特林卡德拉品种的转录物和代谢物分析揭示了有关葡萄成熟动力学的新信息

背景

葡萄(葡萄是世界上经济上最重要的水果作物。然而，导致非更年期果实成熟开始的分子和生化事件的复杂性尚不完全清楚，这在葡萄中由于季节和品种特异性变异而进一步复杂化。葡萄牙葡萄酒品种Trincadeira产生了高品质的葡萄酒，但由于对非生物和生物压力的高度敏感性，在季节之间呈现出极其不规则的浆果成熟。

结果

研究了特林卡代拉葡萄的成熟过程，考虑了转录和代谢特征，并辅以生化数据。豌豆大小的绿色浆果发育阶段的四个时间点mRNA表达谱veraison采用Affymetrix GrapeGen对2007年和2008年两个季节的成熟果实(EL 32、EL 34、EL 35和EL 36)进行比较^®基因组阵列包含23096个问题集，对应18726个独特序列。超过50%的这些问题集在至少两个发育阶段之间显着表达差异(1.5倍)。一组与5877个unigenes对应的共同转录本表明，尽管Trincadeira葡萄的发育不规律，但不同年份之间的共同途径被激活。这些单基因被划分为“代谢”、“发育”、“细胞过程”、“多种/杂项功能”、“调控概述”、“对刺激、应激的反应”、“信号传导”、“运输概述”、“异种蛋白、转座元件”和“未知”等功能类别。通过定量RT-PCR验证了8个选定基因和5个发育阶段(EL 32、EL 34、EL 35、EL 36和EL 38)的微阵列结果。使用¹与二维技术相关的H NMR光谱显示了与氧化应激反应、氨基酸和糖代谢以及次级代谢相关的代谢物的重要性。这些结果与利用基因组阵列获得的转录谱分析相结合，提供了有关导致葡萄成熟的事件网络的新信息。

结论

总的来说，获得的数据为葡萄成熟过程中积累的基因表达和代谢物提供了迄今为止获得的最广泛的调查。此外，它强调了从一个鲜为人知的品种中获得的信息，这些品种表现出可能是特定品种或取决于气候条件的特定特征。在葡萄成熟过程中发现了几个先前未报道的基因，即涉及碳水化合物和氨基酸代谢以及生长调节剂的基因;代谢，表观遗传因素和信号通路。其中一些基因被标记为受体、转录因子和激酶，为建立非更年期果实成熟控制模型提供了良好的功能分析候选者。

葡萄(葡萄属在经济上是世界上最重要的水果作物，2008年全球产量约为6700万吨(FAOSTAT, 2011年)。此外，食用葡萄和葡萄酒对人体有许多营养和健康益处，因为它们含有抗氧化剂多酚，如白藜芦醇[1]。葡萄籽含有大量的酚类化合物，如没食子酸、儿茶素和表儿茶素，以及多种具有显著防癌潜力的原花青素[2]。红酒含有超过200种多酚类化合物，被认为是抗氧化剂。特别是白藜芦醇具有心脏保护作用和抗癌特性[2]。

在传统的葡萄酒产区，生产应该呈现出依赖于葡萄品种和其他因素的典型性。因此，葡萄酒的改良很大程度上受限于品种的自然变异。在这方面，鲜为人知的葡萄牙和西班牙品种提供了大量的选择，以开发具有不同特征的葡萄酒，这可能在要求苛刻的全球市场上构成竞争优势。在这些品种中有葡萄牙的Trincadeira，它在不同的季节呈现不规则的成熟，对温度非常敏感葡萄孢属sp,霜霉但往往会产生独特的葡萄酒(Jorge Böhm, Plansel, personal communication)。

与对番茄等更年期水果的研究相比，对葡萄等非更年期水果的发育和成熟过程的研究较少。葡萄果实的发育包括两个连续的s型生长期，中间有一个滞后期;从开花到成熟可分为三个主要阶段[3.更详细的描述性名称，被称为改进的E-L系统，用于定义葡萄整个生命周期中更精确的生长阶段[4]。第一个生长期对应于种子胚和果皮的形成。第一阶段的特征是浆果的指数生长，单宁和羟基肉桂酸的生物合成，以及酒石酸盐和苹果酸盐两种有机酸的积累。单宁存在于果皮和种子组织中，而几乎不存在于果肉中，是红酒苦味和涩味的原因。成熟的开始，veraison这是一个过渡阶段，在此期间生长下降，开始颜色发育(红葡萄中的花青素积累)和浆果软化。成熟(最后阶段)的特点是pH值增加，额外的浆果生长主要是由于细胞扩张和可溶性糖的积累，阳离子，如钾和钙，花青素和增强风味的化合物。

影响葡萄酒风味(口感和香气)的许多化合物是在葡萄园中由自然环境、葡萄园管理实践和葡萄基因型等因素决定的。更好地了解浆果中糖和风味化合物的积累对于调整葡萄种植实践以适应市场需求至关重要。增加葡萄成熟的知识将有助于建立最佳的葡萄成熟的收获，这是难以确定的，由于在葡萄集群内的浆果之间的成熟的巨大变异性。此外，它将有助于在不断变化的环境中保持高质量葡萄的可持续生产，这是本世纪葡萄栽培的一个主要挑战。

目前尚缺乏单个控制成熟起始的主开关的分子证据，例如乙烯在更年期果实成熟中的作用。众所周知，接下来veraison阶段，生长素和细胞分裂素含量降低，脱落酸浓度升高[5，6]。脱落酸、油菜素内酯和乙烯(在较小程度上)与葡萄果实成熟起始的控制有关，但它们在分子水平上的作用模式需要进一步澄清[7- - - - - -10]。此外，某些生长调节剂，如多胺，在葡萄成熟的背景下很少研究。

高通量分析方法的可用性和葡萄基因组序列的高质量草图[11，12]，以及转录组学的研究[13- - - - - -16]，蛋白质组学[17- - - - - -19]和代谢分析[20.极大地提高了人们对葡萄成熟的认识。此外，已经开发了遗传图谱，能够识别重要性状的qtl，并建立了共识图谱[21]。

这项工作描述了在两个季节(2007年和2008年)进行的葡萄成熟的第一个全面的转录和代谢分析。转录分析使用第二代Affymetrix Vitis微阵列(GRAPEGEN GenChip)进行，该芯片覆盖了大约50%的基因组，并考虑了基于12倍覆盖率的葡萄基因组序列组装的基因组注释和基于EST同源性的注释。关于葡萄成熟的当前模型的信息得到了确认，并且提供了可能是特定品种的新信息，因为对其他葡萄品种的这一过程知之甚少。

浆果的表型和代谢特性

葡萄果实按E-L系统在五个发育阶段取样[4]，并考虑到浆果的重量、有机酸、糖和花青素含量(图2)1，2)．这些发育阶段被鉴定为EL 32，特征是小而硬的绿色浆果积累有机酸;之前的EL 34veraison特点是绿莓开始变软(这一阶段仅在2007年被考虑在所有分析中);EL 35对应于veraison;EL - 36涉及糖和花青素积累，并因细胞增大而积极生长;EL 38对应收获时间。的日期veraison在两年的花后大约9周。然而，浆果的发育非常不规则(如浆果大小)，当两年比较可能是由于不同的降水模式(附加文件)1)和特林卡德拉的基因型特征。不规则的葡萄成熟已观察到这个品种在前几年(未发表)。果实重量从EL 32到EL 36在2008年都没有增加。此外，EL 36连续两年花青素含量的巨大差异可能主要是由于2008年浆果生长没有像2007年那样扩大。事实上，浆果的重量在后一季几乎翻了一番(图1)1)．因此，2008年每个浆果的果皮百分比更高，这可能是花青素含量增加的原因。此外，环境因素，例如缺水压力，也可能涉及[22]。

对特林卡德拉葡萄进行了额外的代谢分析¹H NMR。信号在δ5.39 (d,J= 3.9 Hz)，δ5,17 (d, J = 3.5 Hz)，δ2.67 (dd, J = 16.0, 7.0 Hz)δ2.62 (s)分别为蔗糖的葡萄糖部分、α-和β-葡萄糖、苹果酸和琥珀酸的异头质子(表2)1)．选择这些化学位移对这些成熟过程中的代谢物进行相对量化(基于归一化到内标的信号积分)，如图所示2。

苹果酸盐和琥珀酸盐含量急剧下降veraison;酒石酸δ 4.50 (s)、抗坏血酸δ 4.59 (d, J = 2.0 Hz)和柠檬酸δ 2.93 (d, J = 16.0 Hz)的分布也相同，其中苹果酸和酒石酸在葡萄中最多(图2)2、附加文件2)．为了确认这些代谢物和其他代谢物在成熟过程中是否以显著不同的量存在，我们使用不同化学位移的光谱强度进行了Kruskal-Wallis和Wilcoxon秩和测试(δ= 0.4-10.0)(见材料和方法，附加文件3.)．

这些光谱强度也被用于多元数据分析，使用主成分分析(PCA)的无监督方法。得到了较好的前后判别结果veraison糖区(δ3.08-5.48)从分析中删除(图3.)．不足为奇的是veraison阶段(EL 35)与所有其他阶段分开出现集群，并且在两个季节之间表现出差异，部分原因可能是由于已知在该阶段发生的成熟开始不同步。EL 35、EL 36和EL 38阶段与EL 32和EL 34阶段分离，第一个主成分占方差的89.0%，主要由苹果酸含量贡献。Veraison第二主成分占方差的4.63%，将色果期(EL 35)与色果期(EL 36、EL 38)分离。EL 36和EL 38分期在本分析中聚在一起。

为了克服拥堵¹氢核磁共振光谱主要是由于有机酸和糖类，并提高其分辨率的二维技术。¹H NMR与2D j分辨和COSY(相关光谱)技术是一种可靠的方法，可用于识别广泛的代谢组，检测氨基酸、碳水化合物、有机酸和酚类化合物等化合物。数字4显示¹部分对应于芳香族区的EL 32和EL 35处的H NMR谱(δ5.7-9.0)，在独联体-香豆醇衍生物和反式-咖啡酸(咖啡酸与酒石酸结合veraison。这些化合物和其他化合物的鉴定也是基于特定信号之间的相关性¹H -¹氢相关光谱(COSY)光谱(附加文件)4)和异核多键相干谱(HMBC)。这些苯丙类化合物与几种有机酸和谷氨酸一起在成熟过程中下降，而香草酸、乙基- β -葡萄糖苷、乙酸、缬氨酸、脯氨酸和γ-氨基丁酸(GABA)的含量在成熟后增加veraison阶段(附加文件)3.，相应的化学变化见表1)．

为了进一步表征葡萄成熟过程中的代谢组，进行了总谷胱甘肽含量的定量测定(图2)5)．这种抗氧化化合物是细胞中氧化应激的良好指标。结果清楚地显示谷胱甘肽显著增加veraison成熟期与成熟期相比，在收获期呈下降趋势。先前，谷胱甘肽的含量在葡萄成熟过程中增加，90%减少[23这可能表明一个活跃的抗坏血酸-谷胱甘肽循环。

为了更深入地了解碳水化合物代谢，我们用Lugol溶液染色的葡萄切片评估了淀粉含量。在绿色浆果中可以观察到发育良好的淀粉体(图2)a, b, c)．淀粉体的数量在veraison(图6 d)，在成熟过程中观察到多糖含量下降(图2)6 e, F)．有趣的是，在成熟阶段观察到药物晶体。这些结构通常由草酸钙构成，以前在植物的叶子中发现过葡萄可能是由于成熟葡萄中抗坏血酸的降解[24]。

Unigenes的微阵列、聚类分析及功能分类

采用Affymetrix GrapeGen比较了4个时间点(EL 32、EL 34、EL 35和EL 36)和2个季节(2007年和2008年)的mRNA表达谱^®GeneChip基因组阵列包含23096个问题集，对应18726个独特序列。每个时间点使用生物重复进行测试，每个季节的数据集分别进行分析。经Pearson相关检验，重复质量很好，范围在0.981% ~ 0.97%之间。对微阵列数据(limma)的线性模型进行贝叶斯t统计后，进行差异表达分析[25]， p值使用Benjamini-Hochberg方法进行多重检验校正[26]。差异表达(fold change≥1.5且FDR < 0.05或fold change≤- 0.1.5且FDR < 0.05)的probesets总数为11759个，占芯片所代表的probesets总数的50.91%。在这7130个问题中，两个季节在EL 35和/或EL 36的差异表达(表1)2、附加文件5)．这组与5877个unigenes对应的共同转录本表明，尽管特林卡德拉葡萄的发育不规律，但不同年份之间的共同途径被激活。然而，仅在2007年和2008年，分别有2284和2345个问题集存在差异表达(附加文件)6)．虽然2008年两季差异表达的问题集和基因总数相似，但在EL 35和EL 36上调的基因数量高于下调的基因数量;2007年的情况正好相反6)．这两组之间的差异可能反映了季节间的生物学差异。

尽管在7130个基因的核心集中，有32.79%的基因与功能未知的基因匹配，但大多数问题集都被分配了功能注释(图2)7)．将每个基因按其假定的分子功能划分为功能类别。在被调控基因核心集中，除了功能未知的基因外，还包括浆果发育过程中的9类基因。分别是“代谢”、“发育”、“细胞过程”、“多种/杂项功能”、“调控概述”、“对刺激、应激的反应”、“信号传导”、“运输概述”和“异种蛋白、转座因子”。与代谢相关的调制问题集的数量与具有未知功能的问题集的数量相似(分别为2343和2338)。两个功能类别没有在基因核心集中表示，但在芯片中表示，即“细胞反应概述”和“异种蛋白，病毒蛋白”。后一种基因仅在一个季节中被调节(附加文件)6)．

基因核心集的聚类分析基于k-means方法利用Pearson相关距离对获得的EL 32、EL 35和EL 36在两个年份的基因表达谱进行计算。将问题集聚为8组，代表3个时间点可以获得的最小轮廓数(图2)8)．

我们没有观察到2007年和2008年在EL 35和/或EL 36上差异表达的7130个问题集的基因核心集的聚类之间的一致性，因为在两个季节中只有3451个转录本(48.40%)落在同一聚类中(额外文件)5)．在3451个在两个季节表现出保守特征的问题集中，我们确定聚类1和8是人口最多的。这些簇对应于转录本后被积极调节veraison(885)和veraison和成熟期(786年)。聚类7(250)和聚类3(147)表示在veraison后者代表在EL 36也下调的基因。簇5(400)和簇6(467)代表在EL 35和EL 36处被抑制的基因，尽管后者代表从EL 35到EL 36表达逐渐减少的基因。集群4(445)表示在EL 36处被抑制的基因，集群2(71)表示在EL 36处表达水平最低的基因veraison。

簇1和簇8中富集了被注释为参与基因表达调控的基因，这表明浆果成熟过程中转录调控的复杂性。另一方面，第4类和第6类表明veraison参与运输机制的下调基因有所增加。当我们比较集群2和集群7时，我们可以得出结论，在集群2中，参与初级代谢和运输概述的基因较少，而参与次级代谢和激素信号传导的基因较多5)．结果表明:veraison是由水通道蛋白介导的氨基酸、碳水化合物和脂类代谢及其转运和水转运的活跃阶段。

聚类5和聚类6增加了被注释为参与细胞成分组织和生物发生的基因数量，这是由于高细胞前-veraison活动和暗示细胞重编程的开始veraison。

葡萄果实成熟过程中基因表达分析

碳水化合物代谢

之后浆果开始积累veraison碳水化合物在光合作用中产生并从叶子中输入的碳水化合物

在Trincadeira浆果中，蔗糖浓度在整个浆果发育过程中增加，尽管葡萄糖含量较高(图2)2)．这与赤霞珠(Cabernet Sauvignon)的结果相反，赤霞珠的蔗糖含量保持相对恒定[15]。编码蔗糖生物合成酶的基因的转录物丰度在EL 36时较高(图2)2、表2)，即蔗糖-磷酸合成酶1 (VVTU4280_at，集群8)和蔗糖磷酸酶(VVTU21174_s_at，集群8)，最后一个酶催化蔗糖合成途径的最后一步。其他作者[16]也提到了成熟黑比诺浆果中蔗糖-磷酸合成酶和蔗糖-6-磷酸磷酸酶编码基因的上调，但没有对蔗糖进行量化。

一个有趣的特点是，对赤霞珠和黑皮诺的研究都显示编码蔗糖合成酶的基因上调，而在Trincadeira中，该基因下调(VVTU16744_s_at)，与蔗糖水平的增加一致。

成熟浆果的质体具有活跃而复杂的淀粉代谢。Lugol染色显示EL 35和EL 36中果皮细胞淀粉水平下降，如前所述[15]，这与淀粉降解和编码α -葡聚糖磷酸化酶、H同工酶(VVTU6785_s_at，集群7)、β -淀粉酶(VVTU15830_s_at)、异淀粉酶异构体3 (VVTU5803_s_at，集群8)和α -淀粉酶(VVTU7116_at，集群8)的Unigenes转录丰度增加一致。此外，编码果糖激酶(VVTU2588_s_at, VVTU4521_at)的转录本也下调，这些酶催化果糖-6-磷酸的形成，并可能调节淀粉的形成。-淀粉酶是一种帮助淀粉分解成麦芽糖的酶，麦芽糖是一种可以起到渗透保护剂作用的化合物[27]。值得注意的是，基于与ESTs的同源性，推测编码麦芽糖转运体的RCP1 (ROOT CAP 1)基因(VVTU12879_at, cluster 7)在EL 35和EL 36处的上调(附加文件)5，6)．

尽管淀粉含量在EL 35和EL 36时有所下降(图2)6)，编码淀粉合成酶1和3、叶绿体前体(VVTU23087_s_at，集群8,VVTU1135_at，集群8)和adp -葡萄糖热磷酸化酶大亚基2 (VVTU17473_at，集群8)等推定参与淀粉合成的基因在成熟过程中上调，而其他推定编码同工酶的基因(VVTU11416_at，集群6;vtu12614_at，集群3，附加文件5)．赤霞珠(Cabernet Sauvigon)葡萄成熟过程中，淀粉合成酶编码基因的上调也被观察到[15]。事实上，在水果等贮藏器官中，淀粉合成和降解酶活性的控制是复杂的。不同的淀粉降解途径可能是发育早期特有的，而在发育后期并不活跃[28]。

蔗糖非发酵1 (SNF1)相关激酶和己糖激酶参与调节ADP-Glc焦磷酸化酶翻译后氧化还原激活的糖信号通路[29]。我们在这里报道了这种糖诱导蛋白激酶在葡萄成熟过程中的推测参与。事实上，一个编码snf1相关蛋白激酶SRK2F (VVTU9506_at，簇7)的基因被认为参与高渗反应[30.]仅在EL 35时上调(veraison)．在植物中，SNF1[蔗糖非发酵1]相关激酶1似乎在控制代谢稳态和胁迫信号传导中起重要作用[31]。最近，糖原合成酶激酶3蛋白激酶VvSK1(糖诱导蛋白激酶)被证明可以调节葡萄细胞悬浮液中的糖积累[32]。在Trincadeira葡萄成熟过程中，编码糖原合成酶激酶3 β的基因(VVTU8170_at，集群6)在EL 35和EL 36时下调，这可能是由于品种特异性所致。

质体糖酵解似乎在发病后受到抑制veraison因为编码磷酸甘油酸激酶(VVTU1271_at，集群6)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A和B (VVTU17859_s_at, VVTU5612_at，集群4)和果糖二磷酸醛缩酶(VVTU16699_s_at, VVTU1150_s_at)的几个基因在这些阶段下调。另一方面，细胞质糖酵解似乎被激活。事实上，胞质磷酸甘油酸激酶(VVTU18434_s_at，集群1)、果糖-二磷酸醛缩酶胞质同工酶(VVTU17960_s_at，集群1)、胞质磷酸葡糖共化酶(VVTU2658_at，集群8)和丙酮酸激酶胞质同工酶(VVTU1012_at，集群1)的基因编码上调。

在过去，有报道称整个浆果分析后糖酵解会下调veraison［17]。其他对整个浆果或仅果皮进行的转录组学和蛋白质组学分析表明，在成熟过程中，几种糖酵解酶增加[13，18]。虽然不同的浆果组织可能有不同的糖酵解趋势[18]，我们在这里强调应该考虑到细胞分隔，据我们所知，这是一个以前没有解决的问题。

由于糖过量导致的细胞质糖酵解速率的增加导致丙酮酸的增加，这可能引发有氧发酵代谢[33]。事实上，丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶可能在成熟的果实中产生乙醇(参见[34])。Pilati等。[16观察到编码醇脱氢酶和醛脱氢酶的基因上调，这可能表明在成熟过程中向有氧发酵代谢转变[35]。

我们观察到编码酒精脱氢酶6 (VVTU6090_s_at)和酒精脱氢酶(VVTU4210_at，集群8)的基因在EL 35和36时上调。代谢谱分析表明，这些样品中存在1- o -乙基- β -葡萄糖苷，这可能源于一组酚类β -葡萄糖苷的葡萄糖基部分向乙醇的转移;已知后一种化合物可控制成熟葡萄的胞质酸度[36]。这一数据可能表明，在特林卡代拉葡萄的成熟过程中，有氧发酵正在发生。此外，编码醛脱氢酶的基因(VVTU12019_s_at, cluster 8)在el35和EL36时上调。Giribaldi及其同事[17在蛋白质组学研究中也观察到，在葡萄成熟过程中，醛脱氢酶异构体的存在增加，并将其与之后乙醇的再循环联系起来veraison［13]。

苹果酸和酒石酸等有机酸对葡萄酒口感的影响是众所周知的。在细胞质中，糖酵解过程中产生的PEP通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)和苹果酸脱氢酶的活性生成苹果酸。虽然编码PEPC的一个Unigene在成熟阶段上调(VVTU1967_s_at, cluster 8)，但两个基因在成熟阶段下调(VVTU12208_at, VVTU19092_at)veraison和成熟阶段与苹果酸的减少一致(图2)2)．由于苹果酸脱氢酶能催化草酰乙酸与苹果酸之间的可逆反应，苹果酸脱氢酶可能参与苹果酸合成，该过程主要发生在pre-veraison苹果酸盐的降解veraison。苹果酸脱氢酶的几种同工型在不同的细胞区室中起作用，可能控制苹果酸的净含量。两个苹果酸脱氢酶同工酶，一个glyoxysomal上调(VVTU2535_at, cluster 8;而在成熟过程中，两个同工酶(一个plastidial和一个glyoxysomal)下调(VVTU4095_at, VVTU1903_at)。

苹果酸酶催化苹果酸和丙酮酸之间的可逆转化。编码nadp依赖性苹果酶的两个基因分别在2008年(VVTU18630_at)和2007年(VVTU35950_at)的EL 35和EL36位点上调(附加文件)5，6)．温度等环境因素可能会激活苹果酸降解的特定途径，但也有可能不同的组织表现不同。无论如何，浆果中苹果酸盐浓度的调节是非常复杂的[15]。最近，有研究表明，Trincadeira比其他葡萄牙品种的苹果酸盐含量更高[20.但需要更多的研究来深入了解这种特殊品种的碳水化合物代谢。

氨基酸代谢

脯氨酸等氨基酸由于其缓冲能力而干扰酸度，从而在葡萄酒的口感中发挥作用[37]。在成熟过程中，我们观察到大多数氨基酸增加，但谷氨酸没有增加3.)．事实上，这种氨基酸在成熟过程中减少，编码谷氨酸脱氢酶1 (VVTU13950_s_at，簇4)的基因在EL 36中下调。

有趣的是，编码GLT1 (nadh依赖性谷氨酸合成酶1)的一个基因(VVTU37879_s_at)在veraison在2007年而不是2008年，这说明了季节间氮代谢的差异。在成熟过程中，一个编码硝酸盐还原酶的基因被下调，但仅在2008年(VVTU9432_at，附加文件)，这一事实进一步支持了这一观点6)．

谷氨酸可以通过谷氨酸脱羧酶分解为γ-氨基丁酸(GABA)，这是一种在成熟过程中增加的代谢物。编码谷氨酸脱羧酶的基因(VVTU11854_s_at，集群8)在EL 35和EL 36上调。

有趣的是，当氧化应激和糖积累增加时，在成熟阶段(EL36)发现编码γ -氨基丁酸转运蛋白(VVTU14998_a, cluster 1)的基因转录丰度增加。

在成熟过程中，一个转录物编码琥珀酸半醛脱氢酶(SSADH1);通过芯片和qPCR分析，推测参与GABA降解的VVTU35625_s_at)在两个季节都下调(图2)2，9、表2)．这种酶参与GABA分流产生琥珀酸，琥珀酸的含量也在成熟阶段减少。在非更年期水果柑橘中，GABA分流被认为在成熟过程中降低柠檬酸盐和细胞质活性中起重要作用[j]。38]。然而，我们的研究结果并不能说明这一点，这可能是因为苹果酸是占大部分可滴定酸度的有机酸，而不是柑橘类的柠檬酸。在该果实中，由于相应基因明显下调，因此排除了由ATP柠檬酸裂解酶催化的柠檬酸替代分解[38]。相反，在Trincadeira葡萄中，该基因要么没有差异表达，要么以低倍的变化上调(未显示)。

随后观察到柠檬酸盐水平下降veraison也应该是由于NADP异柠檬酸脱氢酶参与了异柠檬酸转化为2-氧guguate的作用。编码异柠檬酸脱氢酶叶绿体前体的基因(VVTU35297_s_at，集群8)和编码异柠檬酸脱氢酶(NAD+)前体的基因(VVTU4698_at)在EL 36均上调。

尽管如此，谷氨酸可能被GABA分流部分消耗，因为在成熟过程中，GABA水平增加。另外，它也可能被用于脯氨酸的合成，因为这种氨基酸的水平在成熟过程中强烈增加，编码pyroline -5-羧酸合成酶(VVTU22880_s_at, cluster 8)的基因参与脯氨酸的合成被上调。据报道，在赤霞珠葡萄成熟过程中脯氨酸和脯氨酸生物合成基因也有相同的增加[15]。这种氨基酸可能在成熟阶段起渗透保护剂的作用[39，40]。

编码脯氨酸氧化酶的基因在成熟过程中下调(VVTU7588_at，集群5)。有趣的是，编码脯氨酸转运蛋白1的基因(ProT1, VVTU5646_at，集群8)在EL 35和EL 36上调。

据推测参与蛋氨酸生物合成的胱硫氨酸β -裂解酶(VVTU977_at)的基因编码与EL 36时蛋氨酸含量的增加之间存在良好的相关性1、附加文件3.)．它很可能在为多胺的生物合成提供s -腺苷型蛋氨酸的过程中发挥作用，这将在本文的另一部分进行讨论。这些生长调节剂也应该控制精氨酸代谢。虽然大多数氨基酸的含量与参与其生物合成的基因有很好的相关性，但这种氨基酸的情况并非如此。事实上，精氨酸水平在成熟时增加，主要是在收获阶段。然而，编码精氨酸脱羧酶(VVTU12839_at, cluster 8 - arginine decarboxylase (Fragment))参与精氨酸分解代谢的基因在EL35和EL36时增加2,图9)．此外，参与鸟氨酸和精氨酸合成的谷氨酸n-乙酰转移酶(VVTU22296_s_at)编码基因在EL36时下调。

应激反应

已知谷胱甘肽转移酶在许多植物中响应一系列胁迫条件而上调[41]。我们观察到编码a的转录本葡萄谷胱甘肽s -转移酶26 (GSTF12) (VVTU1974_s_at，簇8)在2007年和2008年分别在EL 36的丰度增加了88倍和190倍，可能参与了液泡中花青素的固存[qh]41]。有趣的是，编码谷胱甘肽结合转运蛋白(MRP10;vtu12535_s_at(簇1)在两个季节的EL36上调。据我们所知，这种转运体以前没有在葡萄成熟的背景下描述。

彼拉提及其同事[16]已报道在葡萄成熟过程中发生氧化应激爆发，正如其他更年期和非更年期水果如番茄所报道的那样[42]，草莓[43]，菠萝[44]和胡椒[45]。葡萄果实发育过程中氧化应激的发生一直存在争议，因为在转录水平上，许多典型的氧化应激标记似乎缺失或受到负调控[13]。还应该考虑到葡萄积累了许多可以发挥抗氧化作用的苯丙素。例如，原花青素、儿茶素、表儿茶素和没食子酸清除稳定的自由基比抗氧化剂抗坏血酸更有效[46]。

我们的研究结果支持了Pilati及其同事的研究结果[16[参考译文₂O₂谷胱甘肽在EL 35显著增加，在收获后2周达到最大值，在收获时下降。参与谷胱甘肽生物合成的γ -谷氨酰半胱氨酸合成酶(VVTU4990_at，集群7)编码基因在2007年和2008年的成熟过程中也被上调(表1)2,图9)．需要进一步的研究来弄清楚氧化应激在成熟过程中所起的作用。谷胱甘肽水平的增加曾在科舒和赤霞珠葡萄成熟期间被观察到[23]。与谷胱甘肽还原酶、脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性相比，这些葡萄在成熟过程中未检测到过氧化氢酶、非特异性过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性。在我们的研究中，编码过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、磷脂氢过氧化物谷胱甘肽过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶的几个基因在成熟过程中被上调和下调，尽管在某些情况下，最终由于组织特异性和/或天气条件，一个季节只有一个基因被上调和下调2、附加文件6)．

许多证据表明，抗坏血酸-谷胱甘肽循环在清除活性氧中起着关键作用。它的活性依赖于抗坏血酸和谷胱甘肽的连续氧化和再还原。我们发现基因编码酶的差异在成熟的周期(VVTU7379_at、集群7 -谷胱甘肽还原酶、VVTU14104_s_at集群1 - monodehydroascorbate还原酶,和VVTU13460_at L-ascorbate过氧化物酶1,胞质APX1)除了dehydroascorbate还原酶(VVTU5671_s_at - dehydroascorbate还原酶)2007年衰减但是只有(表2、附加文件6)，并使用还原性谷胱甘肽作为还原剂将脱氢抗坏血酸还原为抗坏血酸。一个编码脱氢抗坏血酸还原酶的基因(VVTU40144_at)在EL 35时的转录丰度增加了1.62倍，但仅在2008年。

这些数据加上抗坏血酸水平下降和谷胱甘肽水平上升的事实，使得很难确定在成熟过程中这种循环的重要作用，就像在番茄中描述的那样[42]。此外，这种循环在叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等隔间中进行，并且可以预期组织特异性活性。例如，据报道，苹果表皮中的抗坏血酸和谷胱甘肽浓度高于其下的中果皮[47]。在Trincadeira葡萄中，我们发现这些基因在2008年显示出更高的转录丰度(附加文件)6)．

我们发现抗坏血酸水平的降低之间有很好的相关性(附加文件)3.)和编码其生物合成/降解的基因的表达。编码L-抗坏血酸氧化酶的两个基因(VVTU23718_at, VVTU29284_at)在EL 35和/或EL 36至少在一个季节上调。此外，编码l -半乳糖-1,4-内酯脱氢酶的基因(VVTU8069_at，集群4)催化抗坏血酸生物合成的最后一步，编码gdp -甘露糖3,5- epimase 1的基因(VVTU27380_s_at)构成抗坏血酸生物合成的另一种途径，通过qPCR评估，在EL 36和EL 38时均下调(表)2,图9)．l -抗坏血酸也是l -酒石酸形成的生物合成前体，在成熟过程中也会减少。参与生物合成和编码的基因的转录物丰度葡萄然而，L-idonate dehydrogenase (VVTU4643_at)仅在2008年季节下调(表2)2、附加文件2)．近年来，葡萄浆果中抗坏血酸生物合成、循环和分解代谢基因的发育受到强烈调控，抗坏血酸前体在低水平积累，其通量转向酒石酸的合成[qh]48]。

编码Latex产氰β -葡萄糖苷酶的基因(VVTU38305_s_at)在EL 35和EL 36时上调。Grimplet和同事[49发现一种编码氰-葡萄糖苷酶的基因在皮肤中过度表达。氰苷是α-羟基辛腈的苷类化合物，它们在草莓果实成熟过程中的作用已被提及[50]。仍需排除浆果中含有氰化合物的可能性[51]。此外，编码β -氰丙氨酸合成酶(VVTU40443_s_at，簇8)的基因在EL34、EL 35和EL 36位点被上调。有趣的是，编码黑芥子酶前体的基因(VVTU6270_at)在EL36时被上调。黑芥子酶或β -硫代葡萄糖苷葡萄糖水解酶水解硫代葡萄糖苷，释放防御化合物，如异硫氰酸酯和腈。硫代葡萄糖苷衍生物对十字花科蔬菜的独特风味和香气有很大贡献[52]。

我们观察到更多基因在2008年成熟季节上调并涉及生物胁迫反应(附加文件)6)．虽然这可能与环境因素有关，但也可以认为，这一观察结果与2008年每个浆果的果皮数量较高有关，而这种组织预计会表达更多与防御有关的基因。编码anthraniloyal - coa:甲醇anthraniloyal转移酶的基因(VVTU687_at，集群8)的转录物丰度显著增加(2007年和2008年的EL 36分别变化了240.6倍和373.3倍)。据我们所知，这个基因以前没有与葡萄成熟有关，可能参与植物抗毒素的合成，以应对压力[53]。

类黄酮代谢

编码黄酮醇、二苯乙烯和花青素合成的酶的基因被发现在葡萄成熟过程中被诱导，如前所述[16]。

一个编码黄酮醇合成酶的基因(VVTU9714_at，集群8)在EL 34、EL 35和EL 36位点被上调，在这一后期表现出更高的转录丰度。该酶负责将二氢黄酮醇转化为黄酮醇，黄酮醇是稳定葡萄酒中花青素的重要共色素。另一方面，编码二氢黄酮醇-4还原酶(VVTU20756_at，簇5)的基因在位点下调veraison和成熟阶段。这种酶负责将二氢黄酮醇转化为白花青素，白花青素是花青素和单宁的前体。这与最近发表的赤霞珠(Cabernet Sauvignon)和诺顿(Norton)品种的结果有所不同。54]。二氢黄酮醇-4还原酶转录本在veraison然后赤霞珠的含量急剧下降，但在诺顿的整个成熟阶段都保持在相同的水平。正如Pilati等人所描述的。[9编码花青素还原酶的基因(VVTU13083_at，簇5)催化表儿茶素衍生化合物的形成，也在EL35和EL36下调，因为原花青素/单宁合成减少veraison。

有趣的是，编码黄烷酮3-羟化酶的基因(VVTU39787_s_at, cluster2)在EL 35下调，而在EL 36上调，qPCR分析进一步揭示了EL 38在两个季节都上调(图2)9)．这表明同工酶的特异性激活是由于从原花青素到花青素合成的转换。

研究发现，编码udp -葡萄糖的基因花青素5,3-在el34和EL35上表达上调O与黄酮醇3-同源的-葡萄糖基转移酶O-葡萄糖基转移酶样蛋白(VVTU13618_x_at, cluster 7)。虽然两种注释都是正确的，但表达模式表明该基因可能编码后一种酶，这种酶负责山啡酚、槲皮素和myrecitin等黄酮醇苷元的糖基化。事实上，在葡萄浆果中，这些化合物以相应的糖苷、半乳糖苷和葡萄糖醛酸苷的形式存在[55]。最近，Ali等人。[20.在Trincadeira葡萄中发现的槲皮素葡萄糖苷含量的下降veraison可能是由于其前体(二氢山奈酚和/或二氢槲皮素)在花青素生产中的利用。

我们还注意到槲皮素3-的上调O-甲基转移酶1 (VVTU9453_at, cluster1)与葡萄推定的o -甲基转移酶同源，该酶在EL36上调，在两个季节的EL38达到表达高峰(图2)9)．这种酶可能负责花青素的转化，并可能有助于品种特定的花青素谱。例如，花青素通过3'-的作用转化为芍药苷O甲基转移酶(56]。

花青素为红葡萄酒提供了充满活力的紫色调。红葡萄果皮中花青素的积累与编码花青素生物合成最后一步的基因udp -葡萄糖:类黄酮3-的表达一致O葡萄糖基转移酶(UFGT)一种编码udp -葡萄糖的基因:类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶(VVTU17578_s_at，簇8)在EL 35和EL 36的转录丰度增加。

异黄酮类化合物是一类主要存在于豆科植物中的防御化合物。有关异黄酮在葡萄成熟过程中的作用的信息很少。异黄酮还原酶催化将异黄酮还原为异黄酮。最近，该蛋白被证明存在于胚性愈伤组织中葡萄参与应激反应[57]。蛋白质组学研究表明，异黄酮还原酶样蛋白的丰度最高veraison［17]。异黄酮还原酶编码基因(VVTU13266_s_at，第5簇，VVTU13951_at，第1簇，VVTU12956_at，第1簇)在成熟过程中出现了下调和上调，后者可能参与了胁迫反应相关化合物的合成。此外，一个编码CYP81E1异黄酮2'-羟化酶(VVTU22627_at)的基因在2008年EL 36上调(附加文件)6)．

香气发展

据报道，葡萄中有几种游离和结合挥发物，它们在葡萄酒香气中起作用。肉桂醇脱氢酶参与木质素前体的合成，但肉桂醇衍生物也负责水果的风味和香气[43]。大多数编码肉桂醇脱氢酶(CAD)的基因在成熟过程中下调(附加文件)5)，这可能与观察到的独联体-香豆醇衍生物和反式-羧酸，当接近veraison(附加文件2)．然而，一个编码肉桂醇脱氢酶的基因(VVTU27826_x_at)在EL 35和EL 36时上调。据报道，一个CAD基因在草莓果实成熟过程中被上调，并被认为参与了风味发育和维管元件的木质素化[j]。43]。另一个CAD基因(VVTU33502_at)显示了一个有趣的模式，因为它在EL 34上调，就在之前veraison在EL36下调。

植物中已发现多种脂氧合酶同工酶[58]。我们观察到编码脂氧合酶的几个基因的上调和下调5)．人们很容易猜测，脂氧合酶同工型激活了pre-veraison可能参与茉莉酸的生物合成和细胞生长，而脂氧合酶异构体在-veraison可能参与糖异生的脂质动员、细胞扩增和C6挥发性化合物的合成。脂氧合酶衍生的氢过氧脂肪酸通过主要途径代谢，包括氢过氧化物裂解酶等酶[59]。脂肪酸氢过氧化物裂解酶(HPL1;vtu37595_s_at(簇7)在EL35上调。Costantini及其同事[60在Malvasia葡萄浆果中发现，脂氧合酶活性增加，并伴随产生C6化合物，如己烯醇和己醛。最近，在Trincadeira葡萄中(E)-2-己烯醛和己醛的含量在EL36处达到峰值(未发表的结果)。己烯醛可以通过醇脱氢酶转化为己醇。编码乙醇脱氢酶的两个基因在EL 34和/或EL 35和EL 36 (VVTU4210_at, cluster 8, VVTU6090_s_at)上调。酒精脱氢酶活性产生的挥发物被认为有助于水果口感和香气的形成[61]。有趣的是，叶子Adh2转基因葡萄藤过表达物显示单萜、类胡萝卜素、原花青素聚合和苯甲醇的水平增加[62]。

萜类化合物是重要芳香化合物的前体veraison［63]。有趣的是，编码a(-)-异丙烯醇脱氢酶(VVTU2626_at)的基因在EL 34、EL 35和EL 36的峰值处上调veraison。这种酶参与单萜类化合物(如薄荷醇)的合成，这是精油中主要的挥发性成分。另一方面，编码(+)-薄荷醇脱氢酶的基因(VVTU21725_at，集群8)被认为参与薄荷醇的生物合成，这是一种挥发性单萜类化合物，在EL35和EL36中，两个季节都上调了。

有些挥发性萜烯不是直接由类异戊二烯焦磷酸盐产生的，而是由类胡萝卜素裂解双加氧酶裂解类胡萝卜素产生的[64]。三个基因编码一个9-独联体-环氧类胡萝卜素双加氧酶2(类胡萝卜素裂解双加氧酶1);VVTU17555_s_at, VVTU8254_at，簇8,VVTU650_at，簇7)在EL 35时上调，可能有助于风味挥发物的形成[65]。

一些被认为与香气发育有关的基因在不同年份之间表现出不同的表达模式，这可能是由于季节变化。这可能会导致葡萄酒香气的差异，尽管显然涉及许多其他因素的复杂相互作用。

编码(-)-germacrene D合成酶的一个基因(VVTU13316_s_at)在EL 35下调，但仅在2008年下调(附加文件)6)．然而，编码germacrene D合成酶的基因在赤霞珠(Cabernet Sauvignon)葡萄成熟初期被上调[66]，如果注释与这种特定的酶活性相对应，则突出显示品种差异。

生长调节剂

虽然葡萄是一种非更年期的水果，但乙烯被认为可以通过适度增加来促进成熟veraison但它的作用仍不清楚[6]。脱落酸在葡萄成熟过程中有明显的促进作用。在浆果发育的早期阶段，生长素和细胞分裂素可能起到延迟成熟的作用[6]。在核心组7130个基因中，与激素代谢相关的基因以生长素和乙烯相关的基因最多。

植物生长激素

虽然外源生长素可以抑制或延缓葡萄的成熟[67内源性生长素的作用尚不完全清楚。在葡萄中，人们普遍认为吲哚-3-乙酸(IAA)水平在开花后达到峰值，然后在成熟果实中下降到非常低的水平，尽管其他研究报告在葡萄成熟过程中水平相对稳定[6]。在生长素生物合成方面，我们发现一个编码吲哚-3-乙酸-氨基合成酶GH3.8 (VVTU3560_at，集群1)的基因在EL36位点表达上调，而一个编码吲哚-3-乙酸-氨基合成酶GH3.2 (VVTU1335_at)的基因在EL35和EL36位点表达下降。GH3酶负责与氨基酸形成IAA偶联物，这些氨基酸可以从活性池中可逆地去除IAA。在拟南芥中，内源生长素含量通过一组生长素诱导体的负反馈协调调节GH3参与生物和非生物应激反应的基因[68]。最近，GH3在成熟过程中催化IAA偶联物的形成被认为代表了更年期和非更年期果实中常见的IAA失活机制，从而使成熟发生[qh]67]。

编码IAA-氨基酸水解酶1 (ILR1) (VVTU35572_s_at)的转录本在el34、EL35和EL36位点上调，该转录本被认为参与IAA稳态。

辅助/ IAAs已被鉴定为快速诱导生长素反应基因[69]。许多编码Aux-IAA蛋白的基因在成熟过程中下调(VVTU17953_s_at, cluster5, VVTU1813_at, cluster6, VVTU7286_at, cluster2, VVTU23500_at, cluster5, VVTU2445_s_at, cluster5)，这可能表明在成熟后生长素水平确实降低了veraison。然而，编码IAA19的两个基因(VVTU3361_at，集群8)和IAA16 (VVTU33878_s_at，集群8)在EL34, EL35和el36上调。

生长素反应因子结合生长素反应基因的生长素反应元件，因此似乎作为基因转录的调节因子[69]。几个生长素反应因子(ARFs 1、2、3、4、6、10、18)在EL35和EL36或已经在EL34下调(附加文件)6)．

转运抑制剂应答1蛋白编码基因在成熟过程中表达上调(VVTU2614_s_at)和下调(VVTU7869_at)。的TIR1(运输抑制反应1)基因编码F-box蛋白，整合介导Aux/IAA降解的SCF复合物[70]。

编码生长素响应性小生长素上行RNA蛋白(SAUR) 29蛋白(VVTU18738_s_at, cluster 8)的基因在成熟过程中上调，而编码生长素响应性SAUR31 (VVTU38338_x_at)的基因则上调。赤霞珠的情况也是如此[15]。有趣的是，编码生长素应答SAUR9的基因(VVTU19090_s_at)在2007年EL 35期间上调，但在2008年下调。编码其他生长素反应蛋白的基因在不同季节也表现出不同的表达模式6)．

大多数与生长素运输和感知相关的转录本在开始时显示出丰度下降veraison。生长素外排载体PIN1和内流载体(VVTU16083_at, VVTU35909_s_at，第5簇，VVTU33865_s_at，第2簇，VVTU16124_at，第6簇)编码基因在EL 34、35和/或EL36时下调。成熟葡萄中对极性生长素运输的抑制并不令人惊讶，因为在成熟过程中积累的高水平黄酮类化合物已被描述为抑制涉及PIN1的极性生长素运输[71]。

乙烯

乙烯在葡萄成熟中的作用仍未完全了解，尽管它通常被认为有促进成熟的作用[6]。事实上，应用1-甲基环丙烯，一种不可逆的乙烯受体抑制剂，之前veraison减小浆果大小和花青素积累[8]。此外，乙烯的应用在veraison导致果实直径增大，调控成熟相关基因的表达模式[72]。在此之前，内源乙烯产量出现了短暂的小幅增长veraison与此同时，1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC)活性也在增加，这种酶负责乙烯生物合成的最后一步[8]。ACC合酶蛋白浓度在veraison内比奥罗蓝皮亚浆果[17]。

我们观察到ACC合成酶(VVTU6382_at, cluster 6;尽管在2007年至少有一个基因在EL34上调(VVTU12042_at，附加文件)，但VVTU5165_at在EL 35和EL 36上表达6、表2)．编码ACC氧化酶的几个基因也在成熟过程中下调(附加文件)6)，一个上调(VVTU5909_at，集群7)。

黑皮诺葡萄酒[16假定的ACC氧化酶转录物积累高峰发生在此之前veraison赤霞珠E-L 32期的葡萄[15]。然而，这些作者并没有像我们在这项工作中那样鉴定出那么多编码ACC氧化酶的基因。我们的结果表明，峰值发生在veraison但ACC氧化酶的某些同工异构体可能具有活性veraison。在西瓜这种非更年期水果中，ACC氧化酶的同源物也在成熟阶段被诱导产生[73]。

感知、传导和对激素信号采取行动的能力可能随着发育而变化[6]。一些葡萄乙烯受体的转录水平在浆果发育过程中发生了变化[15]。乙烯被一系列膜相关受体感知，包括拟南芥中的ETR1/ETR2和EIN4。74])。编码这些受体的基因在成熟过程中被上调(VVTU1588_at, VVTU19389_s_at, cluster 1)。编码EIN4的基因最近被证明在马斯卡特汉堡葡萄成熟过程中表达增加[9]。通过qPCR分析我们发现，在两个季节中，编码ETR1的基因从EL35到EL38的转录物丰度都有所增加(图2)9)．乙烯水平确实可能在成熟过程中降低，因为乙烯结合已被提出抑制受体功能[74]。

我们发现编码EIN3结合F-box蛋白2 (VVTU2683_s_at)的基因在EL 35处下调，而编码EIN3乙烯不敏感蛋白(VVTU8555_at)的基因在EL 35和EL 36处下调，显示与EIL1相关蛋白同源。在拟南芥中，EIN3家族有6个成员，其中EIN3和EIL1是关系最密切的蛋白[74]。EIN3是乙烯反应的正调节因子。核蛋白EIN3是一种转录因子，可调节其直接靶基因如ERF1的表达[74]。该基因(VVTU8172_at，集群1)在EL 36中表现出较高的转录丰度，特别是在2008年。

有趣的是，一个编码MAP3K蛋白激酶的基因(VVTU12870_s_at，集群1)在EL 36在两个季节都上调。拟南芥MAPKs MPK3和MPK6似乎通过促进EIN3的稳定在乙烯反应途径的调节中发挥核心作用，但最近的研究表明它们参与调节乙烯生物合成而不是信号通路[75]。

ERF1属于一个包含apetala2结构域的转录因子大家族，它与许多乙烯诱导基因的启动子结合。此外，ERF1还参与JA介导的基因调控[76]。EIN3/EIN3样蛋白(EIL)和ERF蛋白介导的转录级联导致乙烯控制基因表达的调控[74]。有趣的是，葡萄糖增强了EIN3的降解，突出了前面提到的糖和激素代谢之间的串扰。除ERF1外，编码转录因子的其他基因如编码ERF3 (VVTU18607_s_at, cluster 8)和编码AP2/ERF转录因子DREB sub - A-5 (VVTU17388_at)的基因也在EL35和EL36位点上调。这个AP2/ERF转录因子家族最近被证明与葡萄成熟有关[77]。

许多其他编码转录因子的基因也被下调(附加文件6)，如AP2/EREBP转录因子(VVTU4551_at，集群5)。值得注意的是，编码乙烯应答转录因子ERF105 (VVTU35437_at)的基因在2007年成熟期间下调，而在2008年上调。彼拉提及其同事[16]也观察到一些编码erebp的基因的诱导和抑制。

总之，我们的结果表明，乙烯信号通路可能发挥重要作用之前veraison正如其他非更年期水果所描述的那样。在西瓜中，青果期乙烯产量最高[73]，并在发育后期减少，类似于柑橘[78和草莓[79]。最近，有人提出，乙烯介导的信号通路的下游部分可能在辣椒成熟过程中被激活，而不是在更年期产生乙烯，而是通过乙烯敏感性的改变。80]。这可能是葡萄的情况。应该考虑到一个特定的信号通路，可能涉及ERF1，在葡萄成熟过程中被激活。

茉莉酸

茉莉酸在葡萄成熟中的作用也知之甚少。一个基于基因组注释编码IMP脱氢酶的基因(VVTU16654_a，簇3)在EL 35和EL 36位点出现上调veraison。有趣的是，该基因与LEJ2 (ET和JA生物合成时间缺失2)具有高度同源性veraisonqPCR证实了这一现象，并清晰地观察到(图2)9)．据我们所知，这个基因在水果成熟过程中还没有被报道过。该基因的研究值得进一步关注。茉莉酸的合成量似乎较低veraison。事实上，茉莉酸盐诱导的几个基因在veraison或在成熟阶段，如EDS5(增强疾病易感性5)(VVTU35149_at，集群2)，植物抗毒素缺乏4蛋白(PAD4) (VVTU14779_at)和纤维素合成酶CESA3 (VVTU26669_at)。此外，参与茉莉酸生物合成的mrna，即编码亚烯氧化物环化酶(与芒果苷相关的同源物，VVTU7003_at)， 12-氧二烯酸还原酶3 (VVTU4246_at，集群6)和12-氧二烯酸还原酶2 (VVTU17030_s_at)的mrna在EL 35和EL 36的数量较少。赤霞珠(Cabernet Sauvignon)在成熟过程中也报道了后一种基因表达的减少[15]。然而，一种被认为参与茉莉酸生物合成的烯氧化物合成酶(VVTU16057_at，簇8)的编码基因在EL 35和EL 36被强烈上调。一个编码MYC转录因子的基因参与茉莉酸依赖的转录激活，在EL 34之前被上调veraison(vtu34392_at，附加文件5)，而编码COI1相关蛋白的基因(VVTU23697_at，集群8)在EL 35和EL36上调。COI1是SCF (SKIP-CULLIN-F-box)复合物的F-box组分，该复合物响应激素，靶向JAZ(茉莉酸zim结构域)抑制蛋白降解[81]。编码JAZ1和JAZ8的基因在成熟过程中表达上调(VVTU38616_s_at，集群8;而对于JAZ3 (VVTU4273_s_at，集群6)则下调。有趣的是，编码jar1样蛋白的基因(VVTU3032_at)在EL 36中上调，但仅在2008年。JAR1编码茉莉酸氨基酸合成酶，参与茉莉酸与il的偶联[j]。82这是激活它所必需的。需要进一步的研究来评估这种差异如何影响不同季节的葡萄成分。已知茉莉酸和茉莉酸甲酯可促进葡萄细胞培养物中白藜芦醇的合成和积累[83]。然而，没有报道将内源茉莉酸和葡萄中苯丙素合成的激活联系起来。事实上，在Trincadeira浆果中，茉莉酸盐o -甲基转移酶(VVTU35706_at;据推测参与挥发性甲基茉莉酸合成的vtu11913_at，簇6)在EL 35和EL36下调，表明该化合物在成熟浆果中的含量也较低。另一方面，茉莉酸甲酯酯酶编码基因(VVTU1657_s_at)被认为参与茉莉酸甲酯信号失活的基因被下调。

综上所述，虽然茉莉酸盐在葡萄中的浓度可能会下降veraison它们可能通过与其他生长调节剂的相互作用在成熟过程中发挥作用。例如，NPR1参与水杨酸和茉莉酸之间的拮抗相互作用[84]，对应基因在EL36 (VVTU7560_at, cluster 1)上调。

聚胺类

已知多胺参与植物生长和分化以及胁迫/防御反应[85]。在果实发育过程中，多胺和乙烯的生物合成速率通常相反，这可能是由于多胺对乙烯的生物合成有抑制作用，反之亦然[86]。因为乙烯水平可能会随之下降veraison，多胺水平可能会增加。这是由编码精氨酸脱羧酶(片段)(VVTU12839_at，集群8)、s -腺苷蛋氨酸脱羧酶(VVTU12964_s_at，集群8)、亚精胺合成酶(VVTU1269_s_at)和精胺合成酶(VVTU5224_at，集群1,VVTU10365_at)的基因在EL 35和/或EL 36的转录丰度增加所提示的。这些酶参与多胺的生物合成。此外，我们发现编码精氨酸脱羧酶的基因在两个季节中转录物丰度持续增加，最高可达EL 38(图2)9)．

据报道，多胺是葡萄开花的诱导剂、果实脱落的促进剂和坐果的过程。87]。然而，据我们所知，还没有证据表明多胺在葡萄成熟中起作用。事实上，先前对赤霞珠和黑皮诺葡萄的研究并未显示多胺生物合成酶编码基因的上调[15，16]。另一种参与多胺生物合成的酶是鸟氨酸脱羧酶，但在成熟过程中没有观察到相应基因的差异表达(数据未显示)。胞内游离多胺池受其合成和降解等机制的影响。胺氧化酶分解腐胺(二胺)和多胺，并能生成γ-氨基丁酸[88，一种在特林卡代拉成熟葡萄中增加的化合物(见表)1、附加文件3.)．在该葡萄品种中，我们发现编码胺氧化酶的4个基因(VVTU37047_at，集群1,VVTU6472_at, VVTU851_at，集群8,VVTU5226_at)的EL 35和/或EL 36上调，这可能表明在成熟过程中多胺的活跃分解代谢正在发生。研究人员正在研究多胺在葡萄成熟过程中的作用。

ABA代谢

一些研究报告游离ABA水平在veraison伴随糖的积累和颜色的发展[6]。此外，ABA的应用也被证明可以诱导MYB转录因子的表达，该转录因子已知可以协调激活花青素生物合成途径[89]。ABA可能会诱导糖的吸收和积累，并增加苯丙素的合成，这导致了ABA在促进葡萄成熟中的作用[6]。

最近，ABA和糖信号通路之间的相互作用被证实[10]以及ABA和乙烯之间的相互作用，这可能是葡萄开始成熟所需要的[9]。

两个基因编码一个9-独联体-环氧类胡萝卜素双加氧酶(VVTU17555_s_at, VVTU8254_at，集群8)在两个季节的成熟过程中均上调，但第一次上调在EL 35达到峰值。该酶催化了ABA生物合成的关键步骤，表明ABA水平随之增加veraison［90]。

除了参与触发成熟外，葡萄中ABA的产生可能与种子发育有关[49]。

在EL 35 (VVTU783_at, cluster 7)中，一个编码ABA响应元件结合蛋白2 (AREB2)的基因与基因grip55同源的基因被上调。该蛋白是一个参与ABA响应基因调控的转录因子，被认为在葡萄果实成熟过程中调控ABA /水分胁迫诱导基因的表达[j]。91]。

有趣的是，与rna结合蛋白akip1样蛋白(VVTU19049_s_at)同源的基因UBP1相互作用蛋白2a (UBA2a)的转录丰度在EL 36时增加。该蛋白是核蛋白，参与mRNA剪接。在蚕豆根尖ABA激活的蛋白激酶(AAPK)-相互作用蛋白1 (AKIP1)在ABA处理下被AAPK磷酸化。这种活化的AKIP1蛋白被认为可以结合其他aba应答转录物，如脱氢蛋白[92]。

许多被认为与ABA信号有关的基因在特林卡代拉葡萄成熟过程中被上调，但在此背景下尚未被描述。编码OST1 (OPEN STOMATA 1) AAPK的基因在EL 36上调，但仅在2008年上调(VVTU23465_at，附加文件)6)．

aba激活的激酶鉴定为snf1相关蛋白激酶(SnRK) 2.2;

SnRK2.3和SnRK2.6(也称为OST1, AAPK的拟南芥同源物)。OST1/SnRK2.6是除ABA外可被渗透胁迫激活的拟南芥SnRK2之一，也是ABA信号转导的主要正调控因子[j]。93]。最近，蛋白质激酶SnRK2.2、SnRK2.3和SnRK2.6被认为具有部分冗余功能，但它们一起对ABA应答至关重要，而SnRK2-7和SnRK2-8在ABA信号传导中起次要作用[94]。编码SnRK2-8的基因(VVTU12347_s_at)也仅在2008年在EL 35上调。

编码SNF1蛋白激酶2-3 AKIP OST1 (VVTU22232_at)的基因下调进一步支持了ABA信号的季节性差异，但仅在2007年(附加文件)6)．

一个编码ABA不敏感1 (ABI1)的基因;VVTU28731_s_at)是一种pp2c型蛋白磷酸酶，与OST1相互作用，负调控ABA信号传导的许多方面[93]在EL 34、35和36时上调。

Brassinosteroids

油菜素内酯(BR)在浆果发育中起着重要作用[7]。

Pilati等。[16]报道了编码VvBR6OX1基因的转录丰度，该基因将6-去氧卡斯特酮转化为卡斯特酮，卡斯特酮是葡萄中检测到的唯一具有生物活性的油菜素类固醇veraison与以往资料一致[7]。在Trincadeira中，该基因(VVTU647_at)在EL 35和EL36处下调，而在EL 34处未观察到差异表达(至少在2007年)。

在其他物种中，两者呈负相关VvBR6OX1转录物水平和相应酶底物的数量被注意到[6]。这一事实可能表明，castasterone可能在Trincadeira浆果的早期阶段积累，或者在任何发育阶段都没有积累。编码类固醇5 α还原酶DET2 (VVTU6606_at, cluster 6)的基因被认为参与了油菜素内酯的生物合成，而在EL 34、EL 35和EL 36的表达量也较少，这表明油菜素内酯的生物合成随之减少veraison。

一种被认为参与卡斯特酮分解代谢的酶(CYP734A7 castasterone 26-羟化酶)的基因编码在EL 35和EL 36位点也下调(VVTU24849_at)。从番茄中提取的CYP734A7 castasterone 26-羟化酶被证明能将castasterone代谢为26-hydroxycastasterone，并通过羟化作用使其他油菜素内酯失活[95]。

Wang等人描述了一种假定的油菜素类固醇受体BRI1 (brassinosteroids INSENSITIVE 1)。[96]。有趣的是，编码BRI1的基因在2007年的EL 36中下调，但在2008年上调，这表明油菜素内酯的感知差异是由于不同的气候条件或最终由于组织特异性表达。转录因子BIM1(与bes1相互作用的myc样蛋白1)的基因编码;然而，在两个季节的成熟过程中，VVTU14956_at)都上调了。编码bsu1样蛋白3bsl3 (VVTU1264_at, cluster 1)的基因参与油菜素类固醇介导的信号通路也是如此。此外，我们注意到在两个季节的成熟过程中，油菜素类固醇应答环- h2 (BRH1) (VVTU4905_s_at)的转录物丰度都有所下降。已知该基因在外源油菜素内酯的作用下被下调，在赤霞珠葡萄中，该转录物在E-L期31至35的丰度下降，但在EL - 36的丰度增加[15]。这可能最终与品种特异性相对应。

细胞分裂素

细胞分裂素被认为参与浆果的形成和促进生长，并倾向于抑制成熟(由[6]及其中的参考资料)。玉米素水平在葡萄果实发育早期较高，但在葡萄果实发育前后迅速下降至较低水平veraison［97]。细胞分裂素水平的下降veraison以前是否与细胞分裂素氧化酶基因的高表达有关veraison［15]。然而，在这项工作中，我们没有观察到编码细胞分裂素氧化酶的基因在浆果发育过程中下调。

在Trincadeira葡萄中，参与细胞分裂素降解的细胞分裂素脱氢酶5前体(VVTU7035_at)和细胞分裂素脱氢酶7 (VVTU9094_s_at)编码基因的转录水平在EL 35和EL 36显著降低。编码CR9蛋白的基因(VVTU28950_s_at)是一种细胞分裂素抑制基因，随后下调veraison根据Pilati及其同事的报告[16]。

一些编码细胞分裂素- o -葡萄糖基转移酶2的基因在成熟过程中被上调或下调5)，因此我们的数据不足以支持细胞分裂素水平在这一时期下降的说法。

在拟南芥b型应答调节因子(ARRs)是细胞分裂素应答所必需的dna结合转录激活因子，而a型ARRs则是细胞分裂素激活转录的抑制因子[98]。有趣的是，我们发现一个编码伪反应调节因子9 (APRR9)的基因(VVTU31519_s_at)在2007年和2008年分别在EL 34和EL 35上调。编码A型和B型ARRs的其他基因在EL 34, EL 35和EL 36 (VVTU13271_s_at, VVTU9297_at，集群5,VVTU20270_s_at，集群1,VVTU9337_at)上有差异调控。

赤霉素

已经收集的证据支持赤霉素在果实形成过程中发挥作用(包括在种子发育中发挥重要作用)，但没有强有力的证据表明赤霉素直接参与控制浆果成熟，尽管它们被认为有助于细胞扩大[6]。

编码赤霉素氧化酶的两个基因在EL 35和EL 36位点上调(VVTU13918_at，集群8;VVTU12369_at，集群8)，但其他在同一阶段下调(VVTU8591_at, VVTU9124_at，集群5,VVTU7332_at)，这使得很难理解赤霉素在成熟过程中是如何分解代谢的。此外，一些编码赤霉素应答蛋白和赤霉素调控蛋白的基因在成熟过程中被上调或下调(附加文件)6)．

另一方面，编码赤霉素酸受体GIDL2的基因(VVTU1752_at，簇8)在EL 35和EL 36的转录丰度增加，特别是在2007年。赤霞珠(Cabernet Sauvignon)葡萄发育过程中，两种推测的赤霉素酸受体GIDL1和GIDL2的转录物丰度增加[15]。在Trincadeira葡萄中，在EL 36，我们还发现赤霉素受体GID1L1 (TU15195_at，集群1)编码基因的上调，但在2007年的收获季中转录丰度更高。这可能是由于2007年生长的浆果细胞增大幅度较大。

信号转导

在本研究中，除了已报道的转录因子外，我们还鉴定了黑皮诺浆果中MYB、MADS-box、NAC、基本螺旋环螺旋(bHLH)和WRKY家族的其他成员，以及同源和发育特异性基因等[16]。许多转录因子仅在一个季节内被显著调节，这可能是由于不同的环境因素或受浆果不同组织组成的影响，当它们具有不同的表达模式时。

已有文献报道，类黄酮合成的调控主要是通过结合dna的R2R3 MYB转录因子、WD40蛋白和myc样碱性螺旋环螺旋(bHLH)的相互作用，通过结构基因的协调转录控制来实现的[99]。最近，研究表明葡萄R2R3-MYB转录因子1 VvMYBF1调节发育中的葡萄果实中黄酮醇的合成[j]。One hundred.]。

我们发现编码VvMYBA1和VvMYBA3的基因(VVTU17547_at, VVTU17564_s_at, cluster 8)在EL 36上调。在葡萄中，一些MYB基因已被证明参与类黄酮代谢。特别是，许多白葡萄品种源于MYBA1和MYBA2基因的多等位基因突变[101]，调节由udp -葡萄糖类黄酮3- o -葡萄糖基转移酶催化的反应，通过糖基化稳定花青素。芯片中没有MYBA2。转录因子VvMYBPA1被证明可以调节原花青素的合成[102]。因此，不足为奇的是，该基因在EL 35和EL 36下调(VVTU3046_s_at)。最近，一种编码VvMYBPA1的基因在赤霞珠和诺顿葡萄中的表达模式有显著差异，表明黄酮类化合物通路受不同MYB因子的调控[54]。有趣的是，一个编码myb TKI1 (tsl -激酶相互作用蛋白1;先前未描述的与葡萄成熟有关的簇1 (VVTU9543_at)在EL35时上调，并在EL36时继续增加。这种myb结构域蛋白与TOUSLED (TSL)样核蛋白激酶相互作用，该激酶被认为在染色质代谢中起作用[103]。

编码MADS盒子转录因子的两个基因(VVTU18199_s_at，集群8,VVTU11835_at，集群7)在两个季节的成熟过程中均上调，尽管该家族的许多基因与lim样蛋白一起下调(表1)2)．编码LIM结构域蛋白WLIM1的一个基因在EL 35位点强烈下调，在EL 36位点下调幅度更大(VVTU3258_at)。LIM转录因子在辣椒成熟过程中也出现了同样的下降，辣椒也是一种非更年期水果[80]。

我们发现一个编码稻草人样转录因子8 (SCL8;vtu27392_s_at，簇8)在两个季节的EL 35和EL 36位点，而编码稻草人样转录因子9 (SCL9;vtu37071_at)仅在2008年的EL 36季节上调(附加文件)6)．稻草人样蛋白被认为与锌指蛋白一起参与菠萝的成熟[44]。一个基因编码锌指(c3hc4型无名指);在两个季节，VVTU3183_at)仅在EL35上调。该转录因子可能作为进入成熟阶段的转折点发挥重要作用。

转录因子分析显示，许多WRKY基因在veraison一些显示出成熟的特定特征(附加文件5)．这些转录因子已被证明参与调节植物的防御反应、发育程序和果实成熟[qh]104]。编码WRKY dna结合蛋白48和23的两个基因(VVTU40803_s_at, VVTU2080_at，集群8)在两个季节的成熟过程中均上调，在EL 34开始增加其转录丰度(至少在2007年)。

在研究期间，大多数与NAC转录因子同源的转录本出现正向调节(表2)2、附加文件5)．这些转录因子家族参与生物和非生物胁迫反应、果实发育、ABA信号传导和许多其他过程[105]。在西瓜果实成熟过程中，NAC蛋白同源物被认为在维管分化中起作用[73]。在这些水果中，bZIP转录因子也被证明参与成熟，正如我们在特林卡德拉葡萄中获得的结果所表明的那样。编码bZIP转录因子的部分基因仅在EL34和el35位点上调(VVTU11917_at)，而其他基因则表现出成熟特异性基因(VVTU5563_at, cluster 8, VVTU27362_at, cluster 8，表)2)．这类转录因子与那些参与MADS盒子调节的转录因子一起，与更年期(番茄、桃子)和非更年期(西瓜、辣椒、草莓、菠萝)果实成熟都有关系[44，73，80，106- - - - - -108]。

在拟南芥中，dof型转录因子参与了苯丙素代谢的调控[109]。有趣的是，一个编码锌指蛋白DOF3.5 (VVTU3691_at)的基因仅在两个季节的EL35上调，可能与成熟的开始有关。

赤霞珠葡萄在成熟过程中，大量与钙固存、转运和信号传导相关的基因表现出发育调控的表达模式[15]。编码钙依赖性蛋白激酶(CDPK) 32 cpk32的基因(VVTU2538_at，集群7)在两个季节都在EL 35上调，而编码另一个CDPK相关激酶(VVTU24659_at，集群2)的基因由于在EL 35下调而在EL 36上调而表现出有趣的特征。这些激酶是钙调控的，它们的组织特异性表达受到多种刺激的影响，如干旱胁迫、激素治疗和病原体[110]。

一些CDPKs特异性地与钙传感器蛋白calcineurinb样(CBLs)相互作用，因此被命名为CBLs相互作用蛋白激酶(CIPKs)。最近，一个由CBL1-CIPK23网络激活的葡萄振动筛向内K+通道被证明在干旱胁迫下表现出强烈的上调[qh]111]。编码CIPKs的11个基因在成熟过程中差异表达(附加文件)6)．有趣的是，编码cbl相互作用蛋白激酶1 (CIPK1)的基因在两个季节的EL 35中都上调(VVTU13369_at)，并可能最终成为与成熟开始相关的重要信号模块的一部分。

无赖氨酸(WNK)蛋白激酶和Ste(无菌)20激酶是秀丽隐杆线虫高渗收缩后存活所必需的[112]。编码STE20/SPS1富含脯氨酸-丙氨酸蛋白激酶的两个基因(VVTU26057_at，集群8,VVTU30962_at，集群8)从EL 35到EL 36的转录丰度增加，推测参与葡萄成熟过程中的渗透调节。据我们所知，这些基因与水果成熟没有关系。

受体样激酶(RLKs)参与多种信号通路，包括油菜素内酯感知和植物防御。最近，在柠檬中发现了一种新的lec受体激酶样蛋白，以应对真菌感染[j]。113]。在特林卡德拉葡萄成熟过程中，几种类型RLKs的编码基因被显著调节。这就是细胞壁相关激酶(wall-associated kinase, WAKs)的情况，它们与细胞壁紧密结合，是植物发育过程中细胞扩增所必需的(参见[114])。因此，编码WAK受体蛋白激酶(VVTU9861_at，集群8)和壁相关激酶4 (VVTU38545_at，集群1)的基因在成熟阶段上调也就不足为奇了(表1)2)，当细胞在浆果中扩张时。

重要的是，一个编码受体蛋白激酶的基因(VVTU11578_at，集群7)在两个季节的EL35都出现了表达高峰，并最终参与促进成熟。

此外，我们还发现了4个编码受体蛋白激酶PERK1的基因在EL 36期上调(VVTU9535_at, cluster 8, VVTU8084_at, cluster 1, VVTU4451_at, VVTU10748_at)。其中两个在EL 35已经显示出增加的转录本丰度，并且在EL 36进一步增加(VVTU9535_at, cluster 8, VVTU10748_at)。与AtPERK相似的RLK候选物先前已在葡萄成熟过程中被发现[66]和西瓜[73]。

光信号和生物钟

参与昼夜节律振荡系统的几个基因在EL 35和/或EL 36上差异表达，这表明光在调节成熟过程中起作用(VVTU2126_at, cluster1, VVTU5883_at, VVTU2284_at, cluster1, VVTU2454_s_at，附加文件)6)．编码早期光诱导蛋白(EARLY LIGHT-INDUCIBLE PROTEIN, ELIP1)的基因在两个季节的EL35位点均上调(VVTU40867_x_at)。在番茄果实成熟过程中，早光诱导蛋白基因在叶绿体向染色质转化过程中表达[115]。已知早期光诱导蛋白在类囊体生物发生和应激条件下在叶绿体中积累。

编码Constans-like家族转录因子的几个基因在成熟过程中被正向或负向调节(附加文件)6)．一个编码早花(ELF) 3的基因(VVTU2284_at，集群1)在两个季节的EL 36中都上调了。ELF3核蛋白是一种夜间特异性抑制因子，可抑制昼夜节律钟的光输入。它的活动被认为是核心振荡器产生调节生长反应的昼夜节律所必需的[116]。编码MYB转录因子CCA1 (CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1)的基因在成熟过程中被下调(VVTU3515_s_at，集群6)。这与赤霞珠葡萄的结果不一致，赤霞珠葡萄在EL36时编码CCA1的转录物丰度增加[15]。这可能是由于品种的特殊性或不同的收获条件。另一方面，编码CAB表达时间1蛋白的基因(TOC1_2;来自双组分信号转导系统的VVTU22197_at，簇8)在EL 36在两个季节都上调。

表观遗传因子，RNAi和转座子

表观遗传因子和转座子在促进葡萄成熟过程中的作用研究甚少。然而，参与DNA化学修饰和组蛋白编码的几个基因的表达模式(表2)2、附加文件6)表明表观遗传因素参与的发病veraison。编码组蛋白H3、H2B、H1和H2AXb的基因HTA3在两个季节的成熟过程中均上调(表2)2、附加文件5)．编码组蛋白乙酰转移酶ELP3和HAC1的两个基因(VVTU8618_at, cluster 1, VVTU5223_at)分别在EL 36、EL 35和EL 36上调，且后者在成熟过程中转录丰度增加(表1)2、附加文件6)．编码组蛋白去乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶复合体SIN3组分的4个基因(VVTU5815_at, cluster 1, VVTU87_at, cluster 4, VVTU3690_at, cluster 8, VVTU16981_at)在成熟过程中也表现出不同的表达模式，这可能与它们的特定功能有关。最近，研究人员研究了组蛋白乙酰转移酶和组蛋白去乙酰化酶编码基因在葡萄器官中的表达模式，并提出了这些酶在葡萄成熟过程中调控转录活性的具体作用[j]。117]。

编码染色质重塑蛋白的3个基因(VVTU32711_at、VVTU11309_at、VVTU38460_at)表现出不同的表达谱，在2008年季节有更多表达的趋势(表1)2、附加文件6)．事实上，在果实成熟过程中，组织特异性表观遗传修饰可以预期发生在番茄中，它显示了DNA甲基化的组织特异性变化[118]。此外，与季节相关的环境压力会引起引发DNA甲基化的遗传和表观遗传变化[119]。据报道，番茄在葡萄成熟过程中DNA甲基化的全球下降[118在这两个季节中，胞嘧啶甲基转移酶基因(DRM2, VVTU8524_at, cluster 6)和dna -3-甲基腺嘌呤糖苷酶基因(VVTU2258_at)在成熟开始时均下调和上调。后一种酶作为碱基切除修复酶，切断受损碱基的糖基键。此外,新创胞嘧啶甲基化拟南芥涉及RNAi复合物的组分，如RNA依赖性RNA聚合酶2 (RDR2)， DICER-LIKE3 (DCL3)和假定含有snf2的染色质重塑蛋白DRD1 [119]。编码这些蛋白的基因在Trincadeira葡萄成熟期间下调，但仅在2007年季节下调，而编码argonaute蛋白的基因在两个季节都下调(VVTU5485_s_at，附加文件)6)．这表明葡萄成熟过程中rna介导的表观遗传修饰可能是季节依赖性和/或组织特异性的。有趣的是，两个参与pre-mRNA剪接的基因在成熟过程中被上调(VVTU11603_at, cluster 8, VVTU28953_s_at, cluster 8)，这是调控基因表达的重要机制。

转座因子可以在产生遗传和表观遗传甲基化变化中发挥重要作用[119]。9个反转录转座子(通过RNA中间体转座)在成熟过程中被调节，其中一些在季节之间表现出不同的表达谱(表1)2、附加文件6)，这可能是由于环境因素。事实上，大多数植物转座因子被不同的生物和非生物胁迫激活[120]。

编码未分类的反转录转座子蛋白(VVTU15783_at，集群1 VVTU14689_at)、ty1拷贝亚类反转录转座子蛋白(VVTU10989_at)、ty3吉普赛亚类反转录转座子蛋白(VVTU13723_x_at，集群7)、CACTA超家族转座子蛋白和En/Spm亚类转座子蛋白(VVTU12696_at)、转座子蛋白(VVTU37074_at，集群1;vptu6149_s_at (cluster3)和转座酶(vttu5491_at, cluster1)在两个季节的EL 35和/或EL 36上调，可能在成熟过程中发挥重要作用。

本文对特林卡德拉葡萄成熟过程中的转录组和代谢组进行了全面分析。转录本和代谢物的结合分析有助于阐明成熟过程中碳水化合物、氨基酸和苯丙素代谢的许多方面。在许多基因的表达模式中，已经遇到了与其他品种有关的差异，以及葡萄生产年份的差异。例如，众所周知，Trincadeira比其他葡萄牙品种含有更少的苯丙素[20.这可能与不同的初级代谢有关，正如这里所表明的，蔗糖含量的增加以及成熟过程中蔗糖合成酶基因编码的下调，而这在赤霞珠葡萄中似乎没有发生。此外，糖激酶的差异表达可能是葡萄品种在成熟期和最终在季节之间代谢差异的原因。特别是，与2007年相比，2008年EL 38季节葡萄糖含量较高，而蔗糖和苹果酸呈相反趋势，琥珀酸无显著差异。两种糖和有机酸之间的这种平衡可能取决于气候条件，并代表了合成次生代谢物的前体池的差异。

蛋氨酸、脯氨酸和谷氨酸等氨基酸含量与其生物合成/降解相关基因之间存在良好的相关性。这同样适用于三肽谷胱甘肽、抗坏血酸、琥珀酸、酒石酸等有机酸，以及槲皮素、葡萄糖苷和果酸等酚类化合物。同样值得注意的是，在两个季节的成熟过程中，编码γ -氨基丁酸转运蛋白和谷胱甘肽偶联转运蛋白的基因的表达。据我们所知，这些转运蛋白以前还没有在葡萄成熟的背景下描述过。

与其他品种相比，Trincadeira在黄酮类和萜类途径上存在差异，即编码二氢黄酮醇-4-还原酶和(-)-germacrene D合成酶的基因的表达，最终可能会影响葡萄酒的特定特性。

由于生长调节剂作为控制葡萄成熟的可能的生物技术靶点的重要性，对其代谢和信号通路进行了详细的分析。为所有类型的生长调节剂提供了新的信息(如转录因子、受体、信号通路和代谢的不同成分的编码基因的表达)，并注意到与其他品种以及不同年份的Trincadeira生长之间的差异。这些差异当然值得进行更详细的研究，包括对生长调节剂含量的测量和最终的未来功能分析。此外，我们已经解决了表观遗传因素和转座子在葡萄成熟中所起的假定作用，这是一个很少探索的主题。

所有这些信息得益于基于12X覆盖葡萄基因组序列组装的基因注释的改进，以及使用覆盖葡萄基因组约50%的GRAPEGEN GenChip，比以前可用的Affymetrix葡萄微阵列更具代表性。

最后，我们的研究结果首次提供了葡萄成熟期超过两个季节的转录组学和代谢组学研究，并为理解葡萄成熟复杂过程的调节机制提供了有价值的贡献。

样品采集和RNA提取

2007年和2008年上午10点左右，在位于蒙特蒙特-诺沃(葡萄牙南部)的Plansel葡萄园收集了四个生物重复(每个重复包括来自8-10个Trincadeira品种植物的80-100个浆果)。EL 32、34、35、36和38发育阶段对应的样本(E-L为修正的Eichhorn和Lorenz发育量表，描述为[4立即在液氮中冷冻，然后用干冰运送到实验室。每个生物复制品都包含来自单排植物的浆果，以及来自植物的阳面和阴面。行距为3至10米。

葡萄在液氮中研磨，去籽，然后用提取缓冲液进行RNA提取。121额外的0.8% PVP-40。然后将样品在氯仿/异戊醇(24:1,v/v)中涡流提取两次。为了沉淀蛋白质，在上清液中加入KCl 2 M溶液至终浓度为160 mM，样品在冰上放置1小时。离心后，上清液用1/10 vol醋酸钠3 M和0.8 vol冷异丙醇在Corex管中沉淀，然后用70%乙醇洗涤并溶于水。然后将样品离心，然后用LiCl 4m在冰上沉淀过夜，然后用乙醇洗涤，然后将样品干燥并溶解在水中。然后用KAc 2 M在冰上沉淀1 h以去除多糖。根据供应商的说明(Invitrogen, San Diego, CA, USA)进行DNAse处理。样品用苯酚/氯仿/异戊醇(75:24:1,v/v/v)萃取，乙酸钠和乙醇沉淀，70%乙醇洗涤，水溶解。RNA使用RNeasy Plant Mini试剂盒(Quiagen, Valencia, CA, USA)进一步纯化。

寡核苷酸阵列的靶制备和杂交

使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent technologies, Palo Alto, CA)检测RNA质量。利用1 -cycle靶标记和对照试剂(Affymetrix, Santa Clara, CA)从4 μg的总RNA合成cDNA，得到生物素标记的cRNA，然后在94°C下裂解35 min，片段长度为35-200个碱基。

三个生物重复独立杂交到GrapeGen 520510F阵列(Affymetrix, Santa Clara, CA)。每个样品加入含有100 mM 2-(N-morpholino)乙磺酸、1 M NaCl和20 mM EDTA的杂交溶液中，添加0.01%的Tween-20至最终cRNA浓度为0.05 μg/ml。在45°C下杂交16 h。每个微阵列在Fluidics工作站450 (Affymetrix)中清洗并用链亲和素-藻红蛋白染色，并扫描1.56μm分辨率的基因芯片^®扫描仪3000 7G系统(Affymetrix)。

数据和序列分析及基因注释

鲁棒多阵列分析(RMA)算法用于背景校正、归一化和表达水平汇总[122]。接下来，使用affylmGUI包中包含的Microarray数据(limma)线性模型中的Bayes t统计量进行差异表达分析。使用Benjamini-Hochberg方法对多重检验的p值进行校正[26]。从GrapeGen芯片杂交得到的数据，按绝对倍数变化≥1.5进行过滤，并校正p值< 0.05。

将这些序列与NCBI网站上的基因组预测基因(blastn, e值< e-20，最小100 bp序列)进行比对。通过更新[]中的注释进行基因注释。123遵循作者描述的相同协议，从基因组组装的12X覆盖释放中获得新基因。然后根据基因的功能将其划分为功能类别。分类是通过用GO术语完成MIPS功能分类植物特异性来构建的。

表达模式的聚类

采用三个生物重复(对照对应绿莓- el32)的logExperiment荧光和logControl荧光的中位数进行聚类分析。本分析使用多重实验查看器4.6.2版软件包进行，并基于k-means方法利用Pearson相关距离对获得的EL 32、EL 35和EL 36在两个年份的基因表达谱进行计算。

使用¹氢核磁共振、j分辨、COSY和多变量分析

葡萄在液氮中冷冻和研磨(用镊子除去种子)，并在-40°C下冻干至少72小时。每次样品提取使用50毫克的材料，基本按照[124]。KH₂阿宝₄选项D为正确答案。₂O(99.00%，剑桥同位素实验室，迈阿密)作为缓冲剂。D的pH值₂使用1N NaOD溶液(Cortec, Paris)，将核磁共振测量值O调整为6.0。

样品在750 μl的KH溶液中溶解₂阿宝₄加入0.1%三甲基硅烷丙酸钠盐(标准品购于德国默克公司)和750 μl甲醇-d4(99.8%，剑桥同位素实验室，迈阿密)。然后，对样品进行短暂的涡旋，超声10-20分钟，并在13000 rpm下离心10分钟。取上清(800 μl)进行分析。

¹氢核磁共振和二维J在500 MHz布鲁克DMX-500光谱仪上记录25°C下的-分辨光谱，根据[124]。所得到的光谱经过手动相位和基线校正，并校准为δ 0.0的TSP，所有这些都使用XWIN NMR(版本3.5,Bruker)。的¹使用AMIX(3.7版，Bruker Biospin)自动将H核磁共振谱减至ASCII文件。光谱强度按TSP和总强度进行缩放，并缩小为δ = 0.40- 10.00区域对应的等宽度(0.04 ppm)的积分区域。δ = 4.70 ~ 5.10的区域由于水的残留信号被排除在分析之外。采用SIMCA-P软件(version 11.0;Umetrics, Umea°，瑞典)。使用了帕累托缩放法，该方法使每个变量的方差在数值上等于其标准差。Excel文件中包含的光谱强度降低到等宽的集成区域(0.04 ppm)，用于Kruskal-Wallis和Wilcoxon等级和检验，以确定哪些样品具有显著不同的某些代谢物的量。

二维核磁共振实验(j分辨、COSY和HMBC)按照我们之前实验的参数进行测量[124]。

花青素和谷胱甘肽定量

葡萄在液氮中冷冻，去籽，在- 40°C下冷冻干燥72-96 h，然后用1.5 ml TFA(三氟乙酸)/甲醇/H2O (0.05/80/20, v/v/v)提取20-60 mg粉末。样品旋转1 min，然后在埃彭多夫管中冰上提取1 h。然后将混合物在4°C下13000 rpm离心30分钟。取本品100 μL，在萃取液中稀释至1 ml。将溶液混合后静置5分钟，然后读取吸光度A520。总相对花青素浓度表示为520 nm/g冻干重量处的吸光度值。

对于谷胱甘肽的定量，按上述方法收集并冻干的样品，用0.5 M高氯酸在冰上的磷酸盐缓冲盐水中提取，在4°C下离心10分钟。总谷胱甘肽采用谷胱甘肽还原酶法测定[125]，在412 nm处吸收速率变化15分钟。简单地说，在1 mL的反应体积下，用0.1 M磷酸钾缓冲液、5 mM EDTA (pH 7.5)、2U酵母谷胱甘肽还原酶(Sigma)、DTNB、NADPH和20 μL用KOH中和的提取物进行检测。采用标准曲线测定谷胱甘肽含量。所有检测均使用安捷伦HP 8453二极管阵列分光光度计进行，温度控制并在比色皿中进行磁力搅拌。

定量rt - pcr

根据制造商的说明，使用RevertAid™H - M-MuLV逆转录酶(Fermentas, Burlington, Canada)从1.5 μg RNA合成互补DNA。引物序列(附加文件7)，使用Primer express software3.0 (Applied Biosystems, Forster City, CA)进行筛选。使用Maxima™SYBR Green qPCR Master Mix (2X) (Fermentas, Burlington, Canada)制备实时PCR反应，并使用StepOne™Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA)进行检测。循环条件为95°C 20 min，然后95°C 1 min和60°C 20 min，循环40次。使用每个基因的连续稀释cDNA标准曲线测定重复生物重复和重复技术重复的表达。根据校准曲线计算数据，并使用微阵列分析中绝对无差异表达的actin基因(VVTU17999_s_at)表达曲线进行归一化。

这项工作主要得到ERA-PG (FCT ERA-PG/0004/2006)的支持，该项目隶属于基因组研究辅助育种项目，用于优质葡萄和葡萄酒的可持续生产http://urgi.versailles.inra.fr/projects/GRASP/国家项目PTDC/AGR-GPL/100919/2008和PEst-OE/MAT/UI0006/2011部分资助。作者要感谢Ana Cristina Figueiredo教授(里斯本大学理学院)对样品的冻干和Pablo Carbonell博士(马德里CNB)对实时pcr的宝贵建议。

从属关系

1. 植物系统生物学实验室，植物生物学系/ICAT，生物多样性，功能和整合基因组学中心，葡萄牙里斯本，1749-016

   Ana M Fortes, Patricia Agudelo-Romero和Maria S Pais

2. 葡萄牙里斯本FCUL Química e Bioquímica系Química e Bioquímica中心

   玛尔塔·S·席尔瓦

3. 莱顿大学生物研究所天然产物实验室，莱顿RA, 2300，荷兰

   Kashif Ali, Federica Maltese, Young H Choi和Robert Verpoorte

4. 葡萄牙里斯本外国语大学统计与运筹学学系(Estatística e Aplicações da UL中心)

   Lisete苏萨

5. CCT, C/Madre de Dios 51, Logroño, 26006，西班牙

   Jerome Grimplet & josore M Martinez- Zapater

相应的作者

对应到安娜·M·福尔特斯。

相互竞争的利益

作者宣称他们没有竞争利益。

作者的贡献

AMF设计实验并撰写论文，取样材料，进行RNA提取，芯片数据分析和解释，花青素定量，淀粉染色，参与代谢组学，谷胱甘肽定量和聚类分析。PAR设计引物，进行qRT-PCR并参与数据展示。MSS参与了谷胱甘肽的定量和数据展示。KA, FM, YHC参与代谢组学研究。LS进行了统计分析。JG进行基因组注释。KA、YHC、JG、JMMZ、RV、MSP对稿件进行了批判性修改。所有作者都认可了最终稿。

微阵列数据已提交给基因表达Omnibus (NCBI)，并可通过GEO登录号GSE28779访问。

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