谷物CSP 310和CSP 310样蛋白对线粒体能量活性和脂质过氧化的影响在体外和在活的有机体内

背景

已知植物中冷却和冷冻损伤症状的发展经常与游离脂肪酸的过氧化相一致。线粒体是冷应激期间活性氧物质的主要来源之一。最近，已经提出，在氧化应激期间线粒体中的氧化和磷酸化的解耦可以降低线粒体呼吸链产生的ROS形成。同时，已知植物解耦线粒体蛋白（泵）和其他UCP样蛋白不是植物线粒体中唯一的解耦系统。所有植物都具有抗氰化物抗氧化酶（AOX），其活化导致呼吸和氧化磷酸化的脱模。最近发现，在谷物中，存在冷应激蛋白CSP 310，这导致线粒体中的氧化和磷酸化的脱模。

结果

我们研究了一些谷类植物(冬麦，冬小麦，小麦，小麦，小麦，小麦，小麦，小麦，玉米，玉米，玉米，玉米，玉米，玉米，玉米)的CSP 310类天然细胞质蛋白的影响。Elymus.和玉米）冬小麦线粒体的能量活动。这表明只有CSP 310（具有分子量310kd的冷休克蛋白）导致非磷酸化呼吸的显着增加。所研究的其他谷物的CSP 310样蛋白质对线粒体能量活动没有任何显着影响。发现，在CSP 310样蛋白中，只有CSP 310具有过约氧活性。同时，Elymus.CSP 310样蛋白具有抗氧化活性。不同植物解耦系统激活剂(激活AOX的丙酮酸和泵和CSP 310的底物和激活剂亚油酸)对渗透的影响研究表明，所有这些都降低了冷胁迫下的脂质过氧化。

结论

CSP 310样蛋白对线粒体能量活性和脂质过氧化的不同影响可能取决于它们组合物中的各种亚基组合。所有导致植物线粒体中氧化和磷酸化脱模的植物细胞系统都可以在冷应激期间从氧化损伤中参与植物防御。

植物中冷害和冻害症状的发展通常与游离脂肪酸的过氧化反应相一致[1]。过氧化氢和丙二醛水平通常会因冻融应激而增加，这表明脂质过氧化[2导致结构和功能性膜和膜蛋白的变化[3.]。已经表明，线粒体是超氧化物的主要来源之一，它是一种强大的氧化剂，在低温下的冷却敏感植物组织中[4.]。即使在无应激条件下，线粒体中也有1 - 2%的氧被复合物I中的铁硫中心还原，部分被还原的泛素和细胞色素还原b在复合体III中构成物转化为超氧化物[5.那6.]。线粒体也是低分子量铁积累的主要场所²⁺复合物，诱导膜中的脂质过氧化[7.那8.]。

还显示出冷应激导致许多植物物种中的抗氧化水平增加。此外，已经发现，在红云杉的冷适应过程中表达了谷胱甘肽还原酶的不同同工酶（Picea Rubens.)针。其中一种被认为是冷适应蛋白[9.]。近年来研究发现，在线粒体中还存在着参与细胞抗氧化防御系统的另一种生理机制。V.P. Skulachev认为氧化应激过程中线粒体氧化和磷酸化的解耦可以减少线粒体呼吸链产生ROS [10.]。最近对植物ucp样解耦蛋白如PUMP等的研究支持了这一观点。例如，我们发现对马铃薯块茎线粒体PUMP活性的抑制显著增加了线粒体H₂O₂一代。还发现，与亚油酸和其他游离脂肪酸的UCP样蛋白质的这样的UCP样果壳减少了线粒体H.₂O₂一代(11.那12.]。然而，需要注意的是，分离细胞器和整个植物细胞在同一处理下的反应可能不同。同时，我们知道，在植物线粒体中，PUMP和其他类似ucp的蛋白并不是唯一的解偶联系统。所有植物在线粒体中都有这样一种机制，即抗氰化物氧化酶(AOX)，它在冷胁迫时的激活会导致呼吸和氧化磷酸化的解偶联[13.]。最近，已经发现，在谷物中，如冬小麦和冬季黑麦，存在冷应激蛋白CSP 310 [14.[还在冷应激期间导致线粒体中的呼吸和氧化磷酸化的脱位[15.]。研究发现，与其他已知的解偶联蛋白不同，在分离的冬小麦线粒体中添加CSP 310可诱导抗坏血酸依赖和nadh依赖的脂质过氧化系统[16.]。另一方面，已经表明，通过特异性抗血清的CSP 310抑制增加了分离的线粒体中的脂质过氧化[17.]。因此，确定在整个冬小麦幼苗中CSP 310活性、促氧化剂或抗氧化剂是最显著的是很有趣的。

同时，已经建立了与CSP 310中的蛋白质中的“家族”的存在已经建立在谷物中。早些时候已经表明，细胞质中存在CSP 310样本地蛋白[18.]和线粒体[19.]，并且CSP 310可以与线粒体结合并与线粒体分离[20.]。同时，CSP 310存在于所有物种的线粒体蛋白中，但该蛋白存在于冬黑麦中，仅在冬小麦细胞质蛋白中含量较低。采用仿射色谱法在固定化brcn活化的Sepharose抗CSP 310的柱上制备CSP 310样细胞质蛋白的抗血清Elymus.被获得。这些准备包括470 KD, 310 KD, 230 KD,大约140 KD, 66 KD和56 KD蛋白从冬季黑麦、310 KD, 230 KD,大约140 KD,从冬小麦66 KD和56 KD, 230 KD,大约140 KD, 66 KD和56 KD从玉米和380 - 330 KD, 230 KD,大约140 KD, 66 KD和54 KD蛋白大。所有这些蛋白质由两种类型的亚基组成[18.]。与此同时，天然谷物蛋白光谱的差异使得我们可以假设它们对线粒体能量活动和脂质过氧化的影响存在差异。

本研究的目的是研究某些谷类植物csp310相关蛋白对冬小麦线粒体能量活性和脂质过氧化的影响在体外我们还旨在检验植物解耦系统激活对冬小麦幼苗幼苗芽脂菌芽的影响。

黑麦、冬小麦、小麦中CSP 310相关蛋白的免疫化学影响Elymus.玉米冬小麦线粒体在体温过低时的功能活动在体外如表所示1。在孵化开始的开始，从冬小麦幼苗幼苗射击线粒体具有高能量活性和高度氧化和磷酸化偶联。在冬季黑麦的CSP 310蛋白与CSP 310蛋白质的免疫化学孵育30分钟的孵育引起了约35％的非磷酸化（状态4）呼吸和呼吸控制减少和ADP：​​O比率（表1）.同时，在培养的线粒体中加入与csp310蛋白免疫化学相关的蛋白Elymus.而冬小麦的活性没有任何显著变化。玉米CSP 310“家族”蛋白对非磷酸化(状态4)呼吸作用的影响不显著(见表)1）.有必要注意到，在这项研究中，我们使用从游离脂肪酸纯化的线粒体通过BSA添加，因此该解除掺杂是由添加蛋白质引起的，但不是增加内源性游离脂肪酸含量。来自谷物的CSP 310样蛋白的所使用制剂之间的差异仅在其亚基组合物中。因此，基于数据，我们可以得出结论，只有CSP 310但不是其亚基的任何其他组成导致线粒体中氧化和磷酸化的脱模。

研究了冬黑麦、冬小麦、玉米和小麦中CSP 310样细胞质蛋白的影响Elymus.结果表明，CSP 310蛋白与冬小麦、玉米和玉米的CSP 310蛋白具有免疫相关性Elymus.没有作为来自冬季黑麦的CSP 310样蛋白质的引起效果（图。1）.同时，如果冬小麦和玉米的蛋白质对脂质过氧化没有显著影响，则小麦和玉米的蛋白质对脂质过氧化没有显著影响Elymus.在研究的所有系统中有抗氧化活性（图。1）.特别是来自CSP 310“家庭”的蛋白质来自Elymus.与变体相比，抑制NADH依赖性脂质过氧化超过两倍，而不加入任何蛋白质。

受冬麦，冬小麦的影响Elymus.与CSP 310免疫化学相关的玉米蛋白对37℃时冬小麦线粒体脂质过氧化的影响(每mg线粒体蛋白的双烯结合物的nMol)。M±SD，n= 6。

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CSP 310“家庭”的所有蛋白质先前被证明由两种类型的亚基组成[18.]。这些蛋白质之间的区别仅仅在于天然蛋白质中两种亚基的不同组成。根据这一事实，它们对能量活动和脂质过氧化的影响的差异可以处理它们的天然结构的差异。因此，我们认为非活性的低分子量CSP 310亚基组合可能是一个“仓库”，允许在冷应力下快速增加CSP 310浓度。由于csp310处理对分离线粒体和整株线粒体的反应不同，我们研究了csp310处理对冬小麦幼苗叶片脂质过氧化和耗氧的影响。

结果表明，冷胁迫处理使冬小麦幼苗组织中二烯结合物的形成增加了20%左右(图。2）.这些数据与许多研究者获得的冷胁迫对植物组织脂质过氧化影响的数据有很好的相关性[1那2]。同一，我们观察到冷应力期间冬小麦芽的氧气消耗略微增加（图。3.）.

植物解耦蛋白激活剂对冷应力冬小麦芽脂质过氧化的影响。M±SD，n= 6。

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已知植物解耦蛋白激活剂对冬小麦幼苗冷胁迫时耗氧的影响M±SD，n= 6。

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所有被调查的植物解偶联线粒体系统激活剂(丙酮酸，能激活AOX [13.]，亚油酸，是泵的底物和活化剂[12.和CSP 310)降低了冷胁迫下脂质过氧化的速率(图。2）.值得注意的是，它们都使双烯结合物的形成减少了约30%，这些数值略低，但与非胁迫的冬小麦芽中双烯结合物的含量没有统计学差异(图。2）.研究这些激活剂对冬小麦幼苗在冷胁迫下耗氧量的影响表明，所有这些激活剂都引起了耗氧量的增加(图2)。3.）.需要注意的是，如果丙酮酸和CSP 310对冬小麦幼苗的渗透使耗氧量增加约20 - 25%，那么亚油酸对冬小麦幼苗的渗透使耗氧量增加约100%。这些数据让我们推测，亚油酸对冬小麦幼苗的渗透可以强烈激活ucp样植物解偶联蛋白和其他线粒体载体蛋白家族成员。另一方面，这种效应不仅可以处理泵的激活，还可以处理自身具有强大解耦能力的游离脂肪酸的直接解耦效应。同样，丙酮酸的渗透对脂质过氧化的影响可能是由于其自身的抗氧化作用，但同时它对冷应激时耗氧的影响，使我们可以假设它也可以应对其对线粒体能量活动的影响。

因此，根据获得的数据，我们可以得出结论，在寒冷胁迫期间，所有研究的冬小麦解偶联系统都参与了植物对氧化胁迫的防御。从谷物中获得的低分子量CSP 310样蛋白降低了线粒体的脂质过氧化，但不影响植物线粒体的能量活性。只有CSP 310通过诱导抗坏血酸依赖和nadh依赖的脂质过氧化系统而增加线粒体的脂质过氧化。

冬小麦的三天古老的幼鸽（小麦L,简历。Irkutskaya Ozimaya)在26°C的潮湿纸张上生长，在这项工作中使用。

粗的和纯化的线粒体从冬小麦幼苗中被分离出来，通过前面描述的方法使用不连续Percoll梯度，包括18%，23%，40% Percoll [15.那21.]。通过细胞色素测定线粒体的纯度和完整性c氧化酶活性（EC 1.9.3.1）[22.]。用Lowry法测定线粒体蛋白[23.]。

将分离的线粒体重悬在以下培养基中:20 mM MOPS-KOH缓冲液(pH 7.4)、300 mM蔗糖、10 mM KC1、5 mM EDTA、1 mM MgCl₂，4 mm ATP，4mM ADP，10毫米苹果醇和10毫米谷氨酸。在这些实验中，将0.5mg与CSP 310蛋白质相关的免疫化学相关，加入每1mg线粒体蛋白的线粒体悬浮液中。分离后立即分析线粒体的能量活性，并在0℃温育30分钟后分析。采用线粒体悬浮液的等分试样，在27℃下极性地记录线粒体能量活性。反应介质含有125mm KCl，18mm kH₂阿宝_4.， 1毫米氯化镁₂5 mM EDTA, pH 7.4。10 mM苹果酸在10 mM谷氨酸存在下作为氧化底物。用极谱法计算磷酸化呼吸速率(状态3)、非磷酸化呼吸速率(状态4)、Chance-Williams呼吸控制速率和ADP:O比值[24.]。

与冬麦、冬小麦、黑麦胁迫蛋白CSP 310相关的免疫化学蛋白Elymus.如前所述，如前所述使用染色色谱法与具有固定的抗CSP 310抗血清的BRCN活化的Sephare的柱状色谱法分离出玉米[18.]。

脂质过氧化的速率是通过测量脂质过氧化的初级产物-共轭二烯形成。线粒体在含有175 mM KCl和25 mM Tris-HCl (pH 7.4)的培养介质中培养。1 mM抗坏血酸、1 mM ADP和20 mM铁诱导抗坏血酸依赖的脂质过氧化系统²⁺被添加到潜伏培养基中。用于诱导NADH依赖性脂质过氧化系统1 mm NADH，1 mm ADP和20米克FE²⁺被添加到潜伏培养基中。为了通过摇动通过己烷 - 异丙醇（1：1V / v）混合物（每1mL样品为9ml样品）萃取线粒体脂质的测量。摇晃1 ml h后₂在混合物中加入O使正己烷和异丙醇相分层。用“SF-46”(“LOMO”，苏联)分光光度计在233 nm的正己烷相中测定了二烯共轭物的含量。根据多不饱和脂肪酸共轭二烯2,2 × 10的233 nm摩尔消光系数计算样品中二烯共轭含量^5.×M.^－1sm^－1［25.]。

冬小麦幼苗样品(3 g)分别用1)水、2)丙酮酸(40 mM)、3)亚油酸(40 mM)和4)CSP 310 (1 mg/mL)浸渍1 h，装在纸容器中进行胁迫处理。冬小麦幼苗在-4℃恒温条件下进行1 h的冷胁迫。对照变量未置于胁迫条件下。

冬小麦幼苗的氧吸收在27°C下用封闭型铂电极在1.4 mL体积的电池中进行极谱分析。反应混合物含有175 mM KCl和25 mM Tris-HCl (pH 7.4)。

所有实验都是用六种制剂制成的。在统计上分析所获得的数据，即确定算术装置和标准误差。

BSA -牛血清白蛋白:

泵-植物解偶联线粒体蛋白，AOX -抗氰化物氧化酶，csp310 -冷休克蛋白，分子量为310kd。

这项工作已经在俄罗斯基础研究基金会(项目00-04-48093)的支持下完成。

从属关系

1. 俄罗斯科学院西伯利亚植物生理生化研究所，俄罗斯伊尔库茨克

   Aleksey V Kolesnichenko, Victoria V Zykova, Olga I Grabelnych, Nina A Koroleva, Tamara P Pobezhimova, Yury M Konstantinov和Victor K Voinikov

相应的作者

对应到Aleksey V Kolesnichenko。

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