不同易感性挪威云杉基因型的化学和转录反应Heterobasidion种虫害感染

背景

挪威云杉(挪威云杉(l)岩溶。］is one of the most important conifer species in Europe. The wood is economically important and infections by wood-rotting fungi cause substantial losses to the industry.

挪威云杉的第一道防线是树皮。基于其机械和化学性质，它是一种非常有效的抗感染屏障。一旦受伤或感染被树识别出来，诱导防御就会被激活。在这项研究中，我们使用454测序和化学谱检测了挪威云杉树皮的转录反应异常annosum s.l.感染。目的是在转录组和化学分布之间找到与易感性水平之间的关联Heterobasidion挪威云杉的基因型。

结果

在接种后28天(dpi)， 3-蒈烯产生了高水平的响应h . annosum．然而，与接种或敏感性较高或较低的基因型相关的显著模式只能在苯酚馏分中发现。聚合成原花青素(PA)的类黄酮儿茶素的水平呈现出时间上的变化;在5到15 dpi之间累积h . annosum以易感的基因型感染。转录组数据表明，自由儿茶素的积累之前先前通过了类黄酮和PA生物合成途径中的基因诱导。leucoanthocyanidin还原酶．定量PCR分析证实了苯丙素和类黄酮途径的基因诱导。qPCR数据还强调了这些途径转录调控的基因型依赖差异。

结论

较不敏感的基因型所显示的转录和化学模式的变化动态表明，云杉防御策略的成功存在基因型差异Heterobasidion．然而，在较不敏感的基因型中，高水平的piceaside和类黄酮表明酚类化合物在防御中的重要性。很明显，这是在与Heterobasidion在几个表现出易感性降低的独立基因型之间，需要对成功的宿主防御策略的机制进行分类。

挪威云杉(挪威云杉（L.）喀斯特。]是欧洲生态和经济上的森林生态系统中最重要的针叶树种类之一。是长期生物，云杉树依赖于诱导和构成防御，以限制入侵真菌和昆虫的传播。挪威云杉树的第一行防守是树皮。坚韧番木嘴和贫富壁的物理性质的组合，提供疏水性障碍物和酚类和萜烯的化学性质使吠叫成为对感染的非常有效的障碍[1]．一旦树木识别到损伤或感染，诱导防御就被激活，包括细胞壁强化、分解酶的产生和次生代谢产物，如酚类、二苯乙烯类、木脂素、黄酮类化合物和萜烯[1- - - - - -4]．

根腐真菌Heterobasidionspp。物种综合体是斯堪的纳维亚斯堪的纳维亚州挪威云杉最严重的病原体[5]引起根和阀杆腐烂并使木材缺陷锯切和制浆。几项研究表明，遗传确定的宿主特征部分地确定了挪威云杉的易感性Heterobasidion感染(6- - - - - -11]．

为了保护自己免受病原体和害虫的侵害，针叶树，如云杉，已经进化出了复杂的组成和诱导防御机制[1，2]．其中许多与次生代谢物的产生有关，以延迟或阻止真菌或昆虫在树内的建立[2，12- - - - - -14]．在韧皮内的树脂管道中产生的油树脂是树皮中构成防护的一部分[15，16]．在攻击,新创木质部树脂管的分化[1，15，17]和防御相关萜烯的生产[15，18- - - - - -20.]．同样地，在树皮中同样膨胀和增殖的多肠溶细胞（PP细胞）[21，22]及酚类物质浓度的变化[23- - - - - -26对病原体攻击的反应。

在过去十年中，通过成绩单分析和化学特征的组合成功探讨了Terpenes对昆虫攻击的反应的调节和生物合成[19，27，28]．黄酮类化合物对杨树叶片病原菌的响应研究也采用了类似的方法[29，30.]．然而，在云杉中，这种方法尚未应用于与病原体相互作用的酚类的调节和生物合成。从代谢的角度来看，植物酚醛族构成了比Terpenes更多的异质组。酚类通过几种不同的途径进行生物合成，但它们都来自Shikimic酸和苯丙烷型途径的产品（图1)[31]．

真菌感染通常导致酚糖苷的降低和随后的相应糖糖的增加[12，14，24，26，32]．糖蜜的积累可能是来自真菌的β-葡糖苷酶活性的结果[14或树[33]．斯蒂替含量和抵抗力之间的可能关系Heterobasidion已被调查和林德伯格et al。，[12发现二苯乙烯-涩味苷的初始浓度与挪威云杉树皮菌丝渗透深度呈负相关。树皮二苯乙烯苷含量与耐药之间无相关性h . annosum发现于锡特卡云杉(云杉sitchensis[(锣)。卡里埃])(34]．更好的抵抗力长喙壳属polonica[（Siemaszko）C. Moreau]感染与斯蒂替斯诺南辛林，苯酚多样性和黄酮类（+） - 儿茶素在接种后的嗜酚（+） - 儿茶素的积累有关[23，25]．

在这项研究中，我们检查了克隆挪威云杉树中的转录反应和化学曲线。克隆定量评分易感性Heterobasidionspp。基于2004年展台中可见衰减的筛选[7]．本研究是在瑞典中部的一个复制种植园进行的。取样时，我们选择了4个基因型(无性系)，其中2个基因型的大部分分株都受到了严重的攻击Heterobasidion根据2004年的调查分析，两种基因型显示几乎没有感染。

我们的目的是在转录组和化学分布之间找到与易感性水平的关联Heterobasidion挪威云杉的基因型。我们发现了敏感性水平与苯酚含量和萜烯含量的基因型差异之间的联系。

植物材料和抽样

这些植物材料来自瑞典SkogForsk地区克隆林业项目的一个地点[35]．该立场位于瑞典Årdala（59°01'N，16°49'e），并于1984年成立，其中311个基因型为3岁的裸根切割。它被种植在罗马广场设计中，九个重复和单树图，主图中有1.4米间距。将基因型分布在不同主图种植的八个克隆混合物中。选定的挪威云杉基因型先前已被分类为对感染的自然易感性Heterobasidionspp。7]．

每个无性系使用3个分株，在第0天，每棵树选择2根，1根接种，1根伤处理。分配给接种的根是人工接种的Heterobasidion annosum[（fr.）bref。]（sä16-4）[36]．为了让真菌进入根部，在垂直于根部伸长的直线上做三个5mm的圆形伤口。每个树皮盘被切成两半(平行于根伸长)。其中一半置于含有1.5 mL RNAlater (Ambion)的2ml微离心管中，用于后续转录组分析;另一半置于含有1 mL己烷57 ngμL的小瓶中^-1戊烷作为内标和102ngμl^-1研究了抗氧化剂3-叔丁基-4-羟基氧苯甲醚提取萜烯含量的方法。直径5毫米的木塞，并接种h . annosum，根据Stenlid & Swedjemark [37，然后用塑料薄膜粘在伤口上^®．除了每个伤口上都有一个无菌的木塞外，对分配给伤口的根进行相同的处理。

5天后，对每个根上的剩余接种点取样。取出木塞，在接种点附近取直径1.5 cm的树皮样品，将树皮样品切成两半(与根伸长平行)。一半置于含有1.5 mL RNAlater (Ambion)的2ml微离心管中，用于后续转录组分析;另一半置于含有1 mL己烷57 ng μL的小瓶中^-1戊烷作为内标和102ngμl^-1研究了抗氧化剂3-叔丁基-4-羟基氧苯甲醚提取萜烯含量的方法。接种后15和28天，对其他两个接种孔重复该过程。在15 dpi下，收集了右侧最远的接种点，并采样28 dpi。在28dPI收获的伤口/接种点上的病变长度在44dpi下测量，以验证接种成功，因为病变长度已被证明与现场实验中的真菌生长相关[6，8，38]．

数据记录器Tinytag™在采样期间(2008年8月13日至9月9日)收集温度数据，空气温度范围在6.2°C至25.8°C之间。

化学分析

化学物质

乙腈，水和甲酸，所有LC-MS等级购自Sigma Aldrich。来自SDS（ValdeReuil，法国）购买了用于提取的LC等级的己烷，甲醇和水。N-五戊烷由兰卡斯特（98％GC-PLITY）和3-叔丁基-4-羟基烷（BHA，≥90％GC-PURITY）从Fluka购买。Vanillyl酒精和一些酚参考化学品在Kth的实验室中合成;其他苯酚参考化学品被收到Annie Yart（Inra，Orléans，法国）的礼物。从商业来源获得萜烯参考化学品。

用于GC-MS和HPLC-MS分析的样品的制备

在现场取样时先用正己烷萃取萜烯，然后在室温下过夜。收集己烷进行GC-MS分析，再用1 mL己烷洗涤残渣1 h。提取苯酚时，去除己烷并加入0.5 mL 80%甲醇(106 ng μL)^-1108ng μL^-1BHA）被添加到样品中。苯酚的提取在室温下继续过夜。将所有样品以6000rpm离心10分钟并储存在冷冻机中直至分析。将残余物置于通风橱中的露天小瓶中，并在60℃下进一步干燥40小时，然后再到样品。

gc - ms分析

使用以下温度程序在Varian 3400GC上用DB-Wax柱（30m，0.25mm ID和0.15μm，Agilent，Santa Clara，CA，USA）分离在Varian 3400GC上（30m，0.25mm ID和0.15μm薄膜厚度，CA，CA，USA）上分离出己烷样品：40°C3分钟，斜坡，4°C / min最多230°C，保持恒定19分钟。喷射器温度为225°C和转移线235℃。氦（0.69巴入式压力）用作载气。GC与电子电离（源：150°C，70eV）连接到Finnigan SSQ 7000 MS仪器。如Borg-Karlson所述进行对映异构体的分离et al。［39]．

HPLC-ESI-MS分析

LC-MS分析在Finnigan高效液相色谱系统上进行，该系统由Surveyor MS Pump Plus, Surveyor Autosampler Plus和Surveyor PDA Plus检测器组成，耦合到一个2D线性离子阱，Finnigan LXQ (Thermo Fisher Scientific, San José， CA, USA)。

Ascentis快速RP-amide色谱柱(15 cm, 2.1 mm内径，2.7 μm膜厚;采用高效液相色谱分离，RP-amide保护柱(2 cm, 2.1 mm内径，5 μm膜厚，Supelco, Bellefonte, PA, USA)。采用0.1%甲酸水溶液(a)和0.1%甲酸乙腈(B)梯度分离，流速200 μL/min，烘箱温度30℃。洗脱梯度如下(B %): 10%(0-3分钟)，10-30%(3-51分钟)，30-100%(51-57分钟)，保持11分钟，最后在2分钟内降低到10% B。系统在不同分析之间平衡20分钟。

所有测量都在负模式下进行，全扫描范围在m/z 50-1000之间。对ESI源进行优化，设置为:源电压4.00 kV，毛细管温度270°C，板气流量40 au(任意单位)，扫气20 au。毛细管电压设为-23.00 V，管透镜设为-109.80 V。

成绩单分析

RNA提取、cDNA合成及测序

总RNA的分离基本如Chang描述的那样et al。［40]．为消除基因组DNA的污染，使用前对总RNA进行DNaseI (SIGMA)处理。RNA的质量和数量通过生物分析仪2100(安捷伦)上的RNA纳米分析进行评估。Poly(A)+RNA从样品中提取^®根据制造商的说明，mRNA纯化试剂盒（Invitrogen）。根据制造商的指示，用Messageampiii套件（Ambion）扩增纯化的mRNA。根据制造商提供的方案，通过根据制造商提供的方案，从扩增的RNA（ARNA）合成第一链cDNA，除了使RT-反应得到50分钟。如Sambrook和Russel所述进行第二链合成[41]使用从发酵群中购买的酶。根据基因型和治疗合并足够的质量的双链cDNA。

在挪威测序中心的GS FLX（Roche，454）上提交了24个CDNA样品中的24个CDNA样品中的每种24个cDNA样品中的每种CDNA样品中的每一个。http://www.sequencing.uio.no根据制造商协议(罗氏应用科学公司)。序列阅读和序列质量评分来自挪威测序中心。

qPCR验证基因表达

来自所有四种基因型（2405,7398,3178和3340）的纯化的arna（1μg）与IScript TM cDNA合成试剂盒（Bio-rad）逆转录。在去硫酸盐水中稀释CDNA合成1：1，每20μl使用Maxima的PCR反应使用25ng ArNA等当量的等份。^®SYBR Green / Fluorescein QPCR主混合套件（Fermentas）和每种底漆的终浓度为0.5μm。使用PRIMER3软件从ISOTIG序列设计引物[42]熔化温度（TM）在58°C和60°C之间，并且在95-183 bp之间的扩增子长度（附加文件1）.在iQ™5多色实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad)上运行的热循环条件参数如下:95°C for 10 min;40个循环，95°C 15秒，58或60°C 10秒，60°C 1分钟。每次运行之后进行熔化曲线分析，以验证反应的特异性。采用线性质粒标准曲线测定PCR效率，效率低于95%的引物予以丢弃。每个样品准备了两个技术重复。

转录本丰度归一化到内参基因phosphoglucomutase［43]，真核翻译启动因子4a（elF4A)[44］延伸因子1-α（elf1α.）.使用REST 2006计算相对表达式[45]．

生物信息学和统计分析

用序列汇编软件Newbler v2.3 (Roche)对检索到的序列进行组装。http://my454.com/带有SFF文件的CDNA程序集作为输入文件的默认设置。序列组件在自由可用的生物动物上进行http://www.bioportal.uio.no.．将所有处理的组合序列组装成基因当量的异粒组和可粘合的剪接变体，Isotgs。有关术语ISOGroup，ISOTIG及其与Contig的连接的详细说明，请参阅Ewen-Campen [46但一般来说，同群应等同于一个基因，同位组应对应其剪接变异，而同位组应对应外显子。用平板电脑软件以ace格式对Contigs进行目视检查[47]．所有库的组合组合序列用作参考文件，并用软件BLAST2GO注释[48]，其中的序列被注释为BLASTx同源性，GO术语和EC数字，并使用InterProScan扫描。此外，根据与MEGAN的BLAST同源性鉴定真菌属，对数据集进行真菌序列修剪[49]．

为了估计各文库中基因的相对表达量，我们将每个文库中的单个reads与参考文件中的isogroups和isotigs进行组合，以获取单个样本中表达基因出现的计数数据。计数数据在R中对齐并导入R-package DESeq [50]并在计数数上标准化，并进行进一步的对差异表达转录组分析。

归一化计数数据在DESeq中转换为同方差数据，并通过Ward的层次聚类与JMP™进行聚类。注释到导致萜烯、二苯乙烯和原花青素生产途径的contigs分别聚集在一起。

R (The R Foundation for Statistical Computing, TU Wien, Vienna, Austria)用于病变长度的方差分析。多变量分析使用CANOCO软件(版本4.54，由荷兰Biometris植物研究国际公司Cajo J. F. Ter Braak和Petr Smilauer开发)进行。在排序之前，对变量进行对数变换、单位方差标度和均值居中。采用方差不等的t检验来评估萜类和酚类成分浓度的差异。对来自同一根的样本进行两两t检验，比较处理前后的浓度。t检验采用对数变换后的Excel (Microsoft)数据分析工具进行。

接种

在44 dpi时，接种后的病变长度明显长于单独损伤后(方差分析，复制的两因素:p =0.01）（表1）.然而，不同基因型之间的病变长度没有显著差异(p =0.36）。

集会

四种测序基因型共产生492,102个reads，这些reads在样本之间分布不均匀(附加文件)2）.组装序列，并将得到的isotgs自动注释（表2）.由于没有参考基因组可用于针叶树，我们无法估计在该数据集中涵盖的总基因的百分比，但可能的独特转录物的数量与先前的针叶树研究类似[51]．在本研究中，我们主要关注与萜类和苯基丙烯类生物合成相关的异位标记。

酚类和苯丙类生物合成途径

在构成酚中，两种涩味苷二聚体(piceseaside A/B和G/H)和一种未知的酚葡糖苷在较不敏感基因型的树皮中浓度较高(p< 0.05)。接种对苯酚含量的影响最明显的是色谱中早期洗脱的极性物质减少，后期洗脱的增加，极性化合物减少(图)2）.数字3.显示基于样品的相对酚组成的PCA。第一台PC解释了19％的变异，主要分离样品及治疗。从根部接种当天从根部取出的样品置于图中的左侧，并且右侧是从15或28dPI的接种根部取出的样品。第二台PC具有分离高易感基因型的趋势。本构样品和接种的早期阶段更为突出;在15和28dPI的接种根中取出的样品在易感性的基础上没有分开（图3.）.树皮样品中的类黄酮儿茶素水平与组成水平相比显著降低了5 dpi。儿茶素在5 - 15 dpi之间显著累积h . annosum接种(p= 0.024)和受伤的树皮(p= 0.003)，在15 dpi时，可提取儿茶素的水平与对照组相当(图4）.游离儿茶素的积累在较不敏感的基因型中反应更直接h . annosum与高易感基因型相比（图4p<0.05，未配对T检验）。应该注意的是，可提取的儿茶素的模式在基因型中变化;例如，3178未显示与对照相比5 dpi的任何明显的可提取的儿茶素减少，而3340的减少更加明显（p= 0.0086，未配对T检验）。

基于与所选基因相似的isotigs (Accession number)计数数据的聚类分析苯丙氨酸氨裂解酶（朋友)，肉桂酸4-hydroxylase（C4H)，4-香豆素的连接酶（4CL.)，flavanone-3-hydroxylase（F3H)，二氢烷醇-4-还原酶（DFR)，花青素还原酶（ANR)，leucoanthocyanidin还原酶（拉)，类配偶，肉桂酰辅酶a还原酶（CCR.),肉桂醇脱氢酶（CAD.））在苯丙醇丙烷和黄酮途径与所选参考基因一起导致八簇（簇1-8，图5）.

簇1包括在整个实验中高度表达的所选参考基因。集群2中的ISOTIG在所有治疗中都非常高度表达。与控制相比，群集3含有在5 dpi下显着上调的isotig，而且无论治疗如何，都在整个实验中诱导，例如两个ANR序列和一个拉序列（图5）.所有的isotigs注释为拉在5 dpi显著上调(p<0.05）与对照相比。群集4包括在15和28dpi的对照和受伤样品中显示出更高的表达。在响应于5例15DPI的响应于感染时激活的簇5和6 isotig被发现，例如Isotigs被注释为朋友，拉和F3H(图5）.有趣的是，代表直接参与Lignification的基因的Isotig，即Isotig 14332（CCR.)，在5 dpi时，与对照组相比，表现出短暂的3-4倍的上调，但在15或28 dpi时无法检测到相应的上调。没有一个isotigs注释为CAD.显示任何重要的规则。聚类7-8没有或很少的isotigs在时间点之间有显著差异表达。

与苯丙烷丙烷和黄酮途径相关的ISOTIG的总体表达模式在对照中相似（图5）.在5 dpi处，除了在聚类4-6中发现的isotigs外，所有处理的一般表达模式都相似。在5 dpi或15 dpi时，无法检测到高敏感和低敏感基因型之间的明确分离，但在这些时间点，高敏感基因型比低敏感基因型表现出更相似的表达模式(图)5）.观察到较少易感的基因型有时显示响应于伤害和接种的对比表达模式在四种基因型的QPCR分析中明确验证（图6）.

QPCR分析PAL，C4H，CAD，LAR和ANR基因证实了上述情况。PAL1，C4H.2,C4H3/55 dpi显著上调，无论治疗与否(p<0.05，图6）.只在以后的时间点C4H2显着（p< 0.05)差异。未观察到明显的上调CAD.．重要的监管p< 0.05)ANR2、ANR3 LAR1和LAR2在5 dpi处(图6除了LAR1在整个实验过程中保持向上调节。与R2R3 myb转录因子基因相似的同位基因TT2.（透明的外种皮2）在所有时间点对两种治疗展示了重要的上调（p< 0.05)。被测基因的实际表达水平因基因型而异:7398表达下调PAL1，PAL2，C4H3 / 5和CAD.分别是15和28 dpi，以及术后28天h . annosum以2405为例，不存在接种(图5)6c，e-f）.

萜类和萜类生物合成

本构型样品中萜烯含量在高、低敏感基因型间差异不明显。接种和损伤均可诱导萜烯在伤口周围积累，但萜烯组成没有一致的变化。基于相对萜烯组成的主成分分析(图7）倾向于在第一PC上彼此分离四种基因型，但这种分离与易感性没有相关性。在28 dpi下，治疗之间的3 - carene的积累（p< 0.01):平均h . annosum接种可增加1200倍，而伤害可增加70倍。

与萜烯合成酶有显著相似的有限数量的contigs (TPS.)基因在数据集(登录号)中被发现。有三个与(-) -α/β蒎烯合酶（PaTPS-Pin，[52])，每一个在数据集中组成一个单独的同群。一个同群，包括一个同位群，与前面描述的具有高度相似性(+) 3-carene合成酶基因(PaTPS-Car, 18)。此外，其中一组受到了明显的BLASTx攻击柠檬烯合成酶（TPS-Lim)的基因云杉spp。

本研究旨在找到较低易感性之间的关联Heterobasidion在挪威云杉的宿主基因型中转录组和化学谱的变化。我们使用了独特的克隆材料，从完全生长的挪威云杉树，或高或低的敏感性Heterobasidion在实地试验中测量的sp . [7]．我们在瑞典中部的网站中选择了四种基因型，两个高度易感和两个，对这些比较较低。很好地确定了在互动之间Heterobasidionspp。和针叶树，病变长度与真菌延伸相关，但不是在木材中测量的宿主阻力或木材中的腐烂延长[6，8，38]．因此，在野外条件下，不能指望病变的扩展与真菌的扩展成正比。尽管在44 dpi时，我们无法检测到基因型之间病变长度的任何显著差异，但我们发现，与模拟接种相比，接种伤口中的病变明显更长。这表明，寄主树对接种的反应不同于对伤害的反应或更强。

研究了萜烯和酚的组成，但仅在酚组分中发现了与接种有关的模式或与敏感性较高或较低的基因型有关的模式。伤后和接种后萜类化合物均有较强的增加，但在质量上无普遍差异。而萜烯含量变化最典型的是基因型间的差异，与抗性无相关性。基因型依赖调节与Zeneli及其同事的研究结果一致[53who报告了茉莉酸甲酯处理后边材萜烯生产的基因型依赖反应。伍德沃德et al。［54]，在弱敏感基因型的锡特卡云杉接种后，3-蒈烯的相对增加较大h . annosum与更敏感的基因型相比。我们的研究表明，两种易感水平的基因型之间没有显著差异。然而，接种引起的3-蒈烯诱导比伤害引起的更强，这与挪威云杉的早期研究结果一致[20.，55]．单核细胞的表达水平TPS.挪威云杉的基因与单萜生产水平相关[52，56]．具有相似性与先前描述的挪威云杉单声道的isogroupsTPS.基因可以解释所鉴定的单萜。化学分析中缺乏与萜烯相关的治疗特异性反应也反映在转录组中。虽然有许多序列与前面描述的显著相似病人数据集中存在基因，在治疗之间或高或低易感性基因型之间没有发现一致的反应。根据萜烯的概况和萜烯的调控TPS.转录组数据中的基因表明，Terpenes主要以单独的基因型依赖性方式调节，而不是本研究中的治疗依赖性方式。在Sitka云杉中，报告了一种小基因TPS-Car基因系列[28，57]在基因型中抗拒或易受白松的象鼻虫。此外（+） - 3- carene和萜烯酮（TPS-CAR的另一个主要产物），最近被鉴定为抗象鼻虫的指标，在​​Sitka云杉起源的特定地理区域中的抗性[58]．这些研究表明，可能需要一种更集中的方法，例如涉及从单个基因型中克隆特异性TPS-轿车基因组序列，以解决克隆基于萜烯防御的特异性差异。

组成型酚醛组合物在具有高且易感性的基因型之间不同，但是h . annosum接种可导致分化的酚谱，其特征是极性较低的化合物增加，如苷元。这与之前接种真菌后的发现一致[12，14，24，26，32]．在构成酚中，涩味苷二聚体(piceasides)在低敏感性基因型的样本中浓度较高。Astringin被认为有助于抗h . parviporum由林德伯格et al。［12]由于其浓度与接种后七天悬垂的悬垂性呈负相关。李军第一次描述挪威云杉刺激蛋白的斯特莱顿二聚体et al。［59它们的生态作用尚未被研究。然而，viniferins是二苯乙烯白藜芦醇的二聚体，在对葡萄藤的研究中显示出抗真菌活性，而且二聚体通常比单体更具毒性[60]．我们的结果表明，PiceSides可能对防御系统具有重要性Heterobasidion但其抗真菌效果尚待证实。

Brignolaset al。［61)和施密特et al。［62]的研究表明，激活导致类黄酮和二苯乙烯单体的生物合成途径，并随后将这些单体转化为不溶性产物，在针叶树对伤害和真菌感染的诱导防御中起着核心作用。这表明，对c . polonica取决于挪威云杉的能力容易激活类黄酮途径[61]．因此，我们感兴趣的是类黄酮通路的激活是否在相互作用中也很重要h . annosum．对苯酚谱的仔细检查显示，儿茶素在5到15 dpi之间显著累积h . annosum- 植物和受伤的树皮（图4）.有趣的是，在较不敏感的基因型中，游离儿茶素的积累更直接h . annosum与高易感基因型相比。通过对属于类黄酮生物合成途径的isotigs的双向聚类，揭示了其表达模式。该聚类包含大量高度相似的ANR和DFR isotigs，且表达水平较低(图中的聚类1)5）.虽然没有人确切地知道这些基因家族的许多成员是在云杉中预期的，但这些Isotigs可能反映了大会的质量。我们的数据集平均读取长度为305 bp（附加文件2），由于cDNA合成和图书馆准备中的技术问题，这短于预期。我们还使用NewBler 2.3组装此数据集和Kumar和Blaxter（2010）[63]报告说，这个版本的Newbler生成的程序集的总长度明显低于新版本的Newbler。在马利筋转录组的例子中，Newbler 2.3和后来的版本之间的差异并不像Kumar和Blaxter报道的那样剧烈[46，表明汇编程序对汇编长度的影响是不同的。最后，这些样本包括植物和真菌转录本的混合物，在云杉参考基因组缺失的情况下，这将影响属于植物和真菌基因家族的基因的组装。然而，不同处理之间的差异可以被qPCR发现并验证。在儿茶素积累之前，苯基丙素途径中的基因会伴随活化(朋友,C4H和4CL.)和表儿茶素和儿茶素生物合成途径的基因h . annosum攻击（图5，6）.在转录中看到了454个数据集中的最强烈效果拉基因，在5dpi显著上调。的老年病拉是伴随着上游的上调吗DFR，它形成了leucoanthocyanidins，从中拉综合儿茶素(30.，64]．竞争的上调答（花青素合成酶)，还观察到利用白花青素作为底物形成花青素ANR，一种催化花青素合成表儿茶素的酶[30.，65]．相反，isotigs代表直接参与单分子醇形成的基因(CCR.和CAD.在受伤或接种后未显示任何显著的上调(图5）.这张照片经qPCR分析证实，没有明显的诱导CAD.观察(图6）.然而，上调的调控朋友和C4H在5 dpi时表明纯粹丙醇途径被激活。单氯代醇的形成和木质化是苯丙烷型途径代谢物的主要水槽和伤害后该途径中的适度转录调节h . annosum接种可能表明，更大比例的代谢物被分配到其他下游途径，如被证实上调的类黄酮途径拉和ANR表达。最近关于Sitka云杉的报告说明了这一点h . annosum接种或伤害不会导致树皮或边材中木质素含量的任何显著变化，但树皮中可提取酚的水平会增加[66]．

挪威云杉对Heterobasidion感染部分由基因型决定[6，7]．不同无性系树皮中儿茶素的提取规律不同;两种较不敏感的基因型在接种和伤害后5 - 15天内的游离儿茶素含量明显高于两种高度敏感的基因型(图)4)。qPCR结果表明，黄酮类化合物途径的转录变化是响应h . annosum或伤害治疗在2405和7398这两种较不敏感的基因型中有很大的不同(图)6）.QPCR数据还可以指示克隆之间的更一般差异作为PAL基因的表达，例如，在7398的受伤材料中的15 dPI下已经下调，而它们在28dpi中保持略微上调，而不管治疗2405（图6）.结果表明，基因型2405和7398可能依赖于不同的成功防御策略Heterobasidion．

较不敏感的基因型所显示的转录化学模式的变化动态表明，云杉防御策略的成功存在基因型差异Heterobasidion．然而，在较不敏感的基因型中，高水平的piceaside和类黄酮表明了酚类化合物在防御中的重要性。很明显，这是在与Heterobasidion在几个表现出易感性降低的独立基因型之间，需要对成功的宿主防御策略的机制进行分类。

Karolin Axelsson、Joakim Halldin Stenlid、Maria Jonsson、Anders Molin和Katinka博士Pålsson的技术援助得到了极大的肯定。挪威测序中心是公认的焦磷酸测序。我们感谢Annie Yart博士INRA, Orléans，法国赠送的苯酚参考化学物质，以及Anna Hopkins博士的语言修订。简称FORMAS;瑞典环境、农业科学和空间规划研究理事会和SSF;瑞典战略研究基金会提供了财政支持。

作者笔记

隶属关系

1. 瑞典KTH化学系生态化学课题组

   Marie Danielsson, Jiang Hu, Tao Zhao, Gunilla Swedjemark & Anna-Karin Borg-Karlson

2. 瑞典农业科学大学森林真菌学和植物病理学系，瑞典

   KarlLundén，Malin Elfstrand，Jenny Arnerup，Katarina Ihrmark＆Jan Stenlid

通讯作者

对应于卡尔Lunden．

作者的贡献

MD构思了研究，做了实地实验，进行了酚类分析，化学分析统计，协助起草了手稿，KL构思了研究，做了实地实验，协助样品制备和手稿的起草，完成了转录组分析统计，我做了样品制备,起草了这份手稿和辅助转录组分析JH协助萜烯化合物分析,TZ萜烯化合物的分析,是进行qPCR, KI协助样品制备,GS协助的设计研究中,A-KB-Kassisted起草的手稿,JS构思了研究并协助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿

Marie Danielsson, Karl Lundén对这项工作做出了同样的贡献。

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