂的过程，它似乎在许多不同的水平上受到时间和空间上基因网络的复杂作用的控制。例如，在90 DAP时，涉及贮藏根形成和膨胀的snp以及基因与在150 DAP时发现的基因完全不同，这表明根形成和膨胀的调节机制是时间依赖性的。

本研究的一个关键贡献是发现的snp的多用途特性，可以验证用于商业储存根生产，零碎收获和动物饲料生物质生产的早熟和连续储存根形成。在显著和上调的基因中，本研究中P-loop含核苷三磷酸水解酶超家族蛋白和dhhs型锌指家族蛋白与CSRFAB相关，这些基因通常具有分生组织特异性mRNA表达模式，KNOX蛋白通过维持顶端分生组织活性在茎部发育中起核心作用[53]。纤维素合酶样D1可能参与贮藏根的形成。这是因为据报道，它与器官大小和根生长调节有关[30.]。储根膨胀是一个复杂的过程，包括细胞分裂和扩张。这些基因在150 DAP时表达上调，表明植物具有持续的生物活性，暗示了植物器官的分化。此外，我们的研究还发现了与CSRFAB相关的基因，这些基因在甘薯中ABA生物合成和其他激素信号传导如乙烯、细胞分裂素、赤霉素和生长素中发挥着重要作用[54，55，19]。拉维等人，[55]综述了甘薯贮藏根形成和发育的分子生理学，并发表了一些报告，表明贮藏根的形成(起始)与细胞分裂素之间存在关系，几种细胞分裂素通过发育和激活初生形成层参与甘薯贮藏根的形成[56]。我们的研究结果与这些报道一致，这表明在贮藏起始和发育过程中检测到的差异表达基因对于揭示与连续贮藏根形成、膨胀和进一步发育有关的分子机制具有重要价值。

我们对358个甘薯基因型进行了基因分型，并为CSRFAB在甘薯中运行了首个GWAS。该研究确定了40个与CSRFAB显著相关的独特snp和12个与DCSRFAB显著相关的独特snp。新基因包括12个CSRFAB基因和7个DCSRFAB基因。经标记验证后，这些基因可用于甘薯CSRFAB的遗传改良。为了验证这些关联和候选基因，将需要额外的研究(例如转录/转录组分析，增加精细定位的制造商密度，以及在其他定位人群中进行定位)。候选基因的发现增加了我们对甘薯CSRFAB分子致病机制的认识，并可能为甘薯CSRFAB的育种提供基础知识。具有优秀单倍型的基因型的验证，将为今后通过标记辅助选择改良甘薯CSRFAB提供有价值的育种材料。

植物材料，田间试验和表型评价

亲本基因型来自乌干达国家作物资源研究所(NaCRRI)。该研究收集了358种甘薯基因型，包括;一组来自两个不同基因库的130个遗传多样性基因型，先前用31个简单序列重复(SSR)标记进行了表征[57]和从上述130个基因型中选择20个亲本杂交得到的一组228个基因型。20个亲本包含10个CSRFAB和10个DSCRFAB基因型，228个衍生F1基因型分别为两个性状。228个后代是用North Carolina II交配设计手工授粉产生的[58]。在从2017年3月开始的长雨季和从2017年9月开始的短雨季期间，在乌干达国家半干旱资源研究所(Namulonge，乌干达)和国家半干旱资源研究所(NaSARRI，乌干达Serere)进行了试验。纳木龙格遗址坐标为经度32.6150，纬度0.5250，海拔1150 m.a.s.l。而Serere站点位于纬度1.4970，经度33.3935，海拔1140 m.a.s.l。

试验设计采用随机完全区组设计，两排试验田共20株。尽管种植了4个重复，但总共取样了2个重复。从种植后3个月(MAP)开始，每隔一个月进行一次测量。

表型数据收集

为了确定储根形成和膨胀的模式，在3、4、5和6 MAP处对每种植物基因型的储根进行破坏性取样。在每个采样点，使用地上和地下部分从四个植物林分收集数据。为了分析CSRFAB与产量组成性状的相关性，我们对4个采收期的甘薯贮藏根性状进行了测量，包括:(i)收获株数(NPH)，计算平均值;(ii)总贮藏根数(SRN)， (iii)总根重(TRW)， (v)藤重(VW)。CSRFAB使用先前开发的1到9的量表进行估计，其中1 =没有可见的存储根(SR)起始，也没有可见的膨胀;2 =没有可见的SR起始，但可检测到膨胀;3 =无明显SR起始;4 = SR起始明显，有2根膨胀根;5 =明显的SR起始和3根膨胀根;6 =明显的SR起始和4根膨胀根;7 =明显的SR起始和5根膨胀根; 8 = Distinct SR initiation and 6 bulking roots; 9 = Distinct SR initiation and 7 bulking roots [3.]。

预测增长，增长预测因子的识别和估计

大多数生物体的生长曲线都遵循对数或指数增长趋势。对数增长曲线在开始时增长迅速，但随着时间的推移，增益减小并变慢;指数增长曲线在开始时增长缓慢，但随着时间的推移，增益迅速增大并变大[59]。增长率的增长用其斜率来表示，总增长率的量度用生长过程曲线下的面积来表示[60]。我们对这两个变量进行了探讨，以探讨与CSRFAB相关的性状可能的间接选择。前人研究表明，CSRFAB与产量及其组成部分(如储根数和储根直径)具有较高的相关性，这表明遗传控制与这些性状密切相关，可以利用CSRFAB性状间接选择高产品种[3.]。因此，在整个研究中，CSRFAB评分被用来估计这种表型。因此，随着时间的推移，CSRFAB分数被转换为AUGPC和四个数据点背后的函数的瞬时变化率或斜率。这两个参数以及四个收获时间的响应被用来表征CSRFAB在四个收获时间的变化。AUGPC和斜率的计算公式如下:

\ (AUGPC = \ \ limits_总和{i = 1} ^ {n} \压裂{Y_i + {Y} _ {i + 1}}{2} \离开({T} _ {i + 1} - {T} _i \) \)其中Yi为收获时间i时的给定分数，Ti为收获时间i时的给定分数[61]。

斜率m = f ' (x) =h \ \(\暗流{0}{\ lim} \压裂{\ int \离开(x + h \右)- f (x)} {h} \)其中f ' (x)被称为函数f对x的导数;X为收获时间，h为常数[60]。

表型数据的统计分析

对考虑所有时间收获的CSRFAB评分、斜率和AUGCP预测因子进行方差分析。R包lme4 [62]进行统计分析。表型数据分析的模型为Y_ijk=μ+G_我+T_j+E_k+GT_ij+通用电气_本土知识+一种_ijk+R_路+e_ijkl;其中μ为总平均值，Gi为第i基因型的效应，T_j是j的影响吗^th收获时间，GT_ij是I之间相互作用的效果吗^th基因型和j^th收获时间，GTE_ijk是I之间相互作用的效果吗^th基因型和j^th收获时间在k^th环境中,E_k是k的影响吗^th环境,通用电气_本土知识是I之间的相互作用效应吗^th基因型和k^th环境中,R_本土知识/是L的效果^th在k内的块^th环境和e_ijk是一个随机错误。

在R软件中使用cor函数和Pearson方法对CSRFAB性状进行相关性分析。

箱线图(63]被用来显示五位数的数据汇总，以更好地描述数据中的可变性。在ggplot2(在Rstudio中执行)中，aes()函数和geom_boxplot()层的美学提供了数据可变性和分散性的可视化。

DNA提取

每个基因型的幼叶组织用聚乙烯取样袋共取样5毫克，然后在冰下冷藏。提取缓冲液(200 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB, 3% β-巯基乙醇)，置于65℃水浴中。使用FastPrep-24™5G组织均质机，将2ml管中的叶片组织样品在液氮中研磨5分钟，使用无菌4mm不锈钢球轴承。为了获得高分子量的DNA，将1 ml预热(65°C)的CTAB缓冲液(200 mM Tris-CL, 50 mM EDTA, 2 M NaCl, 2% CTAB和3% β-巯基乙醇)加入到地面样品中，在3000 rpm下旋转30 s。试管在65°C水浴中加热30分钟，孵育期间每隔10分钟轻轻混合一次。样品在冰上冷却，加入500 μl氯仿:异戊醇(24:1)，倒置试管20 ~ 30次混合。然后将样品以每分钟15,000转(rpm)的速度离心15分钟，并将顶层回收到新管中。重复该步骤(氯仿:异戊醇)以确保提取DNA的纯度。用1/5体积的5 M NaOAC和2.5体积的冷无水乙醇(保存在- 20℃)沉淀DNA。将样品轻轻翻转混合，在- 20°C下孵育60分钟。 Samples were centrifuged and DNA pellet recovered by decanting the supernatant. The DNA pellet was washed twice with 500 μl of cold (− 20 °C) 70% (v/v) ethanol and air dried. The DNA pellet was resuspended in 100 μl low-EDAT TE buffer (1 mM Tris-Cl, 0.1 m M EDTA) containing 400 μg RNase-A. The DNA concentration and purity were determined using a NanoDrop spectrophotometer.

基因分型，SNP呼叫和单倍型估计

DNA样本(每个40 μl)送到东非和中非生物科学-国际畜牧研究所(BecA-ILRI)中心的综合基因分型服务和支持中心(IGSS)，基于DArTseq技术进行测序。原始Fastq文件在GBSapp管道中进行预处理Fastq文件、变体和剂量调用、变体过滤。该管道集成了各种软件，包括GATK v3.7 [64]，对高度杂合和多倍体物种进行了优化[21]。过滤参数包括每个数据点的读取深度过滤(读取深度小于阈值的基因型被编码为缺失)。此外，数据缺失率> 20%和次要等位基因频率< 5%的标记也被删除。在46,007个二倍化snp中，经过过滤和数据质量控制过程，考虑了来自358种不同基因型的33,068个信息丰富的二倍化snp。甘薯二倍体祖先的两个物理参考基因组，即trifida和即triloba［20.用于变量调用。

连锁不平衡

使用GAPIT进行连锁不平衡分析[65]并在R-package v3.5.1中使用选定的33,068个SNP标记实现。连锁不平衡(LD)估计为等位基因频率相关的平方(R²)，而且只有P-值< = 0.01的每对基因座认为显著。计算LD衰减以进行基于LD的全基因组关联分析。

全基因组关联研究

为了减少假阳性率和提高统计能力，估计了人口结构Q和亲属关系(K)矩阵。使用压缩混合线性模型(CMLM)，亲属关系或相关性(K)矩阵作为随机效应来解释种群结构并减少虚假关联。使用基因组关联预测工具(GAPIT)版本3的R包进行分析[66]。方差-协方差亲缘关系矩阵(K)采用VanRaden方法计算[67]。数据集的前三个主要组成部分在GAPIT中自动计算，以可视化整个集合的遗传多样性(N= 358)。SNP数据的前三个主成分包含在GWAS模型中。的Bonferroni阈值P数值是根据标记的数目(P= 1/n, n =使用的总SNP)，方法由Li et al.， (2013) [68]。

候选基因的鉴定

基于显著的性状相关snp，二倍体的物理基因组组装即trifida（http://sweetpotato.plantbiology.msu.edu/)作为鉴定候选基因的参考基因组。与相关snp共定位的推测功能候选基因根据与其他物种中已知的注释基因的相似性进行了注释，特别是，拟南芥．使用国家生物技术信息中心的基本局部比对检索工具(NCBI BLAST)和保守域数据库(CDD)资源进行独立分析[69]进行甘薯基因的注释。在查阅相关文献的基础上，确定候选基因的附加注释。

在当前研究中生成和分析的数据集可从国际马铃薯中心(CIP) Dataverse获得:

六倍体甘薯连续贮藏、根形成和膨大的候选基因。https://data.cipotato.org/dataset.xhtml?persistentId=doi%3A10.21223%2FKM16BH）.

°C:

度摄氏

阿坝:

脱落酸

方差分析:

方差分析

AUGPC:

生长进度曲线下面积

BecA-ILRI:

生物科学东非和中非-国际畜牧研究所

爆炸:

基本的局部对齐搜索工具

CDD:

保守域数据库

装备:

染色体

CMLM:

压缩混合线性模型

肌酸磷酸激酶:

肌酸磷酸激酶

CSRFAB:

连续储存，根系形成和膨胀

CTAB:

十六烷基三甲基溴化铵

衣冠楚楚的:

种植后的天数

DArTseq:

分集阵列技术测序

DCSRFAB:

不连续储存、根的形成和膨胀

DMC:

干物质含量

背景:

脱氧核糖核酸

EDTA:

乙二胺四乙酸

GAPIT:

基因组关联与预测集成工具

GBSpoly:

Genotyping-by-sequencing协议

走:

基因本体论

GWAS:

全基因组关联研究

盐酸:

Hygrochloric酸

你好:

收获指数

HT:

收获的季节

国际宇航科学院:

吲哚乙酸

igs:

综合基因分型服务和支持

indel:

Insertion-deletion

LD:

连锁不平衡

m.a.s.l:

海拔数米

加:

次要等位基因频率

传销:

混合线性模型

信使rna:

信使核糖核酸

生理盐水:

氯化钠

NaCRRI:

国家作物资源研究所

NaOAC:

醋酸钠

NaSARRI:

国家半干旱资源研究所

NCBI:

国家生物技术信息中心

PV:

P价值

QQ:

Quantile-quantile

QTL:

数量性状位点

本考察团:

数量性状核苷酸

SNP:

单核苷酸多态性

SRN:

存储根号

对不起:

贮藏根产量

SSA:

撒哈拉以南非洲

v:

葡萄产量

ZFP:

锌指蛋白

我们很抱歉，由于篇幅限制，许多重要的贡献不能被引用。这项研究得到了非洲生物科学挑战基金(BecA-ILRI Hub)和CGIAR根、块茎和香蕉研究项目的支持。这组作者感谢乌干达国家农业研究组织为试验提供了场地，感谢BecA和CIP慷慨地提供了技术支持，包括实验室设施和用品。

田间试验和实验室监督由国际马铃薯中心的SASHA II项目和GT4SP项目支持，该项目由比尔和梅林达·盖茨基金会(BMGF)资助[opp1019987]， CGIAR根、块茎和香蕉研究计划(RTB)由CGIAR基金捐助者(http://www.cgiar.org/about-us/our-funders/）.基因分型和生物信息学工作得到了非洲生物科学挑战基金(BecA-ILRI Hub)的支持。资助机构支付研究费用，包括实验费用和出版费用，但在研究设计、数据收集、分析、解释或撰写手稿方面没有任何作用。

从属关系

1. 马凯雷雷大学农业与环境科学学院农业生产系，乌干达坎帕拉7062信箱

   ast Bararyenya, Phinehas Tukamuhabwa, Mildred Ochwo-Ssemakula, Thomas L. Odong, Herbert Talwana和Arfang Badji

2. 布隆迪农业科学研究所，布隆迪布琼布拉cathendrale大道- B.P. 795号

   Astere Bararyenya

3. 美国田纳西大学昆虫学与植物病理学系，田纳西州诺克斯维尔，37996-4560

   Bode A. Olukolu

4. 国际马铃薯中心(CIP)，拉莫利纳大街1895，拉莫利纳公寓邮政，1558，利马，秘鲁

   Wolfgang J. grneberg

5. 30709-00100，肯尼亚，内罗毕，奈瓦沙路，国际畜牧研究所

   惠灵顿·埃卡亚，玛蒂娜·凯洛和姚·纳赛尔

6. 国际马铃薯中心(CIP)，撒哈拉以南非洲地区办事处，邮政信箱25171-00603，肯尼亚内罗毕

   Jan Low, Dorcus Gemenet和Mercy Kitavi

7. 国际马铃薯中心(CIP)，乌干达坎帕拉Ntinda II路47号，邮政信箱22274号

   罗伯特·m·姆旺加

贡献

AB, PT和ROMM构思了原始的现场筛选实验和研究计划，NY, DG, MK⁵和可⁶设计GWAS实验，监督实验室实验，为AB提供技术支持。OB和AB对下一代序列reads进行高质量筛选，进行SNP召唤和筛选，并进行全基因组关联分析。WJG和MOS评估了现场结果的质量并审查了稿件。HT和TLO审阅了手稿。AB在所有作者的贡献下撰写了这篇文章。JL构思并资助了现场实验，EW构思并资助了实验室实验，两人都审阅了手稿。所有作者都阅读并认可了稿件。

相应的作者

对应到Astere Bararyenya．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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