扩展网络形成GydF4y2Ba葡萄GydF4y2Ba愈伤组织细胞是快速和h的必要性和因果事件GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 引起的原代细胞壁水合GydF4y2Ba

背景GydF4y2Ba

伸展沉积被认为是正确的装配和初级细胞壁的生物物理性质是重要的，其后果对病原体引起的植物抗性，组织形态学，细胞粘附和扩展的增长。然而，一直缺乏对于在改变细胞壁特性的伸展网络的形成有直接和因果作用的证据。GydF4y2Ba

结果GydF4y2Ba

葡萄藤的过氧化氢处理(GydF4y2Ba葡萄GydF4y2Ba简历。Tainiga）愈伤组织壁壁被认为诱导其水合和厚度的显着降低。对基质蛋白质的分析表明，这种蛋白质蛋白质GVP1的不溶解情况发生，其显示典型的双旋曲蛋白延长素的主要结构和翻译后修饰。愈伤组织壁的水合不含盐水 - 可溶性蛋白质的响应不变化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba，但在添加富含伸展蛋白的生理盐水提取物后，完全恢复了这种能力。为了测定GvP1交联和其他壁基质蛋白对水合作用减少的具体贡献，对细胞壁中的GvP1水平进行了控制GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba通过在H期间结合细胞外蛋白的所选部分及其对壁保湿的影响GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba孵化化验。GydF4y2Ba

结论GydF4y2Ba

该方法使我们得出结论，过氧化物酶介导的GvP1共价连接网络的形成是葡萄愈伤组织壁水化反应减少的关键和原因GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．重要的是，这种方法还表明，对水合的扩展网络效应仅部分是不可逆转的，并且对基质电荷的变化保持敏感。我们讨论了这种机制，并根据濒临突出的分布在双子旋钮中的延长素分布的主要墙壁性能的重要性。GydF4y2Ba

主要细胞壁在调节延伸生长，细胞粘附和细胞形态方面发挥的中心作用需要对其流变性质的紧张时间空间调节，其最终通过基质组合物和结构确定。大多数当前的主要细胞壁模型都同意主要壁聚合物在很大程度上不共价互相束缚，尽管物理上交织在一起[GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba]．在这些模型中，半纤维素通过氢键和物理吸附与纤维素联系在一起，果胶在纤维素-半纤维素网络周围或纤维素-半纤维素片层之间形成一种相对可移动的凝胶[GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba]．在双子叶植物的某些组织中，伸展素丰富，并被认为在初级壁生物合成中发挥重要作用[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]，并对它们的结构特性作出贡献[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]。尽管双子叶植物中主要基质聚合物的组成和结构已经得到了很好的描述，但了解聚合物组成的变化及其在基质纳米结构中的相互作用如何与壁特性的变化相关仍然是一个挑战。GydF4y2Ba

植物细胞的扩张最终是由膨胀压力驱动的，但由细胞壁屈服于张力胁迫的能力控制[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]．在新合成的物质整合到基质期间的墙体应力松弛需要基质改性酶的坐标作用，包括扩展蛋白[GydF4y2Ba10GydF4y2Ba]、木葡聚糖内转糖基酶/水解酶(XHT) [GydF4y2Ba11GydF4y2Ba]，各种糖基水解酶，可能还有一些III类过氧化物酶，通过产生羟基自由基和由此产生的壁多糖的分离[GydF4y2Ba12GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

为了反对松弛，伸展生长的调节被认为涉及导致壁塑性损失的过程，而不是膨胀压力的损失[GydF4y2Ba13GydF4y2Ba]．此类方法包括加工果胶甲基酯酶，其去甲基均无肌炎（HGS）以促进CA.GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}桥接和刚性化[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．rhamnogalacturonan-II链之间的硼酸二酯交联，有助于拉伸强度已被描述(综述在[GydF4y2Ba15GydF4y2Ba])在双子叶植物中，有证据表明果胶与木葡聚糖共价交联[GydF4y2Ba16GydF4y2Ba]和果胶到扩展网络[GydF4y2Ba17GydF4y2Ba，这可能也有贡献。III类过氧化物酶也被认为是潜在的重要细胞壁硬化酶[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba]，自过氧化物酶/ h以来GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 驱动的反应可以通过酚类交联来固定粘接延伸的细胞壁[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba，可以发生在阿魏酸果胶之间[GydF4y2Ba20.GydF4y2Ba或extensin [GydF4y2Ba21GydF4y2Ba,GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

细胞粘附的研究较少，但有证据表明，这主要发生在细胞面边缘与细胞间角接壤，而不是整个细胞壁[GydF4y2Ba23GydF4y2Ba]．因此形成的细胞间面角可能含有弱酯化HGs [GydF4y2Ba24GydF4y2Ba，可以通过Ca交联GydF4y2Ba^{2＋GydF4y2Ba}，导致更大的粘合强度[GydF4y2Ba14GydF4y2Ba]．最近对拟南芥的描述支持了这一观点GydF4y2Batsd2GydF4y2Ba/GydF4y2BaQua2.GydF4y2Ba突变体，该突变体在假定的高尔基(果胶)甲基转移酶基因中有缺陷，并显示HG含量均减少[GydF4y2Ba25GydF4y2Ba]和细胞粘附[GydF4y2Ba26GydF4y2Ba]．伸展素也存在于某些组织细胞角的细胞间隙中[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．这些结构蛋白与HGs静电相互作用，促进果胶凝胶[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，并且被认为伸展网络形成[后，以促进进一步的矩阵硬化GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba，可能影响细胞间黏附的强度。GydF4y2Ba

细胞壁中另一个重要但经常被忽视的组成部分是水，水约占细胞壁重量的75%，使基质具有相对致密凝胶的特性[GydF4y2Ba9GydF4y2Ba]．细胞壁含水量已被证明对向日葵下胚轴的延伸有直接影响[GydF4y2Ba30.GydF4y2Ba]．对双子叶植物的研究表明，细胞壁水化的变化主要影响果胶和一小部分木葡聚糖网络的流动性，而纤维素和结合更紧密的木葡聚糖仍然是典型的刚性固体[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba32GydF4y2Ba]．虽然尚不清楚相对可移动的果胶网络是否能抵抗壁面的应力，但甲基酯化果胶流动性的下降与芹菜角组织的生长停止有关[GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．也有人认为，果胶和木葡聚糖可以调节基质的游离体积和粘度，以控制微原纤维的重组和延伸生长[GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba34GydF4y2Ba]．因此改建果胶的流动性，通过在水合或任一变化的交联的形成，可能是矩阵重要和发展过程中的细胞粘合性。GydF4y2Ba

原生质细胞壁在生理pH值下由于高丰度的荷电汞离子而带负电。基质中富含hg的区域的聚电解质性质可以通过Donnan效应驱动壁膨胀，内源性反离子(如Ca)的浓度会增加水化作用GydF4y2Ba^++GydF4y2Ba，mgGydF4y2Ba^++GydF4y2Ba和K.GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba在质外体空间中减少[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．果胶甲基酯酶对HGs的脱甲基作用[GydF4y2Ba36GydF4y2Ba可以增加基体中的电荷密度，从而促进水化。相反，果胶酸钙桥的形成可以抑制基质的膨胀[GydF4y2Ba37GydF4y2Ba]．此外，通过降低果胶电荷和水合作蛋白，碱性肽的静电相互作用可以增加果胶凝胶化[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba，表明壁蛋白与基质的静电相互作用是重要的。GydF4y2Ba

Extensins可以是双子叶植物中初生细胞壁丰富（最多至10％w / w）的。这些结构蛋白具有聚（II）临状构造给他们的棒状形状在溶液[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]，长度可达50-100 nm [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．典型延伸素主要结构中含含含含含量的含有高度的周期性溶液的基序促进了与HGS的静电相互作用[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba28GydF4y2Ba]，可能对果胶迁移和壁基质肿胀的后果。GydF4y2Ba

单体延伸蛋白也可以通过H通过细胞外基质中共价交联到不溶性的扩展网络GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba/过氧化物酶介导过程[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba,GydF4y2Ba39GydF4y2Ba,GydF4y2Ba40GydF4y2Ba]以思想被特定的III类过氧化物酶介导的临床 - 过氧化物酶（EPS）[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba,GydF4y2Ba42GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

电子显微镜研究洋葱中的主要细胞壁表明薄壁，CA。100 nm厚，由3-4个薄膜组成8-15nm厚的微纤维，涂有木葡聚糖，间隔20-40nm [GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba].一直以来，最近对马铃薯细胞壁的AFM研究表明纤维间间距为26 nm[GydF4y2Ba43GydF4y2Ba]．这些尺寸表明单体延伸素可以跨越微纤维隙距离，因此可以想到网络扩展的形成可以帮助锁定主壁聚合物以增加细胞壁刚度[GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba]．事实上，若干研究表明，扩展网络形成对于广泛的植物生理过程是重要的，包括正确的主要细胞壁生物合成[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]、细胞黏附及形态[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba]、生长停止[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]和抗病性[GydF4y2Ba45GydF4y2Ba]．然而，缺乏描述扩展网络对主墙性质的效果的实验数据。GydF4y2Ba

我们选择了一个细胞壁中含有大量单体延伸素(GvP1)的葡萄愈伤组织系，在添加HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在反应由EP，GvEP1 [专门催化GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．这些细胞提供了一种方便的系统，以评估特定细胞壁蛋白的贡献，例如extensin和EP，快速H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba介断的细胞壁性质的变化。使用该系统，我们已经证明，扩展网络形成驱动抗真菌含碱酶的快速增加[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．在这里，我们报道了HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba可以迅速降低原代双旋翼细胞壁的水合和厚度，并且扩展网络形成是该过程中的主要和因果事件。GydF4y2Ba

快速、HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-介导的对细胞壁水化和厚度的影响GydF4y2Ba

从在pH 4.5，用0-100 mM的KCl溶液葡萄愈伤组织中分离的细胞壁的膨胀行为是典型的弱聚电解质（图GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba封闭的圆圈)。当反离子浓度降低时，细胞壁肿胀增加;对于小于10毫米氯化钾的值，效果更明显。GydF4y2Ba

孵育100μmHGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在pH值为4.5的条件下保存30分钟，这些壁在降低KCl浓度下保持了增加溶胀的能力，但在所有KCl浓度下都显示了显著的水化降低(图)GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba，即开三角形)，表示快速和HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba介导的致密矩阵的形成。GydF4y2Ba

为了确定水化作用的变化是否伴随着细胞壁尺寸的改变，我们用快速冷冻扫描电子显微镜测量了细胞壁的厚度(图)GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba）.测量结果表明，不同样品的表观细胞壁厚度差异很大，这可能是由于有时难以确定细胞壁的界限和精确地垂直于细胞壁面获得视图。然而，测量结果表明，在0 mM KCl条件下，天然细胞壁的平均厚度约为230 nm。20.1)。15或100 mM KCl的存在导致显著降低到180和174 nm，分别(学生t检验p < 0.05, n≥15)。细胞在15毫米氯化钾中预平衡培养GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba结果形成的细胞壁平均约25%，在134 nm(学生t检验p < 0.01, n≥15)。GydF4y2Ba

HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-诱导的细胞壁水化减少伴随着GvP1网络的形成GydF4y2Ba

我们此前据报道，葡萄蛋白愈伤组织细胞含有高水平的单体单体extensin，GVP1 [GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]，它被均匀地在侧壁[分布作为单体GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．在这些细胞的提取物中没有检测到其他的延伸蛋白，而对细胞壁的盐水提取导致JIM11表位信号几乎完全去除，这表明在与HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．要确定HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 来自天然和H的延长素网络形成，细胞外，离子结合的基质蛋白（EIBMP）发生细胞壁水合的减少GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-treated细胞壁（图GydF4y2Ba3.GydF4y2Ba通过超级-12，凝胶过滤色谱法进行比较（图GydF4y2Ba3GydF4y2Ba）.色谱图表明与100μM即H孵化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在pH 4.5中导致蛋白质峰（GVP1）在9.5ml下洗脱的渗透性。GVP1不溶解的时间过程随后通过时间监测GVP1的峰值高度的变化，以及CA。在15分钟内看到60％的GVP1不溶解（图GydF4y2Ba3GydF4y2Ba，插图）。GydF4y2Ba

SP-琼脂糖色谱法（图GydF4y2Ba3 bGydF4y2Ba)和三氯乙酸沉淀法(另见方法)使纯化的GvP1从上清液中回收(图GydF4y2Ba3GydF4y2Ba）.GVP1的MALDI-TOF分析表明了90kDa的分子量，没有任何重要的额外质量信号，表明纯度（数据未显示）。GVP1的氨基酸组成是双旋肌延长素的典型（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.进一步比较了H . H .前后盐提细胞壁氨基酸组成GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba治疗表明，GVP1的渗透性发生在盐水 - 不溶性细胞壁结构中GVP1延伸的主要氨基酸增加（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba)，确认其作为一个不溶网络并入墙矩阵中。定量计算GvP1延伸蛋白网络对对照细胞壁的贡献≥0.6% (w/w [DW])，而在100 μM H孵育后约占细胞壁质量的6% (w/w [DW])GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba超过30分钟。GydF4y2Ba

GvP1显示特性典型extensins的GydF4y2Ba

为了确定GvP1是否是一种典型的伸展蛋白，利用同源性克隆（见方法）从葡萄愈伤组织中分离出一个5'截短的伸展蛋白cDNA。所有10个克隆测序编码图中所示的伸展蛋白一级结构GydF4y2Ba4GydF4y2Ba，或删节版。这支持了早期的结果，表明在这些细胞中有单个延伸蛋白的表达[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．纯化GVP1的氰基溴化物切割使得分离由Edman降解测序的两个内肽（P4，P6）。两种序列都可以在获得的extensin cDNA内定位（图GydF4y2Ba4GydF4y2Ba），确认它对应于GVP1。GVP1的序列包含典型的二榫延长蛋白典型的基序，包括结构Ser（HYP）的重复GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba基序，以及酪氨酸 - 赖氨酸 - 酪氨酸 - 赖氨酸和Pro PRO-VAL-酪氨酸 - 赖氨酸基序据信需要伸展的帧内及帧间交联GydF4y2Ba在muroGydF4y2Ba[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]．然而，GvP1的一个不同寻常的序列特征是Ser (Hyp)的可变扩展。GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba基序序列（脯氨酸）GydF4y2Ba_4-6GydF4y2Ba，导致许多extensins [缺乏高频序列周期性存在的GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．对于GvP1作为典型的双子叶植物伸展进一步证据来自在13 A.A.的MALDI-TOF / MS分析糖肽，P6（图GydF4y2Ba4 bGydF4y2Ba）.该肽显示相当大的质量异质性，但周期性为16和132 da。这可以明确归因于延长素羟基化（16Da）和羟脯氨酸阿拉米糖基化（132A）中的预期异质性。GydF4y2Ba

盐水洗脱壁恢复其减少水化反应的能力，以响应HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba当与eibmp重组时GydF4y2Ba

研究了GvP1网络的形成和细胞壁水化的变化。这些和所有后续的水化测量都是在15mm KCl下进行的，其中HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-介导的水合作用差异显著。在原生细胞壁中，60%的单体GvP1与HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba用加利福尼亚州。细胞壁水合减少50％。孵化的较长时间导致较高水平的网络形成和较低水平的细胞壁水合（图GydF4y2Ba5GydF4y2Ba），这表明存在因果关系。GydF4y2Ba

重要的是，看到通过盐水提取的EIBMP去除以增加对照（天然）细胞壁的水化，表明内源性基质蛋白与壁的静电相互作用也是壁水合的重要决定因素。在H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba介质的部分脱水，还看到盐水萃取增加壁水合，虽然在对照细胞壁的盐水萃取后看到的程度显着降低（图GydF4y2Ba5GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

盐水提取的天然壁显示出响应H的水化没有显着变化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba或H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba加抗坏血酸（图GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba)，表示存在eibmpGydF4y2Ba在muroGydF4y2Ba对h至关重要GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在水化介导的变化。GydF4y2Ba

为了研究特定的EIBMP在HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-介导的细胞壁脱水，我们操纵内源性的选定eibmp水平，包括GvP1，GydF4y2Ba在muroGydF4y2Ba．盐提葡萄愈伤组织壁(1 mg DW)保留了内源总EIBMPs (70 μg)和GvP1 (50 μg)的结合能力;额外的文件GydF4y2Ba1a，bGydF4y2Ba）.非扩展素EIBMPs (20 μg)的绑定显示在附加文件中GydF4y2Ba1C-D.GydF4y2Ba．这表明，我们可以将内源性的选择性EIBMPs与盐水提取的细胞壁结合，并检测添加H后的水合作用的变化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

使用类似的高盐条件部分地解离豌豆木葡聚糖相互作用果胶[GydF4y2Ba47GydF4y2Ba]，建议这种治疗可以不可逆转地改变葡萄牙愈伤组织壁的结构和/或组成，可能对壁保湿的可能后果。中性单糖和不同细胞壁分离液的尿酸含量分析（表GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba)事实上，盐提取确实导致果胶的某些损失（视为糖醛酸和阿拉伯糖含量的降低）。然而，尽管存在这种明显的损失，盐提取后观察到的壁水合作用的增加可以通过将EIBMP替换为内源性水平而完全逆转（图2）GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.用HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba导致了两个扩展网络的形成(附加文件GydF4y2Ba1GydF4y2Ba)和水合作用降低(图GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）与H后观察到的水平相当GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-天然细胞壁的处理(图GydF4y2Ba5GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

EIBMPs与壁基质相互作用的相互作用对水化的影响似乎是浓度依赖的，因为高水平(2×) EIBMPs的添加导致水化作用在H之前和之后更大的降低GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba治疗。如在原生细胞壁中，hGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-通过盐水洗脱从基质中提取EIBMP，介导的脱水只能部分逆转（图GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

因此，内源性EIBMPs必须在决定初级细胞壁水化水平方面发挥重要作用，通过它们与基质的静电相互作用和它们在响应H进一步降低细胞壁水化的明显作用GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．这些数据还证实，我们可以用高盐溶液提取EIBMP，随后将它们重新结合到墙壁基质上，而不会因响应H而不可逆转地改变墙壁减少水合的能力。GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．因此，这种方便的实验系统用于研究特定EIBMP在此过程中的作用。GydF4y2Ba

在不存在其他EIBMPS的情况下，扩展网络形成对墙壁水合的影响GydF4y2Ba

将纯化的GvP1单独或与延伸素过氧化物酶GvEP1一起加入到盐水提取的细胞壁中，可以有效地将细胞壁水合作用降低到天然细胞的水平(图)GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.响应至H中检测GvP1的无沉积GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在没有延伸酶过氧化物酶GvEP1的细胞壁中。GvEP1在哪里，HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba治疗导致约65%的extensin的沉积(另见附加文件GydF4y2Ba1 bGydF4y2Ba）.然而，在这些壁中伸展蛋白网络的形成并没有伴随着水化作用的显著降低(图GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.类似地，将GVP1的无EIBMP添加到盐水提取的壁上降低了保湿水合以控制水平，但在添加H后没有看到水合的变化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．这与HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba含总，EIBMPs壁的温育（图GydF4y2Ba5A，BGydF4y2Ba）强烈建议，除GVP1和GVEP1之外的EIBMP存在是H的预先要求GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba诱导减少壁水合。GydF4y2Ba

然而，尽管盐水提取未经处理的天然壁导致了实质的肿胀，但在伸展素网络形成后盐水提取导致了明显的减少肿胀。在HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba天然墙的处理(图GydF4y2Ba5GydF4y2Ba)，或者在盐水提取壁中，总EIBMPs或延伸蛋白和GvEP1被替换(图)GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.这种效果仅限于含有网络GVP1的墙壁，因为盐水提取H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 含有GVP1的无EIBMPS的壁膨胀至水合水平，类似于盐水提取天然墙壁后观察到的水合水平（图GydF4y2Ba5 bGydF4y2Ba）.因此，伸展网络的形成可被认为是有效的抑制进一步细胞壁肿胀。GydF4y2Ba

将eibmp添加到GvP1包含网络的墙壁模拟了HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba对壁水化的影响GydF4y2Ba

进一步调查GVP1网络和其他EIBMPS如何为H有贡献GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba介导的壁水合，壁被制备含有网络GVP1的对照水平，但不含非延长EIBMPS。用一种方法，这是通过盐水萃取的GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 治疗的天然细胞壁。因此，在这种壁中的扩展网络是在内源性EIBMPS存在下形成的（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.成功重新附着EIBMPS的内源性水平（20μgmgGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba细胞壁（DW））从HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-培养的原生细胞壁(包含gvp1 -耗尽的EIBMPs)显著降低细胞壁水合作用至约55%(图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba)，即达到可与原生菌墙孵育H后观察到的水平GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．在加入在天然细胞壁的盐水洗脱的分馏后获得的GVP1无EIBMP的内源性水平之后也获得了定量相似的结果（55-60％），清楚地表明非延长素Eibmps不需要与H反应GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba有效。在第二种方法中获得了类似的数据，其中延长的网络形成为盐水提取的细胞壁，即在没有其他EIBMPS的情况下（图GydF4y2Ba6 bGydF4y2Ba）.这些细胞壁也签约到CA.添加内源性水平或GVP1耗尽的EIBMP后50％的体积。GydF4y2Ba

因此，过氧化氢介导的初级壁水合作用的减少似乎需要延伸蛋白网络的形成，但受到EIBMP与壁基质的静电相互作用的影响。GydF4y2Ba

为了确定非拉伸素EIBMPs的性质，我们从盐水提取物中分离出耐热和抗dtt蛋白，并在含有拉伸素网络的细胞壁中进行了分析，发现它们能够将水化程度降低到与总EIBMPs相当的水平(图)GydF4y2Ba图6A，BGydF4y2Ba）.盐水提取的细胞壁也能结合20 μg。毫克GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba细胞壁（DW）的GydF4y2BaMedicago.GydF4y2Ba叶细胞壁蛋白质。如附加文件所示GydF4y2Ba1 dGydF4y2Ba这些盐水可溶性蛋白的色谱轮廓不是由用H壁的温育改变GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba，提示缺乏丰富的交联结构蛋白。聚l -精氨酸(分子量约15 kDa)在10 μg时也能与盐萃取壁结合。毫克GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba细胞壁（DW）。对彼此而言GydF4y2BaMedicago.GydF4y2Ba细胞壁蛋白和聚l -精氨酸，这些添加量降低了盐水提取壁的壁水化水平，与天然壁相似(分别为100±9%，90±12%)。参见附加文件GydF4y2Ba2.GydF4y2Ba），并且响应于H检测到不显着的水化变化GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba（数据未显示）。然而，当加入相同的量以扩展含有墙壁的网络时，细胞壁水合分别降至Ca 50％和40％（图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.用聚-L-天冬氨酸（11KDA）没有得到明显的结合，表明不存在与带负电荷多肽的离子相互作用的细胞壁部位。GydF4y2Ba

伸展于基质水化影响，可在侧壁和细胞结重要GydF4y2Ba

扩展网络形成对原发性壁水合的影响表明，这种翻译后的方法可以在发育过程中赋予细胞外基质材料的重要生物物理变化。葡萄牙愈伤组织壁似乎具有单糖组合物，典型的原发性细胞壁，GVP1一般显示二榫延长植物的特征（表GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba＆ 数字GydF4y2Ba4.GydF4y2Ba），表明网络GVP1对初级壁水合的影响也可能发生在植物发育过程中的其他延伸的主要细胞壁中。GydF4y2Ba

如前述胡萝卜和洋葱根尖的早期研究[GydF4y2Ba48GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba[所有主要细胞壁不存在伸长型，但是靶向在不同发育阶段的特异性痉挛区域中的靶向。GydF4y2Ba27GydF4y2Ba]．这里用抗伸伸素单克隆抗体JIM11进一步说明了这一点，以探究伸伸素在葡萄愈伤组织和植株中的分布(图)GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

同意以前的结果[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]中，伸展GvP1可以在由JIM11葡萄痂的横向细胞壁（检测图GydF4y2Ba7一个GydF4y2Ba）.为了检测细胞板是否也包含jim11反应表位，研究了树脂固定的愈伤组织薄片(0.5 μm)，细胞板暴露(图)GydF4y2Ba7 bGydF4y2Ba）.然而，没有JIM11表位可以在这个结构中被检测到。因此GvP1伸展在这些细胞中的表达似乎局限于至侧壁。GydF4y2Ba

在葡萄树植株，JIM11表位是在上胚轴，在那里他们被限制于皮层薄壁的细胞角容易检测（图GydF4y2Ba7 cGydF4y2Ba）.在成熟的根切片中，JIM11信号也可以在薄壁细胞-细胞连接处检测到，但仅限于表皮和邻近的亚表皮皮层层(图)GydF4y2Ba7 dGydF4y2Ba）.在根冠中，JIM11表位主要位于细胞内层，通常占据较大的细胞间隙(图)GydF4y2Ba7 eGydF4y2Ba)，但也明显存在于某些细胞壁(图GydF4y2Ba7 fGydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

这些观察结果证实，扩展素在葡萄树上靶向到特定的细胞壁和/或细胞角，在那里它可能提供对组织的局部结构支持。延长网络形成对本文报告的细胞外基质水合水平的影响表明，延长素可以通过细胞外材料的脱水提供这种载体，得到更密集和更刚性基质性质的所得到的形成。GydF4y2Ba

我们已经证明了HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba导致葡萄愈伤组织初生壁水化迅速而显著降低，壁厚显著降低。HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba已知在调节伸展生长中起重要作用[GydF4y2Ba19GydF4y2Ba,GydF4y2Ba50GydF4y2Ba]组织的力学性质[GydF4y2Ba18GydF4y2Ba通过驱动(过氧化物酶介导的)壁组分的酚交联，但据我们所知，这是第一次报道它可以影响初级壁水合作用的快速变化。GydF4y2Ba

对葡萄愈伤组织细胞壁蛋白的分析表明，HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在壁水合介导的还原用的显着增加发生在从较小的水平（<0.6％）至约伸展网络等级6％以干重计对细胞壁基质的（重量/重量）。在这些主壁伸展网络形成似乎是从GvP1 [的交联仅仅形成GydF4y2Ba22GydF4y2Ba,GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．这是通过使用与双子叶伸展素共同基序相对应的异源引物从这些细胞中扩增出单个伸展素cDNA来支持的。GvP1的两个肽序列可以被定位到该cDNA上，确认了其身份。GydF4y2Ba

GVP1是一种丰富的蛋白质，其显示典型的双旋蛋顿延长素的性质，包括结构Ser-（Hyp）的重复GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba图案，富含短（4-7 AA）Tyr的序列，旨在参与分子内体内rosine形成[GydF4y2Ba41GydF4y2Ba,GydF4y2Ba46GydF4y2Ba]及分子间伸展素寡聚[GydF4y2Ba51GydF4y2Ba,GydF4y2Ba52GydF4y2Ba]．gvp1衍生的多肽的MALDI-TOF分析也显示了典型的延伸蛋白翻译后修饰，包括脯氨酸残基的羟基化和阿拉伯酰化。这些发现初步表明，伸展蛋白网络的形成可能有助于HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba介导的降低在初级细胞壁的水合作用。GydF4y2Ba

伸展蛋白在种皮细胞成熟过程中的研究[GydF4y2Ba44GydF4y2Ba]，它对细胞形态的影响[GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba53GydF4y2Ba墙壁拉伸强度[GydF4y2Ba54GydF4y2Ba，认为伸展素在发育中的作用。然而，网络延伸素与其他基质聚合物的相互作用是否对细胞壁产生直接和显著的流变效应尚不清楚。伸展素可以在细胞壁形成的早期阶段分泌，有证据表明，在烟草原生质体细胞壁再生过程中，伸展素为基质组装提供了必要的支架[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba或拟南芥中的细胞板形成[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．另外，嵌合的富含亮氨酸的重复系列的受体样激酶（例如LRX1）的存在的嵌合，克服素状的构件。GydF4y2Ba55GydF4y2Ba，提示伸展素网络的形成可以为调控壁基质材料的下游合成和靶向提供分子线索。因此，可以认为，网络延伸素的功能可能仅限于提供必要的结构、化学和/或分子线索，以便以后和正确地将可能更具流变学影响的新生壁材料纳入发育中的基质中。GydF4y2Ba

在这里，我们检查了在初级壁基质中伸展蛋白网络形成的影响。因此，所使用的实验系统不能提供关于在墙体形成的早期阶段伸展功能的见解。相反,它可以更容易地与那些发生在细胞的侧墙发生扩展增长或增长停止,或在信息的形成粘连细胞间角落里,在这两种情况下,伸展蛋白是合作/分泌,后来集成为一个在现有网络矩阵的胞外聚合物。GydF4y2Ba

利用这种方法，我们可以得出结论，葡萄愈伤组织原代细胞壁中伸展蛋白网络的形成可以直接显著降低其水合作用。正如伴随壁宽变化的EM观察所支持的，由此产生的壁密度增加必然伴随着po的显著降低聚合物分离，影响基质孔径、聚合物流动性和整体壁刚度。GydF4y2Ba

了解急流的机制基础GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 引起的墙壁水合的还原将具有相当大的兴趣。典型的双旋肌延长素的棒状结构含有周期性的，含有Tyr残基的周期性，涉及延伸和 - 克服互联网互联网交叉链路的形成[GydF4y2Ba46GydF4y2Ba,GydF4y2Ba52GydF4y2Ba,GydF4y2Ba56GydF4y2Ba]．后者通常沿着延伸的多肽(长度为50-100 nm [GydF4y2Ba8.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba38GydF4y2Ba,GydF4y2Ba57GydF4y2Ba)，因此可能导致相对致密的蛋白质网络的形成。Tyr的进一步齐聚形成三聚物pulcherosine [GydF4y2Ba51GydF4y2Ba]和四聚体脱脂腺炎[GydF4y2Ba52GydF4y2Ba可能允许对该网络进行更广泛的聚合。GydF4y2Ba

壁伸展的网状需要的Tyr自由基 - 自由基缩合，并且因此，伸展多肽的密切的相互作用。最近与两性工作GydF4y2Ba拟南芥GydF4y2Ba扩展素，ATEX3，已经显示出这种伸蛋白可以通过周期性亲水和疏水基序的横向自交联在界面形成绳状和树突结构[GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba]．番茄伸展素横向关联的证据以前也有描述[GydF4y2Ba38GydF4y2Ba]．这样的关联可能有利于的Tyr残基的来自邻近伸展单体并置，从而促进酪氨酸低聚和分子间交联的基本上二维网络。GydF4y2Ba

可能发生atex3样伸展蛋白的侧方结合GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba在脂质-水界面，如细胞板形成早期的膈体-胞质溶胶界面。然而，如图所示GydF4y2Ba图7A-BGydF4y2Ba，GvP1不被引导到所述细胞板，但被分泌到侧壁的矩阵，其中其与移动和带电果胶静电相互作用将可能既解离并在空间上阻碍稳定伸展-伸展组件。此外，GVP1的主要结构似乎缺乏这种类型的横向关联所需的序列重复的高周期性。GydF4y2Ba

相反，通过其松散的离子结合和与带电果胶网络的缠结可以促进GVP1的交联，其高迁移率[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba,GydF4y2Ba33GydF4y2Ba和频繁的、短暂的孔隙封闭可以促进分子间键合的extensin-extensin近似和纠缠的形成GydF4y2Ba3 dGydF4y2Ba网络内的网络。GydF4y2Ba

最近，我们认为延伸蛋白网络的形成可以将果胶锁定在一个更紧密的结构中[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．这被当前数据部分支持，这表明GVP1网络的形成可以驱动聚合物间间距的减少，并伴随基质水挤出到Syplaast和/或痉挛空间中。几种固态NMR研究还表明，壁水合的减少留下了相对刚性纤维素 - 木糖葡聚糖网络的热迁移率在很大程度上不受影响，而PECTIC馏分变得较小，导致生产更紧凑的墙壁结构[GydF4y2Ba31GydF4y2Ba–GydF4y2Ba33GydF4y2Ba]．因此，网状伸展素的形成很可能主要影响了果胶流动性和孔径的降低，从而影响了整个基质的水化、密度和硬度。然而，很明显，延伸蛋白网络细胞壁的基质密度并不是“锁定”的，但仍然对果胶电荷敏感，尽管相对于控制细胞壁而言明显不那么敏感。这可以从它们在EIBMP改变后持续显示水合作用变化的能力中看出(图)GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba,GydF4y2Ba6.GydF4y2Ba）或反逆水平（KCL;图GydF4y2Ba1.GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

一种可能的力学解释是，GvP1网络向基质提供了额外的弹性成分，从而增加了其杨氏模量和抵抗渗透压的能力，渗透压是由基质和外部溶质之间的电不平衡产生的(MacDougall等人，2001b)。GydF4y2Ba

显然，如果拉伸素网络的形成可以驱动基质水化作用的降低，如这里所证明的，那么网络必须是在应变下形成的。如上所述，这是在水合和可移动的初级壁基质中形成三维网络的可能结果。这种网络仍然可以部分适应由弹性变形或弛豫引起的基质膨胀中的电荷驱动变化。GydF4y2Ba

表征该过程中所需的非扩展EIBMP也可能是感兴趣的。然而，我们建议所涉及的细胞外蛋白可能是不同自然的离子结合蛋白的正常补充。许多蛋白质，即使是酸性Pi的蛋白质，也含有表面连续的碱性残留物，这允许它们与带电果蛋白的结合[GydF4y2Ba58GydF4y2Ba]，从而减少果胶充电和壁肿胀[GydF4y2Ba28GydF4y2Ba,GydF4y2Ba37GydF4y2Ba,GydF4y2Ba59GydF4y2Ba]．与这些蛋白质的非特异性性质一致，我们发现内源性EIBMPs被内源性葡萄EIBMPs的耐热和dtt抗性部分取代，GydF4y2BaMedicago.GydF4y2Ba叶Eibmps或poly-精氨酸均有效地减少水合与对照水平，并且都可以用来密切模仿H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba当添加到含有拉伸素的网状墙体中时，对墙体水化的影响(图GydF4y2Ba6GydF4y2Ba）.GydF4y2Ba

最近，我们报道了伸展蛋白网络的形成是壁抗真菌酶消化的主要因素[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．这很可能是的伸展网络形成基质水化和溶解酶抗性的影响是因果相关的，因为降低的水化可能限制基质孔隙尺寸，从而限制溶解酶的迁移率到壁矩阵[GydF4y2Ba60GydF4y2Ba]．然而，伸展素网络的形成对初生细胞壁水化的影响也可能在双子叶植物发育中发挥重要作用。GydF4y2Ba

延长素在含有初级细胞壁的组织中大致表达[GydF4y2Ba5.GydF4y2Ba–GydF4y2Ba7.GydF4y2Ba一些研究表明，这种结构蛋白可以靶向于侧壁或细胞-细胞连接[GydF4y2Ba27GydF4y2Ba,GydF4y2Ba48GydF4y2Ba,GydF4y2Ba49GydF4y2Ba]．这在我们对葡萄藤选定组织中JIM11信号分布的研究中得到了证实，该表位可以位于细胞壁平面和/或细胞连接内。在所有的病例中，伸展素的分布都强烈地表明，它通过增强细胞壁或加强细胞间的粘附，为组织提供结构支持。伸展蛋白存在于细胞壁的地方，HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-和伸展素网络介导的基质水化降低降低了聚合物的分离，增加了果胶的粘度。这可以增加微原纤维层之间的抗剪切应力，从而增加细胞壁硬度和对这些组织的机械支持。同样，细胞间连接内以果胶为主的延伸素网络的形成也会使果胶的孔径减小，粘度增加，从而增强细胞间的粘附强度。GydF4y2Ba

有趣的是，我们对初级细胞壁的数据表明，延伸蛋白网络的形成增加了基质密度，但这些细胞壁仍然对基质电荷的变化敏感。这可以通过蛋白质与细胞外基质的相互作用或反离子浓度的变化发生，如这里所示，但也可以通过发育调节的变化，如质膜质子泵的活动[GydF4y2Ba61GydF4y2Ba，离子通道[GydF4y2Ba62GydF4y2Ba]或果胶甲酯酶[GydF4y2Ba63GydF4y2Ba]．这表明，扩展网络形成可以赋予墙壁的平面或在细胞间隙中的更刚性的结构，而不会损害壁经历控制膨胀的能力，以便于进一步壁延伸所需的附加壁材料和基质改性酶的能力。发展。GydF4y2Ba

我们提供的证据使得hGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba可以在葡萄愈伤组织细胞中迅速减少初级壁水合和壁厚，并且扩展网络形成是该过程中的主要因果事件。这些发现证实了扩展网络在初级细胞壁密度调节中的重要作用，并证明对壁水合的延长效应对基质电荷敏感。本报告强调在推断数据时考虑内源壁蛋白在墙壁性质上的重要性GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba模型研究墙的功能和性质的解释GydF4y2Ba在活的有机体内GydF4y2Ba伸展蛋白网络在减少原代细胞壁水合作用中的作用可能是这种结构蛋白影响细胞外材料生物物理性质变化的主要手段，从而影响聚合物分离、粘度、细胞壁硬度、细胞粘附和伸展生长的调节。GydF4y2Ba

在葡萄品种的体外培养。Touriga愈伤组织和苗GydF4y2Ba

葡萄藤 （GydF4y2Ba诉酿酒用葡萄GydF4y2BaCV Touriga）愈伤组织维持在改性MS [GydF4y2Ba64GydF4y2Ba]在25°C的黑暗条件下使用，如[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]每3周推翻一次。葡萄藤 （GydF4y2Ba诉酿酒用葡萄GydF4y2Ba对用于免疫定位研究的植株进行了繁殖GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba如前所述[GydF4y2Ba65GydF4y2Ba].顶端叶取自GydF4y2Ba截形苜蓿GydF4y2Ba简历。Jemalong生长了4周，如[GydF4y2Ba66GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

葡萄愈伤组织细胞壁的分离GydF4y2Ba

从3周龄葡萄牙蛋白培养的细胞壁被制备为天然细胞壁（含有内源性，离子结合基质蛋白），或者盐水提取物或H.GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 基本上如前所述[GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．简单地说，葡萄藤愈伤组织被冷冻在液氮中，并使用Spex 6700冷冻/研磨机(Spex Industries, Inc.， Edison, NJ)以360笔刷分钟的速度研磨GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba匀浆分散在5 × vol/g (FWT)的15 mM醋酸钠(pH 4.5;以后用悬浮缓冲液)，并在4500度离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba然后将粗壁颗粒在含0.1% Triton X-100的悬浮缓冲液中洗涤，然后单独在悬浮缓冲液中离心两次洗涤。在需要盐水提取EIBMPs的地方，壁在2 ×体积gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba(新鲜重量)1 M KCl在4°C中轻轻搅拌5分钟，然后在多余的悬浮缓冲液中离心两次洗涤。对HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba处理，分离的细胞壁在100μmH中培养GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba在24°C悬浮缓冲液中保存15分钟。GydF4y2Ba

细胞壁水合作用的测定GydF4y2Ba

细胞壁膨胀特性作为K的函数的测定GydF4y2Ba^+GydF4y2Ba浓度利用260,000da葡聚糖的分子排除用荧光素异硫氰酸（FITC; sigma）标记，如[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]，只在5 mg(新鲜质量)细胞壁中加入含0.2% w/w fitc -葡聚糖的悬浮缓冲液中2ml KCl溶液，并在20°C下平衡12-16小时。通过电导率(电导率计，Consort, Lisbon)估计样品的最终KCl浓度。将每个样品离心，根据其在450nm处的吸光度测定上清液中fitc -葡聚糖的浓度。计算加入的fitc -葡聚糖的稀释度与探针可接触到的细胞壁体积和质量相关。细胞壁的水合质量是由悬浮液的总质量和探针可接触到的溶液质量的差来确定的。每个孤立的溶胀点代表了至少四个独立样本的平均值，每个都是在三个重复中测量的。比较数据由未配对的学生进行分析GydF4y2BaTGydF4y2Ba-测试。GydF4y2Ba

量化细胞壁中GvP1和EIBMP的丰度GydF4y2Ba

为了定量细胞壁中可溶性单体伸展素的水平，用盐洗脱液(1 M KCl在15 mM醋酸钠(pH 4.5))或HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba-培养的葡萄愈伤组织或细胞壁(来自35mg新鲜重量的细胞)注射到Superose-12柱(HR 10/30, Amersham-Pharmacia Biotech, Uppsala)，并如前所述进行定量[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．估计内源水平（μg蛋白质.mgGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba结果表明，在100 μM h培养2 h后，非gvp1 EIBMPs细胞壁(DW)的总蛋白含量显著增加GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba用Biorad蛋白质测定套件（Biorad，德国）测量。这提供了对控制细胞壁中的非GVP1 EIBMP的丰度的良好估计，因为这种提取物仅包含残留的单体GVP1，并且SuperOce-12色谱表明a的总和GydF4y2Ba_{280.GydF4y2Ba}与H孵育后，由非GVP1 EIBMP贡献的吸收材料仍然不变GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

改变外，离子结合基质蛋白在细胞壁内的内容GydF4y2Ba

从分离的愈伤组织细胞壁中制备盐提细胞壁，如上所述。细胞壁在悬浮缓冲液中平衡，然后在4°C下孵育约15分钟，偶尔搅拌选定的eibmp组分(包括纯GvP1和GvEP组分，见下文)。在剩余的悬浮缓冲液中以4500离心去除未结合蛋白2次GydF4y2BaGGydF4y2Ba．GydF4y2Ba

对于全盐水提取物的制备，葡萄痂三周龄培养物用悬浮缓冲液，然后在含1M KCl的相同缓冲液的2×体积/克（鲜重）轻轻搅拌彻底洗涤以洗脱离子结合的细胞表面蛋白．将洗脱液通过0.45μm过滤器（Sartorius），然后通过一个10 kDa截止膜（Diaflow，的Amicon，贝弗利，MA）浓缩，并通过压力辅助过滤悬浮缓冲液平衡收集真空辅助超滤。GydF4y2Ba

h的盐水eluatesGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba如上所述制备治疗的愈伤组织细胞，不同之处在于首先将细胞分散在含有100μmH的悬浮缓冲液中GydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba(2 ×体积gGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba在盐水萃取之前，在15分钟内，在15分钟内在黑暗中在24℃下孵育。GydF4y2Ba

为了制备具有耗尽水平的GVP1水平的葡萄肽EIBMP，整个盐水洗脱液在上述条件下受到超级-12凝胶过滤色谱。除去含有GVP1的级分（在8.5-10-5mL下洗脱），并如上所述脱盐并浓缩的剩余的EIBMPS用于总盐水洗脱液。GydF4y2Ba

准备GydF4y2BaMedicago.GydF4y2Ba如前所述进行叶EIBMP [GydF4y2Ba66GydF4y2Ba[除了在使用前在15mM乙酸钠（pH4.5）中平均分离的叶壁的盐水提取物之外。GydF4y2Ba

具有内源性GVP1和GVEP1的葡萄细胞壁的重构使用60μgGVP1和20ng的GVEP1 mgGydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba（DW）细胞壁。葡萄牙愈伤组织，GydF4y2BaMedicago.GydF4y2Ba分别在20、20和10 μg mg下添加EIBMPs和聚l -精氨酸GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba（DW）细胞壁。在所有情况下，如上所述，通过超级-12色谱法监测壁边的EIBMP和延伸水平。GydF4y2Ba

净化GvP1GydF4y2Ba

将葡萄牙愈伤组织壁（上述）的浓缩和脱盐盐水洗脱液注入到1.5×20 -cm的SP-Sepharose柱（Amersham-Pharmacia）中，在20mM乙酸钠（pH4.5）中平衡，并用2个缓冲液洗涤ml min.GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba直到所有不绑定，aGydF4y2Ba_{280.GydF4y2Ba}-吸收材料已被移除。结合蛋白在0-0.5 M NaCl梯度下以2 mL min的流速洗脱60分钟GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba．含GvP1级分通过的Superose-12色谱法确定的（在8.5毫升洗脱 - 10.5毫升）中描述的条件下，通过压力辅助过滤的上方，然后合并并浓缩（10 kDa截止; Diaflow，的Amicon，贝弗利，MA）。将浓缩物调整为10％的三氯乙酸，以12000rpm离心GydF4y2BaGGydF4y2Ba将上清液用蒸馏水稀释至≤0.1％TCA，然后浓缩并在蒸馏水中平衡通过压力辅助过滤，如上所述。GydF4y2Ba

GvP1糖肽的纯化和MALDI-TOF分析GydF4y2Ba

将纯GVP1加入到含氰溴化物（CNBR）（1：2W / W）的70％甲酸溶液（0.1：1w / v）中，并在25℃下在氮气流下孵育16小时黑暗的。然后将反应混合物用纯水稀释10次，并进行2个冷冻，冷冻干燥至接近干燥（Speed-Vac，救助仪器，核糖，NY）和在纯水中重悬浮以除去挥发物。通过在上述条件下通过超糖-12色谱分离肽。将15-16ml在15-16mL下施加的峰值分别施加至150×3.9mm C.GydF4y2Ba_18GydF4y2Ba用0.1%TFA平衡反相柱。在肽洗脱之前，用5 mL 0.1%TFA在0-80%线性乙腈梯度内洗涤柱，在HGydF4y2Ba_2.GydF4y2Bao以0.5mL min的流速超过7.5ml。GydF4y2Ba^-1GydF4y2Ba．洗脱液在280和254 nm处使用Gold系统检测器(Beckman，美国)进行监测。将选定的肽峰合并，用CGydF4y2Ba_18GydF4y2Ba拉链提示和使用芥子酸作为基质在所述线性模式，其特征在于通过MALDI-TOF MS（Bruker型反射III）。GydF4y2Ba

氨基酸组成分析，氨基酸测序GydF4y2Ba

如前所述分析纯GVP1或葡萄树细胞壁的盐水不溶性级分的氨基酸组成[GydF4y2Ba29GydF4y2Ba]．的伸展肽P4和P6分别用于测序通过Edman降解如前所述制备GydF4y2Ba22GydF4y2Ba]．然后使用Procise TM蛋白序列仪（Model 491 HT; Applied Biosystem，Warrington，UK）从Biobrene™-Treated玻璃纤维盘中测序肽。GydF4y2Ba

用于GVP1的5'截面cDNA的RNA提取和克隆GydF4y2Ba

根据制造商的说明，使用QIAGEN的RNEASY植物迷你套件孤立总RNA。对于3'族PCR，使用POXS3底漆（5'（T）1μg总RNA合成第一链cDNAGydF4y2Ba_18GydF4y2BaNN-CAC AGC AAC AAG TCG GAT CCG ACC（T）20（AGC）（AGCT）3'）在含有200u上标II（Invitrogen II（Invitrogen），0.2mM DnTPS，2.5μl0.1MDTT的25μl中，50分钟在70℃下，将第一个链CDNA合成终止于15分钟的热灭活，然后用MasterCycle个人热链（EPPendorf）直接用作PCR扩增的50μL和2.5μL。PCR利用引物POXS2（5'-cacagtagcaac AAGTCGGATCGACG-3'）和引物ext1（5'-AA（AG）（AT）（GC）ICCICCICCICCIGTITA（CT）AA（AG）-3'），其中I = Inosine）对应于常见的双旋囊延伸蛋白基序Ksppppvyk。PCR循环的条件在94℃下为1分钟的变性，2分钟退火，在72℃下延伸2分钟，在60℃下循环30℃。使用50分钟的最终延伸，以促进随后的Ta克隆。扩增由2.5u Taq聚合酶（MBI Fermentas）进行，总体积为50μl反应，每个DNTP，10ml 10×PCR缓冲液（Stratagene）的5个PMolesPOXS2,10MPols4 0.2mm，（NHGydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba)GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

PCR产物在1% TAE琼脂糖凝胶上可见，300 bp及以上的产物纯化(琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒，罗氏)，乙醇沉淀并连接到pGEM T Easy载体(Promega)。JM109感受态细胞按照厂家说明使用结扎产物进行转化。选取10个阳性克隆进行测序。GydF4y2Ba

细胞壁单糖组合物分析GydF4y2Ba

将糖分析的所有细胞壁样品冷冻干燥并分散在72％H中GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba室温下3小时。稀释至2N H后GydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba所以GydF4y2Ba_4.GydF4y2Ba样品在100°C下水解1 h和2.5 h。糖醛酸用量热法测定，中性糖用气相色谱法测定[GydF4y2Ba35GydF4y2Ba]．GydF4y2Ba

用快速冷冻扫描电子显微镜测量细胞壁厚度GydF4y2Ba

控制或HGydF4y2Ba_2.GydF4y2BaOGydF4y2Ba_2.GydF4y2Ba- 处理的愈伤组织细胞或者均质化或在0，15或100mM KCl溶液平衡30分钟，并立即通过投入液氮搪塑在-210℃，然后在扫描电子显微镜断裂冻结。显微照片拍摄在5kV或更低，使用安装有CT1500HF冷冻系统（英国加坦，牛津，UK）飞利浦/ FEI XL30场发射SEM（FEI英国有限公司，剑桥，UK）。样品进行常规的溅射镀膜与成像前2至4nm的铂。细胞壁厚度的测量是直接在使用飞利浦成像软件显微镜样品进行。各制剂中搜索最佳的对准的部件，其精确地看着垂直于细胞壁平面上，并且不超过3个读数的宽度是从同一制剂服用。平均壁宽度从Tukeys异常值的识别和消除后至少10次重复计算。显着性检验利用未配对的学生t检验。GydF4y2Ba

JIM11抗原表位的免疫定位GydF4y2Ba

新鲜葡萄愈伤组织在液氮中冷冻后，用徕卡CM3050 S低温恒温器切片至20 μm。材料GydF4y2Ba体外GydF4y2Ba将培养的葡萄植株浸入4％多聚甲醛的固定溶液中，在0.1M磷酸钠缓冲液中0.1％戊二醛，pH 7.4，受10分钟的真空浸润，并在温和搅拌下置于4°C过夜。然后将样品在随着在室温下在LR白色树脂中嵌入室温并在60℃下聚合24小时之前将该样品脱水。使用Leica超微大麻切割至0.5μm并收集在聚-L-赖氨酸（Sigma-Aldrich）玻璃载玻片上。将该部分在4℃下孵育8小时，用5％PBS /牛奶含有5倍稀释的初级抗体，JIM11 [GydF4y2Ba48GydF4y2Ba]．PBS洗涤后，将100倍稀释的二抗(Cy5偶联山羊抗大鼠IgG (Jackson Immunoresearch))加入切片，黑暗1小时。载玻片与1%钙白粉在PBS中孵育，然后在PBS中洗涤，并安装在慢褪色光抗褪色工具包(分子探针)中。切片用徕卡TCS SP5 II共聚焦显微镜观察，图像用ImageJ处理。GydF4y2Ba

我们非常感谢基斯·罗伯茨(John Innes，英国)在工作过程中对克里斯蒂娜·席尔瓦·佩雷拉的大力鼓励和支持，以及他对手稿的评论。感谢美国埃默里大学微化学核心设施的Jan Pohl和Olga Stuchlich对MALDI-TOF分析的出色帮助。我们感谢Fundação para a Ciência e a technologia博士资助SFRH/BD/10626/2002 (ADV)， SFRH/BD/6486/2001 (JMLR)和PRAXIS XXI/BD/19872/99 (CSP)，以及项目资助(POCTI/BCI/33116/2000, POCTI/33201/BME/2000)。GydF4y2Ba

隶属关系GydF4y2Ba

1. 植物细胞壁的实验室，研究所德TECNOLOGIA QUIMICAËBiológica/里斯本新大学，阿帕127，奥埃拉斯，2781-901，葡萄牙GydF4y2Ba

   Cristina Silva Pereira，JosélRibeiro，Ada D Vatulescu＆Phil Ap JacksonGydF4y2Ba

2. 细胞和发育生物署，John Innes Center，诺威奇研究园，诺威奇，NR4 7UH，英国GydF4y2Ba

   金正日FindlayGydF4y2Ba

3. 英国，诺维奇，科尔尼，NR4 7UA，诺维奇，诺维奇研究园，食品研究所，食品生物物理系GydF4y2Ba

   Alistair J MacDougallGydF4y2Ba

通讯作者GydF4y2Ba

对应于GydF4y2Ba菲尔普杰克逊GydF4y2Ba．GydF4y2Ba

作者的贡献GydF4y2Ba

CSP表演了大部分水合分析，延伸的延伸素，通用细胞壁提取物和细胞壁，GVP1肽纯化并有助于写入稿件。JMLR辅助生产愈伤组织和一般细胞壁提取物的制备。adv负责克隆5'-截断的GVP1的cDNA序列和免疫细胞化学技术。KF在英国John Innes Centre的墙壁碎片中进行了电子显微镜。在英国食品研究所的AJM托管CSP，在这项工作的最初部分，并促进了细胞壁水合分析的专业知识。PAPJ促成了一般葡萄和Medicago材料的生产，水合分析，对Maldi光谱的解释，研究，设计和协调。所有作者都已读取并批准了最终手稿，并声明他们没有竞争利益。GydF4y2Ba

开放获取GydF4y2Ba本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(GydF4y2Bahttps://creativecommons.org/licenses/by/2.0.GydF4y2Ba)，允许在任何媒介上无限制地使用、分发和复制，但必须正确引用原作。GydF4y2Ba

再版和权限GydF4y2Ba