种间功能相容性Theobroma可可拟南芥FT同源物:分生组织同源基因的9000万年功能保存

背景

在被子植物中，向开花的过渡是由一组复杂的相互作用的网络控制的，该网络整合了一系列发育、生理和环境因素，优化过渡时间，以获得最大的繁殖效率。组成这些网络的分子机制已经被部分表征，包括转录和转录后调控途径。成花素,编码开花轨迹T（英国《金融时报》)，是几种花期调控通路的保守中枢积分器。为了描述控制可可开花时间的分子机制，我们描述了一个可可候选成花原基因，TcFLOWERING T轨迹（TcFT)．了解这种保守的开花时间调节器是如何影响可可植物向开花的过渡的，可以引导加快可可育种的策略。

结果

BLAST搜索可可基因组参考组合确定了7个候选成员CENTRORADIALIS /终端FLOWER1 /自我修剪基因家族包括一个单一的成花原候选基因。在拟南芥中克隆了编码可可成花原的cDNA，并通过转基因基因互补进行功能检测英尺10英寸突变体。候选基因的转基因表达TcFT晚开花拟南芥的cDNA英尺10英寸部分挽救了突变体到野生型的开花时间。基因表达研究揭示了这一点TcFT在时间和空间上的表达方式与拟南芥中的表达方式相似，具体来说，TcFT在叶片中，mRNA被证明在发育和日调节中都存在，并且在花组织中最为丰富。最后，为了测试花原素的种间相容性，我们用AtFT在组织培养中形成显著的花。这些体外花的形态是正常的，它们产生的花粉在体外萌发率很高。

结论

我们已经鉴别出可可豆了香港工商界被子植物发育调控的核心基因家族。可可的角色是单一的英国《金融时报》,就像基因(TcFT)作为可可中确定生长的一般调节剂，在拟南芥的功能互补中得到证实英尺10英寸晚开花突变体和通过基因表达分析。此外，过表达AtFT在可可组织培养中导致早熟开花，显示出高度保守的功能英国《金融时报》以及控制可可开花的机制。

Theobroma可可可可豆是一种经济作物，也是可可豆的唯一来源，可可豆是巧克力产品的主要原料，可可粉和可可油的来源。它在巧克力制造业中独特而关键的作用使其成为非洲、中南美洲和南亚发展中国家的重要出口产品，这些国家主要种植可可。可可种植受到许多因素的限制，包括造成全球损失20-30%的几种真菌、卵菌和病毒疾病[1］．巨大的致病性损失使得提高抗病性的研究和育种对于作物未来的可持续性和改善农民生计至关重要[2］．除了改善抗病性状外，可可育种者还积极寻求改善可可品质性状的途径，如风味、有益健康的代谢物、气候弹性和提高产量。然而，由于可可幼树的寿命和林木作物系统的高育种成本严重限制了育种项目的进展，因此控制开花时间具有科学和实际意义。

原产于热带中美洲[3.]，可可是一种林下树，主要生长在世界各地与赤道纬度20°以内的雨林地区。可可和大多数树木一样，在繁殖发育方面有三个主要的生长阶段:第一阶段。可可树的幼龄生长是直立和正交各向异性的，所有的气生器官具有放射状的叶状分生组织产生于茎尖分生组织。最初的正交各向异性生长决定了未来树木的主干[4］．阶段2。大约2年后，发生阶段变化，植物过渡到成虫阶段[5］．茎尖被吞噬，取而代之的是3-5个斜向(侧向)茎分生组织[4这种植物产生了叶状花序互生的枝条。乔木树的斜向分枝构成了一棵成年可可树的树冠。人们相信乔格特可可树已经达到了繁殖的能力。阶段3。在乔木生长后不久，可可就进入生殖发育阶段t .可可茎生的，花来自于树干和主枝，从脱落叶的腋的休眠的腋生分生组织开始。可可花发育的形态学和解剖学研究表明，它与模式植物拟南芥(Arabidopsis)具有高度保守的调控途径和基因[6］．本研究通过描述参与相变依赖性花诱导的关键调控蛋白的编码基因功能，扩展了对可可分生组织从营养向花分化的控制机制的认识。

分生组织从营养性发育到花性发育的转变是由发育、生理和环境刺激的巧合控制的，这些刺激通过一组复杂的相互作用网络串联起来。对花转变机制的初步研究表明，存在一种保守的移动信号——成花原，它在叶片中产生，并在光周期的响应下传递到芽分生组织[7，8，9］．成花素成为植物生理学长期寻找的“圣杯”，直到本世纪，Eliezer Lifschitz和他的合作者证明了成花素和番茄之间1:1的遗传关系开花地点t (ft)直接同源,单花桁架（SFT)[10］．在一组令人印象深刻的实验中，作者演示了SFT除了在光周期和日中性的物种中产生其他多效性效应外，还能产生移植物传递刺激，从而取代一系列不同的环境刺激。重要的是，作者可以检测到SFT蛋白，但没有转基因SFT受体组织中的mRNA。随后的研究表明，在模型植物拟南芥(AtFT)中，FT同源蛋白从合成叶组织向功能性顶端组织(开花)的维管运动[11，12，13和在大米中[14］．这说明FT同源信号是致花因子，是一种对开花植物光周期响应的调节开花时间的保守移动信号。

开花轨迹T（英国《金融时报》)是CENTRORADIALIS /终端FLOWER1 /自我修剪（香港工商界)植物基因家族[10］．除了在光周期控制开花时间方面的致花作用外，英国《金融时报》是导致生殖生长过渡的几种已知途径的重要集成器，包括环境温度、自主和春化途径[15］．英国《金融时报》还被证明具有多效性，最近被定义为一种协调植物发育过程的通用生长调节剂[10，16］．

大量研究证实英国《金融时报》的花期控制导致生物技术和农艺方法的出现，以加速和控制花的发育和结实[17］．例如，异位过表达英国《金融时报》转基因长世代植物中的基因已被用于加速开花，缩短世代时间，以辅助育种计划。策略包括过表达、诱导表达和基于病毒的表达英国《金融时报》已经证明可以促进一些物种的早开花，包括杨树、棉花和苹果[18，19，20.，21，22，23］．

在这里，我们描述了我们识别可可的工作香港工商界基因候选种和可可候选种的特征英国《金融时报》基因(Tc05v2_g009810)。我们证明可可的候选人TcFT能部分挽救拟南芥的晚开花表型吗英尺10英寸突变体。基因表达分析表明TcFT它的叶片表达在发育和日变化上都受到调控，其方式与一些物种的发花同源基因的表达相似。在我们的分析中，我们还发现类似于拟南芥中的表达，TcFTmRNA在花期后形成的组织中最为丰富，这表明TcFT稳定可可的生殖发育。最后，可可体细胞胚稳定表达AtFT能在离体培养中开花。我们的研究结果表明，在模式植物拟南芥和可可之间，调节开花的主要机制是高度保守和相互兼容的，估计这两个物种大约已经分化。九千万年前[24，25］．

识别可可香港工商界基因家族

以拟南芥FT、TFL1和CENTRORADIALIS (ATC)蛋白序列为查询对象，对7种可可进行了鉴定香港工商界e值小于5 × 10的基因⁻¹⁶BLASTp搜索Theobroma可可Belizian Criollo B97-61 /B2 v2 (Criollo)基因组([26，27];表的年代1)，以及六项假定香港工商界Matina1-6基因([28，29];表的年代2)．

与拟南芥、棉花、番茄和苔藓的CETS蛋白一起，对候选可可CETS蛋白的全长多肽进行系统发育分析(蛋白质名称和id见表S3.)．与之前对其他物种CETS蛋白的分析一致，可可CETS分为三个不同的分支:母枝FT和TFL1- LIKE (MFT-L)、开花位点T-LIKE (FT- l)和终末花1/自我修剪样(TFL1/SP-L)(图1)。1)[30.，31，32，33］．Criollo基因组包含三个假定的CETS, Tc03v2_g003780, Tc06v2_g016620和Tc06v2_g016640，分组在家族的MFT-L亚群中。Tc05v2_g009810，被命名为TcFT，由可可中的FT-L亚群组成，与AtFT有76.4%的氨基酸序列相同(图4)。2)．三种可可cts被分组在TFL1/SP-L枝中。一个候选TcTFL1 Tc05v2_g007510与AtTFL1有71.1%的氨基酸序列相同。候选TcSP Tc09v2_g023800与SlSP和拟南芥ATC属于TFL1/SP组的一个子组，与ATC具有80%的序列一致性(图1)。1和表年代1)．候选TcBFT, Tc03v2_g014270，是最终的TFL1/SP-L可可CETS，与拟南芥的BROTHER of FT和TFL1同属于一个亚群(图1)。1)．

CETS蛋白包含两个结构域，一个高度保守的阴离子结合位点和一个外环(外显子4段B)，被证明对功能至关重要[34，35］．我们的多序列比对(图。2a)证明了7个确定的Criollo CETS预测多肽序列都保留了功能重要的结构域，并保留了保守的短DPDxP和GxHR基序的保守性[36在这些领域内。此外，候选TcFT (Tc05v2_g009810)是唯一保存在Tyr-85和外显子4片段B和D中的可可CETS，被定义为FT功能的关键[34］．

的表达TcFT可可叶的发育受调控吗

为了表征候选基因的表达谱TcFT,我们使用RT-qPCR检测了scavna -6营养树(1.5年生)和开花树(2.5-3.5年生)的多个组织中的转录水平，包括发育阶段A、C和E的叶子(定义在[37])，根，各向异性和斜向的腋芽，斜向的枝尖，花芽和开放的花。候选人TcFT在营养植物和开花植物的所有六种叶片组织类型中都有表达。3.)．在营养树和开花树的成熟叶(E期)中，表达量显著高于幼叶(A期)和发育叶(C期)。具体而言，在营养树中E的表达量分别是A和C的172倍和166倍，而在成树中E的表达量分别是A和C的25倍和7.5倍(p> 0.05,无花果。3.)．这些结果表明，可可的候选人英国《金融时报》基因表达水平随着叶龄的增加而增加，类似于番茄的成花原[10］．这些结果与候选人的假设是一致的TcFT是可可的成花原同源物。

TcFT在花组织中表达量最高

比较所有测定的组织，发现花组织积累TcFTmRNA的含量最高。我们发现与营养树和开花树的顶端组织相比，花组织中的表达更高(末端和腋窝;无花果。3.b)。TcFT除营养树的斜向腋芽和开花树的斜向顶尖外，在所有被测的芽、顶和花组织中均有表达。花芽表达量分别比开花树木的正向和斜向腋芽表达量高96倍和27倍，比斜向顶尖表达量高136倍(p> 0.05)，分别，(图。3.)．此外，花芽表达量观察到比任何测试的铅组织高10倍- 1500倍(p> 0.01或p> 1.001,无花果。3.)．广泛的研究英国《金融时报》在拟南芥和其他物种中发现了多效性英国《金融时报》表达式。尤其是花卉和水果AtFT表达已被证实通过维持最近发育的花序分生组织的逆转阻断，参与稳定受精后的生殖生长[38］．我们的结果表明，与拟南芥相似，TcFT与生长中的芽相比，生殖组织中的表达更高。这一观察结果表明TcFT也可起到稳定可可花发育的作用。

TcFT在成熟的可可叶中是否有每日的调节

的表达式TcFT在更深入的叶片中，我们检测了其在完全成熟(E期)的Scavina-6叶片中相对于日周期的表达。E阶段的叶子在24小时内每4小时从温室生长的开花树木中收集一次。而表达TcFT在这些叶子中含量普遍较低，在黎明后8小时出现了一个显著的表达高峰(p> 0.0001到单因素方差分析中每一个其他时间点的平均值)，然后在一天的剩余时间里，直到第二天黎明，恢复峰值前的表达水平。黎明后12小时的表达量也显著高于黎明(p< 0.05)和黎明后4 h (p< 0.01)，但低于黎明后8小时(p< 0.05,无花果。4)．这个结果类似于英国《金融时报》在几个物种中表达英国《金融时报》具有每日表达模式的正相学。TcFT表达模式在中午达到峰值，与拟南芥相反英国《金融时报》在黄昏前达到表达峰值，随后在夜间恢复到基线表达[13，39，40，41，42，43］．

拟南芥突变体的转基因互补，英尺10英寸与候选人TcFT基因

以确定候选人是否TcFT我们对拟南芥晚开花突变体进行了转基因互补，英尺10英寸(FT失去功能)，在长时间的条件下，它的相变非常延迟。与野生型col0相比，在大约15叶发育后开花，英尺10英寸在> 40莲座叶形成后开始开花[44］．用含有候选植株编码序列的二进制矢量分别对突变株进行转化TcFT由E12-Ω改良CaMV 35S本构启动子驱动[45]和一个主干矢量控制(VC)。通过抗生素抗性筛选，筛选到多个独立的转基因株系，并对其开花时间性状进行评价。

昼16小时/夜8小时光周期生长，英尺10英寸,VC转化株的开花时间比野生型Col-0晚约16天，其莲座叶和茎生叶数量是野生型Col-0的3倍，次生花序数量是野生型Col-0的2倍。5模拟)。拟南芥英尺10英寸突变体，表达了很高的TcFT,花期早12 ~ 13天英尺10英寸和T₁对照病媒植物，但比野生型植物晚4天(图5)。5a和b)。这与假设是一致的TcFT编码一种与AtFT功能同源的蛋白质，并能与拟南芥组织中的其他蛋白质相互作用，诱导植物从营养发育过渡到花发育。

平均而言,E-12Ω::TcFT转基因植物的叶片总数比转基因植物少13和15片英尺10英寸和对照病媒植物，比野生型多3片叶(图2)。5a和c).的表达式E-12Ω::TcFT还改变了分支体系结构英尺10英寸背景。而英尺10英寸控制载体系均不能产生次级花序E-12Ω::TcFT野生型从莲座丛叶的腋芽中平均产生3个次生花序。5a和d)，有趣的是，独立T₁E-12Ω::AtFT品系表现出更强的表型，花期比WT早8天，叶片早8个TcFT在其积极调节花的转变或功能在异系环境次优。我们已经在拟南芥中观察到这种与其他几个可可基因的部分转基因互补，这些基因在功能上具有异源性。46，47，48，49］．总之，这些数据证实了这一点TcFT促进生殖发育，达到与内源性相当的水平AtFT但在拟南芥中过度表达英尺10英寸突变体比AtFT．综上所述，我们的研究结果有力地支持了可可基因座Tc05v2_g009810编码的功能同源物的结论AtFT这种基因存在于可可基因组中。

用可可稳定转化AtFT导致体细胞胚早开花

证明了的同源性质TcFT而且AtFT通过系统发育、功能和基因表达分析，我们下一步从可可次级体细胞胚胎转化子叶[50)与E-12Ω::TcFT或E-12Ω::AtFT超表达结构。两种过表达结构的转化导致了几个异常胚胎的再生，这些异常胚胎生长延迟，生长停滞，没有发育根或芽(数据未显示)。只有一个转换事件E-12Ω::AtFT结果再生了五个在早期发育中表现正常的转基因胚胎。将这些胚胎的子叶切除，进行组织培养，再生额外的胚胎，建立转基因系。为了产生更多的胚胎，从转基因E-12 Ω开始再生:: AtFT子叶很多次了。大约在原始转化1年后，15个转基因胚胎在组织培养中产生一个或多个真叶后开始开花。单花或花簇主要产生于转基因植株的茎尖。6A-c)，但偶尔观察到在叶腋形成花(未显示)。花产生后不久，转基因胚胎停止生长，所有的芽和根组织死亡。

9朵由组织培养植物产生的花被解剖以评估形态完整性(图。6)．所有被观察到的花都具有正常的花器官组成，有4个轮系:一个轮系有5个萼片，一个轮系有5个花瓣，一个轮系有5个雄蕊和5个退化雄蕊，一个轮系有5个融合的心皮。所有AtFT观察到的转基因花的生殖结构(雄蕊和最内轮生的心皮)，与用于转化的基因型PSU-Sca6树的花的生殖结构相比，其外观更暗(棕色vs.白色)。6d e)。为了确定早熟的花朵是否有能力产生有活力的花粉粒，花粉的活力AtFT转基因花卉(n= 2)与温室生长的PSU-Sca6对照花的花粉一起鉴定。开花时和开花后1天的转基因花粉萌发率差异较大，分别为68.6和4.7%，平均发芽率为36.6%。这一结果与PSU-Sca6对照花在相似的实验条件下测试的结果相似。7a-d和表S4)．对照花粉的最高发芽率记录在花朵在28°C下孵育4小时，花粉在26°C下体外萌发(表S4,无花果。7a和e)。虽然这些结果表明，早熟的花产生于过度表达AtFT在产生活花粉的可可体细胞胚中，我们多次尝试都未能成功地为温室种植的植物授粉(数据未显示)。

英国《金融时报》是CETS基因家族的一员吗，一个古老的基因家族，所有形式的生命都有它的成员。在被子植物中，该基因家族的复杂性差异很大。近亲,t .可可拟南芥和棉花的家族结构相对较小，分别为6名和8名成员，而单子稻则是如此玉米小麦将家庭结构扩大到23和19香港工商界基因,分别10，23，31，32］．在目前的研究中，我们确定了7个高度保守的候选家族成员Theobroma可可香港工商界基因家族，这与之前研究的最近的近亲中发现的基因数量相似。与可可最近的亲戚棉花(有完整的参考基因组)相似，可可只包含一个功能成花原同源物，而拟南芥包含两个功能成花原(AtFT而且AtTSF)[11，12，13，51］．此外,虽然TFL1 / SP-L分支在棉花中扩展到五个成员，在可可中，这个分支只包含三个成员，TcTFL1 TcSP,而且TcBFT．棉花和可可都含有多种维生素分区,-L基因显示了一种可能发生在这些物种分化之前的复制。除了两个共享分区,基因方面，可可的基因组中有三分之一被截断分区,- l基因,TcMFT-L3，编码一个截断的小肽，由最关键的残基组成香港工商界功能。

为了评估的作用TcFT在花期调控中，我们在晚花期过表达其编码序列英尺10英寸拟南芥突变体，其开花时间和分枝结构恢复到野生型表型TcFT成为…的功能正交物AtFT。英国《金融时报》在拟南芥和作物中过度表达的许多物种的同源基因导致了早开花。

一般来说，表达式的TcFT的表达式类似AtFT［13，38，52］．也就是说，这两个物种的表达都是发育和每日调节的。英国《金融时报》是几种负责诱导被子植物向生殖生长过渡的信号转导通路的主要集成器[15，53］．综合研究表明，这一作用在许多物种中都是保守的，包括光周期植物和日中性植物。我们发现TcFT表达量随叶的成熟而增加，其变化规律与紫檀相似AtFT还有被广泛研究的番茄成花素，SFT［10］．这种叶片表达模式与英国《金融时报》作为一种决定生长的一般促进剂或促进花转化的促进剂。

的TcFT基因在花组织中表达，与在拟南芥中的表达一致[54，55］．正如前面讨论的,AtFT花组织表达与附近花序和花分生组织的稳定有关[38］．可可花在成年可可树的主干和主干上的脱落叶的腋开始。花序从枝上的同一地点反复生长，最终形成由许多压缩的蝎尾状聚伞花序组成的花垫[56］．对具有不同坐垫密度(花数/坐垫数)的可可品种的生长素浓度的调查表明，花密度与花生长素浓度呈负相关[57］．在同一项研究中，外源生长素的应用与不亲和授粉中花和果的保持增加呈正相关，这使得作者得出结论，激素水平通过一种未知的遗传因素控制可可自亲和。我们的结果表明，拟南芥的基因表达模式是保守的英国《金融时报》表明,TcFT可能通过向附近的分生组织发出信号来稳定可可的繁殖发育，从而产生繁殖结构TcFT花组织中的表达可能影响垫层密度。更多的研究证明了这一点TcFT具有不同坐垫密度表型和/或内生生长素含量的无性系的花表达变化可以揭示两者之间难以捉摸的联系英国《金融时报》而生长素除了发现基因与可可自交不亲和的激素控制有关外。

在这里，我们提出了第一个报告的ft工程早开花在可可。我们试图再生可可胚转化成TcFT在早期生长过程中，少数转化胚胎死亡。TcFT过表达导致发育异常，使正常胚胎无法成功发育，这似乎是合理的。有可能使用更弱或更强的组织特异性启动子，我们可以克服这个障碍。有趣的是，我们能够再生一个转基因体细胞胚胎表达AtFT(无花果。6)作为外植体，通过连续体细胞胚胎发生建立转基因系。利用建立的协议，选择成熟的体细胞胚胎转移到转化培养基上发育成植株。在组织培养转化条件下，植株发育出一个或多个真叶，随后在茎尖分生组织发育出形态正常的单花或顶花簇。需要注意的是，20年来，我们的课课组使用农杆菌介导的转化方法，使用相同的二元载体，融合了各种转基因E-12 Ω启动子和35S终止子，生成了大量的可可转基因体胚，但我们从未观察到组织培养中的花发育，也没有观察到年轻体胚衍生植株的早期花发育。然而，我们的结果与观察到的体外开花的其他植物物种过表达相似英国《金融时报》直接同源。第一个报告的幼树转基因树产生花序描述农杆菌介导的雄性转化白杨和女性p . tremula干细胞与35 s:: PtFT1转化后4周观察花发育。作者报告了正常的花发育，但注意到只有表达弱的株系能够在温室中再生[58］．在苹果中，两篇报道描述了体外开花的应用35 s:: MdFT1转化后8-12个月导致苹果无性系开花[59，60］．转基因苹果植株还被描述为生长习性较弱，经常衰老，花朵偶尔出现异常形态[59］．

除了正常的花形态外，花粉来自AtFT体外萌发试验表明转基因植株是可行的。这一结果表明，从可可组织培养中获得的转基因花粉有潜力作为供体遗传物质用于杂交，可以显著加速可可育种。目前方案的一个缺点是转基因胚胎在最初的花产生后过早死亡。这很可能是构成AtFT这些胚胎的表达迅速推动所有生长中的植物组织进入终末状态。在物种上，如苹果[61和poplar [19]利用诱导启动子(如热激启动子)促进转基因植物生长。同样，允许诱导/控制FT表达的结构可能有利于可可的转化。

我们已经确定并描述了可可的成员香港工商界基因家族和证明候选人TcFT成花原基因在与英国《金融时报》其他物种的基因表达。过度的TcFT在一个晚开花的拟南芥突变体中，部分恢复了正常的野生型开花时间，显示了其促进开花过渡的潜力。此外，异源表达AtFT在可可组织中，可可体细胞胚产生花，产生活花粉。总的来说，我们的结果支持这样的结论:TcFT(Tc05v2_g009810)编码了AtFT的一个进化保守的功能同源序列，表明通过FT诱导控制花的机制在可可和拟南芥之间基本保守。

植物材料和生长条件

拟南芥种子来自拟南芥生物资源中心(Columbia-0 (Col-0))和英尺10英寸(ABRC，库存号CS9869)，并在土壤或半强度MS培养基(PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS, USA)上发芽，添加1%蔗糖。种子在4℃下分层3天，转移到Conviron步入式生长室中生长，昼长如文中所示(22/18℃/夜)，光强120-150 μmol光子m⁻²年代⁻¹在叶水平。Theobroma可可scavna -6和一个亲缘关系很近的PSU-Sca6，是作为温室生长树木的根茎扦插繁殖的，这些树木原产于美国农业部亚热带亚热带研究站，位于波多黎各Mayaguez，这些研究中使用的PSU-Sca6树木原产于美国农业部亚热带研究站，位于波多黎各Mayaguez，以及这些树木的无性系繁殖(通过根茎扦插繁殖)树。在温室条件下，将Sca-6和PSU-Sca6树种植在硅砂和珍珠岩混合(2:1)的花盆中。这些植物的进口和生长遵循美国农业部的所有相关指导方针，并在宾夕法尼亚州立研究保护办公室规定的BL-2级温室中种植。湿度保持在60%，光周期设置为16 h亮/29°C, 8 h暗/26°C。根据需要，补充自然光430-W高压钠灯，以维持250 mmol m的最低光照水平⁻²年代⁻¹PAR，而自动伸缩遮阳限制光水平到1000 mmol m的最大值⁻²s -¹每日多次使用十分之一强度的霍格兰营养液(160 ppm N)灌溉，以保持足够的水分。

系统发育分析

可可香港工商界通过BLASTp搜索对两种基因进行鉴定Theobroma可可基因组:Criollo B97-61 /B2 v2 ([26，27];e值截止1E-10)和Matina1-6 v1.1 ([28，29];e值截断1E-05)基因组使用拟南芥FT (AT1G65480.1)、TFL1 (AT5G03840.1)和ATC (AT2G27550)蛋白质序列作为查询[26，28］．预测的CETS多肽序列的功能关键域t .可可与拟南芥中CETS蛋白的相应结构域(答:芥)、番茄(茄属植物lycopersicum),棉花(陆地棉)，和苔藓(Physcomitrella金属盘)使用在genous Prime 2019.2.1中实现的MUSCLE 3.8.425 [62，63］．基于多序列比对的系统发育树，在Mega 7中采用邻居连接方法进行自举检验[64，65］．如图所示，得到树枝总长度为5.57896991的最优树。1)．在自举测试中，相关类群聚集在一起的复制树的百分比(1000个重复)列在枝条旁边[66］．进化距离使用基于JTT矩阵的方法计算，以每个位点的氨基酸取代数为单位[67］．分析涉及43个氨基酸序列。每个序列对的所有歧义位置都被删除。在最终的数据集中，共有237个职位。系统发生树的根是来自远亲苔藓的MFT-L序列Physcomitrella金属盘．所有用于分析的蛋白质序列的登录号列于补充表3(表S3.)．

向量构造

克隆是利用普通的分子生物学技术[68］．限制性内切酶来自New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, USA)。通过IDT (Coralville, IA, USA)合成寡核苷酸。所有构建物均通过限制性内切酶(NEB)和DNA序列验证(宾夕法尼亚州立核酸设施，University Park, PA, USA)进行分析。

总RNA从黄芩的成熟叶片中分离得到t .可可Scavina-6(100毫克)和拟南芥哥伦比亚-0莲座叶(100毫克)，使用Purelink植物RNA试剂(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)进行如下小改动:在冰冻地面组织中加入1 mL植物试剂，在氯仿提取前向样品中加入0.2 mL 5 M NaCl，第一次氯仿提取用0.6 mL氯仿，第二次氯仿提取用与水层等量的氯仿进行，16000 g离心。的编码序列TcFT AtFT,从每个植物物种中提取1 μg总RNA，用DNaseI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)处理，并用寡聚dT反转录₂₃底漆和M-MLV RT (Promega, Madison, WI, USA)。用Phusion聚合酶(NEB)和引物TcFT_SpeI_f: 5 ' -CGA CTA GTA TGC CTA GAG AAA GAG ACC CCT TG-3 '和TcFT_HpaI_r: 5 ' -CGG TTA ACT CAT CGC CTC CGG CCT CC-3 '或AtFT_SpeI_f: 5 ' -CGA CTA GTA TGT CTA TAA ATA TAA GAG ACC-3 '和AtFT_HpaI_r: 5 ' -CGA CTA ta TAA AGT CTT CCT CC-3 '扩增相应片段。PCR产物钝克隆到克隆载体pMiniT2.0 (NEB)中，转化为化学活性的10-beta大肠杆菌根据制造商的说明(在这里提供工具包和制造信息)。两个物种的编码序列通过SpeI/HpaI消化释放，克隆到二元载体pGZ12.0501 (GenBank: KF871320.1)中E12-Ω启动子后面的相同位点，创建E12-Ωpro::TcFT向量pGSp18.0102(无花果。S1， GenBank MN856144)和E12-Ωpro::AtFT矢量pGSp18.0129(图S2,基因库MN856143)。

拟南芥转化与表型分析

采用电穿孔法将二元载体导入AGL1农杆菌中。拟南芥的英尺10英寸突变体(ABRC库存# CS9869)与pGSh17.0404(骨干载体控制，GenBank MN856142)、pGSp18.0102 (E12-Ωpro::TcFT)或pGSp18.0129 (E12-Ωpro::AtFT)通过花浸法(Clough and Bent, 1998)，并用卡那霉素(100 mg l⁻¹)．转化植株T1代进行分析。选择后，T1植株转入土壤，在16/8昼夜条件下生长。如前所述，对植物的开花时间和结构性状进行表型分析[69］．

表达分析

为了进行时空表达分析，从1.5年生(营养)和2.5-3.5年生(开花)的Scavina-6温室种植的植物中获取叶片组织，在上午11点至下午1点之间在液氮中快速冷冻。对每种组织类型进行3个生物重复分析。使用臼和杵将组织均质，使用Purelink植物RNA试剂(Life Technologies)分离总RNA，并进行如上所述的微小修改。RNA样本用DNase I(赛默飞世尔科学公司)处理。1.6 μg RNA使用SuperScript IV逆转录酶(Thermo Fisher Scientific)进行cDNA合成。研究…的日变化TcFT在24小时的过程中，每4小时从树上收集一次Scavina-6成熟(E期)叶子组织。每个时间点采集4个生物重复。组织均质和RNA提取如上所述。1.4 μg RNA使用SuperScript IV逆转录酶(Invitrogen)进行cDNA合成。所有qRT-PCR反应均使用ABI 7300 StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)和SYBR预混合Ex Taq试剂(Takara Bio USA, Mountain View, CA)进行，所用寡核苷酸见补充表5(表S5)．反应在10 μL的体积中进行，最终引物浓度为0.4 μM。qPCR循环参数为:95°C 10 min, 95°C 15 s, 60°C 30 s, 72°C 40 s，然后进行解离曲线分析。反应在技术三份中进行。采用qbase+ 3.2版本软件进行定量RT-PCR数据分析，包括内参基因稳定性、ΔΔCt和统计分析[70］．

可可稳定转换

为了检验的功能英国《金融时报》在可可系统中，我们转化了PSU-Sca6次级体细胞胚子叶，如前所述[74]，具体修改如下根癌土壤杆菌含有载体pGSh17.0404、pGSp18.0102或pGSp18.0129之一的菌株AGL1。转化协议修改包括:细菌培养在28°C生长一夜，在600 nm测量光密度;523培养基(蔗糖10 g/L，酪蛋白酶解物8 g/L，酵母提取物4 g/L, K 2 g/L₂阿宝₄、0.15 g/L MgSO₄)用于细菌培养的诱导;将30-35株可可子叶外植体加入50 mL含农菌的Falcon培养基中，523培养基;所有超声步骤进行100 s;外植体感染的方法为:以50转/分、28°C的速度将Falcon管侧向摇晃20分钟，然后吸菌培养，然后将外植体转移到固体组织培养基中;外植体与农在固体培养基上培养72 h。培养开始4周后首先观察培养，然后每隔一周观察一次，如上所述[50］．如前所述，通过从头再生培养和繁殖表达报告基因eGFP的转基因胚胎[50］．

转基因和控制花粉离体萌发

在25°C下生长的转基因胚胎的花在离体萌发开始前立即切除。从温室树(如上所述)中采摘刚开放的PSU-Sca6(对照)花从早上8点到9点，在四种预孵育环境中:室温(23°C)、28°C培养箱、37°C培养箱或温室(26°C)中的一种中，在副膜密封玻璃组织培养罐中孵育4小时。转基因植株和对照植株的花粉按照前文[75,76]的方法在体外萌发:将10 μL滴的液体培养基制备在玻璃微载玻片上。将三个花药刷到培养基滴上播种花粉。试验载玻片在100 × 15的湿滤纸衬里的培养皿中密封过夜。转基因花粉只在23°C条件下进行评估，而对照花粉在23°C和温室条件(26°C)下进行评估，以确定最佳条件。测定花粉萌发的培养基组成:10%蔗糖，100ppm硼酸，300ppm硝酸钙，200ppm硫酸镁。对照花的花粉也培养在不同渗透性的培养基上:20或30%的蔗糖和0%或15%的PEG4000。用Reishart Microstar IV复合光学显微镜在20倍放大下观察花粉管的膨胀，以确定萌发。使用Camera Control Pro 2软件(尼康，美国)和附带显微镜的相机捕获图像。

资料及资料可向M. Guiltinan (mjg9@psu.edu)或测序数据，请访问NIH Genbank数据库。

空中交通管制:

拟南芥Centroradialis

BFT:

FT和TFL1的兄弟

香港工商界:

Centroradialis /终端Flower1 /自我修剪

英国《金融时报》:

开花轨迹T

建议:

FT和tfl之母

PEBP:

Phosphytidylethanolamine结合蛋白

SFT:

单花桁架

SP:

自我修剪

TFL1:

终端Flower1

我们感谢Lena Landherr和Melanie Perryman对可可外植体的转化和胚胎的再生。感谢Evelyn Kulesza在我们试图生成AtFT用转基因花粉人工授粉成熟可可树的转基因可可后代。我们感谢伊森·多曼和艾丽西娅·迪肯森在RNA提取方面的帮助。感谢杨怡农博士慷慨地使用ABI StepOnePlus进行qPCR分析。

这项工作得到了宾夕法尼亚州立大学农业科学学院、哈克生命科学研究所、宾夕法尼亚州立大学可可分子生物学捐赠项目和美国农业部国家食品和农业研究所的支持，PEN04569项目和注册号1003147的联邦拨款为设施和工资提供了一般资金。这些实体在设计样本的收集、分析和数据解释中都没有作用，在撰写手稿中也没有作用。亿滋国际公司为第一和第二作者提供工资，并为所有分子研究提供资金。亿滋的代表对研究目标进行了一般性的输入，定期收到进展的更新，审查了手稿并提出了小的编辑建议。

从属关系

1. 美国宾夕法尼亚州州立大学植物科学系

   S. F. Prewitt, A. Shalit-Kaneh, S. N. Maximova和M. J. Guiltinan

2. 哈克生命科学研究所，宾夕法尼亚州立大学，大学公园，美国宾夕法尼亚州

   S. N.马克西莫瓦和M. J.吉尔提南

贡献

所有作者都对研究的构思和设计做出了贡献。SFP和ASK设计并进行了实验;SFP分析数据并撰写稿件;ASK、SM和MJG编辑了手稿。所有作者均已阅读并认可该手稿。

相应的作者

对应到m . j . Guiltinan．

伦理批准和同意参与

不适用。

同意出版

所有作者均同意出版条款。

相互竞争的利益

作者声明他们没有完成权益。

出版商的注意

施普林格自然对出版的地图和机构附属的管辖权要求保持中立。

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