映射QTL用于油脂中的油素基因的油性状和EQTLS

背景

生物燃料作物麻疯树种子油中的主要脂肪酸是棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)。高油酸和总含油量是麻疯树育种的理想条件。到目前为止，人们对麻疯树这些油特性的遗传基础知之甚少。本研究采用数量性状位点(QTL)和表达QTL分析方法，对麻风树籽油性状相关的遗传因子进行了鉴定。

结果

复合间隔映射确定了18个QTL底层油性状。一个非常重要的QTLqC18:1-1在联动组（LG）1的一端检测到奇数（LOD）18.4的对数，并解释的方差百分比（PVE）36.0％。有趣的是，QTLqC18:1-1重叠的QC18：2-1，控制油酸和亚油酸的组成。在控制总含油量的显著QTL中，qOilC-4在LG4上，LOD为5.0,PVE为11.1%，显著性较高。同时，油体中油质是影响油质性状的主要成分;因此，我们开发了三个油苷基因的SNP标记OleI那Oleii.和Oleiii.，它被映射到联动地图上。OleI和Oleiii.映射到LG5，闭合QTL控制油酸和硬脂酸。我们进一步确定了表达式OleI那Oleii.和Oleiii.在QTL定位群体成熟种子中，分别检测到3个基因在LGs 5、6和8上的表达QTL (eqtl)。的eQTLOleiii.那qOleIII-5与控制硬脂酸和油酸的qtl重叠，表明该基因在LG5上存在顺式或反式元素Oleiii.影响脂肪酸组合物。

结论

我们鉴定了18个QTL底层，油性特征和oleosin酸基因的3个EQTL。QTL和EQTL，尤其是qC18:1-1那qOilC-4和qOleIII-5与贡献率(R²)大于10%，分别控制油酸、总含油量和油酸苷基因表达，为启动分子育种，改善麻疯树种子油脂性状提供了必要的数据。麻疯树是生产生物柴油的关键作物。

麻风树图正成为世界上生产生物柴油的主要作物之一[1］．含有大量不饱和脂肪酸的油可以发现申请作为生物柴油饲料原料。为了生产恶化的利润和可持续，要求油产量和质量的遗传提高。但是，在实验室收获并分析种子之前，不能评估油性状，并且没有进行详细的选择性育种。同时由于种子产量，种子油性状，生物或非生物胁迫抗性等经济性重要性状的缺乏分子基础，Joatropha中的分子育种尚未开始。

大多数经济上重要的性状是定量的并且由许多基因和基因复合物确定，其中被描述为定量性状基因座（QTL）。传统的定量性状遗传改善方法主要依赖于表型和血统信息[2]，这很容易受环境因素的影响。为了进行标记辅助选择（MAS）用于提高油脂的油产量和质量，通过鉴定含有最喜欢的基因座的基因组区域，需要了解种子油性状的分子碱基，即QTL分析。已经进行了QTL分析以检测重要的农艺或生理性状的遗传基础，为特质改进提供有价值的信息。遗传标记使得可以检测与特征显着相关的QTL，并使选择更有效[3.］．标记辅助选择是一种利用表型、基因型和系谱数据的选择方法[4.］．此外，由于种子油质性状无法在早期或田间测定，因此MAS改良油质性状比传统育种具有更大的优势。利用DNA标记进行麻疯树的选择可以大大减少麻疯树的育种规模。通过使用MAS，可以在苗圃阶段就决定哪些个体应该保留作为种畜，哪些应该去除。

为了进行QTL分析，需要选择最合适的交叉，以产生DNA和表型水平的足够的遗传变异。QTL总油含量分析已经在许多作物中进行，包括油菜[5.,大豆6.]，玉米[7.),和向日葵8.］．最近的调查显示了拟南芥种子油的含量和脂肪酸组成的巨大变化，表明来自选定的十字架的群体将有助于研究这些特征[9.］．

基因表达的多样性是个体中表型多样性的机制之一，并被视为量化特征的一种[10.］．候选基因表达的决定因素的分析不仅有助于了解表型变异的机制，而且还提供了通过基因表达的调节来改善表型的方法[10.］．随着基因表达分析的进展，已经提出了一种命名为“基因基因组学”的方法以确定基因表达的决定因素[11.］．该方法将MRNA表达水平视为分离群体中的定量性状，并映射在体内控制表达水平的表达QTL（EQTL）。对于在隔离群体中分析的几乎任何基因，EQTL分析可以识别影响其表达水平的基因组区域。EQTL将其作为转录物的基因映射到与转录物的基因相同，通常表示基因（CIS-EQT1）中的顺式作用调节多态性存在。EQTL将远离基因的位置进行测定的映射最有可能识别可以控制在基因组中其他地方的许多基因表达的反作率调节剂（Trans-EQT1）的位置。已经采用了遗传基因组学方法来鉴定EQTL调节基因表达[10.那12.］．

最近，我们建立了使用506微卫星和SNP标记的Joatropha的第一代遗传联系地图，覆盖11个连杆组[13.，为影响种子油等经济重要性状的qtl和等qtl的全基因组扫描提供了必要的工具。麻疯树籽油中脂肪酸以亚油酸(18:2)、油酸(18:1)、棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)为主。油酸和亚油酸是麻疯树油的主要成分[14.］．麻疯树籽油性状改良的育种目标是提高麻疯树籽油总含油量和油酸含量，降低棕榈酸含量[15.］．本文通过对一个286个回交群体的QTL定位，描述了这些种子脂肪酸组成和含量性状的遗传基础。另一方面，种子油储存在称为油体的亚细胞细胞器中。麻疯树油体的蛋白质组组成显示，油酸是影响油质性状的主要成分[16.］．三个麻疯树油酸基因，即OleI那Oleii.和Oleiii.，被隔离[17.］．在这里，我们在QTL映射群中开发了三种oleosin基因的SNP，随后将其映射到连杆地图上。我们确定了QTL映射群中三种基因的表达变化，对油蛋白基因表达进行了EQTL分析，并提供了对油脂基因可能调节的新信息，以改善麻风罗的油性状。

特质分析

在QTL测绘群体中测量脂肪酸组成，JoTropha种子的总油含量和油蛋白基因的基因表达水平。特征的频率分布显示了连续分布（数据未示出），揭示了这些性状的复杂基础基础。正如所列三分之一的十字形所列，后代表型值的分布显示了所有特征的双向侵袭分离（表1）.C18:1在j . curcas比J. Integerrima.，总含油量J. Integerrima.51.04%，比in高很多吗j . curcas．数据表明J. Integerrima.种质可以应用于杂种繁殖以改善农艺性状，例如总油含量。

对这些性状进行相关分析(表)2）.C18:2与C18:1、C16:0呈显著负相关。特别是C18:1与C18:2的相关系数较高，为-0.962，说明影响这两种组合的遗传因素可能有共同之处。的表达水平OleI那Oleii.和Oleiii.彼此展示了高度正相关的。OleI表达水平与C16：0显着相关。油蛋白基因的表达水平与总油含量的相关系数低但显着。脂肪酸组成的显着但低的相关系数值暗示脂肪酸组成的基础和总油含量复杂，并且oleosin基因可能涉及影响这些油性状的多种遗传因素。

QTL和eQTL作图

全长663.0 cM的连锁图谱聚合为11个连锁群，由95个DNA标记组成。标记间的平均距离为7.0 cM。大多数连锁基团与前面描述的一致[13.］．

对脂肪酸组成，总油含量和表达水平进行QTL分析OleI那Oleii.和Oleiii.（表3.;figure1）.我们检测到18个QTLS和3个EQTL，适用于检查的所有特征。以解释的变化百分比检测单个EQTL或QTL（PVE或R.²) 2.3% ~ 36.0%， PVE超过10%者5例。我们鉴定了具有正效应和负效应的qtl或eqtl，正效应表明来自PZM16的等位基因赋予的性状值较高，反之亦然(图2)2）.

脂肪酸组成和总含油量的qtl

在除LGS 3和11之外的所有连杆组中鉴定了18个QTL。确定了高显着效果的QTL位于LG1上，解释了C18：1组合物的36％的36％，并发现与C18：2相关联组成（图2）.有趣的是，LG10上的另一个QTL解释了5.9%的C18:1组成变异也与C18:2组成相关。来自PZM16的等位基因具有较高的C18:1，来自CI7041的等位基因具有较高的C18:2。

总含油量检测到4个qtl。在LGs 1、2和4上的3个qtl上，杂种CI7041的等位基因对总含油量贡献较大。结果表明，在LG4上表现出最有效的QTL，解释了11.1%的变异，其中CI7041等位基因的总含油量较高。

最喜欢的等位基因的影响

LGs 1和LGs 4分别检测到较强的C18:1和总含油量qtl。计算微卫星标记替代等位基因的后代各性状的平均表型值J. Integerrima.（AA）或j . curcas(AA)。利用qtl标记的两个等位基因组合AA和AA对子代进行双向方差分析，研究表型性状与qtl基因型之间的关系。每个qtl等位组合的表型值列于图中3.．不同等位基因组合间的表型均值存在显著差异，揭示了遗传自亲本的等位基因的影响。

在标记Jcuint057的AA基因型的后代qC18:1-1，表现出高于AA（30.9％）的C18：1含量（43.0％）。相比之下，在标记JATR872的AA基因型的后代qOilC-4，总含油量(38.0%)高于AA(33.7%)(图3)3.）.这些结果表明，两个QTL的效果在这两个关键的油性状和最喜欢的等位基因差别j . curcas和J. Integerrima.．

oleosin基因的qtl

开发了SNP标记OleI那Oleii.和Oleiii.基因(表4.），分别映射到LGS 5,3和5（图2）.

OleI和Oleiii.映射到QTL的LG5qC18:0-5那qC18:1-5和Qoleiii.底层C18：0，C18：1和Oleiii.表达式集群。负的加性效应值qOleIII-5表示j . curcas等位基因呈阳性Oleiii.其中LOD评分为3.1分。这eQTLOleiii.附近被本地化Oleiii.基因并与控制C18：0和C18：1的QTL重叠，揭示了CIS-或逆元件Oleiii.随后控制C18：0和C18：1。

一辆在LG8上qOleI-8被删除的底层OleI表达与lod 1.9（表3.;数字1和2）.加性效应值qOleI-8是积极的，表明这一点J. Integerrima.等位基因呈阳性OleI表达。为了找到尽可能多的推定QTL（EQTLS），并获得对检查特征之间的关系的更清晰的了解，采用了宣布暗示EQTL的1.9的阈值EQTL。低阈值可能在植物育种计划中不可用，但他们已被证明有助于了解特征之间的关系[18.］．

Oleii.位于LG3上。一个EQTLOleii.在LG6上检测到LOD 2.6，哪个接近qC18:0-6．建议是一种跨元件Oleii.可以停泊在控制C18:0的区域。加性效应值表明j . curcas等位基因均为阴性，说明j . curcas等位基因对Oleii.表达。

种间居群的发展

为了拓宽培养作物的遗传多样性，并鉴定与有益特征相关的QTL，例如产量，籽粒质量和抗病，特异性群体的发展是一种可行的策略[19.］．我们在Joatropha中开发了大约500个SSR标记，但在内部检测到非常低的多态性j . curcas，表明内部遗传变异非常有限j . curcas．通过杂交，成功构建了QTL/eQTL定位群体j . curcas来J. Integerrima.并在DNA、RNA和表型水平上观察到遗传多样性的增强，这是QTL和等QTL检测的前提。

对于油棕性状的改良，种间杂交方法也被认为是一种可行的方法来引入感兴趣的性状，即油棕中更多的液体油脂[20.］．在MAS中，利用与特定脂肪酸相关的分子标记，可以在种间杂交种及其回交的世代分离中进行更有区别的选择。我们研究了qtl对油品性状的影响，发现最优等位基因来自于不仅有j . curcas但也J. Integerrima.．C18:1在j . curcas比J. Integerrima.，总含油量J. Integerrima.是51.04%，比在j . curcas（表1）.与这个结果一致的是，qC18:1-1和qOilC-4，分别控制C18:1和总含油量j . curcas和J. Integerrima.分别。因此，通过进一步的回复和标记辅助选择，QTL映射群体对于转移最喜爱的等位基因非常有用。

利用各种种质成功地开发了用于水稻抗病虫害和其他农艺性状研究的染色体片段替代系[21-23］．由于麻疯树的生命周期较长，这些回交群体的发育时间较短，因此对未来的QTL定位具有“不朽”的意义。同时，回交群体的具体优势在于，可以进一步利用该群体开发染色体片段代换系，进行标记辅助回交育种。染色体片段代换系将为麻疯树种质改良提供有价值的工具，并有望揭示供体性状的遗传基础J. Integerrima.．

基因在QTL簇中的联动或脂肪效应

一些染色体区域与两个以上的性状相关，表明连锁或多效效应。在同一区域检测到一个控制C18:1和C18:2含量的QTL聚类，即接近标记Jcuint057在LG1和JCUINT180上的LG10上，附加值为C18：1与C18：2相反。这可以解释C18：1和C18：2之间的强度负相关（表2），这与亚油酸从油酸去饱和的事实一致。特别是在LG1上，用非常显着的效果检测QTL，占变异的36.0％。据透露，在这些的QTL或通过调节这两种C18某一基因在脂肪酸代谢途径中的多效性效果并存或者某些基因：1和C18：2页的内容同时进行。对这些QTL的微小映射，分离靶基因并理解链接或脂肪效应是否有意义。QTL区域仍然远离具有大于2cm的连杆距离的侧翼标记。精细映射的QTL将通过MAS加速遗传改进[3.］．目前，麻疯树高分辨率遗传连锁图谱的构建正在进行中，这将为今后的多种遗传和基因组研究，包括QTL精细作图和标记辅助选择奠定坚实的基础。

油酸基因的qtl分析

为了研究麻疯树油红蛋白基因的功能和调控，我们测定了其表达水平OleI那Oleii.和Oleiii.在QTL映射群体中，并通过命名为“基因酸基因组学”的方法进行分析，用于鉴定影响基因表达的基因组区域[12.那24］．结构基因的地图位置及其EQTL的相关性提供了其调节的指示[24］．如果一个基因及其EQTL的位置是一致的，则可以推断顺式调节，这意味着基因本身的等位基因多态性或密切关联的调节因素，直接影响基因的表达。在该研究中，对油蛋白基因的EQT1不会与这些基因的结合。该结果表明，观测到的oleosin基因表达的差异可能是经型调节的后果，这意味着基因表达主要通过反式作用因子调节。对于桉树生物合成的一组基因已经观察到类似的现象。这些基因中的大多数受到LGS 4和9上的两个EQTL的显着影响，而结构基因在整个基因组中分布[25］．

在油性状和油蛋白基因的表达之间观察到显着但低的相关性。Yin等人报告了类似的现象[10.］．他们报道了GmRCAa和GmRCAb的表达与Rubisco初始活性、光合速率和种子产量之间的显著相关性，表明这些基因可能在提高光合能力和种子产量方面发挥作用。但Rubisco初始活性、光合速率和种子产量与基因表达的相关系数相对较小。这也反映在基因表达水平与其他3个性状之间没有发现一致的QTL (eQTL)。因此，他们得出结论，除了GmRCAa和GmRCAb以外的因素限制了光合能力和种子产量。在本研究中，油脂性状与油脂苷基因表达的相关性显著但较低，表明这些基因可能影响脂肪酸组成和含量;同时，影响油质性状的因素还应包括其他复杂因素。

三个EQTLS将提供以超越以前的QTL绘图结果之外的石油特征改善的可能方法。有趣的是，Oleiii.基因，EQTLOleiii Qoleiii-5和Qtl的qC18:0-5和qC18:1-5在LG5的同一地区聚集在一起。进一步解决CIS-或跨元件Oleiii.在LG5上留下的是随后控制脂肪酸组成，仍然需要两种基因座。只有eqtlOleiii.结果与油质组成QTL一致，这可能是油质基因功能分化的结果。

总之，我们鉴定了18个QTL底层，油性特征和oleosin酸基因的3个EQTL。其中，qC18:1-1那qOilC-4和qOleIII-5，分别控制油酸、总含油量和油酸苷基因表达，贡献率较高(R²）并且可以通过将更多标记集成在这些地区来应用于MAS中。这些数据代表了Joatropha中QTLS / EQTLS的首次成功检测QTLS / EQTLS。

植物材料和植物生长条件

j . curcasPZM16被越过J. Integerima.S001和杂交后代CI7041。利用回交组合PZM16 × CI7041构建回交群体(BC)，该群体由286个个体组成。种群和亲本在新加坡林珠康农场试验田标准生长条件下种植。

基因组DNA的分离和cDNA的合成

采用DNeasy植物迷你试剂盒(QIAGEN，德国)提取叶片总DNA并纯化。油体位于成熟种子的细胞内。成熟种子的总含油量和脂肪酸组成是重要的农艺性状。利用植物RNA纯化试剂(Invitrogen)从成熟种子中分离出总RNA，研究油脂提取用成熟种子中油脂苷基因的表达情况。然后用Poly(A) polymerase (Ambion)将Poly(A) tail添加到rna的3'端，再用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen)与oligo(dT) 3'-RACE adaptor (Ambion)进行逆转录。

特质测量及资料收集

用液氮研磨QTL映射群的每个样品，分为3份。每个样品由3种成熟的种子组成，从同一树中随机收集。通过气相色谱（GC）分析脂肪酸组合物。从100mg成熟的种子中提取的总脂质与3N甲醇-HCl（Sigma，St.Louis，Mo，USA）加上400μl2,2， - 二甲氧基丙烷（Sigma，St.Louis，Mo，USA）。使用溶剂（己烷）提取萃取油，然后用酯化从油转移到甲酯。通过GC使用GC Agilent 6890（Palo Alto，Ca，USA）通过使用氦作为载气和DB-23柱进行分析的脂肪酸甲酯（FAME），用于组分分离。GC分析方法在140℃下进行50℃和30℃min^-1斜坡达到240℃，并将最终温度保持在50秒，总运行时间为32分钟。根据峰面积计算分析中包括的FA组分值。

采用real-time PCR仪(I-Cycle, BioRad)对逆转录cdna进行实时荧光定量PCR，以确定mRNA的表达水平。每个反应包含200 ng的第一链cdna, 0.5 μL的10 mmol L^-1基因特异性引物，12.5μL实时PCR Sybr混合（IQ™SYBR^®绿色Supermix Bio-Rad)。扩增条件为95°C 5 min, 95°C 15 s和60°C 60 s循环40次。选取麻疯树18S rRNA作为内源参考，作为对照，检测样品间cDNA量的变化。以麻疯树PZM16成熟种子的cDNA作为每个real-time PCR板的校正器。每个反应进行了两个技术重复。每一行的规范化表达式按[10.),即ΔΔC_T.= (C_T,目标- C._T，18）_基因型- （C._{t，目标 -}C._T，18）_校准器．下ΔΔC_T.值意味着更强的基因表达，反之亦然。来自QTL测绘群的每株植物的五种成熟种子用于确定相对表达水平OleI那Oleii.和Oleiii.．所呈现的结果是每种植物的生物学重复的手段。

DNA标记和基因分型

从麻疯树的第一代连锁图谱中选择了几乎均匀覆盖11个lg的95个标记[13.］．每对引物中有一个引物在5'端用FAM或HEX荧光染料标记。PCR程序对ptc - 100微卫星扩增PCR仪(美国CA MJ研究)包括以下步骤:94°C 2分钟紧随其后的是37 94°C的周期30年代,55°C 30年代和72°C 45 s,然后72°C的最后一步5分钟。每个PCR反应包括1×PCR缓冲(Finnzymes,埃斯波,芬兰)与1.5毫米MgCl₂，每个PCR引物200 nM，每个dNTP 50 μM, 10 ng基因组DNA和1个DNA聚合酶(Finnzymes, Espoo, Finland)。使用DNA测序仪ABI3730xl对产品进行分析，片段大小根据尺寸标准ROX-500 (Applied Biosystems, CA, USA)使用软件GeneMapper V3.5 (Applied Biosystems, CA, USA)确定，如前所述[26］．

统计分析与QTL (eQTL)定位

QTL（EQTL）分析允许解剖有利于性的定量性状的变化的遗传基础。为兴趣的特征进行评分绘制人口的每个人，为该人群建立遗传联系地图是QTL（EQTL）检测的两个先决条件。在该研究中，脂肪酸组成和含量的表达水平数据和OleI那Oleii.和Oleiii.收集3例群体的表达水平，其中286个个体组成，用3个复制收集。通过SAS Proc Corr计算特征之间的Pearson表型相关性。95标记在QTL测绘群中进行了基因分型。用于将三种基因和引物对进行测定的SNP标记，用于通过实时PCR测定表达水平的基因4.．

使用CRIMAP 3.0软件构建连锁图谱，检测连锁并构建图谱[27］．所有的多点距离都用Kosambi函数计算。使用MapChart 2.2软件对连杆组进行图形化可视化[28］．使用QTL Cartographer 2.5版进行QTL（EQTL）分析[29］．利用复合区间作图模型6对qtl (eqtl)进行作图并估计其效应。每隔2 cM扫描基因组，选择正向回归方法。如前所述，通过排列测试分析(1,000个排列，总体错误水平为5%)声明显著QTL (eQTL)的概率(LOD)评分日志。为了找到尽可能多的推测QTL (eQTL)，并更清楚地了解所检测性状之间的关系，我们使用2.0个油酸基因的阈值eQTL分析来宣布一个QTL (eQTL)。低阈值可能在植物育种计划中不可用，但他们已被证明有助于了解特征之间的关系[18.］．

沿间隔的最大LOD评分被视为QTL（EQTL）的位置，并且LOD评分中的区域在最大1个洛氏单位内的区域作为置信区间。从复合间隔映射结果估计检测到QTL（EQTL）的添加效果，作为在兴趣区内取代杂种（CI7041）等位基因的平均效果j . curcas（PZM16）等位基因。因此，在具有积极效果的QTL（EQTL）处，等位基因j . curcas将增加属性值。每个QTL (eQTL)对总表型方差的贡献(r²)的方差分量分析估计。采用QTL命名法:以“q”开头，其后是性状名称的缩写、连锁群的名称和影响该性状在连锁群上的QTL数量。

为了研究LGs 1和4上两个qtl的表型性状与基因型之间的关系，计算了这些微卫星标记替代等位基因的后代的平均表型值J. Integerrima.（AA），从中遗传的等位基因j . curcas(AA)。利用qtl连锁标记的两个等位基因组合(AA, AA)对后代进行双向方差分析。采用SAS (SAS Institute)的一般线性模型(GLM)程序和Bonferroni方法进行多重比较，α < 0.01。

这项工作是项目“遗传改善的麻醉药遗传改善”的一部分，由Nam-Hai Chua教授启动和协调。我们感谢Hong Yan和Yi Chengxin从Joil Pte提供，用于提供植物材料J. Integerrima.在绘制人口建设中。我们感谢Bu Yunping博士在GC分析中得到帮助。我们还感谢您的测序设施，以帮助DNA测序和基因分型。该项目由Joil Pte Limited和新加坡淡山脉生活科学实验室的内部基金提供资金。

隶属关系

1. 淡马锡生命科学实验室分子群体遗传学课题组，新加坡国立大学，新加坡117604

   彭刘，春明王，雷丽，飞孙，彭柳＆enua yue

相应的作者

对应到春明王或者Gen Hua Yue.．

作者的贡献

PL和CMW进行了收集基因型和表型数据的实验。CMW设计了实验，分析了实验数据，起草了实验手稿。GHY主持了麻疯树分子育种项目，并对手稿进行了修订。LL测油特性;FS提取QTL定位群体的DNA和RNA;FS和PL参与了实验室和现场的数据收集工作。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

开放访问本文由BioMed Central Ltd授权发表。这是一篇开放获取的文章，是根据知识共享署名许可协议(https://creativecommons.org/licenses/by/2.0）提供任何介质中的不受限制使用，分发和再现，所以提供了正确的工作。

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