全球转录组分析ameiotic1玉米花药中的等位基因:确定减数分裂进入和进展前期的步骤I

背景

植物减数分裂开始的发育线索发生较晚。Ameiotic1（Am1)编码一种植物特异性核蛋白（AM1），该蛋白是减数分裂进入和进行早期前期I所必需的。在大多数情况下，花粉母细胞（PMCs）保持有丝分裂am1突变体包括AM1-489， 尽管am1普拉伊AM1蛋白在减数分裂的两个不同阶段发挥着重要的作用。为了更深入地了解AM1在减数分裂前转录和减数分裂程序中的作用，我们在这里报告了一项深入分析的基因表达变化，在1 mm(减数分裂进入)和1.5 mm (L/Z)精心安排的花药am1等位基因。

结果

1.0 mm和1.5 mm花药AM1-489和am1普拉伊与安捷伦的有生育能力的兄弟姐妹相比^®4 × 44 K微阵列。这两个AM1-489和am1普拉伊花药在1.0毫米处细胞学正常，并显示中度转录组改变。在1.5毫米阶段，两个突变体在细胞学上都异常，并显示更剧烈的转录组变化。在细胞中有更多的绝对开/关和两倍多的差异表达基因（不育与可育）AM1-489比在am1普拉伊．在1.5毫米处，两种基因中有4,418个基因上调或下调AM1-489或者am1普拉伊囊里。这些主要是阶段特异性转录本。在这些基因中发现了许多假定的减数分裂相关基因，包括一小部分等位基因特异性的、调控错误的pmc基因。在这两个突变体中，近60%的转录组变化(N = 530)在pmc中富集，只有1%在绒毡层细胞转录组中富集。在此报告的所有数组数据将在MaizeGDB存储和访问http://www.maizegdb.org/．

结论

我们对两种不同的调查组调制的分析am1等位基因,AM1-489和am1普拉伊该研究重新定义了AM1作为减数分裂基因子集表达的调节剂的作用，它对减数分裂进程很重要，并提供了与减数分裂进入和早期前期I进展相关的特定阶段的遗传网络的见解。

在有性生殖过程中，减数分裂确保后代从每一个亲本获得一半的遗传信息，从而在一代又一代中保持正确的倍性。许多减数分裂所必需的基因在真菌、无脊椎动物、哺乳动物和植物中高度保守。相反，控制减数分裂启动的机制是保守的伊弗斯[1gydF4y2Ba].与动物不同，植物在发育早期缺乏预先确定的生殖系。因此，了解指定原始孢子细胞（减数分裂细胞的祖细胞）的分子变化对于定义导致从有丝分裂到减数分裂成功转换的细胞过程网络至关重要。

开花是植物发育的后期阶段，几乎所有的花细胞都是体细胞。在生殖细胞中有缺陷的突变体通常在体细胞中没有或很少有缺陷，反之亦然;一旦指定，减数分裂前细胞可以进行有丝分裂增殖，并在周围体细胞组织异常时成功分化进行减数分裂[2]．在被子植物中，减数分裂细胞起源于少数多能体细胞，起源于花分生组织的L2层(L2-d)。在玉米(玉米在150-170 μm花药的子房中，当子房中有大约20个L2-d细胞时，它们会迅速扩大[3.)(图1a）.朝状细胞延长有明显的几天（图1b)，然后暂停3天，成熟为pmc和功能减数细胞;同时，玉米花药从1毫米长到1.5毫米(图)1c和1j）.不区分朝向细胞的L2-D细胞形成3个细胞层，每个细胞类型，围绕性降级群体（图1c）.目前尚不清楚L2-d细胞是如何在花药中被编程为减数分裂前的，或者这种身份是如何在PMC成熟之前的有丝分裂中被保留的。到1.5 mm时，减数分裂前期I已经开始和完成，这取决于许多基因的正确表达[4，5]．虽然原孢子细胞分裂是异步的，但玉米减数分裂是高度同步的，可能是由pmc之间的胞间连丝(细胞质)连接促进的。

我们的研究重点是了解1.0 mm花药中的pmc成熟为减数分裂细胞，即有丝分裂的终止、减数分裂能力的获得和减数分裂的开始需要哪些过程?我们已经在开花植物中发现了许多正常花药分化所需的基因，但我们感兴趣的是，一旦体细胞和PMC细胞的正常群体出现，如何确定导致减数分裂的步骤。一些证据表明减数分裂早在减数分裂前的间期就开始了[6- - - - - -8在玉米花药中PMC成熟的三天期间。此外，在此阶段之前可能有分化步骤，但在细胞学上看不出来。

我们分析减数分裂能力的切入点是AM1;这是正常PMC成熟所需的玉米核蛋白[9]，它是减数分裂起始和早期前期I进展所必需的[10.].这个actual roles of AM1 in the progression of meiosis at either the premeiotic/meiotic or the L/Z transition are still unclear at the molecular level. The closest homologs to AM1 are OsAM1 in rice [11.]和SWI1/DYAD拟南芥［12.，13.]但是这种基因来自真菌和动物基因组。对双突变组合的分析表明Am1是许多减数分裂基因的上位基因，负责同源染色体配对，包括afd1、dv1 ms43,MS28［14.];其他减数分裂过程影响am1突变体包括调控姐妹染色单体的凝聚、端粒束的形成、重组、突触、微管的组织和其他减数分裂基因的表达，特别是那些在前期I早期的基因[10.]．

多个am1等位基因在细胞学上已被区分[14.，15.]所有纯合子都是雄性无菌。除了一个等位基因州（am1普拉伊)，具有PMC细胞解剖结构的中央室细胞进行有丝分裂而不是减数分裂。例如,AM1-489等位基因包含一个μ在3'端附近插入外显子;虽然等位基因被转录，但在突变花药中没有检测到蛋白质[10.].这个am1普拉伊等位基因通过单一氨基酸取代（R358W）编码半官能蛋白质;蛋白质支持减数分裂，但PMC不能正常进展。在肥沃的玉米中，AM1在早期的预先染色中表达了染色体，后来装载到染色体上;缺陷的AM1-Prai蛋白仍然是在L / Z转变的核和减数分裂中分散在核和减数分裂中[10.]L/Z转换是减数分裂过程中的一个重要步骤，在减数分裂过程中，当端粒聚集在核膜上时，同源染色体配对开始，随着同源重组的进行，双链断裂发生[16.].这个am1普拉伊等位基因表明L/Z转变在植物中受到严格的调控，这为我们分析玉米减数分裂的关键步骤提供了依据。突变体的精确表型是种特异性的，但在每种情况下，AM1及其同源物在早期减数分裂事件的调控中发挥作用。来自大米的OsAM1 [11.]具有与玉米相似的结构域，然而拟南芥的SWI1/DYAD蛋白缺乏AM1中发现的N-和c -末端结构域，在中央保守PHD手指结构域的相似性仅为31% [12.，13.].RNA干扰抑制OsAm1导致减数细胞达到瘦素，类似于玉米am1普拉伊突变型[11.]．拟南芥中异常的SWI1/DYAD1蛋白不同程度地影响花药和胚珠减数分裂过程中的染色体结构和内聚力[12.，13.，17.]可能是通过减数分裂染色体重构[18.].这个sister chromatids segregate unevenly during meiosis inswi1-1 /双花药，而在胚珠中，减数分裂被丝分裂取代。拟南芥具体SWI1/DYAD1等位基因显示一小部分未减少的二倍体配子，表明减数分裂或减数分裂后的失败。该表型代表无融合生殖产生的第一步(无融合生殖)，这是植物育种的一个新前景，在这种情况下，后代基因型与亲本相同(减数分裂失败类)或与单个减数分裂产物相同[19.]．

为了更好地理解在PMC成熟过程中为减数分裂和通过关键的L/Z转变所需要的步骤，我们比较了有丝分裂的花药转录组AM1-489L/Z减数分裂阻滞am1普拉伊使用定制安捷伦4×44 K微阵列的细胞系am1突变体影响雄性和雌性减数分裂，选择花药是因为它们比雌性花组织更容易解剖，并且因为在这个阵列平台上已经可以对正常玉米花药发育进行全面的转录组研究[20- - - - - -22]．

植物的发育与形态am1突变的流苏

为了鉴定对本研究相关的肥沃和男性无菌兄弟姐妹的花药开发的阶段，为窝藏的两个背景仔细遵循发育进展am1普拉伊和AM1-489等位基因。如图所示，可育玉米植株上的雄性花序(穗状花序)产生数百个小穗1d和1f．当穗状花序成熟时，沿着主穗直立的侧枝松弛到侧向位置，花粉从伸出的花药脱落。的外部形态am1普拉伊流苏(图1e)与可生育的兄弟姐妹非常相似（图1d）具有相同数量的流苏分支（8-10）的。相比之下,AM1-489流苏(图1g)其侧枝（5-6）少于可育兄弟（8-10，图1f).雄性雄穗发育迟缓AM1-489植物也被观察到，因为雄穗分枝直立的时间比可育的兄弟姐妹长约5-7天；雄穗长am1普拉伊植株与可育的同胞同时从直立向侧方转变。

每个小穗包含两个小花;每个小花含有3个花药(图1h)，每个花药含有4个小室。上小花一般比下小花提前1天。在我们的阵列实验中，只采集上部小花的花药，所有测量均以该小花为参考。许多具有减数分裂前缺陷的玉米雄性不育突变体表现出延迟的雄穗成熟和大约2毫米的花药生长停滞(V. Walbot，未发表的数据)，也就是说，在可育植株中，在减数分裂完成后的三周时间内，花药生长无法维持。雄性不育am1普拉伊花药继续生长，长度可达4至5毫米(图)1i)，大约与有生育能力的兄弟姐妹在同一时间。这说明体细胞的层状结构am1普拉伊突变体花药可以在减数分裂停止的情况下继续生长。无菌am1普拉伊花药室在退化之前是丰满的（未显示）1g）.相比之下,AM1-489花药在大约2毫米处停止，小室塌陷，花药退化早，这是大多数植物的典型特征ameiotic1以及其他减数分裂前的雄性不育突变体[9，22]．我们认为，体细胞花药生长超过2毫米需要有功能性pmc的存在。我们假设体细胞花药组织am1普拉伊花药感知PMCs进入减数分裂等线索，但不需要通过前期I的进程来维持花药生长。

细胞学分期

收集花药，固定后用乙红染色，测定1.0、1.5和2.0 mm花药中pmc的细胞学分期(图)2）.均为1.0 mmAM1-489和am1普拉伊PMC在1.0 mm阶段的Pre-Deiotic相互作用（图2a)，细胞学正常。在可育植物中，原始孢子细胞在1.0 mm的PMC期之前完成了大部分的减数分裂前有丝分裂，但随着细胞成熟，其大小继续从1.0 mm扩大到1.5 mm [3.]1.0 mm可育花药的大多数PMC处于间期，但少数已提前到早期细势期（图1）2a）.在1.5 mm处，可育的pmc肯定处于减数分裂，并同步实现合子(图)2a)，而私营军事公司在AM1-489在有丝分裂的不同阶段(非同步)发现有20条未突触染色体(图2a）.在2.0毫米AM1-489PMC持续一次或多次有丝分裂（图2a)如前所述[15.]．

am1普拉伊PMC的成熟延迟并停留在间期（图2a）在1.5毫米。最终，它们由2.0 mm阶段同步地开始分数（图2a)，在正常1.5 mm阶段后约18小时(图2b, (20]; PMC随后在L/Z过渡处停止。所以,，am1普拉伊pmc在减数分裂进入过程中被延迟，在最初的减数分裂阶段进展更为缓慢。

可育和突变花药的转录组开/关差异

探针被标记为存在(On)或不存在(Off)，如方法所述。玉米花药表达的基因数量惊人:Agilent 4 × 44 K玉米阵列在1.0 mm和1.5 mm花药中常规检测到约30,000个基因的表达[21，22]．因为这两个am1本文所检测的等位基因存在于不同的遗传背景(见方法)，玉米自交系表现出高水平的基因存在/缺失和拷贝数变异[23]我们首先研究了这两个品系中可育兄弟姐妹之间花药转录组的一致性。大多数转录组（91%在1.0mm处，88%在1.5mm处）在两个可育背景之间共享（表1）1gydF4y2Ba).近交系的基因含量平均变异约为7%[23]，因此我们得出结论，许多在两个背景中观察到的差异是归因于玉米多样性。为了最大限度地减少在对背景效果/关基因表达的分析，我们已经直接比较突变体花药转录到肥沃兄弟姐妹。

在1.0毫米AM1-489花药在细胞学上与可育的兄弟姐妹相似;然而，他们在有生育能力的兄弟姐妹中缺失2%(484/30,070)的转录本，这高于估计的0.13%的错误发现率(见方法)。此外，与有生育能力的兄弟姐妹相比，4%(1208)有异位表达(见表)1gydF4y2Ba）.这些异位表达的基因包括那些有助于pmc继续有丝分裂的基因AM1-489囊里。在1.0毫米am1普拉伊花药也类似于肥沃的细胞学上，但较少的〜10％[（31,282-28,104）/ 31,280]转录型和80基因的异位表达（0.26％）。这些转录组的一些转录组差异可以反映连接不平衡（肥沃与索氏菌属的等位基因变异，在基因座中连接到am1等位基因)或显型太微小，无法通过显微镜看到。如下所述，导致转录组差异的主要因素am1普拉伊是这种突变体的发育迟缓。

1.5 mm可育花药中的pmc处于细线期和合子期之间的早期I期，体细胞已经分化，体细胞分裂减慢。而在1.5毫米处则更为严重AM1-489花药在可育兄弟姐妹中缺失了3700多个转录本(约13%)1gydF4y2Ba）.其中3487个在两者中都有表达am1普拉伊突变体和肥沃的兄弟姐妹，因此在数千个丧失表达病例中应该是参与减数分裂的基因。相比之下，刚刚超过500（<2％）基因am1普拉伊与有生育能力的兄弟姐妹相比(表1gydF4y2Ba）.转录组数据支持减数分裂进入延迟的细胞学观察am1普拉伊，因为在1.0 mm处缺失的转录本中有80%(2634个)被表达为1.5 mm。包括所有8种样本类型的全球转录组连锁树也表明，两种背景的转录组差异最大，而突变体和可育样本在1.0 mm处的转录组差异最小。在这两种背景下，突变样本的转录组在1.5 mm处比1.0 mm处更具有可育性1gydF4y2Ba)因此，在比较两个等位基因之前，排除背景差异是很重要的。

我们评估了开/关基因列表中是否存在已知的减数分裂相关基因，但没有发现任何相关基因。因此虽然am1突变等位基因通过异位表达和表达缺失影响了约10%的玉米基因的表达，这些转录组差异必须主要与体细胞过程有关。这说明减数分裂基因是在不育细胞中表达的am1但其表达水平仍可能受到影响。

阶段之间或等位基因之间的上调基因

除了开/关差异外，我们还评估了表达（开）的转录类型，这些转录类型与p值<0.05的对照组相比至少有1.5倍的差异（见方法）.为了在比较两种突变体花药类型时尽量减少背景差异导致的错误发现，仅在两种可育背景中检测到转录本类型（共同可育组：1.0 mm处29262和1.5 mm处28072；在表中突出显示）1gydF4y2Ba)用于评价上调或下调基因。两种突变体花药在1.5 mm处的基因差异表达量是1.0 mm处的4倍左右(图)3a）;大多数转录本是阶段特异性的，证实了这两个发育阶段的不同特性[20].这个greater transcriptome abnormalities at 1.5 mm parallel the more aberrant mutant phenotypes at this stage. A subset of these transcripts is likely essential for entry and progression through early meiosis. TheAM1-489突变体具有大约两倍的基因，上调或下调am1普拉伊在1.5毫米处（图3b)，证实了更严重表型的分子后果AM1-489.3358个差异表达基因是AM1-489，无论处于哪个阶段，都可能参与减数分裂的进入或相反地突出参与有丝分裂抑制的基因。这些转录组差异(2,613,78%)大部分在1.5 mm处发现，包括6个减数分裂基因，即MEL1、SPO11-1、OSD1a、RPA70 (RPA1a)、PS1和MSH5。

除了众多等位基因特异性，差异调节的基因外，共有530个差异表达的基因共同AM1-489和am1普拉伊在1.5 mm阶段(图3c）.其中包括非冗余的468个基因，它们在两者中表达不同(图)3c)和62个相反调控的转录本(“上升与不上升”或“下降与不下降”)。两个突变体的基因在两个阶段都发生了错误调控(图8重叠区域)3.）是很好的候选人共同转录反应am1与L/Z转变进程有关的突变花药。在1.5毫米处发现的468个非冗余基因特别有趣，因为这是减数分裂进程的临界点。玉米减数分裂基因同源物，如Skp1B Zip4 / Spo22-like，Rad54-like和减数分裂特异性周期蛋白[24- - - - - -32，显示转录调控错误am1突变体。

基于细胞学证据，研究人员发现am1普拉伊当预防性维修检查委员会在现场时被延迟，然后被逮捕AM1-489花药进行有丝分裂而不是减数分裂。因此，转录组在AM1-489与1.0 mm可育花药相比，花药在减数分裂进入过程中可能也很重要。Afd1（Rec8 / Rad21同族体),RPA70，例如，适度下调AM1-489在1.0毫米处，但不向下am1普拉伊在1.5毫米。同族体的Afd1编码与凝聚力复合物相关的蛋白质，该蛋白质建立了姐妹染色体内聚力[33- - - - - -35]， 尽管RPA70与复制、修复和转录有关[36]．我们还在这组中发现了一种RNA解旋酶SDE3，它通过RNAi在转录后基因沉默中发挥着重要作用[37]并被证明与蠕虫、苍蝇和哺乳动物的减数分裂有关[38- - - - - -40]。该阵列中包含的所有减数分裂基因的热图（总共78个探针，跨越45个基因）显示在附加文件中2．

我们的结果表明，AM1蛋白衰减了许多减数基因的表达水平和对花药至成熟至关重要的其他体细胞基因。花药开发被推迟（am1普拉伊)最终停滞不前，导致男性不育。

数据验证

在此处报告的研究之前，在同一阵列平台上进行了试验阵列实验。来自家庭的花药被隔离AM1-489和am1普拉伊在中试试验中，只使用1.0 mm和1.5 mm的雄性不育花药，每种样品类型有4个生物池。我们比较了来自试点实验的数据，发现超过90%的试点数据证实了这里展示的结果(附加文件)3.）.

为了进一步验证关键转录本的量化和分类，一组11个减数分裂相关基因，包括Am1采用qRT(定量RT-PCR)分析。其中10个结果与阵列数据一致(见表)2和其他文件4）.唯一一份例外的成绩单(Spo11-1)评分为边缘性上调(1.5倍标准，log2 = 0.6)AM1-489突变体相对于1.5 mm的可育性，但根据qRT结果没有显著变化。值得注意的是我们检查了的表达水平Am1本身。qRT分析证实该转录本在am1普拉伊在微阵列数据中观察到的1.5毫米花药中。当Am1-praI中高表达，导致性母细胞消息积聚。增加的转录物丰度也反映在至少2倍更高水平的AM1-PRAI蛋白在含有1.0-3.0毫米花药比在这些阶段的野生型同胞流苏（附加文件5）.

差异调节转录本的基因本体（GO）注释

使用AGBase分配GO术语http://www.agbase.msstate.edu在美国，超过50%的调查都分配了一个或多个术语。数字4说明了不同转录本的分类，不包括未知类别，这些类别包括在附加文件的基因计数列表中6．几个官能团是突出的。在1.0和1.5 mm时，具有催化活性和转运活性的基因均受到影响AM1-489和am1普拉伊囊里。在Pre-Meiotic 1.0mm阶段，具有水解酶活性或核苷酸结合的基因占具有已知功能的〜30％的基因。当细胞正在为细胞周期制备细胞，包括细胞生长，DNA复制和细胞器繁殖以及体细胞增殖细胞的适当分化时，这些组可能在PMC中临时临时。尽管在该阶段在突变体和肥沃的花盆之间没有观察到重大细胞学差异，但许多细胞过程已经在PMC成熟开始时似乎受到损害。具有核酸结合活性的基因可能对L / Z转变是必需的。我们得出结论，通过新基因表达编程的细胞过程的开关对于PMC的随后的减少病毒进入和进展是必要的，并进行体细胞类型的正常发育。

AM1影响Meiocytes和Tapetum的转录组

基于细胞计数，PMC在玉米中的1.0和1.5mm阶段的阶段占1％的花药细胞[3.]然而，在横截面积上，这些巨细胞占子房的33%（图1c)和大约10%的花药(数据未显示)。使用Tang等人2010年的数据[41我们计算出，水稻pmc包含的RNA至少是普通细胞的25倍;类似地使用Chen等人2010年的数据[42]，拟南芥pmc必须包含比典型二倍体细胞至少100倍的RNA。因此，在分析整个花药时，预计22 - 53%的提取RNA将来自PMC群体。由于玉米与水稻的关系更密切，而且花药的大小和形态也更相似，我们将PMC对总RNA的预期贡献取20%左右。基于这些假设，可育花药中转录本的含量是两者的4-5倍am1突变体可能是PMC富集型或PMC特异性转录本。

尽管如此，图中记录的4587个转录组的大部分变化3b（使用496个冗余的冗余删除了5,083个总数）AM1-489或者am1普拉伊在减数分裂前细胞周围的体细胞组织中可能发生与可育细胞相比的情况。具有绒毡层缺陷的雄性不育突变体是非常常见的(c.f. [22因为这些护理细胞在向pmc传递营养和结构成分方面起着关键作用。虽然到目前为止还没有研究，但是PMC成熟的缺失很容易在1.0 - 1.5 mm的生长期影响相邻绒毡层细胞的分化，这是关于On/Off类转录本的假设。作为将转录本分配到生发前或体细胞组织的第一步，我们交叉检查了来自1.5 mm可育花药的pmc或绒毡层细胞的独立阵列数据集(T. Kelliher和V. Walbot，未发表的数据)。pmc富集基因定义为在pmc中表达比周围绒毡层高至少2倍的基因;相反，那些在绒毡层中表达比pmc高出至少2倍的细胞构成绒毡层富集的细胞。在整个花药中任一等位基因(N = 4,587)特异调控的基因中，13% (N = 613)存在于pmc富集类中;10% (N = 486)属于富含绒毡层组。分别考虑3174个非冗余等位基因AM1-48910% (N = 325)富集pmc, 12% (N = 393)富集绒毡层。在am1普拉伊:非冗余的am1普拉伊具体变化（N = 1577），20％（N = 317）是PMC富集和7％（N = 107）是绒毡层富集的。我们的结论是AM1具有PMC成熟过程中绒毡层分化产生重大影响，与绒毡层缺陷的比例较高AM1-489比在am1普拉伊；我们假设绒毡层细胞在AM1-489最终导致开发不足、时间较短AM1-489突变花药。我们假设在PMC-和绒毡层富集基因的组合列表中发现的基因可能对其他花药细胞类型的正常生长很重要。对于这两种类型am1突变等位基因，这一类包含75%的错误调控基因，表明PMCs的错误分化对体细胞花药细胞有重大影响。

在这两个突变体的530个基因中，有297个基因(56%)在全花药中富集pmc，只有1%的基因在绒毡层中表达约2倍。AM1蛋白以前仅在减数分裂的可育花药中通过免疫定位检测到，而不在相邻的绒毡层中[10.),Ameiotic1在PMCs（早期减数分裂）中检测到的转录性强度大约在1.5毫米的翅塔高约4-5倍。因此，没有AM1或异常蛋白的存在对PMC基因表达具有重大影响。表中列出了六十四个高度PMC富含PMC的基因3.；根据我们对PMC RNA对花药总RNA的预期贡献的估计，在减数分裂细胞中，这些基因比绒毡层中1.5 mm高4倍或更高。成员包括Am1，Skp1B，AGO2［43),而非洲联合银行（泛素相关）基因。

众所周知减数分裂基因的玉米同源物显示出转录误调节am1突变体(附加文件7）：SKP1.是泛素连接酶复合体的一个重要组成部分，在瘦素期到粗线期参与内聚分布和核重组[24，26，44];Rad54,一个Rad51参与染色质重塑和DNA双链断裂修复的伴侣[28，29，45];Msh4和Zip4 / Spo22-like，干扰交叉形成所需的基因[27，46];和Zyp1，突触复合体的中心元素，在L/Z转换时开始在染色体上聚集[47]．我们也注意到了减数分裂我进展的拟南芥和水稻[控制减数分裂细胞周期蛋白的异位表达SDS至关重要48]．

富集pmc基因的k -中值聚类

297个富含PMC的基因在两个突变体中差异表达（附加文件7)用cluster3.0程序中的算法进行聚类http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/. 基于欧几里德距离的K-中值聚类发现了几个有趣的聚类，这些聚类显示在热图中（图1）5).一组37个基因在am1普拉伊但下调AM1-489花药在1.5毫米处与可育的相比（图6和其他文件8）.这些平行的子集Am1表达，包括基因同源的AGAMOUS样MADS-box转录因子49，细胞周期相关的mob1样[50]，含SPX结构域，锌指（C3HC4型无名指）相关，基因沉默抑制因子3（SGS3）[51，52homolog(附加文件9)这些基因可能与减数分裂进入或有丝分裂抑制高度相关。在这两种基因中具有相似模式的基因AM1-489和am1普拉伊可能是减数分裂前期I进展的关键。例如，有45个基因在突变体和与之聚集的突变体中都下调了Skp1B和Rad54-like(图7和其他文件10.）.其他的基因簇包含与减数分裂相关的功能包括MMD1.，ZYP1，无孢子生殖,沃纳综合征atp依赖性解旋酶基因家族(53- - - - - -56]．

植物减数分裂能力细胞在花个体发生中分化较晚。目前，规范少数花体细胞减数分裂能力的步骤尚不清楚。然而，减数分裂细胞中的核事件很容易与有丝分裂细胞中的核事件区别开来，而原孢子细胞和pmc的发育程序至少通过进展到前期I而独立于成功的体细胞发育[2].这个ameiotic1玉米的突变体表明，进行减数分裂与之前的PMC分化事件如细胞和核的增大和圆形的细胞形状是不同的。总共am1突变花药后，原孢细胞正常增殖，使1.0 mm玉米花药中PMCs高度增大，数量和形态正常;体细胞分化在细胞学上也是正常的。对所有am1等位基因am1普拉伊这表明，进入减数分裂需要抑制有丝分裂和激活或维持减数分裂程序，而AM1参与了这些过程。体细胞层的细胞仍在分裂1.0毫米，但大多数细胞层已停止分裂1.5毫米[3.];有丝分裂的体细胞停止不需要am1。

全局转录组分析加强了基因的解剖表型差异AM1-489和am1普拉伊．与1.0 mm的可育突变体相比，这两个突变体在细胞学上几乎没有差异，转录组上也有适度的差异。1.5 mm时，可育pmc进入减数分裂，突变pmc未进入减数分裂;有丝分裂不同步AM1-489pmc，这些细胞am1普拉伊仍处于减数分裂前间期。与1.5 mm处的可育花药相比，突变体的转录组更有特色。比较am1普拉伊在1.0和1.5 mm处的基因图谱证实，这些花药在1.0 mm处发育迟缓，而在1.0 mm处预期出现的大部分转录组在1.5 mm处出现较晚。这些结果表明，AM1对PMC成熟的速度具有早期影响，这对及时进入减数分裂至关重要。

通过分析减数分裂相关基因、k -中值聚类以及与分离的正常pmc中检测到的转录本进行比较，我们发现了与减数分裂进入和L/Z转变相关的玉米基因。在我们的转录组分析研究中发现的许多减数分裂相关的转录本类型已经被报道在姐妹染色单体内聚、突触、同源重组和双链修复中发挥主要作用[57]．基于与已定义蛋白的同源性，预测SWI1/DYAD1和AM1之间共享的区域具有像其他PHD手指同源结构域蛋白一样的DNA结合能力[10.并可能参与调控转录。我们的阵列数据清楚地表明，AM1减弱了其他减数分裂基因的表达。有趣的是，减数分裂相关的基因中没有一个是以绝对的开/关模式调控的，这有点令人惊讶AM1-489pmc进行有丝分裂而不是减数分裂。这些结果重新定义了AM1在许多关键减数分裂基因转录本积累调节中的作用，而不是简单地打开或关闭它们。这也可能意味着，无论减数分裂是否继续进行，许多减数分裂基因，包括与DNA修复相关的基因都被表达出来;这将植物与其他经过充分研究的真核生物区分开来。

区分减数分裂和有丝分裂的一个关键步骤是同源染色体配对。只有在减数分裂期间，同源染色体才会通过突触复合体的形成而保持在一起，直到减数分裂前期I通过交叉的形成(交叉的细胞学表现)而完成。大量的研究已经确认了许多参与减数分裂进入后这些过程的基因[58，以及在比较中突出的几个基因am1到肥沃是在这个类别(附加文件2)。转录本类型仅在AM1-489包括与同源性的人Afd1，RPA70，5级,Msh5基因家族。在两个突变体花药中发现的转录差异包括与Skp1B，Rad54-like，Msh4，十二烷基硫酸钠,Zyp1AFD1是一种作用于ASY1/HOP1下游的玉米REC8同源物，与联会复合体轴向/侧向元件的维持和姐妹染色单体内聚的调节有关[33]．Pawlowski等人[10.]发现AFD1被加载到染色质上am1普拉伊但不是在am1-1私营军事公司。阵列和qRT数据均显示中度但显著降低Afd11.0毫米处的转录本AM1-489，这是类似的am1-1，但不在am1普拉伊．一代,一个重新认可同系物，参与减数分裂双链DNA断裂修复[59]．在植物中一代转录本存在于PMCs和胚珠减数分裂细胞中[60]，并偶而在有丝分裂细胞中出现[61].这个maize一代同系物分析在AM1-489但不是在am1普拉伊与可育的相比。因此，在am1普拉伊蛋白质不影响转录水平一代或者Afd1基因。我们可以得出结论，一个重要的转录调节Afd1和一代发生在减数分裂进入期，但在后来的L/Z转变中不是必需的。的地位praI“减数细胞”可能受到另一个控制水平的影响，以达到合子样阶段。其他机制，如转录后调节和/或特定减数分裂蛋白的核进入可能对减数分裂前期进展更为重要[62]．

RAD51,另一个重新认可同源物，是同源性搜索、染色体配对、DNA链转移(d -环形成)、减数分裂中双链断裂修复和体细胞DNA修复所必需的[63]．中缺失RAD51蛋白am1突变体[10.].都不是Rad51A也不Rad51A2转录水平受到影响，因此，RAD51蛋白水平的转录后调节是可能的。RAD54是一种分支迁移蛋白，参与解离减数分裂期间由DMC1形成的D-环以及由RAD51形成的D-环，但效率较低[45]．有趣的是,Rad54-like两组的转录水平均显著降低am1突变体。

Skp1B另一个已知的减数分裂基因家族在这两个基因中的表达也下调am1突变体。拟南芥SKP1样1（ASK1)基因在细线期到粗线期的重组中起关键作用[24，25]．ASK1蛋白在许多细胞过程中都很重要，包括减数分裂染色质的修改和重建[24，25]和端粒的形成[26]．端粒缺少花束AM1-489并且发育迟缓或不完整am1普拉伊［10.]．端粒聚集在核膜上是许多生物体减数分裂前I期染色体组织的另一个关键事件，发生在L/Z转变[64，65]．基于聚类分析，Rad54-like和Skp1B表达模式非常相似，并且依赖于Am1．因此，这三种蛋白质可能协同作用，促进减数分裂细胞通过L/Z过渡阶段am1普拉伊被逮捕。

与可育突变体相比，在减数分裂过程中其他有趣的表达差异基因包括总是早期［66],沃纳综合症解旋酶［56],Zap-3端粒酶［67),而驱动蛋白［68]．我们对这些基因的分析Skp1B，Rad54-like和Am1主要在减数细胞中表达(比整个花药高至少5倍，比绒毡层高至少3倍)。这一发现表明AM1在减数分裂染色体的建立或稳定过程中直接或间接地与这些蛋白相互作用。两个很好的无融合生殖候选基因，Afd1和油菜素内酯不敏感相关受体激酶基因(69，70]，被下调AM1-489花药直径分别为1.0毫米和1.5毫米。

根据帕尔默[9],am1-1在一轮或两轮异位PMC有丝分裂后，花药退化，并在~2.2mm花药期失败。AM1-489花药也停止生长，这与大多数其他减数分裂前雄性不育突变体相似[22].这个refore, the continued growth ofam1普拉伊结果表明，尽管体细胞和绒毡层的转录组发生了推测的变化，但转录组的差异主要导致pmc的缺陷，而没有显著损害体细胞层。我们进一步认为，pmc的减数分裂进入足以触发体细胞花药生长;发育信号的性质还有待确定。

为了更严格地解决转录组改变的细胞类型特异性，530个非冗余基因在两个细胞中差异表达am1等位基因用于查询源自常规花药中激光微探针的PMC或胶质细胞的阵列分析的基因列表。与在立即相邻的Tapetum中发现的那些相比，在PMC中表达56％的百分之表达至少2倍。我们的结果表明，完全没有AM1或过量的异常AM1-PRAI蛋白的存在对PMC在成熟阶段的水平长度为1.0-1.5mm的情况下对PMC的基因表达产生了深远的影响，包括减少人L / Z过渡阶段。基于估计PMC RNA对总排痰RNA的贡献[41，我们假设转录本富集4倍或更高可能是pmc特异性的。事实上，观察到的最高富集是9倍，最初令人困惑，因为pmc不到细胞群的1%，但应该包含许多与减数分裂有关的独特转录本。然而，在考虑了RNA的贡献后，在分离的PMC中富集4- 5倍是预期的。

最近，多种微阵列或RNA测序纯化性母细胞的分析已经报道了5，41，42，71]．采用手工方式或激光捕获显微切割，母细胞相对没有污染的体细胞进行了足够数量的用于分析获得的。这些水稻和拟南芥分析的局限性在于减数分裂的所有阶段都表示;即使有很少或没有从头最初出现在pmc中的转录本可能在减数分裂期间衰减，因此混合减数分裂细胞群体并不理想。在这些研究中，鉴定了800到1586种减数细胞特异性转录本。对于玉米，我们使用了完整的花药分析，并将其与独立的激光显微解剖的pmc和绒毡层细胞数据集进行了比较AM1-489和am1普拉伊探索关联的基因。Prainhase I跨越玉米花药开发30天的一天。从我们的分析中，鉴定了297ppc富集的基因被预先窄窗口内的两个突变体被识别，因此，我们鉴定了在PMC成熟开始时监管的基因，特别是在AM1-489突变体，可能与抑制有丝分裂和减数分裂的早期准备有关。

我们的am1转录组数据可以作为破译植物减数分裂启动复杂网络的资源。比较两种方法的结果am1等位基因提供了对多个控制点的洞察。

转录组的变化am1减数分裂前的花药导致pmc减数分裂能力的丧失。转录类型仅在AM1-489花药和类似Am1表达模式可能限定用于有丝分裂和进入的抑制要求进入减数分裂和最终影响花药体层的发育和成熟;影响在减数分裂相关联的进程AM1-489突变体包括对姐妹染色单体凝聚力和RNA干扰很重要的基因。在两个突变体中有差异调节的转录本更可能与L/Z转换的进展有关。基因芯片分析表明，玉米减数分裂前期受多个水平的控制，在减数分裂进入和L/Z转变的关键步骤中，AM1仅控制减数分裂基因的一个子集的RNA水平。

植物材料

两个玉米玉米(l)不同的混合背景，包含AM1-489(50% B73 + 25% A619 + 25%混合其他或未知)或am1普拉伊等位基因(75% A619 + 25%混合其他或未知)am1 / / am1）×肥沃的兄弟姐妹（am1 / / am1)杂交或可育杂合子自花授粉(am1 / / am1）.从4-6周的老植株上小心地取出未成熟的流苏枝条，用湿纸巾湿润，直到解剖。花药用两对锋利的镊子从上部的小花中取出，用千分尺测量，直接收集到螺旋帽微离心管中，在液氮中冷冻。每个生物重复采集1.0 mm花药60枚，1.5 mm花药30枚。为了进行细胞学分期，用解剖针将花药室内容物排到显微镜载片上。标准乙酰胭脂红染色[72]，用油镜对样本进行400倍的观察，以分类减数分裂阶段或确认有丝分裂染色体。

微阵列实验

使用Trizol提取总RNA^®加上RNA纯化试剂盒(Invitrogen，卡尔斯巴德，CA)从每个花药池。用生物分析仪检测RNA的质量和数量^®(安捷伦，圣克拉拉，加州)。根据制造商的建议，对4个生物重复进行扩增和平衡染料标记。每个无菌生物库(12个杂交)进行3个技术重复，每个可育生物库(4个杂交)进行1个技术重复。在定制的玉米4 × 44 K阵列(Agilent ID 16047，原始探针设计如在[20]，对载玻片进行清洗、干燥，并在安捷伦的高分辨率微阵列扫描仪上扫描;利用特征提取软件对数据进行处理。使用limma包对红色和绿色通道的中位数前景值进行了两步归一化[73]在R：使用LOWESS方法“阵列内的”，并使用四分位数方法“之间阵列”。与表达值的阵列的阴性对照的平均前景大于3.0个标准差以上的探针被认为是“上”，导致0.13％的估计错误发现率。然而，随着评价为“开”时，重复测量的少于75％的探针，然后进一步分析中排除。差异表达的显着性设定在1.5〜倍有p值≤0.05（LOG2〜0.58）。这些实验的微阵列数据都可以在网上GEOhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/加入编号GSE30149。

定量RT-PCR（qRT）

从三种生物重复量为每种样品类型的三种生物重复量，每种样品的四种技术复制（每种类型的每个类型中的每个基因的反应的四种技术复制）量化丰富。使用上标III从1μg总RNA合成第一链cDNA^®逆转录酶（Invitrogen）。在含有10μl iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA）的20μl qRT反应中扩增稀释的cDNA，并在Opticon2上扩增每个引物250 nM^®系统(Bio-Rad)。以氰化酶基因为组成内标[74]．qRT中所调查基因的引物序列和产物大小列于附加文件中11.．扩增方案为95°C 5分钟，然后95°C 10秒，60°C 30秒，读板40个循环。从55°C到95°C，每0.5°C进行一次熔化曲线分析，每一步保持10秒，以检查单个放大器的生产情况。采用PCR Miner version 2检测循环阈值(Ct)和扩增效率[75]．

Am1：

Ameiotic1

L2-d：

从L2层衍生

L /ž：

细线期、偶线期

私营军事公司：

花粉母细胞

QRT.：

定量RT-PCR。

我们要感谢达伦·莫罗对微阵列实验的技术建议。这项研究得到了美国国家科学基金会(07-01880)的支持。

从属关系

1. 美国斯坦福大学生物学系，加州斯坦福94305

   郭岭南、约翰·费尔南德斯和弗吉尼亚·沃尔伯特

2. 美国加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系，加州94720

   Arnaud Roncheret、Rachel C Wang和W Zacheus Cande

3. 植物研究所和微生物生物学（IPMB），中学，台北，台北11529

   瑞秋C王

相应的作者

通信Guo-Ling南．

竞争利益

两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。

作者的贡献

GN设计并进行微阵列实验，进行qRT验证，分析数据，并撰写手稿初稿。AR注释数据并撰写手稿部分。RCW协助设计并进行细胞学分期，并进行西方分析。JFF进行统计分析。WZC和VW构思了该研究，参与了其设计和协调，并帮助编辑了手稿。所有作者都阅读、编辑并批准了最终手稿。

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