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拟南芥转位蛋白(TSPO)在盐胁迫和四吡啶代谢扰动下在多个水平上受到调控

摘要

背景

转位蛋白18 kDa (TSPO),以前被称为外周型苯二氮卓受体(PBR),对哺乳动物和细菌的许多细胞功能非常重要,如类固醇生物合成、细胞呼吸、细胞增殖、细胞凋亡、免疫调节、卟啉和阴离子的运输。拟南芥包含一个TSPO / PBR与细菌或哺乳动物中的同源基因相比,该基因n端延伸40个氨基酸,表明该基因可能是叶绿体或线粒体定位的。

结果

为了测试TSPO n端延伸是否将其靶向到细胞器,我们在TSPO中融合了三个潜在的转译起始位点TSPOGFP n端cDNA (TSPO: eGFP)。的位置TSPO:发现eGFP融合蛋白依赖于翻译起始位置和植物生长条件。全身的TSPO:在标准条件下植物生长时,在内质网和未知的囊泡中发现了eGFP融合蛋白。然而,全长TSPO:eGFP在150 mM NaCl和盐胁迫条件下生长时定位于叶绿体。相反,当TSPO:eGFP被截断至第2或第3起始密码子21或42位,融合蛋白在标准条件下与线粒体标记共定位。利用启动子格斯融合、qRT-PCR、荧光蛋白标记和叶绿体分割方法,我们证明了这一点在非生物应激条件下,TSPO水平在转录、转录后和翻译后水平上受到调控。盐反应基因在atspo-1混战在盐胁迫条件下,突变体与野生型相比,而在盐胁迫条件下,突变体与野生型相比减少TSPO过表达。四吡咯生物合成基因突变和叶绿素或类胡萝卜素生物合成抑制剂的应用也有影响AtTSPO表达式。

结论

我们的数据表明,AtTSPO在的反应中起着作用拟南芥对高盐胁迫。盐胁迫导致AtTSPO通过其n端延伸从内质网重新定位到叶绿体。此外,我们的研究结果表明AtTSPO在四吡咯生物合成突变体的转录水平上被调控。因此,我们提出在盐胁迫和其他四吡咯代谢受损的条件下,TSPO可能在运输四吡咯中间体方面发挥作用。

背景

高等植物通过一个共同的分支途径合成四种主要的四吡啶(叶绿素、血红素、西罗血红素和光敏变色素)[1- - - - - -3.](附加文件1).在后生动物中,血红素和似红素是在线粒体中合成的,但在植物中,四吡咯的生物合成是质体定位的,这表明四吡咯是从叶绿体运输到线粒体的。这表明血红素生物合成途径的晚期存在于叶绿体和线粒体中(附加文件)1).四吡咯中间体的浓度是严格控制的,因为这些化合物是光反应性的,可以产生活性氧(ROS)。此外,该途径中的许多酶受到环境刺激和发育信号的调控[45].

在哺乳动物中,一个18kda的外周型苯二氮卓受体(TSPO/PBR)位于线粒体外膜[6]在此结合其他蛋白质,如34-kDa电压依赖性阴离子通道和内膜腺嘌呤核苷酸载体[7].TSPO最初被命名为“外周苯二氮卓受体”(PBR),然而,最近它被重新命名为“TSPO”,这反映了它与细菌富含色氨酸的感觉蛋白在结构和功能上的相似性[8].

TSPO主要功能是运输血红素、卟啉、类固醇和阴离子[8- - - - - -11].然而,TSPO蛋白对细胞呼吸作用也很重要[12],细胞增殖[13]和凋亡[14].例如,在红系中,在应激反应中,TSPO对于转运卟啉很重要,卟啉诱导血红素生物合成基因的表达。同样,在小鼠红白血病细胞中,TSPO已被证明运输原卟啉IX,在四吡咯和血红素生物合成中发挥关键作用[15].

在α-变形菌门Rhodobacter sphaeroidesTSPO定位于外膜,氧诱导其表达[16].在高氧条件下,TSPO通过输出四吡啶途径的过量中间产物,如Mg-Protoporphyrin IX (Mg-ProtoIX)和MgProtoIX单甲基酯,负调控光合基因的表达[17].河鼠TSPOHomologue补充Rhodobacter tspo突变,表明TSPO的功能是保守的r . sphaeroides后生动物[18].

TSPO蛋白功能性的证据拟南芥其他植物之前也有报道[19].重组体的运输研究拟南芥TSPO在大肠杆菌揭示了苯二氮平刺激的原卟啉和胆固醇的高亲和力摄取,导致了假设拟南芥同源在原卟啉原IX运输到可以合成血红素的线粒体中起作用。然而,作用TSPO在植物代谢中的作用尚不清楚。

在动物和酵母中,TSPO存在于线粒体的外膜[620.].然而,TSPO在植物中的定位仍然存在争议。Lindenman.[19]免疫金染色显示TSPO定位于线粒体和质体的外膜洋地黄lanata叶子。然而,后续的Western blot实验只能检测到线粒体部分的TSPO。在另一项研究中,TSPO在从茄属植物tuberosum分生组织,而在叶绿体部分检测到低水平[21].在Physcomitrella金属盘,瞬时表达的TSPO融合到GFP的n端,PpTSPO:GFP,定位于线粒体[22].在拟南芥, TSPO与YFP的c端融合导致YFP:在内质网和高尔基堆中发现TSPO [23].

拟南芥基因组包含一个TSPO相关基因(AtTSPO).预测的蛋白质与其细菌和哺乳动物同源物的中心结构域高度相似。然而,TSPO有一个40个氨基酸的n端延伸,在细菌或哺乳动物中都不存在。此外,在这40个氨基酸中,有三个帧内atg密码子可以编码第一个蛋氨酸(位于M1, M21和M42位置)(附加文件)2) [19].为了确定该区域是否包含细胞器靶向信息,我们利用3个不同的起始位点开发了一系列融合蛋白。我们的研究结果表明TSPO存在于不同的细胞器区室,不同的环境胁迫不同。这些结果,加上插入突变和表达研究的分析,表明TSPO在允许过程中起着重要作用拟南芥以应对高盐胁迫。

结果

感应AtTSPO非生物胁迫下基因表达

Physcomitrella金属盘,表示PpTSPO-1是由盐胁迫和脱落酸(ABA)诱导的[22].AtTSPO也是由盐胁迫诱发的吗拟南芥24],以及在拟南芥细胞培养[23].我们进一步定义了的转录丰度AtTSPO用NaCl、甘露醇、ABA和甲基紫ologen (MV)处理5日龄幼苗,提取总RNA,进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)。

与未处理植株相比,150 mM NaCl、250 mM甘露醇、1 μM ABA和0.2 μM甲基紫ologen (MV)处理均显著增加AtTSPO表达式(图1).的动力学AtTSPONaCl和ABA胁迫下的诱导效果相似,均在处理3 h后达到峰值,6 ~ 25 h后逐渐下降1一而且1 a - b分别)。甘露醇的加入导致峰值AtTSPO在3-6 h之间表达,然后丰度缓慢下降(图1一1 a - b而且1得了).然而,与NaCl处理3小时相比,甘露醇处理显示出两倍的诱导作用(图1一而且1得了),这表明AtTSPO是由渗透胁迫而不是盐胁迫引起的。MV处理迅速诱导TSPO,在1小时出现诱导,3小时达到峰值,然后在12-24小时之间下降到基础水平(图1模拟).

图1
图1

感应的AtTSPO信使rna受到非生物胁迫.(一个)实时荧光定量PCR分析AtTspO(a) 150 mM NaCl, (b) 1 μM ABA, (c) 250 mM甘露醇,(d) 0.2 μM甲基紫精处理后的转录产物。计算相对表达水平和肌动蛋白3 g18780)和18岁核糖体rna (3g41768)作为内参基因。(B) GUS基因在AtTSPO-437::格斯而且奇迹:格斯15日龄转基因株系拟南芥未经处理或150 mM NaCl处理的植物。

来确定AtTSPO积累是对NaCl胁迫的转录反应,一个结构,包含437 bp上游推定的翻译起始位点AtTSPO基因被融合到uidA报告基因(AtTSPO-437::格斯),并转化为植物,使在活的有机体内分析AtTSPO对应激条件的转录反应。AtTSPO-437::格斯在处理3 h内,150 mM NaCl诱导,与内源基因的qRT-PCR结果相似(图1 b).在对照实验中,150 mM NaCl处理使基因表达量略有下降奇迹:格斯(图1 b).综上所述,这些结果表明437 bp区域的AtTSPO启动子对TSPO的转录调控是充分的。

识别和表征AtTSPO突变体

确定…的功能AtTSPO在活的有机体内,获得T-DNA插入突变体(SALK_135023) [25AtTSPO.这一行(tspo-1)被发现有两个串联的T-DNA插入,在转录起始密码子上游123 bp处AtTSPO基因(图2).通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析,确认纯合子系为敲除突变体。在这个突变体中,TSPOmRNA水平约为野生型的20%(图2 b).

图2
figure2

具有不同水平的突变体表型AtTSPO表达式.(一个的分离插入突变体示意图AtTSPO拟南芥.在转录起始密码子上游123 bp处串联插入两个T-DNA拷贝AtTSPO.(B)从5日龄幼苗中分离总RNA,逆转录后进行qRT-PCR。所示数据表示独立扩增反应(n = 3)和生物重复(n = 2)的平均值。柱状图表示生物重复的标准误差。(C)在16小时光周期下生长的至少100个7天大幼苗的根长。(D)用分光光度法测定了14天龄、相应基因型的离体植株的叶绿素浓度。所示值为三个独立样品的平均值,每个样品含有100毫克新鲜重量。单位为每克鲜重(fw)的μg叶绿素a + b。

AtTSPO在转基因CaMV 35S启动子中,与GFP n端融合或不融合的基因均构成性过表达拟南芥(OxM1TSPO和OxM1TSPO:eGFP)。我们获得了10个过表达系,但主要集中在两个纯合子系,它们表现出~500倍的过表达AtTSPO(图2 b).的tspo-1, OxM1TSPO:eGFP和野生型在Murashige & Skoog (MS)琼脂培养基或土壤上并排培养,并监测可能的异常表型。与野生型和过表达株系相比,基因敲除的植株的根更长2摄氏度).此外,tspo-1在150 mM NaCl的作用下,与野生型或过表达系相比,其积累的叶绿素量减少了30%左右(图2)二维).

胁迫反应基因表达增强tspo-1

AtTSPO在发芽和幼苗生长试验中,先前的表达被渗透胁迫调节[23].因为TSPO调节光合基因的表达r . sphaeroides16,我们假设tspo-1或OxM1TSPO:eGFP突变体可能具有盐胁迫反应受损。我们检测了一些已知的盐胁迫调节基因(RAB18, ERD10和DREB2A)的表达[26].正如预期的那样,在野生型植物中,150 mM NaCl诱导了胁迫标记基因3 a, B而且3 c).在TSPO过表达系中,DREB2A和RAB18水平较低,但ERD10表达未见明显变化(图3 a, B而且3 c).

图3
图3

应激反应基因在tspo-1在盐胁迫下.(一个) - (C)胁迫诱导的OxM1TSPO基因表达:eGFP和tspo-1qPCR方法与野生型植物进行比较。5天大的幼苗在标准条件下生长,并转移到含有150 mM NaCl的培养皿中3小时。(一个DREB2A, (BRAB18和(CERD10定量qRT-PCR检测mRNA水平。相对量计算和归一化相对于未处理的Col-0(100%)。的肌动蛋白而且18岁rRNA作为内参基因。肌动蛋白,3 g18780;18岁RNA,3 g41768;RAB185 g66400;ERD101 g20450;DREB2A5 g05410。所示数据为独立扩增反应(n = 3)和生物重复(n = 2)的平均值。计算相对表达水平。柱状图表示生物复制的标准误差。

tspo-1在突变体中,150 mM NaCl处理3 h导致所有三个胁迫标记基因的表达增加(图3 a, B而且3 c).综合来看,这些结果表明AtTSPO在调节应激反应基因表达中起重要作用。

光调节四吡咯基因的表达受到抑制tspo-1可拆卸的突变

与TSPO转运四吡咯一致[171927],tspo-1植物积累的叶绿素比野生型植物少(图二维).因为我们发现TSPO参与了盐胁迫反应,因为TSPO负调控光合基因r . sphaeroides17].接下来,我们分析了几个关键的叶绿素生物合成基因的表达tspo-1植物。

最初,我们确定了四吡咯途径中大多数关键基因的mRNA水平(附加文件)1)tspo-1而且gun5突变体。GUN5编码叶绿体mg -螯合酶的H亚基,参与感知四吡咯中间体水平的改变[28].所有已知的四吡咯生物合成基因都依赖于光[29]中被发现下调tspo-1,以及在gun5突变体(28)(图4a c e f g而且4 h),而这两个不依赖光的基因的表达在野生型和tspo-1突变体(图4 b而且4 d).

图4
装具

四吡咯生物合成基因的表达tspo-1突变体.四吡咯生物合成基因的qRT-PCR分析Col-0tspo-1而且gun55天大的幼苗在持续光照下生长。相对量计算和归一化相对Col-0摘要(100%)。除了HEMA2而且FC1在美国,所有的基因都被证明是受光调节的。本文按照四吡咯生物合成的酶序进行了研究。的肌动蛋白而且18岁rRNA基因作为对照。肌动蛋白3 g18780;18岁核糖体rna,3 g41768;(一个HEMA1谷氨酰胺- trna还原酶1 -1 g58290) (BHEMA2谷氨酰胺- trna还原酶2 -1 g04490);(CPPO(Protoporphyrinogen氧化酶——在4 g01690);(DFC1铁螯合酶1 -5 g26030);(EFC2铁螯合酶2 -2 g30390);(FGUN2血红素加氧酶1 -2 g26670);(GGUN4mg -卟啉合成调节剂-3 g59400);(HGUN5mg -螯合酶亚单位H -5 g13630);((叶绿素A加氧酶-1 g44446);和(JGUN1Pentatricopeptide repeat (PPR) protein -2 g31400)。所示数据为独立扩增反应(n = 3)和生物重复(n = 2)的平均值。计算相对表达水平。柱状图表示生物复制的标准误差。

四吡咯通路通量与AtTSPO信使rna水平

tspo-1突变体的光调节四吡咯代谢基因水平降低(图4a c e f g,4 h),叶绿素含量也较低(图二维).为了研究降低四吡咯中间体的通量是否会影响AtTSPO我们使用了两种不同的药物来干扰四吡咯的生物合成,Gabaculine和Norflurazon。Gabaculine通过阻断谷氨酸-1-半醛转氨酶活性作为四吡咯生物合成抑制剂[30.31].除草剂Norflurazon抑制类胡萝卜素的生物合成,并间接影响四吡咯生物合成中的酶[32- - - - - -34].AtTSPO在50 μM的gabaculine处理下,mRNA水平增加了2倍,500 nM的norflurazon处理下,mRNA水平增加了500倍5).

图5
figure5

与四吡咯通量的关系AtTSPO表达式.(一个AtTSPO在50 μM gabaculine和500 nM norflurazon溶液中萌发的野生型植株,与未处理的植株相比,表达量明显增加。(BAtTSPO四吡咯途径不同突变体的mRNA水平。相对量计算和归一化相对于未处理的Col-0(100%)。的肌动蛋白而且18岁rRNA基因作为对照。肌动蛋白3 g18780;18岁RNA,3 g41768。所示数据为独立扩增反应(n = 3)和生物重复(n = 2)的平均值。计算相对表达水平。柱状图表示生物复制的标准误差。

来探索AtTSPO表达受遗传改变的四吡咯生物合成途径的影响,我们分析了其表达AtTSPO在不同的突变背景(附加文件1).我们发现AtTSPO在不同的四吡咯途径突变体中,水平有不同的改变。AtTSPO稳态水平增加gun2(等位基因hy1-由血红素合成光敏色素动素所需)[35],gun4(原卟啉IX-和mg -原卟啉IX结合蛋白突变)[36],fc1(铁螯合酶突变体)[37],hemA1hemA2双突变体(谷氨酰胺- trna还原酶基因均突变)[38),lin-2(coproporphyrinogen III氧化酶突变)[39)(图5 b).增加的表达AtTSPO在这些突变体中与四吡咯水平降低是一致的TSPO为其他舱室中的角色运输四吡体。唯一的生物合成突变体导致AtTSPO水平是crd1(mg -原卟啉IX单甲基酯环化酶突变)[40)(图5 b).所有这些突变,除了crd141],以某种方式抑制ALA的合成,这表明干扰四吡咯的生物合成或积累影响AtTSPO信使rna表达。

TSPO定位取决于所使用的平移起始位置

AtTSPO2g47770)编码一种预测分子量为18 kDa的蛋白质。该蛋白在其n端扩展区有三个可能的帧内atg起始密码子(M1, M21和M42)(附加文件)2) [19].

由于植物TSPO定位的报道有不同的结果,植物TSPO的亚细胞定位[192123的亚细胞位置TSPO,并评估n端延伸在目标定位中的作用AtTSPO在细胞内。过去的研究[20.23]利用n端GFP融合,可能阻止潜在的器官靶向TSPO,特别是线粒体或质体定位。瞄准:允许适当的瞄准TSPO融合为GFP,AtTSPO位于GFP的n端。构建了3个结构子,分别代表从CaMV 35S启动子中表达的潜在起始密码子M1 (OxM1TSPO:eGFP)、M21 (OxM21TSPO:eGFP)和M42 (OxM42TSPO:eGFP)拟南芥

TSPO:通过共聚焦显微镜观察到eGFP在这些品系的根、下胚轴和子叶中的亚细胞定位。全身的根尖内质网(ER)中发现TSPO:eGFP (OxM1TSPO:eGFP)(图6)和子叶(图6摄氏度)在5天大的幼苗中。然而,在这些植物的下胚轴中,在ER和未知身份的囊泡中发现了融合蛋白(图6 b).当使用M21 (OxM21TSPO:eGFP)或M42 (OxM42TSPO:eGFP)时,融合蛋白总是与有丝分裂追踪器共定位,表明线粒体定位(图6d e f g h而且6我)(附加文件3.).这些结果证实了先前对TSPO线粒体定位的观察d . Lanata叶用免疫金染色拟南芥western blot实验[19],以及内质网定位蛋白[23],表明三个起始密码子的替代使用可能对TSPO定位及其翻译后控制。

图6
figure6

TSPO有不同的亚细胞位置,这取决于所使用的转译起始位点.OxM1TSPO共聚焦图像:eGFP (得了), OxM21TSPO:eGFP (D-F)和OxM42TSPO:eGFP (胃肠道)本地化。OxM1TSPO:eGFP定位于ER和根中功能未知的囊泡(一个),下胚轴(B)和子叶(C).OxM21TSPO:eGFP定位于根的线粒体(D),下胚轴(E)和子叶(F).OxM42TSPO:eGFP显示根中线粒体定位(G)、下胚轴(H)和子叶().绿色为GFP荧光,红色为叶绿素自发荧光。样本用Mitotracker进行孵育以识别线粒体(见附加文件3)。在野生型背景下使用含有35S-TSPO:eGFP的纯合转基因植物进行分析。比例尺= 50 μm。

在高盐胁迫下,OxM1TSPOeGFP与质体相关

确立了关键的作用TSPO对非生物胁迫的反应,我们接下来研究了TSPO的定位TSPO:植物在不同胁迫条件下的eGFP融合蛋白。5日龄幼苗分别用250 mM甘露醇、1 μM ABA、0.2 μM MV和150 mM NaCl处理。处理18小时后,OxM1TSPO:eGFP定位于质体(图7g h i j k而且7 l),而OxM21TSPO:eGFP和OxM42TSPO:eGFP即使在NaCl处理延长5天也没有改变定位(数据未显示)。TSPO:甘露醇、ABA或MV处理植物时,GFP定位没有变化(数据未显示)。

图7
figure7

盐胁迫下OxM1TSPOeGFP定位于叶绿体.(f共聚焦分析显示,在标准条件下生长的5日龄幼苗的内质网中OxM1TSPO:eGFP定位,下胚轴中存在功能未知的囊泡。(G-L共聚焦分析显示,OxM1TSPO:eGFP叶绿体定位于150 mM NaCl环境下5日龄幼苗的下胚轴。绿色为GFP荧光通道,红色为叶绿素自发荧光通道。采用野生型背景下含35S-TSPO:eGFP的纯合转基因植物进行分析。比例尺= 50 μm。

的表达水平AtTSPO在盐胁迫下,每个系的总蛋白用GFP抗体进行免疫印迹(图8).在所有情况下,TSPO:GFP蛋白在盐处理24h后显著增加。的积累TSPO:GFP依赖于TSPO因为空载体控制使用CaMV或泛素10 [42]启动子驱动GFP的表达在盐胁迫下没有变化(图8没有显示)。这些结果表明TSPO的积累在转录、转录后和翻译后水平上受到调控。

图8
figure8

盐胁迫下TSPO积累和叶绿体定位.(一个)牛的免疫印迹分析TSPO:eGFP (OxM1TSPO:eGFP, OxM21TSPO:eGFP和OxM42TSPO:eGFP)是植物中GFP抗体检测到的融合蛋白。植物不加处理,或加150 mM NaCl处理。以野生型植物和过表达绿色荧光蛋白(OxeGFP)的植物幼苗为对照。(B)胰蛋白酶化叶绿体的抗gfp免疫印迹拟南芥未经处理或150 mM NaCl处理的植物。对照免疫印迹检测抗体、叶绿体蛋白RuBisCo和D1;转化为胞质UGPase。每个通道代表等量的叶绿体。

确认…的位置我们对从OxM1TSPO:eGFP系中分离出来的叶绿体进行了蛋白酶保护实验,这些叶绿体分别在150 mM NaCl处理和不处理条件下生长。在叶绿体分离和蛋白酶保护后,等量的叶绿体用GFP抗体进行免疫印迹。在叶绿体组分中检测到TSPO接近其预测的单体分子质量(附加文件)4而且5在150 mM NaCl处理18小时的植株中),而在未处理的植株中则没有8 b).由OxTSPO制备的叶绿体:eGFP系偶尔显示出与GFP质量近似的低分子质量带。这条带可能是蛋白质水解的结果TSPO和GFP标签在样品制备过程中,尽管我们不能排除其他可能性,因为我们没有抗体TSPO蛋白本身。RuBisCo和D1抗体证实了蛋白酶保护后叶绿体的完整性和存在。对细胞质蛋白UGPase的抗体也证实了这些组分不受细胞质污染(附加文件)5).这些数据以及共聚焦显微镜显示M1和M21之间的区域对于靶向很重要盐胁迫下TSPO对叶绿体的影响。自TSPO不受胰蛋白酶消化的影响(图8 b),AtTSPO可能是叶绿体外包膜的组成部分。

讨论

TSPO在叶绿体和线粒体中的定位与其在卟啉转运中的作用是一致的。植物TSPO已被提出参与质体与线粒体四吡咯生物合成途径的相互作用[19].在高等植物中,四吡咯几乎只在质体中合成,除了血红素合成的最后两个步骤可能同时发生在叶绿体和线粒体中。如果TSPO参与四吡咯输运[19,我们有理由认为TSPO可以将四吡咯中间体通过细胞器膜转运,这就解释了为什么植物需要TSPO的叶绿体和线粒体异构体。

与这一假设相一致的是TSPO蛋白比哺乳动物和细菌的蛋白质长。叶绿体和线粒体的靶向决定因子通常位于蛋白质的n端;因此,在TSPO的c端形成了一个与GFP融合的蛋白。使用这个策略,我们证明了TSPO有不同的亚细胞定位模式,这取决于转译起始密码子、组织类型或植物所受的非生物胁迫。GFP融合体位于TSPO的N端或c端可能解释了之前研究的不一致性[192123]与这里介绍的相比。Guillaumot使用的结构[23的n端融合了YFPTSPO,这可能潜在地掩盖了将TSPO靶向到叶绿体和线粒体的转运肽。事实上,最近观察到类似的情况拟南芥HEMERA蛋白。当HMR的c端有CFP时,它只定位在叶绿体中,然而,HMR与YFP的c端融合(YFP-HMR)只定位在细胞核和细胞质中,而不是叶绿体[43].

逆境条件的拟南芥导致er局部化的运动M1TSPO:eGFP到叶绿体。我们还证明了TSPO n端扩展中不同的起始密码子可以将TSPO蛋白靶向到不同的细胞器上。其他植物蛋白,如MDAR(拟南芥单脱氢抗坏血酸还原酶)和tRNA核苷酸转移酶[4445]也被认为是针对不同的细胞器,因为不同的转录起始位点。因此,很容易推测,氯塑性TSPO可以保护叶绿体免受盐胁迫损伤,保护线粒体TSPO通常可以将叶绿体合成的卟啉导入线粒体。已经在哺乳动物中观察到TSPO亚细胞定位的改变。哺乳动物TSPO定位于线粒体外膜,但在快速细胞增殖过程中,如转移过程,它重新定位于核膜,这表明发育控制其亚细胞定位[46].

我们的结果提示存在叶绿体靶区在盐胁迫下工作的TSPO。的n端结构TSPO (M2TSPO: eGFP和M3TSPO:eGFP)不能成为该细胞器的目标。这些结果表明,前20个氨基酸TSPO可能是该蛋白叶绿体靶向肽的一部分。需要进一步的实验来精确地描述这一叶绿体靶向决定因素。

TSPO在植物细胞中的定位是复杂的,涉及到盐胁迫时蛋白质从内质网和囊泡到叶绿体的重新定位。近年来,人们提出了几种蛋白质导入叶绿体的新机制。例如,有人假设叶绿体、线粒体和其他细胞器膜的包膜之间的密切接触可以允许蛋白质在它们之间运动[47].在线粒体和内质网之间已经观察到这种融合[48],其中提示囊泡相关膜蛋白1 (VAMP-1)可能参与了线粒体与靶膜的对接[49].反过来,这可以促进蛋白质从线粒体到其他隔室的重新定位。最近在植物中发现了密切的胞内膜接触,即叶绿体和内质网之间的接触[50],以及线粒体和细胞核之间的关系[51,证实了这一假设。目前尚不清楚在此过程中使用的是哪种途径盐胁迫下TSPO的迁移。然而,我们的数据表明TSPO在压力下改变其定位,也有可能是Frank之前观察到的线粒体亚型.[22专利中林登曼著.[19d . lanata而且拟南芥可以在拟南芥通过使用替代翻译开始密码子。

转录水平AtTSPO在野生型拟南芥植物对盐、甘露醇、ABA和百草枯的反应增加。启动子区TSPO对盐胁迫转录应答也有充分作用。归纳AtTSPO当使用本构启动子(35S和UBI10)表达时,也观察到受盐胁迫的影响AtTSPO,提示归纳TSPO在转录水平和转录后水平都有发生。

TSPO过表达系应激反应基因水平降低(ERD10DREB2A而且RAB18),而tspo-1突变体过度表达这些基因。这表明AtTSPO表达和/或功能对于这些基因在应激条件下的适当调节是必要的。这些结果也表明TSPO在应激适应中起重要作用拟南芥,这一观点与p .金属盘22].自RhodobacterTSPO是光合基因的负调控因子[17),有可能TSPO在调节植物的胁迫反应基因方面也有类似的作用。

的精确函数盐胁迫下四吡咯转运中的TSPO尚待确定。然而,有许多报告表明,四吡咯流动的改变可能与耐盐性有关。外源5-氨基乙酰丙酸(ALA)可提高高等植物的耐盐性[51- - - - - -56].也有研究表明转基因拟南芥过量产生ALA的烟草和水稻具有更好的耐盐性[5758].Abdelkader.[59]认为,高盐胁迫主要通过降低卟啉的形成速率来抑制叶绿素的积累.[58]表明盐胁迫导致血红素含量显著降低。因此,在高等植物中,ALA和四吡咯的合成对盐胁迫很敏感。

另外,我们证明了TSPO对四吡咯的通量和/或代谢很重要。除草剂诺氟拉松,一种非竞争性植物烯去饱和酶抑制剂,[31- - - - - -33]和神经毒素Gabaculine,它通过阻断谷氨酸-1-半醛转氨酶活性来抑制四吡咯的生物合成[2930.]在本研究中使用,以减少通过四吡咯生物合成途径的通量。我们的数据显示,四吡咯生物合成基因的突变和这两种不同药物的应用降低了四吡咯中间体的通量AtTSPO表达式。所有测试的抑制ALA合成的突变都增加了AtTSPOmRNA稳态水平。在诺氟拉松和gabaculine抑制ALA的形成时,也观察到同样的结果。唯一的突变体测试下降AtTSPO表达式是crd1,其积累mg -原卟啉单甲基酯,这种积累不影响ALA合成的抑制[40].最后,有可能TSPO可能参与植物细胞内不同四吡咯信号分子的分配。四吡咯代谢基因的几种光调控mrna的稳态水平在实验中被下调tspo-1变种人,这表明,TSPO可以作为四吡咯生物合成的调节器,类似于它的细菌对应物[16].

结论

TSPO已被证明在多种生物中运输许多小分子,但其在植物中的功能尚不清楚。这里我们演示一下拟南芥TSPO在转录、转录后和翻译后水平上被调节,以应对非生物应激条件,如盐胁迫。我们的研究结果表明TSPO可以定位于ER和线粒体,但当植物受到盐胁迫时AtTSPO存在于叶绿体中。我们的数据也表明,在正常情况下AtTSPO可能是重要的进口叶绿体合成血红素到线粒体。然而,针对AtTSPO盐胁迫对叶绿体的作用可以保护叶绿体免受损伤。此外,四吡咯中间体被认为在叶绿体到细胞核的逆行信号传导中起作用[3560].有可能TSPO可能参与植物细胞内不同四吡咯信号分子的分配,这取决于环境条件。在盐胁迫或四吡咯代谢受损的条件下,TSPO可能在重定向四吡咯中间体方面发挥作用。我们的发现表明,四吡咯生物合成途径的突变或抑制增加了AtTSPO表达式。与此同时,TSPO可能直接参与细胞质中高活性卟啉的解毒。我们目前正在调查这些可能性。

方法

植物材料和生长条件

拟南芥种子生态型Col-0表面消毒和镀上MS1/2介质(61]使用或不使用50 mM卡那霉素。幼苗在4℃条件下保持3天,然后在23℃条件下光照/暗循环16/8小时的生长室中生长。在标准条件下垂直生长10天的植物上进行根长测量。对于非生物胁迫处理,150 mM NaCl, 250 mM甘露醇,1 μM ABA (Sigma;在MS中加入0.2 μM百草枯1/2琼脂板,5天大的幼苗在正常生长条件下孵育。诺氟拉松和Gabaculine实验用MS镀种子1/2含1%或2%蔗糖,含或不含5 μM诺氟拉松(山德士制药公司;维也纳,奥地利)或50 μM的gabaculine (Sigma,美国)。所有实验均独立重复3次,计算平均值。

RNA提取和qRT-PCR分析

根据制造商说明书,使用Spectrum™植物总RNA试剂盒(Sigma #STRN250-1KT)分离总RNA。使用First Strand cDNA synthesis Kit (#K1611)将1微克总RNA添加到每个cDNA合成反应中。对于qRT-PCR,在SYBR存在下进行DNA扩增®MyIQ™单色实时PCR检测系统(BioRad)中的绿色qPCR检测(Invitrogen),使用表中的引物对1.循环使用:95℃,1 min 30 sec;40 ×(95℃,10秒;60℃,1分钟);95℃,1分钟;60℃,1分钟和81 ×(60℃,10秒)。相对mRNA水平由归一化的PCR阈值循环数来确定肌动蛋白而且18 s RNA.所有实验均独立重复3次,计算平均值。

表1实时定量PCR (qRT-PCR)所用引物

TSPO敲除验证

tspo-1T-DNA突变体SALK_135023从Salk标本中获得[24].采用基因特异性PCR引物进行PCR分型,分离纯合突变体TSPO-LP和TSPO-BP联合LBa1(表2).表型研究仅采用纯合子系。

表2用于克隆和分型的引物

AtTSPO GUS融合载体的构建及GUS检测

平动星位上游437 bp处AtTSPO基因(2g47770)被平动融合成uidAGateway法转染pKGWFS7基因®(表达载体™)[62]并被引入拟南芥通过农杆菌属-介导转化[63].有关克隆引物和构造信息,请参见表2而且3.,分别。对于组织化学GUS表达,植物样品在GUS测定液(1 mm 5-溴-4-氯-3-吲哚基葡萄糖苷,0.5 mm K)中37°C浸泡16小时3.铁(CN)6, 0.5 mm K4铁(CN)6, 0.3% (v/v) Triton X-100, 20% (v/v)甲醇,50mm无机磷酸盐缓冲盐水)。该反应进一步在37°C的黑暗中进行,最长持续16小时。

表3构造信息

AtTSPO融合蛋白的亚细胞定位

对于GFP融合结构,克隆包含的编码区域AtTSPO以及从甲硫氨酸21和42开始的融合产生并克隆到pK7FWG2 [62)(表3.)根据制造商的说明(Invitrogen, CA, USA)。所用引物为:TSPO M1: TSPO NT1和TSPO CT1;TSPO M2: TSPO NT2和TSPO CT1;TSPO M3: TSPO NT3和TSPO CT1;TSPO 80aa: TSPO NT1和TSPO CT80(表2).拟南芥在徕卡DM IRE2(徕卡微系统)共聚焦激光扫描显微镜下观察。对于线粒体特异性染色,拟南芥幼苗在MitoTracker中孵育®红色CMXRos (Invitrogen, #M7512)根据制造商的说明。GFP的激发波长和发射波长分别为488和505-530 nm (BP 505-530滤波器),MitoTracker的激发波长和发射波长分别为543和560-615 nm (BP 560-615滤波器)®分别。所有图像都在徕卡DM IRE2图像浏览器程序(徕卡微系统)上处理。

叶绿素含量的测定

发芽后10天的幼苗称重,冷冻在液氮中,并在80% (v/v)丙酮中研磨。研磨的组织在2000克离心5分钟,将任何不溶性物质制成颗粒。然后测定了提取的叶绿素在645和663 nm处的吸光度。叶绿素(a和b)含量根据Lichtenthaler方法测定[64].

叶绿体隔离

从平板生长中分离叶绿体拟南芥如前所述进行苗木[65].叶绿体的最后再悬浮在缓冲液(330 mM山梨醇,50 mM HEPES-KOH, pH 8.0)中,浓度为1 mg叶绿素ml-1

免疫印迹

通过添加蛋白提取缓冲液(50 mM HEPES pH 7.9, 300 mM蔗糖,150 mM NaCl, 10 mM乙酸钾,罗氏蛋白酶抑制剂鸡尾酒,1% (w/v) Triton, 1 mM DTT)从10日龄幼苗中提取总蛋白。研磨后的组织在5000 × g下离心5分钟,使组织成粒,用Bradford法定量蛋白质[66].样品在250 mM Tris-HCl, pH 6.8, 10% (w/v) SDS, 30% (v/v)甘油,5% (v/v) β-巯基乙醇和0.02% (w/v)溴酚蓝中煮沸5min。SDS-PAGE采用标准程序进行。叶绿体蛋白样品被等量的总叶绿素归一化加载。SDS-PAGE之后,分离的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Bio-Rad)。免疫检测时,用抗GFP (ROCHE, #11814460001)、UGPase (AGRISERA, #AS05086)、RuBisCo (AGRISERA, #AS03037)和D1(AGRISERA, #AS05084)的抗体孵育膜。除GFP检测采用小鼠二抗外,其余免疫反应蛋白均采用兔二抗检测。根据制造商说明,使用化学发光试剂盒(Thermo Scientific, #34076)检测免疫反应。

缩写

阿坝:

脱落酸

阿拉巴马州:

5-Aminolevulinate

CFP:

青色荧光蛋白

D1:

光系统II反应中心D1蛋白

HMR:

与蛋白质

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

格斯:

β葡萄糖醛酸酶

Mg-Proto第九:

Mg-Protoporphyrin第九

MV:

甲基紫罗碱

ROS:

活性氧

二磷酸核酮糖羧化酶:

核酮糖1 5 5-biphosphate羧化酶,

TSPO:

易位蛋白

UGPase:

UDP-glucose焦磷酸化酶

鞋面:

囊泡相关膜蛋白

YFP:

黄色荧光蛋白。

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下载参考

确认

我们感谢Jesse Woodson, Juan M. Perez-Ruiz, Ana Lucia Giannini, Amanda Mangeon和Marcio Castro Silva-Filho对手稿提供了重要的反馈。索尔克研究所提供了插入突变系和ABRC,以提供材料。来自Rede de Plataformas Tecnológicas da Fundação Instituto Oswaldo Cruz (FioCruz)的Pedro Paulo de Abreu Manso和Bernardo Miguel de Oliveira Pascarelli为共聚焦显微镜分析提供技术支持。Luiza da Silva为工厂改造提供技术支持。EBP得到了CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior)的博士奖学金和CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico)、索尔克研究所和Balcoffee Trading Intermediações Ltda的SWE奖学金的支持。YJ由欧洲分子生物学组织(EMBO)和马克和伊娃·斯特恩基金会长期资助。BJSCO由美国国立卫生研究院和美国国家综合医学科学研究所F32GM086037基金资助。JGU由美国癌症协会资助RSG-05-196-01-CCG。这项工作得到了美国能源部向JC提供的能源部能源部FG02-04ER15540的资助,国家环境保护委员会Científico e Tecnológico (CNPq)和Fundação卡洛斯·查加斯·菲尔奥·德·安帕罗à里约热内卢国家公园里约热内卢(FAPERJ)向GSM提供的资助。

作者信息

从属关系

作者

相应的作者

对应到乔安妮Chory吉尔伯托Sachetto-Martins

额外的信息

作者的贡献

EBP、JC和GSM构思并设计了实验。EBP完成了所有的实验,分析了数据并撰写了论文。YJ帮助共聚焦显微镜分析。BJSCO参与了分馏实验。上帝抵抗军和JGU提供了技术支持。JC和GSM是项目督导,参与了从项目开始所有实验的讨论和稿件的准备。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。

电子辅助材料

显示本研究中分析基因的植物四吡咯生物合成途径示意图

附加文件1:。蓝色部分是已经描述过的基因。与这些基因名称和AGI代码相对应的酶是:1 g58290);谷氨酰胺- trna还原酶21 g09940);谷氨酰胺- trna还原酶32 g31250);ALA合成调节剂3 g14110);LIN2(协比卟啉原氧化酶1,1 g03475);血红素加氧酶1,2 g26670);光敏变色素合成酶3 g09150);GUN4 (mg -卟啉合成调节剂,3 g59400);GUN5 (mg -螯合酶亚单位H,5 g13630);mg -螯合酶亚单位I,4 g18480和5 g45930);CHLD (mg -螯合酶亚基D,1 g08520);原卟啉IX甲基转移酶4 g25080);CRD1 (mg -原卟啉IX单甲基化酶3 g56940);铁螯合酶15 g26030);铁螯合酶22 g30390)。(pdf 535kb)

不同生物TSPO序列的比对

附加文件2:。TSPO蛋白的ClustalW序列比对Rhodobacter sphaeroides(AF195122.1),鼠形(J05122)和拟南芥TSPO (TSPO -2 g47770)。左边的数字表示来自初级蛋白质的氨基酸位置。在一致线中,保守的氨基酸被高亮显示为(*),当观察到一个保存位置时为(.)。M1, M21和M42突出显示TSPO异构体。黑色箭头代表前80种氨基酸(TSPO80aa)拟南芥TSPO。(pdf 862 kb)

M42TSPO:eGFP与有丝分裂器共定位

附加文件3:M42TSPO:eGFP与有丝分裂器共定位拟南芥M42TSPO:eGFP 5日龄转基因株系(A-C)用有丝分裂记录仪孵育,鉴定线粒体。(A)来自GFP通道的图像显示为绿色。(B)来自核分裂跟踪器通道的图像以红色显示。(C)绿色荧光蛋白和有丝分裂器通道合并,显示为黄色。比例尺= 50 μM。(pdf 528kb)

免疫印迹显示

附加文件4:TSPO:eGFP在盐胁迫中积累.牛三种亚型蛋白水平的免疫印迹分析盐胁迫下的TSPO:eGFP (OxM1TSPO:eGFP, OxM21TSPO:eGFP和OxM42TSPO:eGFP)显示了蛋白的积累。以野生型植物和过表达绿色荧光蛋白(OxeGFP)的植物为对照。以抗ugpase和红-ponceau染色作为加载对照。等量的总蛋白质。(pdf 924kb)

OxTSPO:eGFP植物叶绿体的免疫印迹

附加文件5:。拟南芥用GFP、RuBisCo、D1和UGPase抗体进行免疫印迹,用未处理或150 mM NaCl处理的10 d幼苗制备叶绿体。在每个通道中加载等量的OxM1TSPO:eGFP叶绿体蛋白样本。(TP)总蛋白;Chl:叶绿体蛋白;PP(蛋白酶保护处理)。(pdf 1004kb)

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关于本文

引用本文

Balsemão-Pires, E.,杰伊拉斯,Y.,奥尔森,B.J.et al。拟南芥转位蛋白(TSPO)在盐胁迫和四吡啶代谢扰动下在多个水平上受到调控。BMC植物生物学11日,108(2011)。https://doi.org/10.1186/1471-2229-11-108

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关键字

  • 植物TSPO
  • 亚细胞定位
  • 非生物胁迫
  • 监管
  • 叶绿体