的作用TRIPTYCHON在毛状图案中拟南芥

背景

毛状图案拟南芥由三种类型的激活剂，R2R3MYB, bHLH和WD40蛋白，以及六种R3MYB抑制剂控制。在抑制剂中TRIPTYCHON（试一试)似乎有特殊的功能。其相应的突变体产生毛状体簇，而所有其他抑制剂都参与毛状体密度调节。

结果

为了更好地理解的作用试一试在毛状体模式中，我们分析了其转录调控。启动子分析确定了毛状体模式的相关调控区域。这个重要的区域包含一个双负反馈回路所需的片段，这样它就可以调节抑制试一试/中国共产党auto-repression。通过转化…的单细胞pTRY:GUS行p35区域：GL1、p35区域：GL3和p35区域：TTG1在场或不在场p35区域：试一试或p35区域：中国共产党我们证明了TRY和CPC可以抑制试一试没有激活因子转录下调的表达。我们进一步通过R3MYB抑制剂TRY和CPC的启动子/CDS交换实验表明，TRY蛋白在簇形成和毛状体密度方面具有特定的特性。

结论

我们对一个试一试启动子片段介导双负反馈回路揭示了毛状体形成机制的调控网络的新见解。此外，我们发现TRY的自抑制可以在激活因子转录下调的情况下发生，这表明差异复合物形成模式具有生物学意义。最后，我们证明了TRY在抑制剂中的独特作用是TRY蛋白的特性。

毛状图案拟南芥已经成为一个被充分研究的模型系统，以了解植物中二维模式形成背景下的细胞-细胞通讯[1- - - - - -3.]。毛状体形成于幼叶的基部[4]。毛状体的位置与任何可识别的叶片结构无关，克隆分析排除了细胞谱系机制[5，6]。由于这些原因，人们普遍认为，模式是由最初等效细胞之间的细胞相互作用介导的[2，3.，7]。

基因筛选已经确定了控制这一过程的两类突变体。所有模式基因，除了TTG1有以部分冗余方式起作用的相近的同系物[8- - - - - -16]。以下总结将仅考虑最相关的参与者，根据突变表型的强度进行判断。一个突变类显示较少或没有毛状体。因此，相应的基因被认为是毛状体形成的积极调节因子。三个最重要的阳性调节因子是WD40蛋白TRANSPARENT TESTA GLABRA1 (TTG1) [17- - - - - -19]， R2R3 MYB相关转录因子GLABRA1 (GL1) [20.]，基本螺旋-环-螺旋(bHLH)样转录因子GLABRA3 (GL3) [4，21，22]。

在第二类中，毛状体集群或较高的毛状体密度表明具有抑制作用。两种最重要的抑制剂是R3单重复MYB因子tritychon (TRY)和CAPRICE (CPC) [12，23]。然而，两个对应的基因在叶片中表现出高度的序列相似性和难以区分的表达模式[12]，它们的突变表型表明了不同的作用模式。而中国共产党突变体的毛密度更高试一试突变体显示毛状体簇和毛状体数量减少[4，12]。

大多数模式基因的表达模式是非常相似的。最初，所有基因在形成毛状体首字母的叶基细胞中普遍表达(模式区)。随后毛状体的表达增加，在表皮细胞中消失[10- - - - - -14，16，24- - - - - -26]。泛在表达对应于模式前的情况，在这种情况下，所有细胞都是等效的。在这一阶段，正调节因子和负调节因子被认为参与调节反馈回路，该回路具有几个重要特征，包括激活因子对抑制剂的激活，抑制剂对激活因子的抑制以及抑制剂在细胞间移动的能力[14，15，27，28]。这就产生了细胞之间的差异，最终形成了毛状细胞和非毛状细胞的模式[2，3.]。

在初始模式建立后，叶片生长导致毛状体间距增加而没有形成新的毛状体。由于在这一阶段，基因表达在表皮铺装细胞中停止，而在毛状体中增加，毛状体起始能力的丧失很可能是由于缺乏激活基因表达。叶片后期的激活因子基因表达是否在叶片成熟过程中被普遍关闭，还是由于TRY和/或其他抑制剂的侧向抑制，目前尚不清楚。

所提出的激活剂和抑制剂之间的调节反馈回路最终导致抑制剂的自动抑制。原则上，这可以通过两种方式实现。由于R3单重复MYB抑制剂缺乏转录激活区，它们可以与激活子的启动子元件结合，从而阻止激活子的转录。由于抑制因子被激活因子激活，激活因子活性的降低导致抑制剂转录减少。或者，抑制剂可以在翻译后使活化复合物失活[29]。酵母两种杂交实验表明，GL1和TTG1结合GL3蛋白的不同区域，表明它们形成了三聚体转录激活复合物[22]。TRY或CPC与GL3结合可取代GL1，从而使复合物失活[14，29]。虽然这两种机制都导致抑制剂的抑制，但它们的调节方案不同。通过将TRY和/或CPC结合到启动子上，激活子的转录抑制将产生一个涉及激活子转录下调的调节反馈回路。由于抑制剂可以直接抑制自身的激活，假设的由微分复合物形成的抑制将建立一条调节反馈回路的捷径。

在这篇论文中，我们分析了试一试在毛状体形成过程中。首先，我们确定了试一试与试一试功能和特定的基础和毛状体特异性表达模式。此外，我们还确定了特定表达模式增强所必需的单独区域，并表明这些区域是拯救所必需的。其次，我们发现TRY或CPC可以抑制试一试通过转化单个表皮细胞直接表达而不受激活因子的转录调节pTRY:GUS线与三个活化剂和TRY或CPC。最后，我们进行了启动子交换实验中国共产党和试一试并测试了营救的能力试一试突变的毛状体表型。这些实验揭示了TRY蛋白在聚类和毛状体密度调节中的特殊特性。

先前的研究表明，4.2 kb的基因组区域包含1.8 kb的5'区和1.3 kb的3'区，就足以挽救这一物种试一试突变表型[12]。在第一步，我们测试了3'区或内含子是否与试一试变换函数试一试突变植株具有1.8 KB的5'区，与试一试cd(图1，pTRY- a, B, c尝试try-JC）.这些植物显示出完全恢复的群集表型，这表明1.8 kb 5'区域包含正确生长所需的所有调控序列试一试表达于叶表皮。

的表达分析试一试启动子片段

为了鉴定特定的调控元件，我们生成了5'启动子片段，并通过与dna的融合来监测它们的调控功能p35区域-最小启动子和GUS标记基因(图21和2）.由于给定结构的表达在不同的T2线之间是可变的，因此我们只给出表达最强的线的图片(图1)2)，并提供GUS染色24小时后基础表达和毛状体特异性表达以及仅毛状体特异性表达的品系的百分比(图2)1 b）.假设驱动弱表达的启动子元件产生较少的具有强表达的转基因系，这个百分比被视为所考虑的启动子片段表达强度的近似值。

对于表达分析，我们最初使用了一个片段，该片段位于一个独特的假定TATA Box的上游，位于可能的转录起点上游32个碱基对，由RACE PCR确定[12)(图1，pTRY一)。该片段揭示了GUS在毛状体中表达，但在之前的研究中发现，GUS普遍表达在幼叶区域(基部表达)。12]缺席(图2 c, D）.因此，我们将紧接在a片段之后的片段包括在内，并将其延伸到相对于ATG起始密码子的-4位置(pTRY- b)。pTRY-B代表Schellmann等人鉴定的5' UTR，包括est建议的三个可能的转录起始侧(EH866228.1, AV533156.1, AI999616.1)和两个假定的TATA盒(TATA, TATAAA) [12，30.- - - - - -32]。一个启动子片段，pTRYa, B，组合pTRY——和pTRY-B在22.7%的品系中也表现出毛体特异性表达，另有61.9%的品系(n = 35)表现出毛体基础表达和毛体表达。的pTRY-B片段单独无表达。这表明pTRY-B片段对于增强或稳定基因驱动的表达至关重要pTRY——一个片段。

进一步的缺失序列显示一个最小的启动子区域约620 bp (pTRY-A3, B)pTRY-片段pTRY-B区域在上下文中也是必要的pTRY-A3片段介导基础表达(图2)2 e, F）.进一步的5'缺失约200bp (pTRY-A4, B)显示毛体特异性表达，但只有微弱的基础表达。这些品系的毛状体特异性表达仅在分支形成后毛状体发育的晚期发现(图2)2 g H）.200 bp片段pTRY-A5、B在毛状体中无基础表达，有时也有微弱的不规则表达(图2)2 i, J）.

这些数据不允许决定是否pTRY-B片段增强了基础和毛状体特异性表达，或者是否特异性调节了基础表达。因此，我们比较了pTRYa3 B和pTRYGUS染色过程中不同时间点的-A3(数据未显示)。我们观察到，在两个小时后，两种品系的幼体毛中都可以检测到GUS染色。而基底表达在pTRY-A3, B在2小时后也可以检测到，在pTRYGUS染色4天后仍呈-A3。这些数据表明，pTRY-B片段特异性上调基底试一试的上下文中的表达式pTRYa3片段。

通过拯救实验鉴定相关启动子区域

为了测试它们的功能，我们使用不同的启动子片段来表达试一试cd在try-JC突变株(图)1 a, C）.为了避免单个转化体可能表现出广泛的表型，我们没有在T2中选择单个系进行分析，而是直接分析T1植株的表型，以考虑完整的表型谱。在这两个实验中pTRYa, B和pTRY-A3, B片段完全挽救了聚类表型(图2)1 c）.的表达试一试由pTRY-A3无明显的救援能力(图2)1 c）.较小的碎片(pTRY-A4, B)部分获救try-JC集群表型。综合这些数据表明pTRY-B碎片对抢救至关重要。

规管试一试TTG1, GL3, GL1和TRY或CPC启动子

在下一步中，我们的目标是证明TTG1, GL3, GL1, TRY和CPC对于最小值的激活/抑制方案试一试启动子片段。目前的模型假设TTG1、GL3和GL1可以转录激活这些抑制剂试一试或中国共产党这些反过来又抑制了激活因子从而也抑制了它们自身的表达。TRY和CPC可以与GL1竞争GL3结合的发现[14，29表明抑制剂可以直接在蛋白质水平上抵消激活剂的活性。在这种情况下，TRY或CPC抑制自己的表达，而不抑制激活子的转录。

作为试一试在基因实验中已被证明受激活因子的调节[27]试一试promoter提供了一个工具来证明TRY/CPC可以在不抑制激活子转录的情况下抵消激活子。我们使用子叶作为我们的分析，因为在这个器官中没有检测到GUS的表达pTRY-A3, B:GUS植物(图3 c）.GL1、GL3和TTG1在CDS的控制下p35区域启动子用于瞬态变换。除了这三个结构外，我们还增加了一个p35区域：绿色荧光蛋白：YFP构造控制轰炸效率。在4个独立的实验中，每次分析100个细胞，我们发现平均68.2±18.0%的GUS细胞同时表达TTG1, GL3和GL1归纳出最小值试一试启动子片段(图3.）.转换时35个年代：绿色荧光蛋白：YFP单独检测未发现GUS阳性细胞。

在第二步中，我们测试了该模型是否TRY或CPC可以抵消活化剂的活性。在酵母的三个杂交实验中，TRY和CPC与GL1竞争GL3结合的模型表明，不同的复合物形成使得所提出的激活物复合物失活[14，29]。我们利用了这样一个事实，在这个实验装置中，任何的间接抑制试一试通过TRY或CPC的转录抑制激活子被排除在外，因为它们的表达是在基因的控制下35个年代启动子。在4个独立的100个细胞的实验中，我们发现表达时gus阳性细胞仅为0.2±0.5%或0.2±0.4%p35区域：试一试或p35区域：中国共产党分别加入三种活化剂。这表明TRY和CPC可以抵消试一试由三种激活因子激活而没有激活因子的转录抑制。

MYB和MYC结合位点的相关性

我们发现激活剂可以激活试一试同时发现GL3和GL1能与GL3和GL1结合试一试ChIP实验启动子[33，34]提示我们寻找推测的MYB和MYC (bHLH因子)结合位点。我们发现了5个推测的MYB和2个推测的MYC位点pTRY-A3, B片段，这是最小的启动子片段，完全挽救试一试表型(表1）.在五个推测的MYB位点中，有两个似乎最有希望，因为它们是在其他植物中也受ttg1依赖途径调节的调控途径的背景下确定的[35]。此外，与这些MYB结合位点结合的MYB因子与GL1在系统发育树上处于同一进化枝[36]。因此，我们将重点放在这两个假定的结合位点上。为了确定两个选定的MYB和两个MYC位点在调节正确表达模式中的作用，我们分别对每个位点进行突变，同时对MYB和两个MYC位点进行突变(图2)4摄氏度）.没有一个突变的结构显示出明显的减少，甚至没有pTRY -A3、B:GUS表达(图24 b）.然而，我们注意到MYB1位点对基础表达有最积极的影响，而MYB2和MYC位点具有抑制作用。作为一个pTRY -A3, B:在两个MYC位点包含突变的TRY构建体可以完全挽救MYC试一试突变集群表型这些位点似乎与这种情况无关(附加文件1）

的pTRY-B区介导抑制因子的抑制

在另一组实验中，我们测试了pTRY:GUS表达式中没有pTRY-B片段或在pTRY-A4, B系是由内源性R3MYB抑制因子活性引起的。我们比较了的表达式pTRYa3, B,pTRYa3和pTRY-A4, B在野生型和中国共产党试试突变体背景(图5）.所有构建体都显示了强烈的基毛特异性GUS表达。因此缺乏基础表达pTRY-A3系缺乏基部和大部分毛状体的特异性表达pTRY-A4、B线被救在中国共产党试试突变体。这些数据表明-424到-176段(pTRY-A4)促进基础表达pTRY-B片段和-623到-424 (pTRY-A5片段介导抑制剂的抑制。

为了表明这种抑制剂的抑制涉及到模式激活剂，我们使用了瞬时表达试验。的p35区域：GL1、p35区域：GL3和p35区域：TTG1在野生型和中国共产党试试携带pTRYa3, B,pTRYa3和pTRY-A4, B构造(表12）.在野生型中，我们发现gus阳性细胞只存在于携带基因的植物中pTRY-A3, B结构(n = 100)。相比之下，所有构建体均显示gus阳性细胞中国共产党试试突变背景表明这一调控事件涉及毛状体图案激活因子。此外，每转化的表皮细胞中gus阳性细胞的百分比在pTRY-A3, B转化子叶在中国共产党试试双突变表明更强的激活。

TRY蛋白调控簇形成和毛状体密度的特性

事实上，在6个R3单重复MYB抑制剂基因中，只有在试一试导致聚类表型提出的问题，是否转录调控试一试或者说它的蛋白质特性构成了这种差异。因此，我们比较了启动子的互换和CDS的互换试一试和中国共产党他们有能力拯救试一试突变体。中国共产党之所以选择它，是因为它代表了毛状体密度调节的主要抑制剂，而且它具有相似的表达模式，包括早期的普遍表达和后来的毛状体特异性表达。这里我们选择了525bp的5'上游区域中国共产党基因，这表明了预期中国共产党叶和根中的表达式(附加文件)2)，并成功营救了中国共产党突变的毛状体表型时融合到中国共产党光盘(附加文件)3.）.这两种组合都包含cd试,pTRY：cTRY和pCPC：cTRY，完全挽救了聚类表型(图2)6）.相比之下，两者的结合试一试的启动子中国共产党没有明显的救援(图2)6）.这说明了具体的作用试一试防止簇的形成不是基于其转录调控，而是基于特定的蛋白质特性。

我们还测定了这些获救鱼类的毛状体数量。在这方面试一试突变体与所有其他抑制剂突变体相反，其毛状体比野生型少[12]。的表达试一试在…的控制之下试一试启动子能显著拯救毛状体数量。相比之下，pTRY：中央构造显示营救弱但不显著。在使用中国共产党推动者我们找不到救援pCPC：中央构建和过度表达表型导致毛状体较少或甚至没有pCPC: cTRY植物。综上所述，我们在以下背景下认识到了TRY的蛋白质特异性试一试依赖性毛状体密度调节。研究发现试一试CDS由中国共产党发起人救不了试一试在这种情况下，密度缺陷表明两个启动子之间存在其他相关差异。

在本研究中，我们分析了试一试了解更多关于的独特作用试一试在R3MYBs同源物中，毛状体模式的差异是由聚类表型判断的试一试突变体。

政府的角色pTRY-B片段:一般的基础表达增强/抑制或调节者

我们的启动子分析揭示了一个重要的作用pTRY-B片段，因为它对于幼叶基部表达和挽救聚类表型是绝对必要的试一试突变体。它似乎调节了时空表达模式。一些研究结果表明，pTRY的基础表达特别需要-B试一试．首先，我们没有发现任何基础表达的缺失pTRY野生型背景中的-B片段。第二，在毛状体中表达同样强烈(根据GUS染色时间过程实验判断)pTRY-B片段和基础表达与毛状体特异性表达同时出现pTRY-B碎片，但4天后未见。

的绝对要求pTRY-B代表营救试一试聚类表型立即表明试一试与图案相关。这一发现将是对当前理论模型的重要支持[2]。由于模式是在初始等效细胞的领域中产生的，因此模式系统需要从激活剂和抑制剂的初始普遍表达开始，这是建立模式所必需的。因此，根据此场景的要求pTRY-B片段因此也有基础表达支持这种类型的模型。

基底是怎样的?试一试受pTRY- b片段?关于这个问题的答案来自于我们的分析pTRY-A3, B:GUS和pTRY-A3:GUS构造试着中国共产党突变体。研究发现pTRY-A3片段可被GL1、GL3和TTG1激活试着中国共产党双突变体，但不存在于野生型，同时存在基础表达pTRYa3试着中国共产党植物表明pTRY-B片段介导试一试受到TRY或中共的镇压。因此，明显的要求pTRY-B片段的基础表达实际上是一个双负调控事件。目前的数据表明，-424至-176片段对开启基础表达很重要，而TRY/CPC抑制了这种激活，上游的-623至-424和下游的-176至-4区域抵消了这种抑制。由于MYB2位点的缺失导致基础表达增加，因此该位点可能参与了该调节回路。同样，两个MYC位点缺失后较高的基础表达可以解释为双负抑制环中这些位点的功能。

自我压抑的试一试没有激活因子的转录调节

解释毛状体形成的模型拟南芥是由Meinhardt和Gierer [37]。这个理论模型用两个组成部分来解释模式的形成:活化剂激活它自己的抑制剂和它自己的表达，抑制剂能够比活化剂移动得更快。

当将这一理论模型应用于生物学背景时，有两种可能性。首先，抑制剂通过下调激活物间接下调自身表达。第二，抑制剂通过竞争性复合物的形成抑制自身的表达[27，29，38]。虽然我们不能排除第一种可能性，但我们的数据表明，第二种情况就足够了。我们证明了最小值试一试GL1、GL3和TTG1在子叶细胞中的联合表达可使启动子异位激活。由于这三种活化剂都是在控制下表达的35个年代启动子、任何涉及这三个基因的转录反馈回路都不太可能与本实验相关。TRY或CPC对三种活化剂活性的抑制提供了TRY和CPC抑制的证据试一试直接表达，而不是通过涉及激活基因的转录反馈回路。

TRY蛋白在图案化方面的特性

进一步了解分子性质的独特性试一试在6个r3 -单重复MYB抑制剂中，我们使用了启动子交换实验中国共产党哪些方面共享试一试启动子的表达模式:GUS分析。这使我们能够研究这两个基因的转录调控和蛋白质功能的相关性试一试突变簇的形成和密度表型。我们发现在这些拯救实验中，TRY和CPC蛋白的行为不同，只有TRY蛋白可以拯救试一试突变体聚类和密度表型下表达试一试启动子。类似的情况在中国共产党突变体抢救实验中，TRY蛋白的表达在控制下中国共产党与CPC蛋白相比，启动子导致了更强的过表达表型[39]。的贡献试一试特定的启动子性质仅在毛状体密度调节的背景下被发现。这与……的行为形成对比ETC3的另一个同系物试一试和中国共产党．的etc3突变体可以通过同样的方式通过调控被ETC3拯救ETC3,共产党和试一试启动子，因此启动子在毛状体密度表型上是可互换的etc3变异，但不是相对于试一试突变体(14]。因此，依赖于TRY的毛状体密度调控既依赖于特定的蛋白质特性，也依赖于转录调控的特定方面。

我们观察到的TRY和CPC蛋白功能的差异，原则上可能是由于蛋白质的稳定性、蛋白质的运动以及它们与其他蛋白质的相互作用，特别是bHLH因子的相互作用。这两种蛋白均与bHLH因子相互作用[10，11，13，14，16，40]。然而，它们的相互作用似乎有所不同，CPC与GL3的结合更强[41]并且比TRY更有效地抑制GL1与GL3的结合[14]。它们与GL3结合的不同强度也可能改变TRY和CPC的细胞间运动[14]。这两种蛋白都在细胞间移动，并共享一个79 bp的n端区域，其中W76和M78被证明是CPC移动所必需的，并且在TRY蛋白中保存[27，28，38]。然而，TRY蛋白缺乏前9aa，这也是CPC运动所必需的[28因此，原则上可能会导致不同的运动行为。TRY蛋白与CPC、ETC1、ETC2、ETC3、TCL1最明显的区别在于其c端未知功能的延伸[41]。虽然我们开始了解R3单个MYB因子在毛状体发育中的功能多样化，但仍然难以捉摸的是，哪些特性导致了它们对聚类和密度控制的需求差异。

在这项工作中，我们表明，TRY的自抑制作用不需要激活子的转录下调，这表明差异复合物的形成与生物学相关。我们进一步表明，TRY在抑制剂中的独特作用是TRY蛋白的特性。最后我们对试一试启动子导致鉴定出一个620bp的片段，足以挽救试一试突变表型。它包含一个片段，调解其自身的抑制表明一个复杂的调控方案的抑制。很可能，我们在这里看到的只是冰山一角，转录调控试一试在器官特异性水平上是否有额外的复杂性涉及额外的调控基因，如已被充分研究的基因Squamosa启动子结合蛋白样（SPL基因[42]。

植物品系和生长条件

植株在24°C的土壤中生长，光照周期为16 h /黑暗周期为8 h。植物转化采用花浸渍法[43]。转基因pTRY- 3、b: 1呃和cpc-1尝试- 82双突变体[12这个品系是由遗传杂交产生的。进行了互补实验try-JC和cpc-1突变体(23，44]和Col-0和WS-0分别作为控件。对于子叶的瞬时转化pTRYa3, B:格斯,pTRYa3:格斯和pTRY-A4, B: L中的GUS线呃或在cpc-1尝试- 82采用双突变本底。在这些实验中，表面灭菌的种子在含有1%蔗糖和20 μg/ml Basta的MS板上生长7天，22°C, 16 h光照/8 h黑暗循环。

构造

建设试一试和中国共产党启动子片段

ler pTRY-B在pGEM-T-easy中克隆为一个HindIII片段。其余启动子片段均通过BP反应(Invitrogen)在pDONR201中克隆。启动子突变是通过基于PCR的位点定向诱变引入的(详情可索取)。pENTR1A-w/o-ccdB是通过删除EcoRI片段以取出pENTR1A的attB序列内的Gateway重组盒而创建的。所有片段均经测序验证。(详细的引物信息见附加文件4）.

CaMV 35 s最小启动子GUS和CDS结构

基本的网关目标载体PARB (pANGUS-Gateway recombbinationscasettea - basta - resistance)是通过几个步骤创建的。的CaMV 35 s最小启动子(-46 ~ +7)与pBT-GUS基因融合[45]作为BamHI和XmaI片段克隆到pPAM (GenBank AY027531)中。将Gateway重组磁带A (Invitrogen)克隆为pANGUS (pANGUS- reca)的BcuI和SalI片段。卡那霉素抗性被来自pGREEN-Bar的无启动子和无终止子的bar基因作为RsrII和SpeI片段取代。的pTRY-B片段被直接克隆到PARB的HindIII位点35个年代产生PARB-B的最小启动子PARB -试一试cd, PARB-B -试一试cd, PARB -中国共产党-CDS是PARB和PARB- b的衍生物，其中GUS基因被试一试或中国共产党cd(左呃）.

启动子- gus -和启动子- cds构建体采用LR重组(Invitrogen)pCPC-pDONR201, pENTR1A-w/o-ccdB和缺失和替代系列的不同入口克隆pTRY以及来自PARB的不同目的地向量。

瞬态共转化实验的效应体结构拟南芥表皮子叶细胞

CDS来自L呃在pDONR201中BP重组或在pENTR1A中克隆。效应者构造(p35区域：GL1、p35区域：GL3, p35区域：TTG1, p35区域：试,p35区域：中国共产党)和控制p35区域：绿色荧光蛋白：YFP分别由各自的入口克隆与pAMPAT-GW进行LR重组而成。

组织化学分析和显微镜

GUS活性的测定方法如先前所述[46]。光学显微镜我们使用徕卡DMRE显微镜。使用key - f70 3-CCD JVC相机和DISKUS软件(DISKUS, Technisches b ro)拍摄图像。所有试验均采用35个独立的T2系进行统计分析。

毛状体起始位点和聚类频率的评价

在50株T1植株的前4个完全展开的叶片和30株Col-0、WS-0、WS-0、WS-0、WS-0、WS-0、ms - 1叶片上统计了毛状体起始位点和毛状体簇数。try-JC和cpc-1植物。补种植物与Col或or间差异的意义try-JC经学生t检验(双尾分布，两样本方差相等，P < 0.01)。启动子CDS交换实验中的毛状体密度和簇频率数据用盒状须图表示。使用Excel (Microsoft Office Standard 2007)的四分位数函数返回数据集的五个四分位数(最小值、第一四分位数(第25百分位数)、中位数、第三四分位数(第75百分位数)和最大值)。图本身是用一个免费的boxplot模板(http://www.austromath.at/medienvielfalt/materialien/beschreibendeStatistik/content）.

Microprojectile轰炸

瞬态试一试用粒子轰击法进行了表达分析拟南芥子叶(47]。每组实验独立完成至少4次。轰击后植物生长24小时，通过共轰击的存在来确定转化细胞的数量p35区域：绿色荧光蛋白：YFP．经过一夜GUS染色和组织清理后，测定GUS染色细胞的数量，计算GUS阳性细胞相对于转化细胞的百分比。

在网上分析试一试启动子

为了确定植物顺式调控DNA元件(Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements, PLACE)的转录因子结合位点，http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和TRANSFAC (TFSEARCH:搜索转录因子结合位点(版本1.3))，http://mbs.cbrc.jp/papia/)数据库。

试一试:

Triptychon

中国共产党:

任性

绿色荧光蛋白:

绿色荧光蛋白

GL1:

Glabra1

GL3:

Glabra3

TTG1:

透明testa glabra1

YFP:

黄色荧光蛋白

格斯:

Glucoronidase

ETC3:

三联体和摩羯座的增强剂

TCL1:

Trichomless1

SPL:

Squamosa启动子结合蛋白样(SPL)

我们感谢Birgit Kernebeck出色的技术援助。提供以下载体:pampatt - gw by B. Ülker(科隆MPIZ)， pANGUS by M. Jakoby(科隆MPIZ)， pbluesscript - gw - reka by S. Biere(科隆MPIZ)，试一试-CDS-pGEM-T和中国共产党- S. Bhylahalli的cd - pbluescript，试,GL3和TTG1U. Herrmann的入口克隆和Arp Schnittger的pENTR1A-w/o-ccdB。我们要感谢斯文·谢尔曼博士对手稿的批判性阅读和有益的建议。这项工作得到了DFG优先项目SFB572的支持。

从属关系

1. 科隆大学植物研究所生物中心，z lpicher Straße 47b，德国科隆50674

   玛蒂娜·佩什和马丁·赫斯坎普

相应的作者

对应到马丁Hulskamp．

作者的贡献

MP进行了所有的分子和基因研究。MH参与了工作的设计和协调，并撰写了稿件。所有作者都阅读并批准了最终稿件。

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