四倍体马铃薯后代群体中作物性状与转录组差异的联系

背景

马铃薯是世界上消耗量第三大的作物。产量、产品质量和抗病性等性状的育种是主要的优先事项。确定这些和其他重要性状的分子特征对未来的育种工作很重要。本研究采用性状分析和RNA-seq方法，对SW93-1015与栽培品种dsamsisame杂交的后代群体进行了研究，以期在分子水平上了解分离性状，并鉴定与这些性状表达相关的转录本。在受控环境下具有田间性能预测价值的转录标记在植物育种中具有重要价值。

结果

在北欧气候条件和可控气候条件下，对SW93-1015和dsamsisamade共34个子代进行了17个不同性状的表型分析。通过从头组装RNA-seq reads，构建了包含所有34个子代和亲本的主转录组。在受控环境下获得的34个品系的基因表达数据通过不同的相似性指数进行性状间的关联，包括Pearson和Spearman，以及DUO(计算基因表达的高低值与性状的共现性)。我们的研究将转录本与产量、生长速度、高产块茎、晚疫病和块茎枯萎病、块茎绿化和早花等性状联系起来。我们发现了一些与晚疫病抗性相关的转录本和与编码受体相关的转录本Dickeya以上易感性。ubx结构域蛋白的转录水平与产量呈负相关，GLABRA2表达调节剂与生长速度呈负相关。

结论

在我们的研究中，我们确定了100个转录本，根据马铃薯17个性状的表达推定关联，代表了已知的和新的关联。这种方法可用于将转录组与性状联系起来。我们首次引入DUO在转录组数据上的应用，探讨了将受控、最佳环境与后代群体中性状的转录表达水平与不同方法联系起来的可能性。我们在另一个后代群体中验证了五个假定的转录标记的表达模式。

马铃薯是世界第三大粮食作物。它有很高的产量潜力，是许多国家烹饪中几乎不可替代的一部分[1]。由于欧洲栽培的四倍体马铃薯在引进时起源于有限的种质资源，它的遗传基础很窄[2]。由于其高度异质性和近交抑制，DNA标记迄今在马铃薯育种中的应用相当有限[3.]。下一代测序(NGS)为植物后代群体的高通量转录组分析提供了新的可能性，也为研究与表型性状相关的转录表达提供了新的途径。

将转录本与表型联系起来可能是开发与特定特征相关的新的转录本标记和转录本谱，即所谓的分子特征的一种方法。这在其他作物中也得到了证明，例如，在玉米作图群体中发现了对叶片发育重要的转录本[3.，4]。近年来，许多与马铃薯抗旱复杂性状相关的转录物和代谢物标记被报道[5]。这些假定的转录标记也为揭示涉及多基因起源的复杂性状的基因提供了第一步，这可能克服分析多倍体物种的部分挑战。

许多研究发现，父母之间的表达差异比子代之间的表达差异更明显。事实上，据报道，双亲之间的大多数差异表达基因在杂交后代中以亲本间水平表达[6]。在玉米中，F₁代显示遗传多样性与转录变异之间存在相关性，然而，四分之一的基因在表达上表现出非加性效应[4，7，8]。基因表达谱在亲本和子代之间以及子代之间的差异程度可能取决于所研究的物种、亲本基因型、环境差异和植物组织。

在这里，我们通过在控制条件下的RNA-seq世代研究了来自两个四倍体亲本的群体成员之间转录组组成的差异。我们通过应用三种不同的相关方法，Pearson和Spearman相关，以及新的DUO相似性度量来比较与某些表型性状相关的转录本。DUO将矩阵的值分类为高、低或中性，然后计算高、低或高/低值的共现性。(clier等人，已提交)。DUO指标是根据现有及已公布的自订相关系数(简称“自订相关系数”)[9]。CCC是一种单核苷酸多态性(SNP)相关度量，专为数据向量的元素分为两大类的情况而设计。DUO配方的结构与CCC配方相同，不同之处在于，DUO配方的类别为高/低表达水平/表型水平，而不是等位基因。除了Pearson和Spearman相关指标之外，这是一个有用的指标，因为它自然地处理分类数据。

通过这种方法，我们在马铃薯后代群体中发现了与不同性状相关的潜在新的转录标记和谱，同时揭示了与特定性状相关的潜在分子机制。理想情况下，转录物标记应该足够强大，可以在受控环境中使用，以进一步加强筛选过程，因为在受控条件下每年可以产生几代植物。因此，转录组是在受控条件下生长的非胁迫植物中捕获的，而表型数据则是在田间或受控气候条件下记录的。

抗晚疫病(由5种)已经在该种群中进行了研究，并且已经克隆了这种抗性背后的受体抗性(R-)基因[10]。根据先前基于选择性反应监测(SRM)对该种群进行的定量蛋白质组学研究，我们得出结论，即使在没有病原体的情况下，抗性基因也会影响一些选定的分泌蛋白的丰度[11]。在没有任何病原体存在的情况下，我们再次发现了r基因的转录组效应。此外，我们报告了在控制条件下抗性筛选的表型数据链格孢属以上在叶片和块茎中接种Dickeya以上接种。在田间试验中，我们记录了马铃薯的重要农艺性状，并分析了马铃薯的相关转录本，如高度、生长速度、开花时间、叶质地、叶损伤、块茎数量、绿块茎数量和产量。

后代群体的表型相关性

我们对3个性状类别的17个植物性状进行了34个品系的表型分型(表2)1),即生物压力:p . 5叶片抗性(PIR)，由块茎疫病引起p . 5(TBS)、Dickeya反应(DR，易感度)、叶片稻瘟菌感染后病变(LAI)、块茎稻瘟菌感染量(AIV)、hr样病变程度(HRL);块茎:块茎数(NoT)，块茎田间绿化(TGF)，接近土壤表面可见块茎(VT)，单株产量2013 (YP13)，单株产量2014 (YP14);叶/射击/花:晚季衰老水平(SLS)、生长率(GR)、株高(H)、晚季坏死叶水平(NLL)、叶片质地(LT)、开花时间(FT)。17个性状中，3个为分类性状，其余为定量性状(表1)1)。多数性状的得分值在后代系中表现出明显的差异，亲本的得分值往往不同于分离后代系中各性状的平均值(表1)1)。分析的所有性状的表型数据包含在附加文件中1表S1。

为了将表型相互关联，根据性状值计算Spearman相关(表2)2)。正如预期的那样，几种生长表型如块茎产量(2013年和2014年;R的线性回归²= 0.31)，高度与生长率呈正相关。这些性状的相关性在不同的马铃薯种植系统中是众所周知的。12，13])。生长相关性状与开花时间和衰老呈负相关，如果开花时间和衰老较晚，则块茎产量较低，这反映了北欧气候条件下生长季节相对较短的高产品种不宜发育太晚的必要性。同样，田间坏死病变的发展和实验室的hr样反应与产量呈负相关。实验室观察到的hr样病变程度与现场观察到的坏死点数量明显正相关。

在测量的病害性状中，黑穗病侵染与产量、生长率和株高呈正相关，而黑穗病侵染较少与田间较晚的衰老和较晚的开花时间相关[14]。

p . 5易感性与任何其他测量的性状都不相关，这反映了我们最近在后代群体中发现的驱动晚疫病抗性的单一显性抗性基因的1:1存在或不存在[10]。有趣的是，许多转录本的大量变化被确定为r基因存在的可能影响，下面将讨论。

转录组组装和注释

共测序了34个分离马铃薯品系的8.756亿对末端reads。每行的平均读取次数约为2500万次。在进行reads质量控制后，只考虑质量评分大于20且长度大于20bp的清洗reads进行分析。

基因型之间的序列差异会影响reads比对。因此，我们基于来自所有系和两个亲本的序列数据生成了一个主转录组，以映射所有读取回。为了构建主转录组，将34个品系的所有测序样本汇集在一起。主转录组的从头组装共产生212,536个contigs，最小长度为201 bp, N50值为1177 bp，平均长度为724 bp。为了确保组装的质量，将reads映射回主转录组，每个样本成功映射的reads平均达到令人满意的83%(表2)S2．通过BUSCO进一步评估该组装的序列完整性，在1440个超保守核心蛋白中鉴定出1258个在转录组组装中是“完整的”，对应于87%的完整基因。68个序列被BUSCO(附加文件)鉴定为“碎片化”2表S3)。这比报道的马铃薯转录组的完整性略低，但应该记住，主转录组仅来自叶片组织，不包括根，可能导致完整性较低。用BLASTX对主转录组进行ITAG和PGSC基因组注释和Uniprot数据库的注释。共有185,189条ITAG注释(87.13%)、178,635条PGSC注释(84.04%)和122,104条Uniprot注释(57.45%)与组装的转录本相关联。利用BLASTN将所有转录本与已测序的马铃薯基因组进行比对，确定组装转录本的基因组位置。Uniprot, ITAG, PGSC和基因本体(GO)注释以及转录本标识符的详细摘要可以在附加文件中找到2表S4。

转录物丰度及差异基因表达分析

转录组丰度估计发现所有34个子代和两个亲本系的共同转录本。从标准化读计数中鉴定出FPKM值大于或等于1的共同转录本，结果显示，在所有34个子代系和父本desresime和SW93-1015中表达了21,708个(10.25%)转录本。正如预期的那样，大量的转录本与植物光合作用和中枢代谢有关。通常表示的转录本的列表及其功能注释作为附加文件给出3.表S5。5484个带注释的转录本在行间差异表达(FDR < 0.05, 2倍变化)。在附加文件中给出了差异表达转录本的列表3.表S6。对转录组数据进行了主成分分析(PCA)，显示亲本之间存在差异，并且有几条系与亲本相比有所不同(附加文件)4:图S1a)，后代系与亲本相比差异基因表达数见图S1b，方法S1(附加文件)中差异基因表达数的计算方法见图S1b4:图S1b和方法S1)。GO分析没有显示某些类别的明显过度代表性(数据未显示)。

分类性状的基因表达分析

3个性状的表型为分类型:5种电阻(PIR;抗性或易感)，叶片纹理(LT;软或硬)，开花时间(FT;早或晚)。除了相关分析外，我们还通过DESeq2 (p< 0.05)，以性状类别为重复。然而，显著差异表达的基因只有在p . 5阻力。共有83个转录本在抗性和易感品系间差异表达(p < 0.05;Fold Change> 2;额外的文件5表S7，见下文）．

表型和转录组相关性鉴定性状相关转录物

对于转录组与表型的关联，我们只选择了34个子系中至少8个子系和两个亲本中表达计数(FPKM)大于5的转录本。共有18542份成绩单符合这些选择标准。这个严格的门槛导致了Trinity鉴定的转录本的大量丢失(212,536)。为了测试高转录本丢失的影响，我们分别将三位体鉴定的转录本212,536和18,542与PGSC基因组(BLAST, e值<1e-05)进行匹配，发现这些转录本分别代表28,933和10,926个独特的PGSC转录本。叶组织中存在的转录本的真实数量可能介于这两个数字之间，但为了避免假阳性，我们决定维持所选择的阈值。此前，在普雷贾的叶片转录组中检测到约22,000个转录本[15]。

为了探索基因表达与表型的关系，我们将表达数据与表型数据进行组合，并通过均值和标准差进行缩放。计算34个后代系和双亲的转录本表达量与性状值之间的Pearson相关系数(PCC)、Spearman相关系数(SCC)和DUO相关系数。通过Pearson (r =≤- 0.5或≥0.5)、Spearman (r =≤- 0.5或≥0.5)和DUO (r =≥0.65)分析，在18542个转录组与表型相关的转录本中，分别鉴定出1685个、2185个和273个与性状相关的转录本。从Pearson, Spearman和DUO中鉴定出的每个性状的转录本数量以及方法之间和三种方法之间的共同转录本数量见表3.和无花果。1．每个性状的前20个相关转录本以及PCC和SCC的相关性在附加文件中给出6表S8和S9。

DUO和皮尔逊/斯皮尔曼的差异

为了将转录本与性状联系起来，首先应用Pearson相关系数和Spearman等级相关系数，因为它们是互补的，性状与转录本之间的关系可以预期呈现线性和非线性关系。如表所示3.，大多数相关转录本显示两种方法之间有明显的重叠。然而，在某些性状上，如块茎疫病得分存在明显差异。对于给定的转录-性状对，DUO相似性度量度量这两个对象之间极值的共现性。DUO的独特之处在于，它为每种类型的相关性返回单独的值(例如，第一种相关性的高值与第二种相关性的低值)，从而减少了由样本异质性引起的误差。虽然DUO指标发现的关联数量低于Pearson和Spearman，但它确实发现了那些指标所遗漏的性状-转录关联(例如见图2)。2)，因此在本质上可以看作是互补的。在附加文件中7:图S2相关网络(p≥0.65)表明一些转录本与多个性状相关，如晚衰老(SNS)和少量田间坏死(NLN)。然而，需要更多的实验数据和基因与性状关系的生物学验证，以更好地对这些方法进行基准测试。

鉴定出性状相关转录本

生物因素

研究人员用三种不同的病原体对马铃薯种群进行了测试，这三种病原体是欧洲马铃薯种植中常见的问题:5种造成晚疫病，链格孢属以上导致早疫病和Dickeya以上引起黑腿病。

我们确定了几个与p . 5叶片抗性(晚疫病)与DUO以及Pearson和Spearman相关性(见下文)。转录本受正向和负向抗性调控。有趣的是，这些可以被视为该群体中鉴定的Rpi-ABPT(与DMG400032576最接近的序列同源)基因的影响[10]，并表明该受体具有某种基础作用，而不受p . 5或其他胁迫，如转录组是在受控环境的最佳条件下由植物产生的。

在一些抗性品系中检测到低水平的Rpi-ABPT基因转录本，但不是所有抗性品系，因此该转录本没有通过纳入关联分析的阈值(见方法和材料;数据未显示)。受调控的基因还与该群体中分泌肽的研究有关，其中用于预测抗性的所有肽在抗性组合中含量较低，即使没有任何疾病[11]。这些数据也增加了关于成本和阻力权衡的讨论[16]。

在差异表达分析中，DESeq2只上调转录本，因为叶片抗枯萎病通过了阈值(调整)p< 0.05;折叠变化> 2)，共有56个独特的基因来自不同的染色体(附加文件5表S6）．可以在附加文件中看到8图S3有相当数量的转录本只能通过差异表达分析检测到。值得注意的是，在差异表达分析中，所有检测到的转录本都被包括在内，而在该分析中仅鉴定出的大多数转录本的表达水平较低，因此没有通过纳入关联分析的阈值(见上文和材料与方法)。差异表达基因中有几个与抗病性相关，其中3个属于tir - nps - lrr抗性基因大家族(DMG400007743、DMG400032576和DMG400011529)，其他属于马铃薯特有的小家族，如抗晚疫病蛋白(DMG400046318)和植物抗病蛋白(DMG400044298)。另一个ngs - lrr家族成员NRC1 (DMG400007462)经Pearson相关检测为负相关p . 5阻力。其他值得注意的转录本仅通过差异表达分析鉴定为richadhesion受体(DMG400037420)， Erwinia诱导蛋白2 (DMG400023621)和锌关节家族蛋白的几个成员(DMG400036915, DMG400022758, DMG400028865)。我们对它们在抗性中的作用所知不多，但锌关节家族先前已被证明在茄属植物中扩展，具有高水平的p . 5电阻(17]。

与叶枯病抗性相关的转录因子较少。然而，一个TCP转录因子(DMG400016363)在叶片抗稻瘟病株系中表达较少p . 5表明该转录因子可能是一个假定的易感性因子。这是一组不同的转录因子，其中许多参与器官发育，但也参与植物防御和效应触发免疫(ETI) [18]。事实上，在效应物与拟南芥免疫蛋白的蛋白-蛋白相互作用网络中，至少有三个已确定的免疫相互作用物属于TCP家族。研究发现，这两种细菌的效应物都能直接靶向这些细菌两专性生物营养卵菌Hyaloperonospora arabidopsidis(Hpa)，所有这三种tcp的单突变体导致两种通常无毒的Hpa分离株的疾病易感性[19]。除了TCP转录因子外，DUO还在水稻中发现了一个负相关的MADS转录因子(DMG400000008)，与MADS-box转录因子50 (OsMADS50)的相似性较弱。

三个最相关的转录本p . 5叶片抗性基因为阿拉伯半乳聚糖蛋白(DMG402032565)、钠/钾/钙交换剂(DMG400006339)和功能未知的C-myc转录物(DMG400025428)，均通过差异表达分析检测到。编码一个色域重塑复合体(DMG400006925)的转录本明显受到抗性的正调控，并且与AtBAF60 (AT5G14170)高度相似，最近被证明介导了幼苗生长的抑制[20.]。

黄酮类化合物通常与植物防御有关，通过差异表达分析发现，黄酮类化合物3-羟化酶DMG400006354也与叶片抗性负调控。此外，DUO还发现了一个与参与类黄酮生物合成的AtSRG1 (senesence - related GENE 1)相似的白花青素双加氧酶(DMG400003091)。

在这个后代群体中，块茎疫病抗性与叶面疫病抗性没有联系[11，21]，并且只有两个转录本，它们与p . 5叶片和块茎均有抗性。两个转录本，动作蛋白解聚因子2 (DMG400027752)和FGFR1癌基因伴侣(DMG400032551)，参与细胞组织与耐药正相关。后者与拟南芥AtTON1A微弱相似，该突变体在表皮和皮质细胞中表现出异常的细胞生长和分裂模式[22]。

然而，黑穗病与块茎疫病抗性之间存在较弱的相关关系(表2)2)，但只有一个编码罗丹斯样结构域功能未知基因的转录本(DMP400033223)与这两个性状相关。用于块茎抗性的三个WRKY转录因子(DMG400020608;DMG400009530;DMG400028520)和VAMP蛋白SEC22 (DMG400016420)与富含氧化石墨烯的生物刺激和几丁质响应相关，均与抗块茎枯萎病呈负相关(附加文件)6)。

d .以上马铃薯的易感性似乎是一种数量性状，迄今尚未发现单基因抗性，这使得通过表达相关性研究这一性状特别有意义。尽管如此，DUO应该有效地识别二元差异，发现了许多与信号传导相关的假定受体和转录本。例如，在抗性品系中高度表达的转录本(DMG401017405)与拟南芥中编码gpcr型G蛋白的基因(AT4G27630)具有同源性。该蛋白是膜结合的，据报道与植物激素ABA结合，但不受非生物胁迫的转录调节[23]。与CDG1激酶高度同源的受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(DMG400017596)也高度表达，抗性增加。相反，在抗性品系中低表达的转录物是拟南芥硝酸盐转运蛋白同源物(DMG400013815)。据报道，拟南芥的一种蛋白可以作为氮可用性的哨兵，并与假单胞菌感染的易感性增加有关[24]。另外三种在Dickeya抗性系中低表达的DUO相关转录本是CC-NBS-LRR类的抗病蛋白(DMG400018462)、cf -2.1样受体(DMG400006655)和网络氧化酶(DMG400021111)。后者经常作为马铃薯诱导抗性反应的一部分出现[25]。与之相关的转录本少得多d .以上但一种渗透酶I同源物(DMG400024588)在两种方法之间重叠，并且在抗性较强的品系中表达较低。

只有少数转录本与互花菌叶片感染DUO相匹配。然而，通过Pearson相关性鉴定的转录本的氧化石墨烯分析显示，与系统性获得性抗性以及茉莉素和乙烯反应相关的转录本丰富(附加文件)9)。其中Jar1同源基因DMG400033879表达量高的株系抗性增强。Jar1催化jasmonyl-isoleucine (JA-Ile)偶联物的形成，进而促进jasmonyl-异亮氨酸信号通路中JAZ1和COI1的相互作用。同样，EIN3转录因子(DMG400005915)在抗性较强的品系中普遍表达较低。EIN3与MYC2、MYC3和MYC4相互作用，调控植物防御。这表明，即使在没有病原体的情况下，这些激素途径也会根据抗性水平而变化。

发育及产量性状

为了研究发育和产量相关性状，我们将与这些性状相关的84个DUO转录本亚群与拟南芥同源基因进行了关联(附加文件)10:表S10)。事实上，拟南芥的几个同源物与生长发育有关，几个转录因子家族也有代表，GO分析也是如此(附加文件)9)。然而，与2013年和2014年产量数据相关的转录本没有显示特定GO术语的富集。

根据Pearson和Spearman的结果，光系统II CP47叶绿素载子蛋白(DMG400046303)与产量呈正相关，编码光系统Q(B)蛋白(DMG400004211)的基因也在光反应中活跃。相反，在这两年中，ubx结构域蛋白UBX2 (DMG400029482)和酰基辅酶a合成酶(DMG400020593)的转录水平与产量呈负相关。在拟南芥中，敲除UBX家族的一个成员导致生长速度增加[26]。

对于高度和生长速率高度相关的性状，GO术语“从营养阶段向生殖阶段过渡的时间调节”被过度描述(附加文件)9)。与该性状相关的是一个MADS箱形转录因子(DMG400022748)和开花位点T (DMG400016179)，它们分别与性状呈负相关和正相关。与身高和生长速率高度负相关的是GLABRA2表达调节剂(DMG400023632)，其在拟南芥中的同源调控细胞分裂，是ABA信号通路的一部分[27]。该基因的高表达也与晚季较少的坏死叶片有关。此外，一种被推测为squamosa启动子结合蛋白(DMG400022824)是拟南芥中参与开花调控的转录因子[28]，与身高、生长率呈高度负相关，与早期衰老呈正相关。

块茎数量的转录本呈高度正相关和负相关。糖介导的信号通路中有GO富集(附加文件)9)。例如甘露醇转运蛋白(DMG400011964)和己糖转运蛋白(DMG400009994)正相关，与拟南芥TMT2 (AT1G45249)高度相似。ABRE结合因子(DMG400008011)呈负相关，这是一个参与ABA信号传导的转录因子。与ABA信号相关的还有NAC结构域转录因子(DMG400009245;AT1G01720)。

叶片结构性状与多种转运蛋白(如铵转运蛋白1 (DMG400028710))和细胞壁蛋白(如聚半乳糖醛酸酶(DMG400002931))有关。

晚开花与一种编码簇绒蛋白相互作用蛋白的基因表达增加有关，该基因与AtNTR1 (AT1G17070)高度相似。这种拟南芥基因的突变会改变昼夜节律[29]。与晚衰老相关的还有一个锌指蛋白(DMG401017733)，该蛋白在拟南芥中的同源物抑制晚开花时间[30.]。早期衰老也与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PBS1同源物(DMG400004594)的高表达有关。PBS1在拟南芥中被很好地描述，并参与pamp触发免疫(PTI) [31]。

qPCR验证标记转录物

为了验证我们假设的一些转录物生物标志物的表达，我们在使用相同亲本的独立杂交获得的单独后代群体中进行了分析。选择对早疫病、薯类疫病和块茎疫病具有抗性和易感性对比的4个品系。图中显示了其中5种可能的转录物生物标志物的表达。3.结果表明，高抗性和高易感品系对间表达差异呈一定趋势。

因此，至少在杂交相同亲本时，这些结果证实了甘油-3-磷酸脱氢酶(DMG400012712)和Aldo/酮还原酶(DMG404006439)是DUO鉴定的早疫病的生物标志物。此外，AP2结构域类转录因子(DMG400000681)和GPR89A (DMG401017405)被证实与Dickeya耐药有关，后者经DUO鉴定。最后，一种过氧化物酶(DMG400032199)在块茎枯萎病的单独后代群体中表达，与预期一致。

我们确定了与马铃薯作为作物重要的17个性状相关的已知和新的转录本。该方法可用于将转录组和其他分子表达数据与分离群体和精英材料的未来特征联系起来。在这项研究中，我们验证了五个假定的转录标记在一个独立后代群体中的表达模式。然而，需要进一步的研究来建立与本研究中不同性状相关的转录标记和谱的预测价值，通过测试其他马铃薯后代群体、育种品系和栽培品种以及其他生长季节和气候。我们还展示了用不同的关联方法分析这类数据的好处。为此，我们首次尝试了基于转录组数据的DUO新方法。DUO计算表型值和表达水平之间的共现性，因此明显不同于更常用的Pearson和Spearman相关。

植物生长，表型，样品收集和制备

四倍体亲本，即从Plant Science Sweden AB获得的desreqade品种和从Svalöf Weibull AB获得的SW93-1015育种系，此前在Ali et al. 2012和2014中进行了描述[21，32]。隔离人口也已在以下方面加以描述p . 5叶抗性筛选数据[10]。在瑞典的Borgeby(55°45′5.8″N 13°2′13.5″E)进行了田间试验，并于2013年和2014年记录了表型。Chawade等人先前已经描述了野外生长条件和管理。[11]。表格1包含在每个表型研究中调查的植物或块茎数量的信息，以及在什么条件下进行。对离体植株进行Dickeya评分[33]。p . 5对块茎(块茎枯萎病)的抗性进行了评估，详见[21]，叶片(晚疫病)的疫霉抗性数据见Lenman et al. 2016。在叶片和块茎中进行了[34]。在田间分别对后期坏死叶和衰老叶的百分比进行评分。hr样病变程度评分为1 - 6分，1表示田间无坏死叶片。

为了提取RNA，马铃薯植株在受控条件下生长(SLU Alnarp的Biotron)，日光灯光强为200 μmol m-2 s-1, 16 h/8 h日夜交替。温度设置为20℃，相对湿度设置为65%。罐子每周循环使用，以避免位置效应。所有的采样都在开花前完成，并将两株植物中部的10个完全展开的小叶汇集在一起，按照Ali et al. 2014的描述提取RNA [32]。

测序，从头转录组组装和注释

样品在华大基因(中国深圳)通过Illumina测序平台HiSeq 2000进行配对末端reads (2 × 100 bp)测序。序列存放在ArrayExpress (E-MTAB-5996)中。通过去除适配序列修剪测序读数，使用Nesoni clip (v0.128)去除平均质量分数小于20的低质量序列。长度小于20bp的Reads也被去除[35]。使用Trinity版本trinityrnaseq_r20140717(默认参数)将剩余的reads组装成一个主转录组[36]。为了评估转录组组装的质量，使用bowtie2比对器将测序读数映射回组装的转录本[37]。转录组组装的完整性使用BUSCO [18]，在默认参数上运行，通过估计保守基因的存在和完整性来评估组装的完整性。组装好的转录组数据通过BLASTX针对UniProt数据库进行注释。使用BLASTX对NCBI非冗余蛋白数据库进行序列相似性搜索，e值截止值为1e-10。转录本也针对PGSC DM v 3.04进行了注释[38]和ITAG 2.3注释[39]。使用默认设置在$ $中进行GO富集分析[40]，其中包括罗斯福的调整(Yekutieli)和p< 0.1。使用Amar等人2014年确定的马铃薯基因组最佳功能注释分配给转录本的氧化石墨烯术语[41]。在PLAZA4.0中对鉴定转录本的序列身份和基因家族进行了探索[42]。

丰度估计及差异基因表达分析

使用RSEM (v1.2.7)使用默认参数对转录组组装进行丰度估计[43]来估计RNA转录物的基因和异构体表达水平。转录物丰度的相对度量是TPM (Transcripts Per Million)和FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript Per Million mapping reads)。使用DESeq2寻找分类性状之间的差异表达基因[44，45]。DESeq2采用负二项分布法进行差异表达分析。采用默认设置的Trinity版本trinityrnaseq_r20140717，使用DESeq2对差异表达基因和转录本进行鉴定和分析。

表型和转录相关

为了建立表型和转录物之间的关系，利用杂交系的FPKM值对转录物进行筛选，生成核心转录组。计算杂交群体和亲本各转录本和表型性状的Pearson相关系数(PCC)和Spearman相关系数(SCC) [4]。我们还通过新开发的相似性测量方法DUO(使用基于载体的相关系数发现同步基因表达模块，clier等人，已出版)探索了表型和转录组关系。将基因表达数据和性状数据合并成一个矩阵米其中每一行代表一个基因或表型，每一列代表一个样本。使用自定义Perl脚本通过除以每个条目来扩展每行x_我通过行max()的最大值X)，如下式所示:

在哪里\({x}_i^{\ast} \)是缩放入口我行向量X，x_我是原始条目我行向量X和马克斯(X)是row的最大值X．这确保了所有基因和表型的值都在0到1之间。

然后按照以下程序计算所有对基因和表型之间的DUO相似性度量:

确定了矩阵的上阈值和下阈值米，使得矩阵中25%的值高于上阈值，标记为“高”，矩阵中25%的值低于下阈值，标记为“低”。对于每一对特征(矩阵中的行)一个和B，进行四次比较，即特征中高值的共现一个高价值的特点B，低价值的特点一个特征值低B，高价值的功能一个特征值低B特征中低值之间的共现一个高价值的特点B，用下式:

在哪里我代表基因的高值一个或者基因值低一个，j代表基因的高值B或者基因值低B R_ij表示向量长度的分数，其中我和j共现,f_我和f_j的相对频率我和j分别。

表型-转录组相关网络

在与至少一个性状相关的所有转录本之间构建了一个转录-性状关联网络，转录本和表型表示为节点，转录本和表型之间的相关值表示为边权。对于DUO网络的可视化，在0.65以下的边被丢弃，由此产生的性状-转录关联在Cytoscape 3.4.0版本中被可视化[46]。每个节点代表一个基因或性状的高值或低值，边缘代表这两个节点之间的Duo相似性。使用ggplot2 [41]， RStudio [38]，以及各种R包/资源[37，40，42]。

网络比较

Pearson, Spearman和DUO网络通过计算这些网络之间共享的边(转录性状关联)的数量来进行比较。这是在整个网络级别上完成的(图2)。2)和每个性状级别(表1)3.)。维恩图是用R [37]、rvenndiagram套件[39]和RStudio [38]。

qPCR验证

通过qPCR验证5个基因的表达水平。利用引物Blast (Primer Blast, NCBI)软件设计引物，要求引物熔融温度59 ~ 71℃，引物长度18 ~ 24个核苷酸，产物大小100 ~ 250个碱基对(bp)， GC含量40 ~ 60%。引物序列和效率在附加文件中给出11表S14。为了合成cDNA，使用SuperScript®III逆转录酶将500 ng总RNA转录为cDNA，并根据制造商的协议(InvitroGen)使用RNase H进行降解。使用Power SYBR®Master Mix (InvitroGen)的CFX96 (ABI)进行qPCR, PCR周期根据制造商的建议运行。采用对比CT法对转录本进行相对定量。采用Pfaffl法将数据归一化为3个内参基因[47]。采用带有多个内参基因的改良型geNorm计算基因表达量。

RNA-seq数据存储在ArrayExpress (E-MTAB-5996;https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-5996/)。

AIV:

块茎交孢菌侵染量

英国石油公司:

碱基对

CCC:

自定义相关系数

CT:

循环阈值

背景:

脱氧核糖核酸

博士:

Dickeya响应

FPKM:

每千碱基的片段数，每百万的片段数

英国《金融时报》:

开花的时间

走:

基因本体论

格:

增长速度

H:

株高

人力资源:

过敏的反应

休斯研究:

hr样病变程度

ITAG:

国际番茄注释组

赖:

叶交替菌感染后的病变

LT:

叶结构

附近:

晚季坏死叶片的水平

NLN:

野外坏死灶

不是:

块茎数量

PAMP时:

病原体相关分子模式

主成分分析:

主成分分析

PCC:

皮尔森相关系数

PGSC:

马铃薯基因组测序联盟

PIR:

p . 5叶片的抗性

PTI:

PAMP-triggered免疫力

qPCR:

定量聚合酶链反应

R -基因:

耐药基因

RNA:

核糖核酸

RNA-seq:

核糖核酸测序

鳞状细胞癌:

斯皮尔曼相关系数

SLS:

衰老程度在季节后期

SNP:

单核苷酸多态性

社交网站:

后期衰老

SRM:

选择性反应监测

TBS:

引起块茎枯萎病p . 5

TGF:

大田块茎绿化

VT:

可见块茎接近土壤表面

YP13:

单株产量2013

YP14:

单株产量2014

我们感谢Mia Mogren、Ashfaq Ali、Fredrik Reslow、Per m hlenbock、Erland Liljeroth、Dharani Dhar Burra、Kibrom Abreha、Tewodros Mulugeta、Eu Sheng Wang和Liying Wang对表型分析的帮助。我们感谢审稿人提出的建设性意见。

这项工作得到了瑞典环境战略研究基金会(Mistra Biotech)、瑞典研究理事会Formas(2015-442)、瑞典农民农业研究基金会(0-15-20-557)和瑞典农业科学大学植物育种平台的研究资金支持。作者感谢乌普萨拉高级计算科学多学科中心为访问UPPMAX计算基础设施提供的支持。这项研究也得到了植物-微生物界面科学重点领域(http://pmi.ornl.gov)，由美国能源部科学办公室生物与环境研究办公室(BER)和能源部实验室指导研究与发展基金(8321)资助，位于橡树岭国家实验室。橡树岭国家实验室由UT-Battelle, LLC为美国能源部管理，合同为DE-AC05-00OR22725。这项研究也得到了美国国立卫生研究院拨款(RF1 AG053303和GM100364)和奈特阿尔茨海默病研究中心(ADRC)试点拨款的支持。

由瑞典农业科学大学提供的开放获取资金。

从属关系

1. 瑞典农业科学大学植物保护生物系，Sundsvägen 10，瑞典阿尔纳普

   埃里克·亚历山大松，阿斯塔·苏贝迪和埃里克·安德里森

2. 现地址:美国马萨诸塞州波士顿市哈佛大学陈曾熙公共卫生学院生物统计学系

   Erik Alexandersson

3. 瑞典农业科学大学植物育种系，瑞典乌普萨拉阿尔纳普

   Sandeep Kushwaha

4. 国家动物生物技术研究所，海德拉巴，印度

   Sandeep Kushwaha

5. 美国田纳西州橡树岭橡树岭国家实验室生物科学部

   黛博拉·威尔和丹尼尔·雅各布森

6. 美国田纳西州诺克斯维尔市田纳西大学布莱德森跨学科研究与研究生教育中心

   黛博拉·威尔和丹尼尔·雅各布森

7. 密苏里大学圣路易斯分校圣路易斯，密苏里州，美国

   Sharlee气候

贡献

SKK进行生物信息学分析。EAL和EAN进行并领导了表型和RNA分离的实验室和现场实验，并为本项目提供了总体指导。AS进行qPCR分析。SC开发了DUO方法，DW和DJ执行了DUO方法并计算了网络边缘重叠。所有作者都撰写并批准了最终的手稿。

相应的作者

对应到Erik Alexandersson．

伦理批准并同意参与

不适用。

发表同意书

不适用。

相互竞争的利益

埃里克·亚历山大森是BMC植物生物学编委会成员。除此之外，作者宣称他们没有竞争利益。

出版商的注意

施普林格·自然对已出版的地图和机构关系中的管辖权要求保持中立。

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